JP3831409B2 - シアル酸誘導体の製造方法および新規なシアル酸誘導体 - Google Patents
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Description
〔技術分野〕
本発明は、シアル酸誘導体の製造方法および新規なシアル酸誘導体に関する。
〔背景技術〕
シアル酸は、細胞表層にある多くの糖鎖末端に結合している糖残基である。このシアル酸と、このシアル酸に結合する物質により、細胞間の相互作用が行われている。例えば、インフルエンザウイルスが生体に侵入する際、インフルエンザウイルスの表層に存在する蛋白質（ヘマグルチニン）が、侵入する相手側の細胞表層のシアル酸に結合し、これに引き続いてインフルエンザウイルスの侵入が起こることが知られている。
そこで、次のようなインフルエンザ感染の予防方法が提案されている。すなわち、シアル酸類縁体を細胞または人工細胞のような担体に結合させる。この担体を生体内に存在させて、ウイルスを担体上のシアル酸類縁体に結合させる。これにより、生体内で本来の細胞とウイルスが結合するのが阻害され、ウイルス感染が予防できる。この後、ウイルスが結合した担体を生体外に除去することにより、ウイルスを除去することも可能である。現在、このようなシアル酸を利用した治療方法が多数研究されている。
下式に示されるシチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（以下、ＣＭＰ−シアル酸という）（１２）は、シアル酸転移酵素のシアル酸供与体として作用することが知られている。すなわち、シアル酸転移酵素により、ＣＭＰ−シアル酸（１２）からシアル酸がシアル酸受容体糖鎖に転移され、シアロシドが合成される。
このシアロシドは、様々な生理活性を有することが知られている。例えば、ガングリオシドとして知られるシアロシドには、シアル酸ポリマーが結合しており、神経成長作用を持つことが知られている。以上のことから、ＣＭＰ−シアル酸は、抗ウイルス剤、抗痴呆剤の合成に利用できることがわかる。
従って、ＣＭＰ−シアル酸に代表される、シアル酸誘導体を大量に合成することができる化学的合成方法を開発することは極めて有用である。従来、ＣＭＰ−シアル酸の製造方法としては、以下のような方法が報告されている。
（ｉ）J.Am.Chem.Soc.,110(1988),7159-7163；
シアル酸またはシアル酸を修飾したシアル酸類縁体およびシチジン−５’−トリフォフェートを、シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸シンセターゼを用いて酵素的に縮合する。
（ii）Tetrahedoron Lett., 34,1765,1993；
シアル酸の２位に脱離基を導入し、且つ、シアル酸の各水酸基に保護基を導入した後に、シチジン−５−モノフォスフェートのリン酸部分でシアル酸の２位を求核置換し、続いて保護基を脱保護してＣＭＰ−シアル酸（１２）を得る。
(iii)Tetrahedoron Lett.,34,2775,1993；
シチジンの各水酸基をアリルオキシカルバメートで保護した後、これにアリルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルフォスフォロジアミダイトを作用させて、シチジンの５’位にアリルＮ，Ｎ−１−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基を導入し、次いで、このシチジン誘導体と、２位の水酸基が保護され、且つ、他の水酸基がアリルオキシカルバメートで保護されたシアル酸とを縮合する。得られた中間体のリン酸部分を酸化し、さらに保護基を脱離し、ＣＭＰ−シアル酸（１２）を得る。
しかしながら、上記方法（ｉ）は、酵素の基質特異性のために、シアル酸類縁体の中の一部は、シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸シンセターゼによるシチジン−５’−トリフォスフェートとの縮合反応が進行しない。また、この酵素は高価であり、生産コストが高くなるので、上記方法（ｉ）は、ＣＭＰ−シアル酸およびその類縁体の工業的量産には適当でない。
また、上記方法（ii）は、反応に厳密な禁水条件を必要とする。また、生成物の精製が困難である。
また、上記方法（iii）は、水酸基をアリルオキシカルバメートで保護する工程が困難であり、且つ、生成物の精製が困難である。また、各工程の合成中間体を単離することができないので、最終結果物の精製を厳密に行う必要が生じる。さらに保護基の脱離に高価なパラジウム触媒を必要とする。これらの理由により、上記方法（iii）は工業的量産に適当でない。
以上説明したとおり、従来のＣＭＰ−シアル酸の製造方法はいずれも工業的量産に適するものではない。J.Am.chem.Soc.114,8749(1992)(p.8748〜8750）には、その２位に２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基が導入され、且つ、各水酸基がアセチル基で保護されたシアル酸と、５位を除く各水酸基がベンゾイル基で保護されたシチジンとを縮合して、縮合体を得ることが開示されている。しかしながら、得られた縮合体から、脱保護により目的のＣＭＰ−シアル酸（１２）を得ることまでには至っていない。
〔発明の開示〕
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、工業的生産に適したシアル酸誘導体の製造方法および新規なシアル酸誘導体を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、
下式で示されるシアル酸誘導体（１）の製造方法であって、
［式中、Ｍは、水酸基またはアセトアミド基であり、
Ａは、下式（２）に示される基または下式（３）で示される基であり、
（式中、ｎは０または１以上の整数であり、Ｍは上述と同じ意味を表す）
Ｂは、置換または非置換の核酸塩基である。］
下式で示される化合物（４）および化合物（５）を酸触媒存在下で縮合させて、下式で示されるフォスファイト誘導体（６）を得る工程と、
［式中、Ｍ’は、−ＯＲ1またはアセトアミド基を示し、
Ｒ1およびＲ3は、アシル基またはシリル基であって、互いに同じでも異なっていても良く、
Ｒ2はアルキル基であり、
Ａ’は、下式（７）で示される基、または下式（８）で示される基を示し、
（式中、ｎは０または１以上の整数を示し、Ｒ1、Ｍ’は上述と同じ意味を表す）
Ｂ’は、アミノ基がアシル基またはシリル基で保護された核酸塩基である。］
前記フォスファイト誘導体（６）を酸化剤で酸化し、下式で示されるフォスフェート誘導体（９）を得る工程と、
（式中、Ｍ’，Ａ’，Ｂ’，Ｒ1〜Ｒ3３は、上述と同じ意味を表す。）
前記フォフェート誘導体（９）を塩基で脱保護して、前記シアル酸誘導体（１）を得る工程とを具備することを特徴とするシアル酸誘導体の製造方法を提供する。
（式中、Ｍ’，Ｍ，Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｒ1〜Ｒ3は、上述と同じ意味を表す。）
また、本発明者は、上述の製造方法に従って、下式で示される新規なシアル酸誘導体（１０）を得ることに成功した。
［式中、Ｍは、水酸基またはアセトアミド基であり、
Ｘは、一般式（１１）で示される基であり、
（式中、ｍは０〜３の整数であり、Ｍは上述と同じ意味を表す）
Ｂは、置換または非置換の核酸塩基である。］
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明のシアル酸の製造方法において、第１の出発原料である化合物（４）は、シアル酸類縁体であって、２位の水酸基を除き、各水酸基が保護基Ｒ1で保護されている。これと同時に、１位のカルボキシル基が保護基Ｒ2で保護されている。
