DE69503994T2

DE69503994T2 - Verfahren zur herstellung von sialinsäure-derivaten und neue sialinsäure-derivate

Info

Publication number: DE69503994T2
Application number: DE69503994T
Authority: DE
Inventors: Takashi Japan Tobacco Inc. Yokohama-Shi Kanagawa-Ken 227 Ebata; Yasuhiro Okurayama Park Heights No.518 Yokohama-Shi Kanagawa-Ken 223 Kajihara; Hisashi Japan Tobacco Inc. Yokohama-Shi Kanagawa-Ken 227 Kodama
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-03-14
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2015-03-15
Also published as: WO1995025115A1; US5621086A; EP0698610A1; DE69503994D1; EP0698610B1; EP0698610A4; JP3831409B2

Description

Technisches Umfeld

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäure-Derivats sowie ein neues Sialinsäure-Derivat.

Stand der Technik

Eine Sialinsäure ist ein Zuckerrest, der an die Enden unterschiedlicher Zuckerketten gebunden ist, die auf Zelloberflächen vorhanden sind. Interzelluläre Wechselwirkungen werden durch die Sialinsäure und eine Substanz, die an die Sialinsäure binden kann, vermittelt. Beispielsweise ist bekannt, daß wenn ein Influenzavirus in einen lebenden Organismus eindringt, ein Protein (Hämagglutinin), das sich auf der Oberfläche eines Influenzavirus befindet, an eine Sialinsäure auf der Oberfläche eines Erythrozyten bindet und das Virus anschließend in das Erythrozyt eindringt.
Um eine Infektion mit Influenzaviren zu verhindern, wurde die folgende Methode vorgeschlagen. Bei dieser Methode läßt man ein Sialinsäureanalogon an einen Träger, wie beispielsweise eine Zelle oder eine künstliche Zelle, binden. Der Träger wird in einen lebenden Organismus gebracht, und die Viren können an die Sialinsäureanaloga auf den Trägern binden. Dadurch wird dann ein Binden der Viren an körpereigene Zellen des lebenden Organismus in vivo verhindert, wodurch einer Infektion mit den Viren vorgebeugt wird. Ferner können die Viren entfernt werden, indem man den Träger aus dem lebenden Organismus herausnimmt, nachdem die Viren daran gebunden haben. Gegenwärtig wird eine große Bandbreite therapeutischer Methoden untersucht, in denen Sialinsäuren verwendet werden.
Cytidin-5'-monophosphosialinsäure (im folgenden als "CMP-Sialinsäure" bezeichnet), dargestellt durch folgende Formel, dient bekanntermaßen als Sialinsäuredonor, wenn eine Sialinsäuretransferase (Sialyltransferase) aktiv ist. Die Sialinsäuretransferase überträgt die Sialinsäure von CMP-Sialinsäure (12) auf die Zuckerkette eines Sialinsäureakzeptors, wodurch Sialoside synthetisiert werden.
Es ist bekannt, daß oben beschriebene Sialoside verschiedene physiologische Funktionen ausüben. Zum Beispiel hat ein Sialosid, das als Gangliosid bekannt ist und an das ein Sialinsäurepolymer gebunden ist, Nervenwachstumsaktivität. Aus dem Vorangegangenen kann geschlossen werden, daß die CMP-Sialinsäure zur Synthese eines Antiviruswirkstoffs und eines Antidemenzwirkstoffs verwendet werden kann.
Daher ist es sehr nützlich, ein chemisch-synthetisches Verfahren zu entwickeln, um ein Sialinsäure-Derivat, die CMP-Sialinsäure, in großer Menge herzustellen. Bisher sind folgende Verfahren zur Herstellung von CMP-Sialinsäure bekannt.
(i) J. Am. Chem. Soc., 110 (1988), 7159-7163;
Eine Sialinsäure oder eine modifizierte Sialinsäure, nämlich ein Sialinsäureanalogon wird mit Cytidin-5'-triphosphat unter Verwendung von Cytidin-5'-monophosphosialinsäuresynthetase als Enzym kondensiert.
(ii) Tetrahedron Lett., 34, 1765, 1993;
Nachdem eine Abgangsgruppe an der 2-Position der Sialinsäure und eine Schutzgruppe an jeder der Hydroxygruppen der Sialinsäure eingeführt wird, wird die 2-Position der Sialinsäure durch den Phosphorsäureanteil von Cytidin-5'-monophosphat nucleophil ersetzt und anschließend die Schutzgruppe entfernt, wobei CMP-Sialinsäure erhalten wird (12).
(iii) Tetrahedron Lett., 34, 2775, 1993;
Nachdem einzelne Hydroxygruppen von Cytidin mit Allyloxycarbamat geschützt werden, wird Allyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit mit dem geschützten Cytidin zur Reaktion gebracht. Eine Allyl-N,N-1-diisopropylphosphoramiditgruppe wird dadurch an die 5-Position von Cytidin eingeführt. Als Ergebnis erhält man ein Cytidin-Derivat. Anschließend wird das Cytidin-Derivat mit einer Sialinsäure, deren Hydroxygruppe an der 2-Position geschützt ist und dessen andere Hydroxygruppen mit Allyloxycarbamat geschützt sind, kondensiert, wodurch ein Intermediat erhalten wird. Der Phosphorsäureteil des Intermediates wird oxidiert und die Schutzgruppe entfernt, wobei CMP- Sialinsäure (12) erhalten wird.
Allerdings wird bei der oben genannten Methode (i) die Kondensationsreaktion einiger Arten von Sialinsäureanaloga mit Cytidin-5'-triphosphat, die durch Cytidin-5'-monophosposialinsäuresynthetase vermittelt wird, aufgrund der Substratspezifität der Synthetase nicht ausgeführt. Außerdem ist Cytidin-5'-monophosphosialinsäuresynthetase teuer, wodurch hohe Herstellungskosten entstehen. Daher ist Methode (i) nicht zur industriellen Großproduktion von CMP-Sialinsäure und deren Analoga geeignet.
Die Reaktion der Methode (ii) erfordert vollständig wasserfreie Bedingungen. Weiterhin ist es schwierig, das Produkt zu reinigen.
