DE4426632A1 - Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen, insbesondere von monoklonalen Antikörpern oder deren Fragmenten. Die markierten Immunglobuline sind hinsichtlich ihrer Radioaktivität oder Farbintensität nachweisbar. Sie sind in der Medizin, vorzugsweise in der nuklearmedizinischen Diagnostik und Therapie, und in der Biochemie einsetzbar.

Radioaktiv markierte Immunglobuline besitzen in der Medizin und in der Biochemie eine wachsende Bedeutung, da sie durch die gute Detektierbarkeit von Radionukliden und die hohe Spezifität der Immunglobuline den Nachweis von sehr kleinen Stoffmengen, z. B. in Radioimmunoassays oder in bildgebenden Verfahren, gestatten. Weiterhin können sie in der nuklearmedizinischen Therapie für innere Bestrahlungen, z. B. von Tumoren, eingesetzt werden. Für den Erfolg der Untersuchungen ist ein Markierungsverfahren erforderlich, das durch eine schonende Reaktion eine feste Bindung der radioaktiven Nuklide an den Immunglobulinen ermöglicht, ohne die Immunreaktivität der Immunglobuline zu beeinträchtigen.

Es sind verschiedene Markierungsverfahren bekannt, die auf Kopplungsreaktionen an funktionellen Gruppen der Peptidketten von Immunglobulinen beruhen. Dabei erfolgt die Umsetzung z. B. von Aminogruppen des Immunglobulines mit bifunktionellen Substanzen. Diese Substanzen enthalten das radioaktive Nuklid oder nehmen es, z. B. durch Komplexierung, bei späterer Zugabe auf [1-4]. Aufgrund der weitgehend statistischen Verteilung der Kopplungsstellen über das Immunglobulin-Molekül wird jedoch auch in den antigenbindenden Regionen der Immunglobuline modifiziert und dabei die Immunreaktivität verändert.

Bei Verfahren, die auf der Kopplung an Sulfid-Gruppen beruhen, erfolgt eine Markierung außerhalb der antigenbindenden Regionen. Für diesen Reaktionsweg müssen jedoch Disulfid-Brücken des Immunglobulin-Moleküls durch Reduktion gespalten werden (z. B. DE-PS 29 53 674, [5]), wodurch die Tertiärstruktur des Moleküls verändert wird. In EP 0397213 wird z. B. die Umsetzung der dann erhaltenen SH-Gruppen mit Maleimiden beschrieben, del Rosario et al. [6, 7] beschreiben ein Markierungsverfahren mit Iodacetyl-Verbindungen nach Spaltung der Disulfidbrücken mit Dithiothreitol.

Kopplungsverfahren an den Oligosaccharidketten sind für Markierungen gut geeignet, da bei diesen Verfahren die Bindungsstelle Immunglobulin/Radionuklid definiert ist und bekanntermaßen die Oligosaccharide für die Immunreaktivität des Moleküls geringe Bedeutung besitzen. Bisher bekannte Verfahren beruhen auf einer Oxidation des Immunglobulins, bei denen OH-Gruppen der Oligosaccharide zu Aldehydgruppen umgesetzt werden. Unerwünschte Nebenreaktionen aufgrund der Oxidation sind jedoch dabei nicht auszuschließen. Van Lenten [8] beschreibt z. B. ein allgemeines Verfahren zur Oxidation von Glykoproteinen mit Natriumperiodat, die DE-OS 41 15 038 die Herstellung von Konjugaten auf diesem Wege. Da Aldehyd-Gruppen in natürlichen Immunglobulinen nicht vorkommen, lassen sich hier spezifisch bifunktionelle Komplexbildner anlagern, z. B. Hydrazide (EP 0247792), [9], [10].

[1] Kozak, R.W. et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, S. 474-478
[2] Hnatowich, D.J. et al., (1983) Science 235, S. 613-615
[3] Hnatowich, D.J. et al., (1985) J. Nucl. Med. 26, S. 503-509
[4] Brechbiel, M.W. et al., (1986) Inorg. Chem. 25, S. 2772-2781
[5] Srivastava, P.C. et al., (1989) NucCompact 20, S. 145-149
[6] del Rosario, R.B. et al., (1990) Cancer Research (Suppl.) 50, S. 804s-808s
[7] del Rosario, R.B. et al., (1991) J. Nucl. Med. 32, S. 915
[8] Van Lenten, L. et al., (1971) J. Biol. Chem. 246, S. 1889-1894
[9] Saccavini, J.C. et al., (1986) Nucl. Med. Biol. 13, S. 191-194
[10] Simonsen, R.B. et al., (1990) Cancer Research (Suppl.) 50, S. 985s-988s