ここで、シアル酸類縁体とは、一般式（４）中のＡ’が一般式（７）で示される基である場合のシアル酸単量体や、Ａ’が一般式（８）で示される場合のシアル酸ポリマーである。
水酸基の保護基Ｒ1には、塩基処理により脱離される保護基が用いられる。具体的には、保護基Ｒ1は、例えば、アセチル、モノクロロアセチル、ベンゾイル、ピバロイルのような非置換または置換のアシル基、または、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリエチルシリルのようなシリル（ＳｉＲ3）基である。
また、カルボキシル基の保護基Ｒ2は、保護基Ｒ1と同様に、塩基処理により脱離されるものであり、例えば、メチル、エチル、ブチルのようなアルキル基である。
このような水酸基およびカルボキシル基への保護基Ｒ1，Ｒ2の導入は、公知の方法により行うことができる。
シアル酸モノマーおよびシアル酸ポリマーは、市販されているものを利用できる。これらを、長谷川らの方法（Hasegawa, A.;Ishida,H.;Kiso,M.J.Carbohydrate Chem. 1993, 12(3),371-376)に従って、保護基を導入することによりシアル酸類縁体が得られる。シアル酸ポリマーへの保護基の導入を行うと、分子内ラクトンが形成されるが、このラクトンは後述の塩基処理工程において再び開環される。
一方、第２の出発物質である化合物（５）は、リボ核酸誘導体である。このリボ核酸誘導体は、５位に２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基が導入されている。かかるアミダイド化は、例えば、市販のリボ核酸に対して、アセトニトリルまたはジクロロメタンのような有機溶媒中で、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルフォスフォロジアミダイト、ジイソプロピルアミン、１Ｈ−テトラゾールを用いて行うことができる。
また、リボ核酸誘導体の各水酸基が、上述の保護基Ｒ1と同様の保護基Ｒ3で保護され、かつ、その核酸塩基のアミノ基がアシル基またはシリル基で保護されている。
ここで、核酸塩基とは、例えば、アデニン、グアニンのようなプリン塩基、および、例えば、シトシン、ウラシル、チミンのようなピリミジン塩基である。
化合物（４）および化合物（５）の縮合反応は、アセトニトリル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ベンゼン、ジメチルホルムアミドのような有機溶媒、好ましくは極性有機溶媒中で、低温、好ましくは−４０〜２５℃の温度範囲で、酸触媒の存在下行われる。例えば、酸触媒を加えるときは低温とし、徐々に昇温しながら反応を進行させる。ここで使用できる酸触媒は、有機酸が好ましく、例えば、１Ｈ−テトラゾール、ＤＬカンファ−スルホン酸、ピリジウム−ｐ−トルエンスルフォネート、ｐ−トルエンスルホニル酸（トシル酸）等を用いることができる。
化合物（４）および化合物（５）の縮合反応は、より具体的には、上記有機溶媒中で、−４０℃で、１Ｈ−テトラゾールを加えて反応を開始し、徐々に室温に戻しながら行う。
上述の縮合反応により得られたフォスファイト誘導体（６）は、次いで、そのリン酸部分が酸化され、その結果、フォスフェート誘導体（９）が得られる。この酸化は、例えば、アセトニトリル、ベンゼン、ジメチルホルムアミドのような有機溶媒中で、例えば、０〜２５℃で、フォスファイト誘導体（６）と等量または少過剰の酸化剤の存在下で行われる。酸化剤としては、例えば、ｔ−ブチルヒドロパーオキシド、ヨウ素／ピリジンを用いることができる。
フォスフェート誘導体（９）からの保護基の脱離は、塩基処理により行われる。ここで使用される塩基は、例えば、アンモニア水、炭酸ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、1,8-ジアザビシクロ［5,4,0］-7-ウンデセン（ＤＢＵ）、1,8-ジアザビシクロ［5,4,0］-7-ノネン（ＤＢＮ）、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミンが挙げられる。
より具体的には、塩基処理は、例えば、アンモニア水、炭酸ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドにより、水−メタノール中で室温において、１段階で行われる。
また、フォスフェート誘導体（９）からシアル酸誘導体（１）を得るために、下式で示されるように、まず、三級アミンＥを用いてシアノエチル基を脱離させて、中間体（Ｉ）を得る。次いで、中間体（Ｉ）を塩基処理して脱アセチル化を行ない、シアル酸誘導体（１）を得ることもできる。
ここで、三級アミンＥとしては、例えば、ＤＢＵ、ＤＢＮ、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミンを用いることができる。また、塩基としては、例えば、アンモニア水、炭酸ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドが使用可能である。これらの一連の反応は室温において行われる。
さらに具体的に説明すると、例えば、ＤＢＵ／ＴＨＦを用いて、フォスフェート誘導体（９）のシアノエチル基を脱離させて中間体Ｉを得る。次に、中間体Ｉをナトリウムメトキシドで処理して脱アセチル化を行なうことにより、シアル酸誘導体（１）が得られる。
以上説明した各工程で得られる化合物は、精製することなく次の工程に用いることができ、大量合成に応用できる。
また、新規なシアル酸誘導体（１０）は、シアル酸ポリマーとリボ核酸−５’−Ｏ−アミダイドとの縮合体であり、本発明のシアル酸誘導体の製造方法により合成された新規化合物である。シアル酸ポリマーは、シアル酸単量体に比べ、シアル酸結合性物質、例えば、インフルエンザウイルスの表層に存在する蛋白質であるヘマグルチニン、との結合活性が強いと考えられる。このように、シアル酸ポリマーは、シアル酸の治療学的使用の実現に貢献し得るものであり、本発明の新規なシアル酸誘導体（１０）は、シアル酸ポリマーの糖鎖への導入に有用である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、本発明の実施例を詳細に説明する。
実施例１ シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）の製造
１．１ トリアセチルシチジン−５’−Ｏ−アミダイト（５ａ）の合成
Ｎ4−２’，３’−アセチルシチジン（Angew. chem., 85(1),43-44(1973)）１２０ｍｇ（３３ｌμｍｏｌ）、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルフォスフォロアミダイト１９９ｍｇ（６６２μｍｏｌ）、および、ジイソプロピルアミン６７ｍｇ（６６２μｍｏｌ）を、無水アセトニトリル５．０ｍｌに溶解した。得られた溶液に、０℃で１Ｈ−テトラゾール４６ｍｇ（６６２μｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を、飽和重曹水及び水で順次洗浄した。洗浄後の有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。得られた残留物をクロロホルム（５ｍｌ）に溶解し、−７８℃に冷却し、ペンタン１００ｍｌ中にそそぎ入れた。析出した沈殿物を濾別して、下式で示されるトリアセチルシチジン−５’−Ｏ−アミダイト（５ａ）のリン原子を不斉中心とするジアステレオマー混合物（１：１）（１８６ｍｇ，６５％）を得た。このジアステレオマー混合物は精製することなく以下の工程で使用した。
