WO1995004278A1 - Verfahren zur markierung von immunglobulinen - Google Patents

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WO1995004278A1
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Reinhard Brossmer
Uwe Schwarz
Gerd Wunderlich
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Technische Universität Dresden
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Definitions

  • the invention relates to a method for labeling immunoglobulins, in particular monoclonal antibodies or their fragments.
  • the labeled immunoglobulins can be detected in terms of their radioactivity or color intensity. They can be used in medicine, preferably in nuclear medicine diagnostics and therapy, and in biochemistry.
  • Radioactively labeled immunoglobulins are of increasing importance in medicine and biochemistry, since they are easy to detect by radionuclides and the high specificity of immunoglobulins means that very small substances, e.g. in radioimmunoassays or in imaging processes. Furthermore, they can be used in nuclear medicine therapy for internal radiation, e.g. of tumors. For the success of the investigations, a labeling process is required which, through a gentle reaction, enables the radioactive nuclides to be firmly bound to the immunoglobulins without impairing the immunoreactivity of the immunoglobulins.
  • Coupling methods on the oligosaccharide chains are well suited for labeling, since in these methods the immunoglobulin / radionuclide binding site is defined and, as is known, the oligosaccharides are of little importance for the immunoreactivity of the molecule.
  • Previously known methods are based on an oxidation of the unglobulin, in which 0H groups of the oligosaccharides are converted to aldehyde groups.
  • undesirable side reactions due to the oxidation cannot be ruled out.
  • Van Lenten [8] describes e.g. a general process for the oxidation of glycoproteins with sodium periodate, the DE-OS 4115038 the preparation of conjugates in this way. Since aldehyde groups do not occur in natural immunoglobulins, specifically bifunctional complexing agents can be added here, e.g. Hydrazides (EP 0247792), [9], [10].
  • P.985s-988s The object of the invention is to mark immunoglobulin gently and selectively.
  • the object is achieved in that immunoglobulin is reacted with cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid derivatives (CMP-NeuNAc derivatives) which have been modified at positions 5 and / or 9 of the NeuNAc by a sialyltransferase.
  • CMP-NeuNAc derivatives cytidine-5'-monophospho-N-acetylneuraminic acid derivatives
  • the selectivity of the enzymes binds to oligosaccharide residues with the final structure ßGal- (1-4) -ßGlcNAc-, ßGal- (1-3) -ßGlcNAc-, ßGal- (1-3) - ⁇ GlcNAc-, ßGal- (1 -3) -ßGalNAc- or ⁇ NeuNAc- (2-3) -ßGal- (1-3) - ⁇ GlcNAc-, so that a change in the antigen-binding regions can be excluded.
  • the method according to the invention enables the labeling of immunoglobulins under particularly gentle reaction conditions, since the transfer takes place in aqueous buffer solutions and the addition of harmful chemicals such as e.g. Oxidizing or reducing agents is avoided.
  • the required saccharide structures are not or not contained in the immunoglobulin in sufficient quantities, either by cleaving off terminally bound NeuNAc by a neuraminidase or by addition of galactose from UDP-galactose by means of galactosyltransferase or by a combination of these methods, the amount of the addition of the NeuNAc- Derivatives required saccharide structures increased and thereby the markability of the immunoglobulin can be improved.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Human IgG was prepared analogously to Example 1. Inactive KI solution was added for the reaction with iodogen and then that
  • a human IgG solution was first galactosylated as in Example 3 and then desialylated as in Example 1. From this pretreated human IgG, 1.1 ⁇ g in 10 ⁇ l 50 mM phosphate buffer pH 7.0 reacted with 5 ⁇ l of a CMP-9- 131 I-diiodsalizoylamido-NeuNAc solution and with 10 mU ⁇ -2,3-sialyltransferase for 2 H. After the reaction mixture had been separated, a labeling yield of 41.4% was obtained.
  • Human IgG was prepared analogously to Example 1.