Aufgabe der Erfindung ist es, Immunglobulin schonend und selektiv zu markieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Immunglobulin mit Cytidin-5′-monophospho-N-Acetylneuraminsäure- Derivaten (CMP-NeuNAc-Derivate), die an den Positionen 5 und/oder 9 der NeuNAc modifiziert wurden, durch eine Sialyltransferase umgesetzt wird. Dabei werden aus den CMP- NeuNAc-Derivaten die NeuNAc-Derivate auf die Oligosaccharidreste transferiert.

Durch die Selektivität der Enzyme erfolgt die Bindung an Oligosaccharidresten mit der Endstruktur βGal-(1-4)-βGlcNAc-, βGal-(1-3)-βGlcNAc-, βGal-(1-3)-αGlcNAc-, βGal-(1-3)-βGalNAc- oder αNeuNAc-(2-3)-βGal-(1-3)-αGlcNAc-, so daß eine Veränderung der antigenbindenden Regionen ausgeschlossen werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren die Markierung von Immunglobulinen unter besonders schonenden Reaktionsbedingungen, da der Transfer in wäßrigen Pufferlösungen stattfindet und der Zusatz von schädigenden Chemikalien wie z. B. Oxidations- oder Reduktionsmitteln vermieden wird.

Sind die erforderlichen Saccharidstrukturen im Immunglobulin nicht oder in nicht genügender Menge enthalten, kann entweder durch Abspaltung von endständig gebundener NeuNAc durch eine Neuraminidase oder durch Anlagerung von Galaktose aus UDP-Galaktose mittels Galaktosyltransferase oder durch Kombination dieser Verfahren die Menge der für die Anlagerung der NeuNAc-Derivate erforderlichen Saccharidstrukturen erhöht und dadurch die Markierbarkeit des Immunglobulins verbessert werden.

In den Ansprüchen 4 bis 9 sind verschiedene modifizierte CMP- NeuNAc-Derivate genannt, die sich für das Verfahren eignen. Sie sind entweder bereits radioaktiv markiert (Anspruch 7) oder geeignet, Nuklide durch Komplexierung aufzunehmen (Ansprüche 5 und 6). Biotin (Anspruch 8) hat eine hohe Affinität zu Avidin bzw. Streptavidin, so daß eine Verbindung zwischen den mit Biotin markierten Immunglobulinen und radioaktiven Nukliden oder biochemisch aktiven Molekülen, z. B. Peroxidase, erreicht werden kann, so daß ein Nachweis durch Messung der Radioaktivität oder durch Bestimmung der Farbintensität möglich wird. Nach Anspruch 9 ist auch die Markierung mit Fluoreszein möglich.

Die Erfindung wird nachfolgend in mehreren Ausführungsbeispielen näher beschrieben.

Beispiel 1

Eine Lösung von 2 mg human-Immunglobulin (IgG) in 2 ml 50 mM Acetatpuffer pH 5,5 wurde mit 0,42 Einheiten immobilisierter Neuraminidase für 1 h versetzt. Nach 1 h erfolgte die Abtrennung der Neuraminidase durch Zentrifugation. 1 µg CMP-9-salizoylamido-NeuNAc wurde mit ¹³¹I unter Verwendung von Iodogen markiert und über High Performance Liquid Chromatography (HPLC) auf einer Ionenaustauschersäule abgetrennt. 400 µl der Fraktion, die das CMP-9-¹³¹I-monoiodsalizoylamido-NeuNAc enthält, wurden mit 400 µl der vorbereiteten human-IgG-Lösung und mit 40 mU α-2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen. Dabei wurden nach etwa zweistündiger Reaktionszeit Ausbeuten bis zu 56,4% für den Transfer der radioaktiven Substanz auf human-IgG ermittelt.