（式中、Ａｃはアセチル基を示す。以下同じ）
得られた生成物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.40(bs,1H,NH-4)
8.26,8.24(each d,each 0.5H,J=7.6Hz,H-6)
7.44(d,1H,H-5)
6.37,6.30(each d,each 0.5H,J=4.9Hz,H-1')
5.47-5.36(m,2H,H-2',3')
2.76(t,1H,J=6.1Hz,cyanoethyl CH2)
2.25(s,3H,Ac)
2.11,2.10,2.07,2.06(each s,each 1.5H,each Ac)
1.28-1.24(bs,12H,Me)
31P-NMR(CDCl3) δ 150.51,149.67ppm
１．２ フォスファイト（６ａ）の合成
テトラ−Ｏ−アセチルシアル酸(Chemische Berichte 1966,99,611-617)（４ａ）４０ｍｇ（８０．０μｍｏｌ）および工程１．１で合成した化合物（５ａ）１８０ｍｇ（３００μｍｏｌ）を、それぞれ乾燥トルエンを用いて２回共沸した。各々の溶液をエバポレートして乾固し、それぞれの残留物を合わせて無水アセトニトリル２ｍｌに溶解した。この反応溶液を、アルゴンガス気流下、−４０℃に冷却した。次いで、この溶液に1H−テトラゾール２１ｍｇ（３００μｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した後に、室温に戻した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、その有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝１：２）で精製し、下式で示されるフォスファイト（６ａ）のジアステレオマー混合物を（１．６：１）を得た（３４ｍｇ，４４％）。得られたジアステレオマー混合物は精製することなく以下の工程で使用した。
得られた生成物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(CDCl3)
δ 10.00(s,0.38H,NH-4)
8.99(s,0.62H,NH-4)
8.07(d,0.38H,J=7.5Hz,H-6)
7.81(d,0.62H,J=8.6Hz,NH")
7.70(d,0.62H,J=7.5Hz,H-6)
7.52(d,0.38H,H-5)
7.45(d,0.62H,J=7.5Hz,H-5)
6.87(d,0.38H,J=10.0Hz,NH")
6.11(d,0.38H,J=4.7Hz,H-1')
5.18(m,0.62H,H-5")
3.87(s,1.14H,Me)
4.50(dd,0.62H,J=2.4,12.1Hz,H-9")
3.85(s,1.86H,Me)
2.70(t,1.24H,J=6.1Hz,cyanoethyl CH2)
2.50(dd,0.38H,J=4.4,12.9Hz,H-3"eq)
2.48(dd,0.62H,J=4.9,12.8Hz,H-3"eq)
2.23,2.19,2.14,2.13,2.03,1.97,1.94,1.85(each s,Ac)
31P-NMR(CDCl3) δ 136.77,134.28ppm
１．３ フォスフェート（９ａ）の合成
工程１．２で得られたフォスファイト（６ａ）１７ｍｇ（１７．６μｍｏｌ）をアセトニトリル１ｍｌに溶解した後、この溶液に、室温でｔ−ブチルヒドロパーオキシド３３μｌを添加した。３０分間経過後、反応溶液を酢酸エチルに希釈し、この有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル＝１：９）で精製し、下式で示されるフォスフェート（９ａ）を得た（１５ｍｇ，８７％）。得られたフォスフェート（９ａ）は、リン原子を不斉中心とするジアステレオマー混合物（１．６：１）であった。
得られた生成物の物理的データは以下のとおりである。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.29(bs,0.38H,NH)
9.22(bs,0.62H,NH)
7.69-7.56(m,2H,H-6x2,NHx2)
7.52(d,0.38H,J=7.5Hz,H-5)
7.44(d,0.62H,J=7.4Hz,H-5)
4.14(dd,0.62H,J=8.6,12.0Hz,H-9"a)
3.97(dd,0.38H,J=9.1,12.2Hz,H-9"a)
2.99(dd,0.38H,J=4.9,13.7Hz,H-3"e)
2.82(t,2H,J=6.1Hz,CH2)
2.65(dd,0.62H,J=4.8,13.3Hz,H-3"eq)
2.26,2,24,2.19,2.18,2.14,2.13,2.12,2.11,2.04,1.99,1.97,1.96,1.93,1.85(s,Ac)
31P-NMR(CDCl3) δ-7.61,-8.44ppm
１．４ シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）の合成
実施例１の工程１．３で得られたフォスフェート（９ａ）３３ｍｇ（３３．７μｍｏｌ）を乾燥メタノール１．５ｍｌに溶解し、この溶液に粉末のナトリウムメトキシド（９１ｍｇ，１．６９ｍｍｏｌ）を加え室温で９０分間撹拌した。得られた溶液のpHは１２以上であった。続いてこの溶液に水５ｍｌを加えさらに９０分間撹拌した。その後、反応溶液をそのまま凍結乾燥し、ゲルろ過カラム（Sephadex G-15,水，４℃）で精製した。シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）を含むフラクションを陰イオン交換樹脂（ＡＧ １−Ｘ８、ギ酸型）に通して、下式に示すシチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）を吸着させた。この後、この陰イオン交換樹脂に水を流して、無機塩等の不純物を除いた。次に、炭酸アンモニウム（水→１Ｍ）で陰イオン交換樹脂から化合物（１ａ）を溶出させ、この溶出液を凍結乾燥して化合物（１ａ）を得た（１６ｍｇ，７５％）。
得られた生成物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(D2O,300MHz,HOD=4.81)
δ 7.97(d,1H,J=7.6Hz,H-6)
6.12(d,1H,J=7.6HZ,H-5)
5.98(d,1H,J=4.4Hz,H-1')
4.06(ddd,1H,J=4.7,10.9Hz,H-4")
3.61(dd,1H,J=6.3,11.7Hz,H-9"a)
3.44(d,1H,J=9.4Hz,H-7")
2.48(dd,1H,J=4.7,13.1Hz,H-3"eq)
2.04(s,3H,Ac)
1.64(ddd,1H,J=6.1,13.1Hz,H-3"ax)
31P-NMR(D2O,H3PO4=0.00ppm) δ-4.43ppm
実施例２
実施例１の工程１．３で得られたフォスフェート（９ａ）(73mg,75μmol)をテトラヒドロフラン(1.0ml)に溶解し、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン（ＤＢＵ）(13.6mg,90μmol)を加え、次いで室温で５分間放置した後、ナトリウムメトキシド(40mg,746μmol)、メタノール−水(0.7ml-1.4ml)を加えた。室温で１２時間放置した後、凍結乾燥した。残留物をゲル濾過カラム（Sephadex G-15,4℃、水）で精製し、ＣＭＰ−シアル酸(33mg,69%)を得た。
得られた生成物の物理的データは実施例１の工程１．４の場合と一致した。