  • 1 ⁇ g of CMP-5-N- (salizoylaminoacetyl) -neuraminic acid was labeled using iodogen and separated by high performance liquid chromatography (HPLC) on an ion exchange column.
  • 100 ⁇ l of the fraction containing the CMP-5N-Monoiodsalizoylaminoacetyl-NeuNAc were mixed with 100 ⁇ l of the prepared IgG solution and with 10 mU ⁇ -2,6-sialyltransferase (EC 3.2.1.18).
  • samples were subjected to gel filtration and the radioactivity of the fractions was measured. After a reaction time of 45 minutes, yields of up to 66.6% were determined.
  • Human IgG was prepared analogously to Example 1. 500 ⁇ l of the prepared IgG solution were mixed with 20 ⁇ l of a solution containing 0.01 g / 1 CMP-9-fluoresceinylamido-NeuNAc and with 10 mU ⁇ -2,6-sialyltransferase (EC 3.2.1.18). After various reaction times, samples were subjected to gel filtration. After a reaction time of 150 minutes, yields of up to 89% were determined.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen, insbesondere von monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten. Die markierten Immunglobuline sind hinsichtlich ihrer Radioaktivität oder Farbintensität nachweisbar. Sie sind in der Medizin, vorzugsweise in der nuklearmedizinischen Diagnostik und Therapie, und in der Biochemie einsetzbar. Erfindungsgemäß werden NeuNAc-Derivative, die an den Positionen 5 und/oder 9 modifiziert wurden, an Oligosaccharidbestandteile des Immunglobulins durch eine Sialyltransferase gebunden. Die NeuNAc-Derivative liegen in aktiver Form, gebunden an CMP, vor. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Immunglobuline unter besonders schonenden Reaktionsbedingungen markiert. Der Zusatz von schädigenden Chemikalien wie z.B. Oxidations- oder Reduktionsmitteln wird vermieden. Mit hoher Selektivität werden die Immunglobuline nur an definierten Strukturen der Oligosaccharidketten modifiziert, so daß eine Veränderung der antigenbindenden Regionen ausgeschlossen werden kann.

Description

Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen, insbesondere von monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten. Die markierten Immunglobuline sind hinsichtlich ihrer Radioaktivität oder Farbintensität nachweisbar. Sie sind in der Medizin, vorzugsweise in der nuklearmedizinischen Diagnostik und Therapie, und in der Biochemie einsetzbar.
Radioaktiv markierte Immunglobuline besitzen in der Medizin und in der Biochemie eine wachsende Bedeutung, da sie durch die gute Detektierbarkeit von Radionukliden und die hohe Spezifität der Immunglobuline den Nachweis von sehr kleinen Stoff engen, z.B. in Radioimmunoassays oder in bildgebenden Verfahren, gestatten. Weiterhin können sie in der nuklearmedizinischen Therapie für innere Bestrahlungen, z.B. von Tumoren, eingesetzt werden. Für den Erfolg der Untersuchungen ist ein Markierungsverfahren erforderlich, das durch eine schonende Reaktion eine feste Bindung der radioaktiven Nuklide an den Immunglobulinen ermöglicht, ohne die Immunreaktivität der Immunglobuline zu beeinträchtigen.
Es sind verschiedene Markierungsverfahren bekannt, die auf Kopplungsreaktionen an funktioneilen Gruppen der Peptidketten von Immunglobulinen beruhen. Dabei erfolgt die Umsetzung z.B. von Aminogruppen des Immunglobulines mit bifunktionellen Substanzen. Diese Substanzen enthalten das radioaktive Nuklid oder nehmen es, z.B. durch Komplexierung, bei späterer Zugabe auf [1-4]. Aufgrund der weitgehend statistischen Verteilung der Kopplungsstellen über das Immunglobulin-Molekül wird jedoch auch in den antigenbindenden Regionen der Immunglobuline modifiziert und dabei die Immunreaktivität verändert.