Im Verfahren (iii) ist die Stufe, bei der die Hydroxygruppen mit Allyloxycarbamat geschützt werden, schwierig durchzuführen, und die Reinigung des Produkts ist schwierig. Da synthetisierte Intermediate der einzelnen Stufen nicht isoliert werden können, ist eine sehr sorgfältige Reinigung des Endprodukts erforderlich. Weiterhin ist ein sehr teurer Palladiumkatalysator erforderlich, um eine Schutzgruppe zu entfernen. Aus diesen Gründen ist Methode (iii) nicht zur industriellen Großproduktion geeignet.
Wie oben beschrieben ist jedes der konventionellen Verfahren zur Herstellung von CMP-Sialinsäure nicht zur industriellen Großproduktion geeignet. J. Am. Chem. Soc. 114, 8749 (1992)(S. 8748-8750) offenbart, daß eine Sialinsäure, bei der eine 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit-Gruppe an der 2-Position eingeführt wurde und bei der alle Hydroxygruppen mit Acetylgruppen geschützt sind, mit Cytidin, bei dem alle Hydroxygruppen außer der an der 5-Position mit einer Benzoylgruppe geschützt sind, kondensiert wird, wodurch eine kondensierte Verbindung erhalten wird. Dieses Dokument offenbart jedoch nicht, daß bei der erhaltenen kondensierten Verbindung die Schutzgruppe später entfernt wir, um die gewünschte CMP- Sialinsäure (12) zu erhalten.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die oben genannten Probleme gemacht. Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein geeignetes Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats zur industriellen Produktion sowie ein neues Sialinsäurederivat bereitzustellen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats (1) der folgenden Formel bereit:
wobei M eine Hydroxylgruppe oder eine Acetamidgruppe ist und A eine Gruppe der nachfolgenden Formel (2) oder (3) ist:
wobei n ein Ganzzahliges von 0, 1 oder darüber ist, M wie oben definiert ist, und B eine substituierte oder nicht substituierte Nucleinsäurebase ist, umfassend
Durchführen einer Kondensation zwischen einer Verbindung (4) oder einer Verbindung (5) der nachfolgenden Formeln in Gegenwart eines Säurekatalysators, wodurch ein Phosphitderivat (6) der nachfolgenden Formel erhalten wird,
wobei M' - OR&sub1; oder eine Acetamidgruppe bedeutet, R&sub1; und R&sub3; eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe sind und gleich oder unterschiedlich sein können, R&sub2; eine Alkylgruppe ist, und A' eine Gruppe der nachfolgenden Formeln (7) oder (8) ist:
wobei n ein Ganzzahliges von 0, 1 oder darüber ist, R&sub1; und M' wie oben definiert sind, und B' eine Nucleinsäurebase ist, deren Aminogruppe durch eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe geschützt ist
Oxidieren des Phosphitderivates (6) mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Phosphatderivat (9) der unten angegebenen Formel (9) erhalten wird:
wobei M', A', B' und R&sub1; bis R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen;
und Entfernen der Schutzgruppe vom Phosphatderivat (9) mit einem alkalischen Mittel, wodurch ein Sialinsäurederivat (1) erhalten wird:
wobei M', M, A, A', B, H' und R&sub1; bis R&sub3; die gleichen wie oben angegebenen Bedeutungen aufweisen.
In Übereinstimmung mit dem vorgenannten Verfahren haben die Erfinder erfolgreich ein neues Sialinsäurederivat (10) der nachstehenden Formel erhalten:
wobei M eine Hydroxylgruppe oder eine Acetamidgruppe ist, und X eine Gruppe der nachfolgenden Formel (11) ist:
wobei m ein Ganzzahliges von 0 bis 3 ist, M wie oben definiert ist, und B eine substituierte oder nicht substituierte Nucleinsäurebase darstellt.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
Bei dem Verfahren zur Herstellung der Sialinsäure der vorliegenden Erfindung wird Verbindung 4, welche ein Sialinsäureanalogon ist, deren Hydroxylgruppen außer der an der 2-Position individuell mit den Schutzgruppen R&sub1; geschützt sind, als erstes Ausgangsmaterial benutzt.
Gleichzeitig wird eine Carboxygruppe an der 1-Position mit der Schutzgruppe R&sub2; geschützt.
Das Sialinsäureanalogon, das hier verwendet wird, ist ein Sialinsäuremonomer der allgemeinen Formel (4), wobei A' durch die allgemeine Formel (7) oder ein Sialinsäurepolymer der allgemeinen Formel (4) dargestellt wird, wobei A' durch die allgemeine Formel (8) dargestellt wird.
Die Schutzgruppe R&sub1; einer Hydroxylgruppe ist eine Schutzgruppe, die durch Behandlung mit einem alkalischen Mittel entfernt werden kann. Insbesondere enthält die Schutzgruppe R&sub1; eine substituierte oder unsubstituierte Acylgruppe wie zum Beispiel Acetyl, Monochloracetyl, Benzoyl oder Pivaloyl und eine Silyl (SiR&sub3;-)-Gruppe wie zum Beispiel Trimethylsilyl, t-Hutyldimethylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl oder Triethylsilyl.
Die Schutzgruppe R&sub2; einer Carboxylgruppe kann durch Behandlung mit einem alkalischen Mittel in derselben Weise entfernt werden wie im Fall der Schutzgruppe R&sub1;. Beispiele für die Schutzgruppe R&sub2; enthalten eine Alkylgruppe wie Methyl, Ethyl oder Butyl.
Die Schutzgruppen R&sub1; und R&sub2; können mit Hilfe eines bekannten Verfahrens in eine Hydroxylgruppe und in eine Carboxylgruppe eingeführt werden.
Ein im Handel erwerbliches Sialinsäuremonomer und ein Sialinsäurepolymer können hierbei verwendet werden.
Eine Schutzgruppe wird in das Sialinsäuremonomer und in das Sialinsäurepolymer gemäß der Methode von Hasegawa et al. (Hasegawa; Ishida, H.; Kiso, M. J. Carbohydrate Chem. 1993, 12(3), 371-376) eingeführt, wodurch Sialinsäureanaloga erhalten werden. Wenn eine Schutzgruppe in das Sialinsäurepolymer eingeführt wird, wird ein intramolekularer Lactonring gebildet. Das Lacton wird bei einer später beschriebenen Alkalibehandlung wieder geöffnet.