実施例4 シチジン−５’−モノフォスフォジシアル酸ダイマー（１ｂ）の合成
４．１ ヘキサ−Ｏ−シアル酸ダイマー（４ｂ）の合成
上述の長谷川らの方法に従って、Ｎ−アセチルノイラミン酸ダイマー（α，２→）（ナカライテスク社製；商品名）に保護基を導入した下式で示す２−チオフェニルシアル酸ダイマー（１３）５０ｍｇ（２１μｍｏｌ）を、アセトン−水（２０：１、０．５ｍｌ）に溶解した。この溶液に、０℃でＮ−ブロモスクシンイミド９．５ｍｇ（５３μｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を分取した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル＝１：１９）により精製し、下式で示すヘキサ−Ｏ−シアル酸ダイマー（４ｂ）（１６ｍｇ，８９％）を得た。
得られた生成物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(CDCl3)
δ 5.76(d,1H,J=10.4Hz,NH)
5.43(d,1H,J=10.4Hz,NH)
3.89(s,3H,0Me)
2.45(dd,1H,J=5.6,13.3Hz,H-3'eq)
2.34-2.25(m,2H,H-3ax,3eq)
2.18,2.15,2.08,2.05,1.94,190(each s,each 3H,Ac)
2.04(s,6H,Ac x 2)
４．２ フォスファイト（６ｂ）の合成
工程４．１で合成したヘキサ−Ｏ−シアル酸ダイマー（４ｂ）２１ｍｇ（２４．７μｍｏｌ）および実施例１の工程１．１で合成したトリアセチルシチジン−５’−Ｏ−アミダイト（５ａ）９７ｍｇ（１７３μｍｏｌ）を、夫々別に乾燥トルエンを用いて２回共沸した。各々の溶液をエバポレートして乾固し、それぞれの残留物を合わせて無水アセトニトリル１．４ｍｌに溶解した。この溶液を、アルゴンガス気流下、−４０℃に冷却した。次いで、この溶液に１Ｈ−テトラゾール１２ｍｇ（１７３μｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した後に、室温に戻した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、その有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝１：３）で精製し、下式で示されるフォスファイト（６ｂ）のジアステレオマー混合物（２：１）を得た（１５ｍｇ，４７％）。得られたジアステレオマー混合物は精製することなく以下の工程で使用した。
得られた生成物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.30(bs,1H,NH)
7.80(d,1H,J=9.0Hz,NH)
7.52,7.45(each d,each 1H,J=7.4Hz,H-6,-5)
6.16(bs,1H,H-1')
5.95(dd,1H,J=3.6,6.6Hz,H-2")
5.62(t,1H,J=6.6Hz,H-3')
3.89(s,3H,Me)
2.69(t,2H,J=6.3Hz,CH2)
2.51(dd,1H,J=4.8,13.0Hz,H-3'''eq)
2.32,2.25,2.14,2.12,2.09,2.05,2.04,1.98,1.88(each s,each 3H,Ac)
31P-NMR(CDCl3) δ 135.30,133.52ppm
４．３ フォスフェート（９ｂ）の合成
工程４．２で得られたフォスファイト（６ｂ）１．６ｍｇ（１．２μｍｏｌ）をアセトニトリル０．１ｍｌに溶解した後、この溶液に、室温でｔ−ブチルヒドロパーオキシド２０μｌを添加した。１０分間経過後、反応溶液を酢酸エチルに希釈し、この有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル＝１：９）で精製し、下式で示されるフォスフェート（９ｂ）を得た（１．５ｍｇ，９４％）。得られたフォスフェート（９ｂ）は、リン原子を不斉中心とするジアステレオマー混合物であった。
得られた生成物の物理的データは以下のとおりである。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.97(bs,1H,NH)
7.72(d,1H,J=9.3Hz,NH")
7.48,7.44(each d,1H,J=7.4Hz,H-6,-5)
6.29(bs,1H,H-1')
5.94(dd,1H,J=2.5,6.6Hz,H-2')
5.76(t,1H,J=6.6Hz,H-3')
3.92(s,3H,Me)
2.80(t,21H,J=6.1Hz,CH2)
2.60(dd,1H,J=6.5,14.8Hz,H-3'''eq)
2.33,2.26,2.15,2.14,2.09,2.04,2.03,2.00,1.88(each s,each 3H,Ac)
2.05(s,6H,Ac)
1.41(dd,1H,J=11.5,13.8Hz,H-3"ax)
31P-NMR(CDCl3) δ-6.86ppm
４．４ シチジン−５’−モノフォスフォジシアル酸ダイマー（１ｂ）の合成
実施例４の工程４．３で得られたフォスファイト（９ｂ）(22mg,17μmol)を、テトラヒドロフラン(0.4ml)に溶解し、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン（ＤＢＵ）(3mg,20μmol)を加え、次いで室温で５分間放置した後、ナトリウムメトキシド(22mg,407μmol)、メタノール−水(0.2ml-0.4ml)を加えた。室温で１２時間放置した後、凍結乾燥した。残留物をゲルろ過カラム（Sephadex G-15,，４℃、1mM NH4OH）により精製し、CMP-シアル酸ダイマー(9mg，56％)を得た。
得られた生成物の物理的でデータは以下の通りである。
1H-NMR(D2O,500MHz,50mM NH4HCO3,HOD=4.80)
δ 7.86(d,1H,J=7.5Hz,H-6)
6.01(d,1H,J=7.5HZ,H-5)
5.88(d,1H,J=2.9Hz,H-1')
2.64(dd,1H,J=4.3,12.6Hz,H-3'''eq)
2.44(dd,1H,J=4.7,13.3Hz,H-3"eq)
1.98,1.92(each s,each 3H,Ac)
1.64(dd,1H,J=12.1,12.6Hz,H-3'''ax)
1.59(ddd,1H,J=2.7,13.3Hz,H-3"ax)
31P-NMR(D2O,H3PO4=0.00ppm) δ-5.48ppm
本発明のシアル酸誘導体の製造方法によれば、生体内における細胞間の相互作用に関与する糖鎖の非還元末端へのシアル酸供与体として有用なＣＭＰ−シアル酸類縁体を、化学的合成により、安価な試薬を用いて製造することができると共に、シアル酸誘導体を高純度で得ることができる。この結果、シアル酸誘導体を工業的量産を実現することができる。
また、本発明の新規なシアル酸誘導体によれば、シアル酸ポリマーの糖類への導入に有用であり、新たなシアル酸の治療学的応用を提供することができる。
本発明は、シアル酸誘導体の製造方法および新規なシアル酸誘導体に関する。
〔背景技術〕
シアル酸は、細胞表層にある多くの糖鎖末端に結合している糖残基である。このシアル酸と、このシアル酸に結合する物質により、細胞間の相互作用が行われている。例えば、インフルエンザウイルスが生体に侵入する際、インフルエンザウイルスの表層に存在する蛋白質（ヘマグルチニン）が、侵入する相手側の細胞表層のシアル酸に結合し、これに引き続いてインフルエンザウイルスの侵入が起こることが知られている。