Beispiel 2

Human-IgG wurde analog Beispiel 1 vorbereitet. Für die Umsetzung mit Iodogen wurde inaktive KI-Lösung zugesetzt und das dann entstehende CMP-9-¹³¹I-diiodsalizoylamido-NeuNAc mit HPLC wie im Beispiel 1 abgetrennt. 100 µl der Fraktion, die das CMP-9-¹³¹I-diiodsalizoylamido-NeuNAc enthält, wurden mit 50 µl der vorbereiteten human-IgG-Lösung und mit 20 mU α-2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen. Dabei wurden nach etwa zweistündiger Reaktionszeit Ausbeuten bis zu 41,3% ermittelt.

Beispiel 3

4 mg human-IgG wurden mit 0,04 mU Galaktosyltransferase und 50 µg UDP-Galaktose in 2,3 ml Phosphatpuffer pH 8.5 umgesetzt. Nach 1 h erfolgte die Abtrennung des galaktosylierten Human-IgG durch HPLC über eine Ionenaustauschersäule mit NaCl-Gradienten. 5,4 µg galaktosyliertes human-IgG in 10 µl reagierten mit 5 µl einer Lösung, die CMP-9-¹³¹I-diiodsalizoylamido-NeuNAc enthielt, und 10 mU α-2,6-Sialyltransferase für 2 h. Nach einer Gelfiltration wurde eine Markierungsausbeute von 35% ermittelt. Eine Vergleichsmessung mit nativem human-IgG ergab keine Markierung.

Beispiel 4

Eine human-IgG-Lösung wurde erst wie in Beispiel 3 galakto­ syliert und dann wie in Beispiel 1 desialyliert. Von diesem vorbehandelten human-IgG reagierten 1,1 µg in 10 µl 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 mit 5 µl einer CMP-9-¹³¹I-diiod­ salizoylamido-NeuNAc-Lösung sowie mit 10 mU α-2,3-Sialyltransferase für 2 h. Nach Auftrennung des Reaktions­ gemisches ergab sich eine Markierungsausbeute von 41,4%.

Beispiel 5

Human-IgG wurde analog Beispiel 1 vorbereitet. 1 µg CMP-5-N- (Salizoylaminoacetyl)-neuraminsäure wurde unter Verwendung von Iodogen markiert und über High Performance Liquid Chromatography (HPLC) auf einer Ionenaustauschersäule abgetrennt. 100 µl der Fraktion, die das CMP-5N-Monoiodsalizoylaminoacetyl-NeuNAc enthält, wurden mit 100 µl der vorbereiteten IgG-Lösung und mit 10 mU α-2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen und die Radioaktivität der Fraktionen gemessen. Hierbei wurde nach einer Reaktionszeit von 45 Min Ausbeuten von bis zu 66,6% ermittelt.

Beispiel 6

Human IgG wurde analog Beispiel 1 vorbereitet. 500 µl der vorbereiteten IgG-Lösung wurden mit 20 µl einer Lösung, die 0,01 g/l CMP-9-Fluoreszeinylamido-NeuNAc enthält, und mit 10 mU α-2,6-Sialyltransferase (EC 3.2.1.18) versetzt. Nach verschiedenen Reaktionszeiten wurden Proben einer Gelfiltration unterworfen. Hierbei wurden nach einer Reaktionszeit von 150 Min Ausbeuten von bis zu 89% ermittelt.

Abkürzungen

NeuNAc
IgG = Immunglobulin
CMP = Cytidinmonophosphat
HPLC = High Performance Liquid Chromatography
UDP = Uridindiphospho

Claims (9)

1. Verfahren zur Markierung von Immunglobulinen oder deren Fragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß Immunglobulin mit Cytidin-5′-monophospho-N-Acetylneuraminsäure-Derivaten (CMP- NeuNAc-Derivate), die an den Positionen 5 und/oder 9 der NeuNAc modifiziert wurden, durch eine Sialyltransferase umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Immunglobulin zuvor mit Neuraminidase versetzt und das nach der Reaktionszeit abgetrennte Immunglobulin markiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Immunglobulin zuvor mit Uridindiphosphogalaktose und Galaktosyltransferase versetzt und das nach der Reaktionszeit abgetrennte Immunglobulin markiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß CMP- NeuNAc-Derivate verwendet werden, bei denen, ausgehend von der Struktur wenigstens einer der natürlichen ResteR₁: -OH ersetzt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R₁, R₂ durch ersetzt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R₁, R₂ durch ersetzt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R₁, R₂ durch ersetzt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R₁, R₂ durch Biotin ersetzt wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß wenigstens einer der Reste R₁, R₂ durch Fluoreszein ersetzt wird.