Andererseits ist Verbindung (5), die als zweites Ausgangsmaterial verwendet wird, ein Ribonucleinsäurederivat. Bei dem Ribonucleinsäurederivat wurde an der 5-Position eine 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit-Gruppe eingeführt. N,N-Diisopropylphosphoramidit kann in eine im Handel erhältliche Ribonucleinsäure in einem organischem Lösungsmittel wie zum Beispiel Acetonitril oder Dichlormethan unter Verwendung von 2- Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit, Diisopropylamin und 1H-Tetrazol eingeführt werden.
Jede der Hydroxylgruppen des Ribonucleinsäurederivats wird durch die Schutzgruppe R&sub3;, die wie oben beschrieben ähnlich der Schutzgruppe R&sub1; ist, geschützt, und eine Aminogruppe dieser Nucleinsäurebase wird mit einer Acylgruppe oder einer Silylgruppe geschützt.
Beispiele für hier verwendete Nucleinsäurebasen sind Purinbasen wie Adenin und Guanin und Pyrimidinbasen wie Cytosin, Uracil und Thymin.
Die Kondensationsreaktion zwischen Verbindung (4) und Verbindung (5) wird in einem organischen Lösungsmittel wie Acetonitril, Dichlormethan, Tetrahydrofuran, Diethylether, Benzol, oder Dimethylformamid durchgeführt, vorzugsweise in einem polaren organischen Lösungsmittel bei tiefen Temperaturen, vorzugsweise im Temperaturbereich von -40 bis 25ºC in Gegenwart eines sauren Katalysators. Beispielsweise wird ein saurer Katalysator in das Reaktionsgemisch gegeben, während man die Temperatur niedrig hält. Anschließend läßt man die Reaktion weiterlaufen und erhöht dabei allmählich die Temperatur. Als saurer Katalysator wird vorzugsweise eine organische Säure verwendet. Die organische Säure umfaßt 1H-Tetrazol, DL-Camphersulfonsäure, Pyridinium-p-toluolsulfonat, p-Toluolsulfonylsäure (Tosylsäure) und ähnliches.
Insbesondere wird die Kondensationsreaktion zwischen Verbindung (4) und Verbindung (5) durch Zugabe von 1H-Tetrazol zu einem Gemisch der Verbindung (4) und der Verbindung (5) in dem vorher erwähnten organischem Lösungsmittel bei -40ºC gestartet und unter allmählicher Erhöhung der Temperatur auf Raumtemperatur fortgeführt.
Anschließend wird der Phosphatteil des Phosphitderivates (6), erhalten bei der vorher genannten Kondensationsreaktion, oxidiert, wobei ein Phosphatderivat (9) erhalten wird. Die Oxidation wird in einem organischen Lösungsmittel wie Acetonitril, Benzol oder Dimethylformamid bei z.B. 0 bis 25ºC in Gegenwart eines Oxidationsmittels in gleicher oder größerer Menge wie das Phosphitderivat durchgeführt. Als Oxidationsmittel kann t- Butylhydroperoxid oder Iod/Pyridin verwendet werden.
Die Entfernung der Schutzgruppe von dem Phosphatderivat (9) wird durch Behandlung mit einem alkalischen Mittel durchgeführt. Beispiele für alkalische Mittel, die dabei benutzt werden, sind Ammoniakwasser, Natriumcarbonat, Natriummethoxid, Natriumethoxid, 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]-7-undecen (DBU), 1,8- Diazabicyclo[5,4,0]-7-nonen (DBN), Triethylamin und Diisopropylamin.
Insbesondere wird die Alkalibehandlung in einer Einstufenreaktion unter Verwendung von Ammoniakwasser, Natriumcarbonat, Natriummethoxid oder Natriumethoxid in Wasser-Methanol bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die nachfolgenden Reaktionen, dargestellt durch folgendes Schema, können durchgeführt werden, um das Sialinsäurederivat (1) aus dem Phosphatderivat (9) zu erhalten; eine Cyanoethylgruppe wird von dem Phosphatderivat (9) unter Verwendung eines tertiären Amins E entfernt, wodurch ein Intermediat (I) erhalten wird, welches durch Alkalibehandlung weiter deacetyliert wird, wodurch ein Sialinsäurederivat (1) erhalten wird.
Bei diesen Reaktionen können DBU, DBN, Triethylamin und Diisopropylamin als tertiäre Amine E verwendet werden. Als alkalische Mittel können Ammoniakwasser, Natriumcarbonat, Natriummethoxid und Natriumethoxid verwendet werden. Eine Reihe dieser Reaktionen, dargestellt durch obiges Schema, werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Insbesondere wird die Cyanoethylgruppe des Phosphatderivats (9) unter Verwendung von DBU/THF entfernt, wobei Intermediat I erhalten wird. Intermediat I wird durch Behandlung mit einem Natriummethoxid deacetyliert, wodurch das Sialinsäurederivat (1) erhalten wird.
Da die Verbindungen, die in den einzelnen oben beschriebenen Stufen erhalten wurden, bei der folgenden Stufe ohne Reinigung verwendet werden können, kann dieses Herstellungsverfahren zur großindustriellen Synthese angewandt werden.
Das neue Sialinsäurederivat (10) ist eine zusammengelagerte Verbindung eines Sialinsäurepolymers und Ribonucleinsäure-5'- O-amidit und ist eine neue Verbindung, die nach dem Herstellungsverfahren des Sialinsäurederivats dieser Erfindung synthetisiert wurde. Das Sialinsäurepolymer besitzt eine Bindungsaffinität zu einer sialinsäurebindenden Substanz, beispielsweise zu einem Protein, nämlich Hämagglutinin, das in der Oberflächenschicht von Influenzaviren vorkommt. Man nimmt an, daß die Bindungsaktivität des Sialinsäurepolymers stärker als die eines Sialinsäuremonomers ist. Ebenso trägt das Sialinsäurepolymer zur Realisierung der therapeutischen Verwendung der Sialinsäure bei. Das neue Sialinsäurederivat (10) dieser Erfindung kann dazu verwendet werden, ein Sialinsäurepolymer in eine Zuckerkette einzuführen.

Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung

Im folgenden werden Beispiele der Erfindung im Detail beschrieben.
Beispiel 1 Herstellung von Cytidin-5'-monophosphosialinsäure (1a)

1.1 Synthese von Triacetylcytidin-5'-O-amidit (5a)

120 mg (331 umol) N&sup4;-2',3'-Acetylcytidin (Angew. Chem., 85(1), 43-44(1973)), 199 mg (662 umol) 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit und 67 mg (662 umol) Diisopropylamin wurden in 5,0 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Zu der erhaltenen Lösung wurden bei 0ºC 46 mg (662 umol) 1H-Tetrazol gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung mit Ethylacetat verdünnt. Die erhaltene organische Phase wurde wiederholt mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbönatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Waschen der organischen Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend aufkonzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in Chloroform (5 ml) aufgelöst, auf -78ºC gekühlt und in 100 ml Pentan gegeben. Das Präzipitat, das sich bei der vorherigen Stufe absetzt, wurde abfiltriert, wobei eine Mischung (1:1) (186 mg, 65%) von Diastereomeren erhalten wurde, deren asymmetrisches Zentrum das Phosphoratom des Triacetylcytidin-5'-O-amidit (5a) der folgenden Formel ist. Das Gemisch wurde ohne Reinigung in der folgenden Stufe verwendet.
wobei Ac eine Acetylgruppe ist. Im folgenden ist Ac so definiert.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (CDCl&sub3;)
δ 9,40 (bs, 1H, NH-4)
8,26, 8,24 (je d je 0,5 H, J = 7,6 Hz, H-6)
7,44 (d, 1H, H-5)
6,37, 6,30 (je d, je 0,5 H, J = 4,9 Hz, H-1')
5,47 - 5,36 (m, 2H, H-2', 3')
2,76(t, 1H, J = 6, 1 Hz, Cyanoethyl CH&sub2;)
2,25 (s, 3H, Ac)
2,11, 2,10, 2,07, 2,06(je s, je 1,5H, je, Ac)
1,28 - 1,24 (bs, 12H, Me)
³¹P-NMR (CDCl&sub3;) δ 150,51, 149,67 ppm