そこで、次のようなインフルエンザ感染の予防方法が提案されている。すなわち、シアル酸類縁体を細胞または人工細胞のような担体に結合させる。この担体を生体内に存在させて、ウイルスを担体上のシアル酸類縁体に結合させる。これにより、生体内で本来の細胞とウイルスが結合するのが阻害され、ウイルス感染が予防できる。この後、ウイルスが結合した担体を生体外に除去することにより、ウイルスを除去することも可能である。現在、このようなシアル酸を利用した治療方法が多数研究されている。
下式に示されるシチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（以下、ＣＭＰ−シアル酸という）（１２）は、シアル酸転移酵素のシアル酸供与体として作用することが知られている。すなわち、シアル酸転移酵素により、ＣＭＰ−シアル酸（１２）からシアル酸がシアル酸受容体糖鎖に転移され、シアロシドが合成される。
このシアロシドは、様々な生理活性を有することが知られている。例えば、ガングリオシドとして知られるシアロシドには、シアル酸ポリマーが結合しており、神経成長作用を持つことが知られている。以上のことから、ＣＭＰ−シアル酸は、抗ウイルス剤、抗痴呆剤の合成に利用できることがわかる。
（ｉ）J.Am.Chem.Soc.,110(1988),7159-7163；
シアル酸またはシアル酸を修飾したシアル酸類縁体およびシチジン−５’−トリフォフェートを、シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸シンセターゼを用いて酵素的に縮合する。
（ii）Tetrahedoron Lett., 34,1765,1993；
シアル酸の２位に脱離基を導入し、且つ、シアル酸の各水酸基に保護基を導入した後に、シチジン−５−モノフォスフェートのリン酸部分でシアル酸の２位を求核置換し、続いて保護基を脱保護してＣＭＰ−シアル酸（１２）を得る。
(iii)Tetrahedoron Lett.,34,2775,1993；
シチジンの各水酸基をアリルオキシカルバメートで保護した後、これにアリルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルフォスフォロジアミダイトを作用させて、シチジンの５’位にアリルＮ，Ｎ−１−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基を導入し、次いで、このシチジン誘導体と、２位の水酸基が保護され、且つ、他の水酸基がアリルオキシカルバメートで保護されたシアル酸とを縮合する。得られた中間体のリン酸部分を酸化し、さらに保護基を脱離し、ＣＭＰ−シアル酸（１２）を得る。
しかしながら、上記方法（ｉ）は、酵素の基質特異性のために、シアル酸類縁体の中の一部は、シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸シンセターゼによるシチジン−５’−トリフォスフェートとの縮合反応が進行しない。また、この酵素は高価であり、生産コストが高くなるので、上記方法（ｉ）は、ＣＭＰ−シアル酸およびその類縁体の工業的量産には適当でない。
また、上記方法（ii）は、反応に厳密な禁水条件を必要とする。また、生成物の精製が困難である。
また、上記方法（iii）は、水酸基をアリルオキシカルバメートで保護する工程が困難であり、且つ、生成物の精製が困難である。また、各工程の合成中間体を単離することができないので、最終結果物の精製を厳密に行う必要が生じる。さらに保護基の脱離に高価なパラジウム触媒を必要とする。これらの理由により、上記方法（iii）は工業的量産に適当でない。
以上説明したとおり、従来のＣＭＰ−シアル酸の製造方法はいずれも工業的量産に適するものではない。J.Am.chem.Soc.114,8749(1992)(p.8748〜8750）には、その２位に２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基が導入され、且つ、各水酸基がアセチル基で保護されたシアル酸と、５位を除く各水酸基がベンゾイル基で保護されたシチジンとを縮合して、縮合体を得ることが開示されている。しかしながら、得られた縮合体から、脱保護により目的のＣＭＰ−シアル酸（１２）を得ることまでには至っていない。
〔発明の開示〕
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、工業的生産に適したシアル酸誘導体の製造方法および新規なシアル酸誘導体を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、
下式で示されるシアル酸誘導体（１）の製造方法であって、
Ａは、下式（２）に示される基または下式（３）で示される基であり、
Ｂは、置換または非置換の核酸塩基である。］
下式で示される化合物（４）および化合物（５）を酸触媒存在下で縮合させて、下式で示されるフォスファイト誘導体（６）を得る工程と、
Ｒ1およびＲ3は、アシル基またはシリル基であって、互いに同じでも異なっていても良く、
Ｒ2はアルキル基であり、
Ａ’は、下式（７）で示される基、または下式（８）で示される基を示し、
Ｂ’は、アミノ基がアシル基またはシリル基で保護された核酸塩基である。］
前記フォスファイト誘導体（６）を酸化剤で酸化し、下式で示されるフォスフェート誘導体（９）を得る工程と、
前記フォフェート誘導体（９）を塩基で脱保護して、前記シアル酸誘導体（１）を得る工程とを具備することを特徴とするシアル酸誘導体の製造方法を提供する。
また、本発明者は、上述の製造方法に従って、下式で示される新規なシアル酸誘導体（１０）を得ることに成功した。
Ｘは、一般式（１１）で示される基であり、
Ｂは、置換または非置換の核酸塩基である。］
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明のシアル酸の製造方法において、第１の出発原料である化合物（４）は、シアル酸類縁体であって、２位の水酸基を除き、各水酸基が保護基Ｒ1で保護されている。これと同時に、１位のカルボキシル基が保護基Ｒ2で保護されている。
ここで、シアル酸類縁体とは、一般式（４）中のＡ’が一般式（７）で示される基である場合のシアル酸単量体や、Ａ’が一般式（８）で示される場合のシアル酸ポリマーである。
水酸基の保護基Ｒ1には、塩基処理により脱離される保護基が用いられる。具体的には、保護基Ｒ1は、例えば、アセチル、モノクロロアセチル、ベンゾイル、ピバロイルのような非置換または置換のアシル基、または、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリエチルシリルのようなシリル（ＳｉＲ3）基である。
また、カルボキシル基の保護基Ｒ2は、保護基Ｒ1と同様に、塩基処理により脱離されるものであり、例えば、メチル、エチル、ブチルのようなアルキル基である。
このような水酸基およびカルボキシル基への保護基Ｒ1，Ｒ2の導入は、公知の方法により行うことができる。
シアル酸モノマーおよびシアル酸ポリマーは、市販されているものを利用できる。これらを、長谷川らの方法（Hasegawa, A.;Ishida,H.;Kiso,M.J.Carbohydrate Chem. 1993, 12(3),371-376)に従って、保護基を導入することによりシアル酸類縁体が得られる。シアル酸ポリマーへの保護基の導入を行うと、分子内ラクトンが形成されるが、このラクトンは後述の塩基処理工程において再び開環される。
一方、第２の出発物質である化合物（５）は、リボ核酸誘導体である。このリボ核酸誘導体は、５位に２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト基が導入されている。かかるアミダイド化は、例えば、市販のリボ核酸に対して、アセトニトリルまたはジクロロメタンのような有機溶媒中で、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルフォスフォロジアミダイト、ジイソプロピルアミン、１Ｈ−テトラゾールを用いて行うことができる。