Bei Verfahren, die auf der Kopplung an Sulfid-Gruppen beruhen, erfolgt eine Markierung außerhalb der antigenbindenden Regionen. Für diesen Reaktionsweg müssen jedoch Disulfid-Brücken des Immunglobulin-Moleküls durch Reduktion gespalten werden (z.B. DE-PS 2953674, [5]), wodurch die Tertiärstruktur des Moleküls verändert wird. In EP 0397213 wird z.B. die Umsetzung der dann erhaltenen SH-Gruppen mit Maleimiden beschrieben, del Rosario et al . [6,7] beschreiben ein Markierungsverfahren mit Iodacetyl- Verbindungen nach Spaltung der Disulfidbrücken mit Dithiothreitol .
Kopplungsverfahren an den Oligosaccharidketten sind für Markierungen gut geeignet, da bei diesen Verfahren die Bindungsstelle Immunglobulin/Radionuklid definiert ist und bekanntermaßen die Oligosaccharide für die Immunreaktivität des Moleküls geringe Bedeutung besitzen. Bisher bekannte Verfahren beruhen auf einer Oxidation des Im unglobulins, bei denen 0H- Gruppen der Oligosaccharide zu Aldehydgruppen umgesetzt werden. Unerwünschte Nebenreaktionen aufgrund der Oxidation sind jedoch dabei nicht auszuschließen. Van Lenten [8] beschreibt z.B. ein allgemeines Verfahren zur Oxidation von Glykoproteinen mit Natriumperiodat, die DE-OS 4115038 die Herstellung von Konjugaten auf diesem Wege. Da Aldehyd-Gruppen in natürlichen Immunglobulinen nicht vorkommen, lassen sich hier spezifisch bifunktionelle Komplexbildner anlagern, z.B. Hydrazide (EP 0247792) , [9], [10] .
[1] Kozak, R.W. et al . , (1986) Proc .Natl .Acad.Sei.USA 83,
S.474-478 [2] Hnatowich,D.J. et al. , (1983) Science 235, S.613-615 [3] Hnatowich,D.J. et al. , (1985) J.Nucl.Med 26, S.503-509 [4] Brechbiel,M.W. et al . , (1986) Inorg.Chem. 25, S.2772-2781 [5] Srivastava, P.C. et al . , (1989) NucCompact 20, S.145-149 [6] del Rosario, R.B. et al. , (1990) Cancer Research (Suppl.)
50, S.804s-808s [7] del Rosario, R.B. et al . , (1991) J. Nucl.Med. 32, S. 915 [8] Van Lenten, L. et al. , (1971) J.Biol.Chem. 246, S.1889-1894 [9] Saccavini, J.C. et al . , (1986) Nucl .Med.Biol . 13, S.191-194 [10] Si onsen, R.B. et al . , (1990) Cancer Research (Suppl.) 50,
S.985s-988s Aufgabe der Erfindung ist es, Immunglobulin schonend und selektiv zu markieren.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Immunglobulin mit Cytidin-5 '-monophospho-N-Acetylneuraminsäure- Derivaten (CMP-NeuNAc-Derivate) , die an den Positionen 5 und/oder 9 der NeuNAc modifiziert wurden, durch eine Sialyltransferase umgesetzt wird. Dabei werden aus den CMP- NeuNAc-Derivaten die NeuNAc-Derivate auf die Oligosaccharidreste transferiert.
Durch die Selektivität der Enzyme erfolgt die Bindung an Oligosaccharidresten mit der Endstruktur ßGal-( 1-4 )-ßGlcNAc-, ßGal-( 1-3)-ßGlcNAc-, ßGal-( 1-3)-αGlcNAc-, ßGal-( 1-3)-ßGalNAc- oder αNeuNAc-(2-3)-ßGal-( 1-3)-αGlcNAc-, so daß eine Veränderung der antigenbindenden Regionen ausgeschlossen werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren die Markierung von Immunglobulinen unter besonders schonenden Reaktionsbedingungen, da der Transfer in wäßrigen Pufferlösungen stattfindet und der Zusatz von schädigenden Chemikalien wie z.B. Oxidations- oder Reduktionsmitteln vermieden wird.