1.2 Synthese des Phosphits (6a)

40 mg (80,0 umol) Tetra-O-acetylsialinsäure (Chemische Berichte 1966, 99, 611-617))(4a) und 180 mg (300 umol) der Verbindung (5a), die in Stufe 1.1 synthetisiert wurde, wurden jeweils einer zweifachen azeotropen Destillation mit Toluol unterzogen. Jede der erhaltenen Lösungen wurde bis zur Trockene eingedampft. Die Rückstände beider Lösungen wurden vereinigt und in 2 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Die erhaltene Reaktionslösung wurde im Argongasstrom auf -40ºC abgekühlt. Anschließend wurden zu der Reaktionslösung 21 mg (300 umol) 1H-Tetrazol gegeben und es wurde 30 Minuten gerührt. Danach wurde die Temperatur der Reaktionslösung auf Raumtemperatur erhöht. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylacetat verdünnt. Die erhaltene organische Phase wurde mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Nachdem die organische Phase über wasserfreiem Ma gnesiumsulfat getrocknet wurde, wurde der erhaltene Rückstand durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Hexan : Aceton = 1:2) gereinigt, wodurch ein Diastereomerengemisch (1,6 : 1) des Phosphits der folgenden Formel (6a) in einer Ausbeute von 34 mg (44%) erhalten wurde. Das erhaltene Diastereomerengemisch wurde ohne Reinigung in der folgenden Stufe verwendet.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (CDCl&sub3;)
δ 10,00 (s, 0,38, H, NH-4)
8,99 (s, 0,62 H, NH-4)
8,07,(d, 0,38 H, J = 7,5 Hz, H-6)
7,81 (d, 0,62 H, J = 8,6 Hz, NH")
7,70 (d, 0,62 H, J = 7,5 Hz, H-6)
7,52 (d, 0,38 H, H-5)
7,45 (d, 0,62 H, J = 7,5 Hz, H-5)
6,87 (d, 0,38 H, J = 10,0 Hz, NH")
6,11 (d, 0,38 H, J = 4,7 Hz, H-1')
5,18 (m, 0,62 H, H-5")
3,87 (s, 1,14 H, Me)
4,50 (dd, 0,62 H, J = 2,4, 12,1 Hz, H-9")
3,85 (s, 1,86 H, Me)
2,70 (t, 1,24 H, J = 6,1 Hz, Cyanoethyl CH2)
2,50 (dd, 0,38 H, J = 4,4, 12,9 Hz, H-3" eq)
2,48 (dd, 0,62 H, J = 4,9, 12,9 Hz, H-3" eq)
2,23, 2,19, 2,14, 2,13, 2,03, 1,97, 1,94, 1,85
(je s Ac)
³¹P-NMR (CDCl&sub3;) δ 136,77, 134,28 ppm

1.3 Synthese des Phosphats (9a)

Nachdem 17 mg (17,6 umol) des Phosphits (6a), das in Stufe 1.2 erhalten wurde, in 1 ml Acetonitril gelöst wurde, wurden 33 ul t-Butylhydroperoxid bei Raumtemperatur zugegeben. 30 Minuten danach wurde die Reaktionslösung mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Das erhaltene Konzentrat wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Methanol. Ethylacetat = 1 : 9) gereinigt, wodurch das Phosphat (9a) (15 mg, 87%) der folgenden Formel erhalten wurde. Das erhaltene Phosphat (9a) war ein Gemisch (1,6 : 1) von Diastereomeren, deren asymmetrisches Zentrum ein Phosphoratom ist.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (CDCl&sub3;)
δ 9,29 (bs, 0,38, H, NH)
9,22 (bs, 0,62 H, NH)
7,69-7,56 (m, 2 H, H - 6 · 2, NHx2)
7,52 (d, 0,38 H, J = 7,5 Hz, H-5)
7,44 (d, 0,62 H, J = 7,4 Hz, H-5)
4,14 (dd, 0,62 H, J = 8,6, 12,0 Hz, H-9"a)
3,97 (dd, 0,38 H, J = 9,1, 12,2 Hz, H-9"a)
2,99 (dd, 0,38 H, J = 4,9, 13,7 Hz, H-3"e)
2,82 (t,2 H, J = 6,1 Hz, CH&sub2;)
2,65 (dd, 0,62 H, J = 4,8, 13,3 Hz, H-3"eq)
2,26, 2,24, 2,19, 2,18, 2,14, 2,13, 2,12, 2,11, 2,04, 1,99,
1,97, 1,96, 1,93, 1,85 (s, Ac)
³¹P-NMR (CDCl&sub3;) δ -7,61, - 8,44 ppm