また、リボ核酸誘導体の各水酸基が、上述の保護基Ｒ1と同様の保護基Ｒ3で保護され、かつ、その核酸塩基のアミノ基がアシル基またはシリル基で保護されている。
ここで、核酸塩基とは、例えば、アデニン、グアニンのようなプリン塩基、および、例えば、シトシン、ウラシル、チミンのようなピリミジン塩基である。
化合物（４）および化合物（５）の縮合反応は、アセトニトリル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ベンゼン、ジメチルホルムアミドのような有機溶媒、好ましくは極性有機溶媒中で、低温、好ましくは−４０〜２５℃の温度範囲で、酸触媒の存在下行われる。例えば、酸触媒を加えるときは低温とし、徐々に昇温しながら反応を進行させる。ここで使用できる酸触媒は、有機酸が好ましく、例えば、１Ｈ−テトラゾール、ＤＬカンファ−スルホン酸、ピリジウム−ｐ−トルエンスルフォネート、ｐ−トルエンスルホニル酸（トシル酸）等を用いることができる。
化合物（４）および化合物（５）の縮合反応は、より具体的には、上記有機溶媒中で、−４０℃で、１Ｈ−テトラゾールを加えて反応を開始し、徐々に室温に戻しながら行う。
上述の縮合反応により得られたフォスファイト誘導体（６）は、次いで、そのリン酸部分が酸化され、その結果、フォスフェート誘導体（９）が得られる。この酸化は、例えば、アセトニトリル、ベンゼン、ジメチルホルムアミドのような有機溶媒中で、例えば、０〜２５℃で、フォスファイト誘導体（６）と等量または少過剰の酸化剤の存在下で行われる。酸化剤としては、例えば、ｔ−ブチルヒドロパーオキシド、ヨウ素／ピリジンを用いることができる。
フォスフェート誘導体（９）からの保護基の脱離は、塩基処理により行われる。ここで使用される塩基は、例えば、アンモニア水、炭酸ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、1,8-ジアザビシクロ［5,4,0］-7-ウンデセン（ＤＢＵ）、1,8-ジアザビシクロ［5,4,0］-7-ノネン（ＤＢＮ）、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミンが挙げられる。
より具体的には、塩基処理は、例えば、アンモニア水、炭酸ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドにより、水−メタノール中で室温において、１段階で行われる。
また、フォスフェート誘導体（９）からシアル酸誘導体（１）を得るために、下式で示されるように、まず、三級アミンＥを用いてシアノエチル基を脱離させて、中間体（Ｉ）を得る。次いで、中間体（Ｉ）を塩基処理して脱アセチル化を行ない、シアル酸誘導体（１）を得ることもできる。
さらに具体的に説明すると、例えば、ＤＢＵ／ＴＨＦを用いて、フォスフェート誘導体（９）のシアノエチル基を脱離させて中間体Ｉを得る。次に、中間体Ｉをナトリウムメトキシドで処理して脱アセチル化を行なうことにより、シアル酸誘導体（１）が得られる。
以上説明した各工程で得られる化合物は、精製することなく次の工程に用いることができ、大量合成に応用できる。
また、新規なシアル酸誘導体（１０）は、シアル酸ポリマーとリボ核酸−５’−Ｏ−アミダイドとの縮合体であり、本発明のシアル酸誘導体の製造方法により合成された新規化合物である。シアル酸ポリマーは、シアル酸単量体に比べ、シアル酸結合性物質、例えば、インフルエンザウイルスの表層に存在する蛋白質であるヘマグルチニン、との結合活性が強いと考えられる。このように、シアル酸ポリマーは、シアル酸の治療学的使用の実現に貢献し得るものであり、本発明の新規なシアル酸誘導体（１０）は、シアル酸ポリマーの糖鎖への導入に有用である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、本発明の実施例を詳細に説明する。
実施例１ シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）の製造
１．１ トリアセチルシチジン−５’−Ｏ−アミダイト（５ａ）の合成
Ｎ4−２’，３’−アセチルシチジン（Angew. chem., 85(1),43-44(1973)）１２０ｍｇ（３３ｌμｍｏｌ）、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルフォスフォロアミダイト１９９ｍｇ（６６２μｍｏｌ）、および、ジイソプロピルアミン６７ｍｇ（６６２μｍｏｌ）を、無水アセトニトリル５．０ｍｌに溶解した。得られた溶液に、０℃で１Ｈ−テトラゾール４６ｍｇ（６６２μｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を、飽和重曹水及び水で順次洗浄した。洗浄後の有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。得られた残留物をクロロホルム（５ｍｌ）に溶解し、−７８℃に冷却し、ペンタン１００ｍｌ中にそそぎ入れた。析出した沈殿物を濾別して、下式で示されるトリアセチルシチジン−５’−Ｏ−アミダイト（５ａ）のリン原子を不斉中心とするジアステレオマー混合物（１：１）（１８６ｍｇ，６５％）を得た。このジアステレオマー混合物は精製することなく以下の工程で使用した。
得られた生成物の物理的データは以下の通りである。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.40(bs,1H,NH-4)
8.26,8.24(each d,each 0.5H,J=7.6Hz,H-6)
7.44(d,1H,H-5)
6.37,6.30(each d,each 0.5H,J=4.9Hz,H-1')
5.47-5.36(m,2H,H-2',3')
2.76(t,1H,J=6.1Hz,cyanoethyl CH2)
2.25(s,3H,Ac)
2.11,2.10,2.07,2.06(each s,each 1.5H,each Ac)
1.28-1.24(bs,12H,Me)
31P-NMR(CDCl3) δ 150.51,149.67ppm
１．２ フォスファイト（６ａ）の合成
テトラ−Ｏ−アセチルシアル酸(Chemische Berichte 1966,99,611-617)（４ａ）４０ｍｇ（８０．０μｍｏｌ）および工程１．１で合成した化合物（５ａ）１８０ｍｇ（３００μｍｏｌ）を、それぞれ乾燥トルエンを用いて２回共沸した。各々の溶液をエバポレートして乾固し、それぞれの残留物を合わせて無水アセトニトリル２ｍｌに溶解した。この反応溶液を、アルゴンガス気流下、−４０℃に冷却した。次いで、この溶液に1H−テトラゾール２１ｍｇ（３００μｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した後に、室温に戻した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、その有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝１：２）で精製し、下式で示されるフォスファイト（６ａ）のジアステレオマー混合物を（１．６：１）を得た（３４ｍｇ，４４％）。得られたジアステレオマー混合物は精製することなく以下の工程で使用した。
1H-NMR(CDCl3)
δ 10.00(s,0.38H,NH-4)
8.99(s,0.62H,NH-4)
8.07(d,0.38H,J=7.5Hz,H-6)
7.81(d,0.62H,J=8.6Hz,NH")