Sind die erforderlichen Saccharidstrukturen im Immunglobulin nicht oder in nicht genügender Menge enthalten, kann entweder durch Abspaltung von endständig gebundener NeuNAc durch eine Neuraminidase oder durch Anlagerung von Galaktose aus UDP- Galaktose mittels Galaktosyltransferase oder durch Kombination dieser Verfahren die Menge der für die Anlagerung der NeuNAc- Derivate erforderlichen Saccharidstrukturen erhöht und dadurch die Markierbarkeit des Immunglobulins verbessert werden.
In den Ansprüchen 4 bis 9 sind verschiedene modifizierte CMP- NeuNAc-Derivate genannt, die sich für das Verfahren eignen. Sie sind entweder bereits radioaktiv markiert (Anspruch 7) oder geeignet, Nuklide durch Komplexierung aufzunehmen (Ansprüche 5 und 6). Biotin (Anspruch 8) hat eine hohe Affinität zu Avidin bzw. Streptavidin, so daß eine Verbindung zwischen den mit Biotin markierten Immunglobulinen und radioaktiven Nukliden oder biochemisch aktiven Molekülen, z. B. Peroxidase, erreicht werden kann, so daß ein Nachweis durch Messung der Radioaktivität oder durch Bestimmung der Farbintensität möglich wird. Nach Anspruch 9 ist auch die Markierung mit Fluoreszein möglich.
Die Erfindung wird nachfolgend in mehreren Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
Beispiel 1
Eine Lösung von 2 mg human-Immunglobulin (IgG) in 2 ml 50 mM Acetatpuffer pH5,5 wurde mit 0,42 Einheiten immobilisierter Neuraminidase für lh versetzt. Nach lh erfolgte die Abtrennung der Neuraminidase durch Zentrifugation. 1 μg CMP-9- salizoylamido-NeuNAc wurde mit 131ι unter Verwendung von Iodogen markiert und über High Performance Liquid Chromatography (HPLC) auf einer Ionenaustauschersäule abgetrennt. 400 μl der Fraktion, die das CMP-9-13 I-monoiodsalizoylamido-NeuNAc enthält, wurden mit 400 μl der vorbereiteten human-IgG-Lösung und mit 40 mU α- 2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen. Dabei wurden nach etwa zweistündiger Reaktionszeit Ausbeuten bis zu 56,4 % für den Transfer der radioaktiven Substanz auf human-IgG ermittelt.
Beispiel 2
Human-IgG wurde analog Beispiel 1 vorbereitet. Für die Umsetzung mit Iodogen wurde inaktive KI-Lösung zugesetzt und das dann
1 -3 -I entstehende CMP-9- I-diiodsalizoylamido-NeuNAc mit HPLC wie im Beispiel 1 abgetrennt. 100 μl der Fraktion, die das CMP-g-1^1!- diiodsalizoylamido-NeuNAc enthält, wurden mit 50 l der vorbereiteten human-IgG-LÖsung und mit 20 mU α-2,6- Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen. Dabei wurden nach etwa zweistündiger Reaktionszeit Ausbeuten bis zu 41,3 % ermittelt.
Beispiel 3
4 mg human-IgG wurden mit 0,04 mU Galaktosyltransferase und 50 μg UDP-Galaktose in 2,3 ml Phosphatpuffer pH 8.5 umgesetzt. Nach lh erfolgte die Abtrennung des galaktosylierten Human-IgG durch HPLC über eine Ionenaustauschersäule mit NaCl-Gradienten. 5,4 μg galaktosyliertes human-IgG in 10 μl reagierten mit 5 μl einer
1 -i
Lösung, die CMP-9-XJ-LI-diiodsalizoylamido-NeuNAc enthielt, und 10 mU α-2,6-Sialyltransferase für 2 h. Nach einer Gelfiltration wurde eine Markierungsausbeute von 35 % ermittelt. Eine Vergleichsmessung mit nativem human-IgG ergab keine Markierung.