1.4 Synthese von Cytidin-5'-monophosphosialinsäure (1a)

33 mg (33,7 umol) des in Stufe 1.3 des Beispiels 1 erhaltenen Phosphats (9a), wurden in 1,5 ml trockenem Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 91 mg (1,69 mmol) pulverförmiges Natriummethoxid gegeben, und es wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung betrug 12 oder mehr. Anschließend wurden 5 ml Wasser zu der erhaltenen Lösung gegeben, und die Lösung wurde für weitere 90 Minuten gerührt. Danach wurde die Reaktionslösung ohne weitere Behandlung lyophilisiert und mit Hilfe einer Gelfiltrationssäule (Sephadex G-15, Wasser, 4ºC) gereinigt. Anschließend wurden Fraktionen, die Cytidin-5'-monophosphosialinsäure (1a) enthielten, über ein Anionenaustauscherharz (AG 1-X8, Ameisensäuren-Typ) gegeben, um Cytidin-5'-monophosposialinsäure (1a) zu adsorbieren. Danach wurde dem Anionenaustauscherharz Wasser zugeführt, um Verunreinigungen wie anorganische Salze zu entfernen. Verbindung (1a) wurde dann von dem Anionenaustauscherharz mit Ammoniumcarbonat (Wasser→1M) eluiert, und das Eluat wurde lyophilisiert, wobei Verbindung (1a) in einer Ausbeute von 16 mg (75 %) erhalten wurde.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (D&sub2;O, 300 MHz, HOD = 4,81)
δ 7,97 (d, 1H, J = 7,6 Hz, H-6)
6,12 (d, 1H, J = 7,6 Hz, H-5)
5,98 (d, 1H, J = 4,4 Hz, H-1')
4,06 (ddd, 1H, J = 4,7, 10,9 Hz, H-4")
3,61 (dd, 1H, J = 6,3, 11,7 Hz, H-9"a)
3,44 (d, 1H, J = 9,4 Hz, H-7")
2,48 (dd, 1H, J = 4,7, 13,1 Hz, H-3"eq)
2,04 (s, 3H, Ac)
1,64 (ddd, 1H, J = 6,1, 13,1 Hz, 2-3" ax)
³¹P-NMR (D&sub2;O, H&sub3;PO&sub4; = 0,00 ppm) δ -4,43 ppm

Beispiel 2

73 mg (75 umol) des Phosphats (9a), das in Stufe 1.3 aus Beispiel 1 erhalten wurde, wurden in 1,0 ml Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung wurden 13,6 mg (90 umol) 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]-7-undecen (DBU) gegeben.
Nachdem die Lösung bei Raumtemperatur 5 Minuten ruhig stehengelassen wurde, wurden 40 mg (746 umol) Natriummethoxid und 0,7 bis 0,1 ml Methanol-Wasser zugegeben. Nachdem die Lösung 12 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wurde, wurde die Lösung lyophilisiert.
Der Rückstand wurde an einer Gelfiltrationssäule (Sephadex G- 15, 4ºC, Wasser) gereinigt, wodurch CMP-Sialinsäure (33 mg, 69 %) erhalten wurde.
Die physikalischen Daten des erhaltenen Produkts stimmen mit denen aus Beispiel 1, Stufe 1.4 überein.

Beispiel 4 Synthese von Cytidin-5'-monophosphodisialinsäuredimer (1b)

4.1 Synthese von Hexa-O-sialinsäuredimer (1b)

50 mg (21 umol) 2-Thiophenylsialinsäuredimer (13), erhalten durch Einführung einer Schutzgruppe in N-Acetylneuraminsäuredimer (α, 2→)(hergestellt von Nacalai Tesque; Handelsname), wurden in 0,5 ml Aceton-Wasser (20 : 1) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 9,5 mg (53 umol) N-Bromsuccinimid gegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung mit Ethylacetat verdünnt und mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Nachdem die organische Phase abgetrennt wurde, wurde diese über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Methanol Ethylacetat = 1 : 19) gereinigt, wobei Hexa-O-sialinsäuredimer (4b) (16 mg, 89%) erhalten wurde.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (CDCl&sub3;)
δ 5,76 (d, 1H, J = 10,4 Hz, NH)
5,43 (d, 1H, J = 10,4 Hz, NH)
3,89 (s, 3H, OMe)
2,45 (dd, 1H, J = 5,6, 13,3 Hz, H-3'eq)
2,34 - 2,25 (m, 2H, H-3 ax, 3eq)
2,18, 2,15, 2,08, 2,05, 1,94, 190
(je s, je 3H, Ac)
2,04 (s, 6H, Ac, · 2)