7.70(d,0.62H,J=7.5Hz,H-6)
7.52(d,0.38H,H-5)
7.45(d,0.62H,J=7.5Hz,H-5)
6.87(d,0.38H,J=10.0Hz,NH")
6.11(d,0.38H,J=4.7Hz,H-1')
5.18(m,0.62H,H-5")
3.87(s,1.14H,Me)
4.50(dd,0.62H,J=2.4,12.1Hz,H-9")
3.85(s,1.86H,Me)
2.70(t,1.24H,J=6.1Hz,cyanoethyl CH2)
2.50(dd,0.38H,J=4.4,12.9Hz,H-3"eq)
2.48(dd,0.62H,J=4.9,12.8Hz,H-3"eq)
2.23,2.19,2.14,2.13,2.03,1.97,1.94,1.85(each s,Ac)
31P-NMR(CDCl3) δ 136.77,134.28ppm
１．３ フォスフェート（９ａ）の合成
工程１．２で得られたフォスファイト（６ａ）１７ｍｇ（１７．６μｍｏｌ）をアセトニトリル１ｍｌに溶解した後、この溶液に、室温でｔ−ブチルヒドロパーオキシド３３μｌを添加した。３０分間経過後、反応溶液を酢酸エチルに希釈し、この有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル＝１：９）で精製し、下式で示されるフォスフェート（９ａ）を得た（１５ｍｇ，８７％）。得られたフォスフェート（９ａ）は、リン原子を不斉中心とするジアステレオマー混合物（１．６：１）であった。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.29(bs,0.38H,NH)
9.22(bs,0.62H,NH)
7.69-7.56(m,2H,H-6x2,NHx2)
7.52(d,0.38H,J=7.5Hz,H-5)
7.44(d,0.62H,J=7.4Hz,H-5)
4.14(dd,0.62H,J=8.6,12.0Hz,H-9"a)
3.97(dd,0.38H,J=9.1,12.2Hz,H-9"a)
2.99(dd,0.38H,J=4.9,13.7Hz,H-3"e)
2.82(t,2H,J=6.1Hz,CH2)
2.65(dd,0.62H,J=4.8,13.3Hz,H-3"eq)
2.26,2,24,2.19,2.18,2.14,2.13,2.12,2.11,2.04,1.99,1.97,1.96,1.93,1.85(s,Ac)
31P-NMR(CDCl3) δ-7.61,-8.44ppm
１．４ シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）の合成
実施例１の工程１．３で得られたフォスフェート（９ａ）３３ｍｇ（３３．７μｍｏｌ）を乾燥メタノール１．５ｍｌに溶解し、この溶液に粉末のナトリウムメトキシド（９１ｍｇ，１．６９ｍｍｏｌ）を加え室温で９０分間撹拌した。得られた溶液のpHは１２以上であった。続いてこの溶液に水５ｍｌを加えさらに９０分間撹拌した。その後、反応溶液をそのまま凍結乾燥し、ゲルろ過カラム（Sephadex G-15,水，４℃）で精製した。シチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）を含むフラクションを陰イオン交換樹脂（ＡＧ １−Ｘ８、ギ酸型）に通して、下式に示すシチジン−５’−モノフォスフォシアル酸（１ａ）を吸着させた。この後、この陰イオン交換樹脂に水を流して、無機塩等の不純物を除いた。次に、炭酸アンモニウム（水→１Ｍ）で陰イオン交換樹脂から化合物（１ａ）を溶出させ、この溶出液を凍結乾燥して化合物（１ａ）を得た（１６ｍｇ，７５％）。
1H-NMR(D2O,300MHz,HOD=4.81)
δ 7.97(d,1H,J=7.6Hz,H-6)
6.12(d,1H,J=7.6HZ,H-5)
5.98(d,1H,J=4.4Hz,H-1')
4.06(ddd,1H,J=4.7,10.9Hz,H-4")
3.61(dd,1H,J=6.3,11.7Hz,H-9"a)
3.44(d,1H,J=9.4Hz,H-7")
2.48(dd,1H,J=4.7,13.1Hz,H-3"eq)
2.04(s,3H,Ac)
1.64(ddd,1H,J=6.1,13.1Hz,H-3"ax)
31P-NMR(D2O,H3PO4=0.00ppm) δ-4.43ppm
実施例２
実施例１の工程１．３で得られたフォスフェート（９ａ）(73mg,75μmol)をテトラヒドロフラン(1.0ml)に溶解し、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン（ＤＢＵ）(13.6mg,90μmol)を加え、次いで室温で５分間放置した後、ナトリウムメトキシド(40mg,746μmol)、メタノール−水(0.7ml-1.4ml)を加えた。室温で１２時間放置した後、凍結乾燥した。残留物をゲル濾過カラム（Sephadex G-15,4℃、水）で精製し、ＣＭＰ−シアル酸(33mg,69%)を得た。
得られた生成物の物理的データは実施例１の工程１．４の場合と一致した。
実施例4 シチジン−５’−モノフォスフォジシアル酸ダイマー（１ｂ）の合成
４．１ ヘキサ−Ｏ−シアル酸ダイマー（４ｂ）の合成
上述の長谷川らの方法に従って、Ｎ−アセチルノイラミン酸ダイマー（α，２→）（ナカライテスク社製；商品名）に保護基を導入した下式で示す２−チオフェニルシアル酸ダイマー（１３）５０ｍｇ（２１μｍｏｌ）を、アセトン−水（２０：１、０．５ｍｌ）に溶解した。この溶液に、０℃でＮ−ブロモスクシンイミド９．５ｍｇ（５３μｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を分取した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル＝１：１９）により精製し、下式で示すヘキサ−Ｏ−シアル酸ダイマー（４ｂ）（１６ｍｇ，８９％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)
δ 5.76(d,1H,J=10.4Hz,NH)
5.43(d,1H,J=10.4Hz,NH)
3.89(s,3H,0Me)
2.45(dd,1H,J=5.6,13.3Hz,H-3'eq)
2.34-2.25(m,2H,H-3ax,3eq)
2.18,2.15,2.08,2.05,1.94,190(each s,each 3H,Ac)
2.04(s,6H,Ac x 2)
４．２ フォスファイト（６ｂ）の合成
工程４．１で合成したヘキサ−Ｏ−シアル酸ダイマー（４ｂ）２１ｍｇ（２４．７μｍｏｌ）および実施例１の工程１．１で合成したトリアセチルシチジン−５’−Ｏ−アミダイト（５ａ）９７ｍｇ（１７３μｍｏｌ）を、夫々別に乾燥トルエンを用いて２回共沸した。各々の溶液をエバポレートして乾固し、それぞれの残留物を合わせて無水アセトニトリル１．４ｍｌに溶解した。この溶液を、アルゴンガス気流下、−４０℃に冷却した。次いで、この溶液に１Ｈ−テトラゾール１２ｍｇ（１７３μｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した後に、室温に戻した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、その有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝１：３）で精製し、下式で示されるフォスファイト（６ｂ）のジアステレオマー混合物（２：１）を得た（１５ｍｇ，４７％）。得られたジアステレオマー混合物は精製することなく以下の工程で使用した。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.30(bs,1H,NH)