Beispiel 4
Eine human-IgG-Lösung wurde erst wie in Beispiel 3 galakto- syliert und dann wie in Beispiel 1 desialyliert. Von diesem vorbehandelten human-IgG reagierten 1,1 μg in 10 μl 50 mM Phophatpuffer pH 7,0 mit 5 μl einer CMP-9-131I- diiodsalizoylamido-NeuNAc-Lösung sowie mit 10 mU α-2,3- Sialyltransferase für 2 h. Nach Auftrennung des Reaktions¬ gemisches ergab sich eine Markierungsausbeute von 41,4 %.
Beispiel 5
Human-IgG wurde analog Beispiel 1 vorbereitet. 1 μg CMP-5-N- (Salizoylaminoacetyl)-neuraminsäure wurde unter Verwendung von Iodogen markiert und über High Performance Liquid Chromatography (HPLC) auf einer Ionenaustauschersäule abgetrennt. 100 μl der Fraktion, die das CMP-5N-Monoiodsalizoylaminoacetyl-NeuNAc enthält, wurden mit 100 μl der vorbereiteten IgG-Lösung und mit 10 mU α-2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen. Hierbei wurde nach einer Reaktionszeit von 45 Min Ausbeuten von bis zu 66,6 % ermittelt.
Beispiel 6
Human IgG wurde analog Beispiel 1 vorbereitet. 500 μl der vorbereiteten IgG-Lösung wurden mit 20 μl einer Lösung, die 0,01 g/1 CMP-9-Fluoreszeinylamido-NeuNAc enthält, und mit 10 mU α-2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen. Hierbei wurden nach einer Reaktionszeit von 150 Min Ausbeuten von bis zu 89 % ermittelt.
Abkürzungen
NeuNAc
IgG Immunglobulin
CMP Cytidinmonophosphat
HPLC High Performance Liquid Chromatography
UDP Uridindiphospho

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen oder deren Fragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß Immunglobulin mit Cytidin-5 '-monophospho-N-Acetylneuraminsäure-Derivaten (CMP- NeuNAc-Derivate) , die an den Positionen 5 und/oder 9 der NeuNAc modifiziert wurden, durch eine Sialyltransferase umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Immunglobulin zuvor mit Neuraminidase versetzt und das nach der Reaktionszeit abgetrennte Immunglobulin markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Immunglobulin zuvor mit Uridindiphosphogalaktose und Galaktosyltransferase versetzt und das nach der Reaktionszeit abgetrennte Immunglobulin markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß CMP- NeuNAc-Derivate verwendet werden, bei denen, ausgehend von der Struktur
Figure imgf000010_0001
wenigstens einer der natürlichen Reste
Figure imgf000010_0002
0
Figure imgf000010_0003
ersetzt wird, 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R-^, R2 durch 0
-NH-C-(CH2)k - [Y-(CH2)1]m
mit k,l,m,o: 1,2,3,4,5
X: -H, -CH3, -OH,-COOH,-NH2, -SH, -PO3H
Figure imgf000011_0001
ersetzt wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R-,, R2 durch 0
II
-NH-C-(CH2)n - CH-tCHa)!.!- Y - jCH2)p Y Y
I I
(CH2)p - Y - (CH2)1 mit l,o,p: 1,2,3,4,5 n: 0,1,2,3,4,5,6
X: -H, -CH3, -OH,-COOH,-NH2, -SH, -PO3H
Y: N-(CH9) -X, S, NH
I I I ersetzt wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R-^ R2 durch
Figure imgf000011_0002
n: 0,1,2,3,4,5,6
W: -I, -At, -Fl, -Cl, -Br
Z: -OH ersetzt wird. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R-^, R2 durch Biotin
Figure imgf000012_0001
ersetzt wird.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R-,, R durch Fluoreszein
Figure imgf000012_0002
ersetzt wird.
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