4.2 Synthese des Phosphits (6b)

21 mg (24,7 umol) Hexa-O-sialinsäuredimer (4b), das in Stufe 4.1 synthetisiert wurde und 97 mg (173 umol) Triacetylcytidin-5'-O-amidit (5a), das in Stufe 1.1 aus Beispiel 1 synthetisiert wurde, wurden jeweils einer 2-fachen azeotropen Destillation mit trockenem Toluol unterzogen. Jede der oben erhaltenen Lösungen wurde bis zur Trockene eingedampft. Die Rückstände beider Lösungen wurden vereinigt und in 1,4 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Diese Lösung wurde im Argongasstrom auf -40ºC gekühlt.
Anschließend wurden zu dieser Lösung 12 mg (173 umol) 1H-Tetrazol gegeben. Nach 30 Minuten Rühren wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylacetat verdünnt, und die erhaltene organische Phase wurde mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Nachdem die organische Phase über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet wurde, wurde der erhaltene Rückstand durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Hexan: Aceton = 1 : 3) gereinigt, wobei ein Diastereomeren gemisch (2 : 1) eines Phosphits (6b) der folgenden Formel in einer Ausbeute von 15 mg (47%) erhalten wurde. Das erhaltene Diastereomerengemisch wurde ohne Reinigung in der folgenden Stufe verwendet.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (CDCl&sub3;)
δ 9,30 (bs 1H, NH)
7,80 (d, 1H, J = 9,0 Hz, NH)
7,52, 7,45 (je d, Je 1H, J = 7,4 Hz, H-6, -5)
6,16 (bs, 1H, H-1')
5,95 (dd, 1H, J = 3,6, 6,6 Hz, H-2")
5,62 (t, 1H, J = 6,6 Hz, H-3')
3,89 (s, 3H, Me)
2,69 (t, 2H, J = 6,3 Hz, CH&sub2;)
2,51 (dd; 1H, J = 4,8, 13,0 Hz, H-3'''eq)
2,32, 2,25, 2,14, 2,12, 2,09, 2,05, 2,04, 1,98, 1,88 (je s, je 3H, Ac)
³¹P-NMR (CDCl&sub3;)δ 135,30, 133,52 ppm

4.3 Synthese des Phosphats (9b)

1,6 mg (1,2 umol) des Phosphits (6b), das in Stufe 4.2 erhalten wurde, wurde in 0,1 ml Acetonitril gelöst. Zu dieser Lösung wurden bei Raumtemperatur 20 ul t-Butylhydroperoxid gegeben. 10 Minuten später wurde die Reaktionslösung mit Ethylacetet verdünnt. Die erhaltene organische Phase wurde mit einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Die erhaltene konzentrierte Lösung wurde durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Methanol. Ethylacetat = 1 : 9) gereinigt, wodurch eine Phosphat (9b) der folgenden Formel in einer Ausbeute von 1,5 mg (94%) erhalten wurde. Das erhaltene Phosphat (9b) war ein Diastereomerengemisch, deren asymmetrisches Zentrum ein Phosphoratom ist.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (CDCl&sub3;)
δ 9,97 (bs, 1H, NH)
7,72 (d, 1H, J = 9,3 Hz, NH")
7,48, 7,44 (je d, 1H, J = 7,4 Hz, H-6, -5)
6,29 (bs, 1H, H-1')
5,94 (dd, 1H, J = 2,5, 6,6 Hz, H-2')
5,76 (t, 1H, J = 6,6 Hz, H-3')
3,92 (s, 3H, Me)
2,80 (t, 21H, J = 6,1 Hz, CH&sub2;)
2,60 (dd, 1H, J = 6,5, 14,8 Hz, H-3'''eq)
2,33, 2,26, 2,15, 2,14, 2,09, 2,04, 2,03, 2,00, 1.88 (je s, je 3H, Ac)
2,05 (s, 6H, Ac)
1,41 (dd, 1H, J = 11,5, 13,8 Hz, H-3"ax)
³¹P-NMR (CDCl&sub3;) δ 6,86 ppm

4.4 Synthese von Cytidin-5'-monophosphodisialinsäuredimer (1b)

22 mg (17 umol) des Phosphats (9b) das in Stufe 4.3 des Beispiels 4 erhalten wurde, wurden in 0,4 ml Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung wurden 3 mg (20 umol) 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]-7-undencen (DBU) gegeben.
Nachdem die Lösung 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen wurde, wurden 22 mg (407 umol) Natriummethoxid und 0,2 ml bis 0,4 ml Methanol-Wasser dazugegeben. Nachdem 12 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wurde, wurde die Lösung lyophilisiert. Der Rückstand wurde an einer Gelfiltrationssäule (Sephadex G-15, 4ºC, 1 mM NH&sub4;OH) gereinigt, wobei das CMP-Sialinsäuredimer (9 mg, 56%) erhalten wurde.
Physikalische Daten des erhaltenen Produkts:
¹H-NMR (D&sub2;O, 500 MHz, 50 mM NH&sub4;HCO&sub3;, HOD = 4,80)
δ 7,86 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H-6)
6,01 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H-5)
5,88 (d, 1H, J = 2,9 Hz, H-1')
2,64 (dd, 1H, J = 4,3, 12,6 Hz, H-3'''eq)
2,44 (dd, 1H, J = 4,7, 13,3 Hz, H-3'''eq)
1,98, 1,92 (je s, je 3H, Ac)
1,64 (dd, 1H, J = 12,1, 12,6 Hz, H-3'''ax)
1,59 (ddd, 1H, J = 2,7, 13,3 Hz, H-3"ax)
³¹P-NMR (D&sub2;O, H&sub3;PO&sub4; = 0,00 ppm) δ-5,48 ppm
Gemäß des Herstellungsverfahrens eines Sialinsäurederivats der vorliegenden Erfindung kann ein CMP-Sialinsäureanalogon erhalten werden, welches als Sialinsäuredonor verwendet werden kann, der unter Verwendung preiswerter Reagenzien an das nicht-reduzierende Ende einer Zuckerkette, die interzelluläre Wechselwirkungen in einem lebenden Organismus vermittelt, gebunden werden kann, und gleichzeitig kann ein Sialinsäurederivat in hoher Reinheit erhalten werden. Als Ergebnis kann eine industrielle Großproduktion des Sialinsäurederivates erreicht werden.
Weiterhin eignet sich das neue Sialinsäurederivat der vorliegenden Erfindung, um ein Sialinsäurepolymer in eine Zuckerkette einzuführen, und neue therapeutische Methoden können unter Verwendung des neuen Sialinsäurederivates verwirklicht werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats (1) der nachfolgenden Formel:

wobei M eine Hydroxylgruppe oder eine Acetamidgruppe ist und A eine Gruppe der nachfolgenden Formel (2) oder (3) ist:

wobei n ein Ganzzahliges von 0, 1 oder darüber ist, M wie oben definiert ist, und B eine substituierte oder nichtsubstituierte Nukleinsäurebase ist, umfassend:

Durchführen einer Kondensation zwischen einer Verbindung

(4) und einer Verbindung (5) der nachfolgenden Formeln in Gegenwart eines Säurekatalysators, wodurch ein Phosphitderivat (6) der nachfolgenden Formel erhalten wird,

wobei M'- OR&sub1; oder eine Acetamidgruppe bedeutet, R&sub1; und R&sub3; eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe sind und gleich oder unterschiedlich sein können, R&sub2; eine Alkylgruppe ist, und A' eine Gruppe der nachfolgenden Formeln (7) oder (8) ist:

wobei n ein Ganzzahliges von 0, 1 oder darüber ist, R&sub1; und M' wie oben definiert sind, und B' eine Nukleinsäurebase ist, deren Aminogruppe durch eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe geschützt ist;

Oxidieren des Phosphitderivats (6) mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Phosphatderivat (9) der unten angegebenen Formel (9) erhalten wird:

wobei M', A', B' und R&sub1; bis R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen;

und Entfernen der Schutzgruppe vom Phosphatderivat (9) mit einem alkalischen Mittel, wodurch ein Sialinsäurederivat (1) erhalten wird:

wobei M', M, A, A', B, B' und R&sub1; bis R&sub3; die gleichen wie oben angegebenen Bedeutungen aufweisen.

2. Verfahren zur Herstellung eines Sialinsäurederivats (1) der nachfolgenden Formel:

wobei M eine Hydroxylgruppe oder eine Acetamidgruppe ist, und A eine Gruppe der nachfolgenden Formeln (2) oder (3) ist:

wobei n ein Ganzzahliges von 0, 1 oder darüber ist, M die gleiche Bedeutung wie oben angegeben aufweist,

und B eine substituierte oder nicht substituierte Nukleinsäurenbase ist, umfassend:

Durchführen einer Kondensation zwischen einer Verbindung (4) und einer Verbindung (5) der nachfolgenden Formeln in Gegenwart eines Särekatalysators, wodurch ein Phosphitderivat (6) der nachfolgenden Formel erhalten wird,

wobei M'- OR&sub1; oder eine Acetamidgruppe bedeutet,

R&sub1; und R&sub3; eine Acylgruppe oder eine Silylgruppe sind und sie gleich oder unterschiedlich sein können,

R&sub2; eine Alkylgruppe ist,

A' eine Gruppe der nachfolgenden Formel (7) oder (8) be deutet:

wobei n ein Ganzzahliges von 0, 1 oder darüber bedeutet, R&sub1; und M' die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, und B' eine Nukleinsäurebase ist, deren Aminogruppe mit einer Acylgruppe oder einer Silylgruppe geschützt ist; Oxidieren des Phosphitderivats (6) mit einem Oxidationsmittel, wodurch ein Phosphatderivat (9) der nachfolgenden Formel erhalten wird,

wobei M', A', B' und R&sub1; bis R&sub3; die gleichen Bedeutungen wie oben angegeben aufweisen;

Entfernen der Schutzgruppe von der Cyanoethylgruppe des Phosphatderivats (9) mit einem tertiären Amin, wodurch ein Zwischenprodukt (I) erhalten wird,

wobei E ein tertiäres Amin bedeutet, M', A' und R&sub1; bis R&sub3; die gleichen Bedeutungen wie oben angegeben aufweisen; Deacylierung des Zwischenprodukts (I) mit einem Alkali, wodurch ein Sialinsäurederivat (1) erhalten wird,

wobei M', M, A, A', B, B', E, R&sub1; bis R&sub3; die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie sie oben angegeben sind.

3. Sialinsäurederivat (10) der nachfolgenden Formel:

wobei M eine Hydroxylgruppe oder Acetamidgruppe ist, und X eine Gruppe der nachfolgenden Formel (11) ist,

wobei m ein Ganzzahliges von 0 bis 3 ist, M die gleiche Bedeutung wie oben angegeben aufweist,

und B eine substituierte oder nicht-substituierte Nukleinsäurebase darstellt.