7.80(d,1H,J=9.0Hz,NH)
7.52,7.45(each d,each 1H,J=7.4Hz,H-6,-5)
6.16(bs,1H,H-1')
5.95(dd,1H,J=3.6,6.6Hz,H-2")
5.62(t,1H,J=6.6Hz,H-3')
3.89(s,3H,Me)
2.69(t,2H,J=6.3Hz,CH2)
2.51(dd,1H,J=4.8,13.0Hz,H-3'''eq)
2.32,2.25,2.14,2.12,2.09,2.05,2.04,1.98,1.88(each s,each 3H,Ac)
31P-NMR(CDCl3) δ 135.30,133.52ppm
４．３ フォスフェート（９ｂ）の合成
工程４．２で得られたフォスファイト（６ｂ）１．６ｍｇ（１．２μｍｏｌ）をアセトニトリル０．１ｍｌに溶解した後、この溶液に、室温でｔ−ブチルヒドロパーオキシド２０μｌを添加した。１０分間経過後、反応溶液を酢酸エチルに希釈し、この有機層を飽和重曹水および水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール：酢酸エチル＝１：９）で精製し、下式で示されるフォスフェート（９ｂ）を得た（１．５ｍｇ，９４％）。得られたフォスフェート（９ｂ）は、リン原子を不斉中心とするジアステレオマー混合物であった。
1H-NMR(CDCl3)
δ 9.97(bs,1H,NH)
7.72(d,1H,J=9.3Hz,NH")
7.48,7.44(each d,1H,J=7.4Hz,H-6,-5)
6.29(bs,1H,H-1')
5.94(dd,1H,J=2.5,6.6Hz,H-2')
5.76(t,1H,J=6.6Hz,H-3')
3.92(s,3H,Me)
2.80(t,21H,J=6.1Hz,CH2)
2.60(dd,1H,J=6.5,14.8Hz,H-3'''eq)
2.33,2.26,2.15,2.14,2.09,2.04,2.03,2.00,1.88(each s,each 3H,Ac)
2.05(s,6H,Ac)
1.41(dd,1H,J=11.5,13.8Hz,H-3"ax)
31P-NMR(CDCl3) δ-6.86ppm
４．４ シチジン−５’−モノフォスフォジシアル酸ダイマー（１ｂ）の合成
実施例４の工程４．３で得られたフォスファイト（９ｂ）(22mg,17μmol)を、テトラヒドロフラン(0.4ml)に溶解し、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン（ＤＢＵ）(3mg,20μmol)を加え、次いで室温で５分間放置した後、ナトリウムメトキシド(22mg,407μmol)、メタノール−水(0.2ml-0.4ml)を加えた。室温で１２時間放置した後、凍結乾燥した。残留物をゲルろ過カラム（Sephadex G-15,，４℃、1mM NH4OH）により精製し、CMP-シアル酸ダイマー(9mg，56％)を得た。
1H-NMR(D2O,500MHz,50mM NH4HCO3,HOD=4.80)
δ 7.86(d,1H,J=7.5Hz,H-6)
6.01(d,1H,J=7.5HZ,H-5)
5.88(d,1H,J=2.9Hz,H-1')
2.64(dd,1H,J=4.3,12.6Hz,H-3'''eq)
2.44(dd,1H,J=4.7,13.3Hz,H-3"eq)
1.98,1.92(each s,each 3H,Ac)
1.64(dd,1H,J=12.1,12.6Hz,H-3'''ax)
1.59(ddd,1H,J=2.7,13.3Hz,H-3"ax)
31P-NMR(D2O,H3PO4=0.00ppm) δ-5.48ppm
本発明のシアル酸誘導体の製造方法によれば、生体内における細胞間の相互作用に関与する糖鎖の非還元末端へのシアル酸供与体として有用なＣＭＰ−シアル酸類縁体を、化学的合成により、安価な試薬を用いて製造することができると共に、シアル酸誘導体を高純度で得ることができる。この結果、シアル酸誘導体を工業的量産を実現することができる。
また、本発明の新規なシアル酸誘導体によれば、シアル酸ポリマーの糖類への導入に有用であり、新たなシアル酸の治療学的応用を提供することができる。
Claims (3)
- 下式で示されるシアル酸誘導体（１）の製造方法であって、
［式中、Ｍは、水酸基またはアセトアミド基であり、
Ａは、下式（２）で示される基または下式（３）で示される基であり、
（式中、ｎは０または１以上の整数であり、Ｍは上述と同じ意味を表す）
Ｂは、置換または非置換の核酸塩基である。］
下式で示される化合物（４）および化合物（５）を酸触媒存在下で縮合させて、下式で示されるフォスファイト誘導体（６）を得る工程と、
［式中、Ｍ’は、−ＯＲ1またはアセトアミド基を示し、
Ｒ1およびＲ3は、アシル基またはシリル基であって、互いに同じでも異なっていても良く、
Ｒ2はアルキル基であり、
Ａ’は、下式（７）で示される基、または下式（８）で示される基を示し、
（式中、ｎは０または１以上の整数を示し、Ｒ1、Ｍ’は上述と同じ意味を表す）
Ｂ’は、アミノ基がアシル基またはシリル基で保護された核酸塩基である。］
前記フォスファイト誘導体（６）を酸化剤で酸化し、下式で示されるフォスフェート誘導体（９）を得る工程と、
（式中、Ｍ’，Ａ’，Ｂ’，Ｒ1〜Ｒ3は、上述と同じ意味を表す。）
前記フォフェート誘導体（９）を塩基で脱保護して、前記シアル酸誘導体（１）を得る工程とを具備することを特徴とするシアル酸誘導体の製造方法。
（式中、Ｍ’，Ｍ，Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｒ1〜Ｒ3は、上述と同じ意味を表す。） - 下式で示されるシアル酸誘導体（１）の製造方法であって、
［式中、Ｍは、水酸基またはアセトアミド基であり、
Ａは、一般式（２）で示される基または一般式（３）で示される基であり、
（式中、ｎは０または１以上の整数であり、Ｍは上述と同じ意味を表す）
Ｂは、置換または非置換の核酸塩基である。］
下式で示される化合物（４）および化合物（５）を酸触媒存在下で縮合させて、下式で示されるフォスファイト誘導体（６）を得る工程と、
［式中、Ｍ’は、−ＯＲ1またはアセトアミド基を示し、
Ｒ1およびＲ3は、アシル基またはシリル基であって、互いに同じでも異なっていても良く、
Ｒ2はアルキル基であり、
Ａ’は、下式（７）で示される基、または下式（８）で示される基を示し、
（式中、ｎは０または１以上の整数を示し、Ｒ1、Ｍ’は上述と同じ意味を表す）
Ｂ’は、アミノ基がアシル基またはシリル基で保護された核酸塩基である。］
前記フォスファイト誘導体（６）を酸化剤で酸化し、下式で示されるフォスフェート誘導体（９）を得る工程と、
（式中、Ｍ’，Ａ’，Ｂ’，Ｒ１〜Ｒ３は、上述と同じ意味を表す。）
前記フォフェート誘導体（９）のシアノエチル基を三級アミンで脱離させて、下式で示される中間体（Ｉ）を得る工程と、
（式中、Ｅは三級アミンを示し、Ｍ’，Ａ’，Ｂ’，Ｒ1〜Ｒ3は、上述と同じ意味を表す。）
前記中間体（Ｉ）を塩基で処理して脱アセチル化することにより、前記シアル酸誘導体（１）を得る工程とを具備することを特徴とするシアル酸誘導体の製造方法。
（式中、Ｍ’，Ｍ，Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｅ、Ｒ1〜Ｒ3は、上述と同じ意味を表す。） - 下式で示されるシアル酸誘導体（１０）。
［式中、Ｍは、水酸基またはアセトアミド基であり、
Ｘは、下式（１１）で示される基であり、
（式中、ｍは０〜３の整数であり、Ｍは上述と同じ意味を表す）
Ｂは、置換または非置換の核酸塩基である。］
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