DE1620631A1 - Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden - Google Patents

Description

Dr. Walter Beil 27. Mai 1966 Dr. Eans Chr. Beil

■hccLtsar.v/äIte ~- "

Frankfurt a. M.-Höchst

Adeionstraße 58 - TeL 312649

Unsere Ir. 12 688

The ITpjohn Company Kalamazoo (Michigan, YStA)

Yeri'anron zur H^rstellung von Oligonukleotiden

.Die vorli j;-_:ana-·? "tfriiiidury betrifft ein Verfcuiren zae Ll ivs't'iliiuij neasr. V e .-hliylun^en_} inabrisoü-lera von 5^! _S5'--Dinuiileo3id.i^ioap.iab'öng die 1-a-D—Arabinofur^nosylcytoöiii als -3±i^:jv· Frukleosidanteil en tu alten. Sie oetriiTt ferner 3 in Ver- ϊ.'.ar-j>: zur ilaratsllunj entspreehendar Z'.yi'-X'iaerprolLikte so?/ie Ii j M"3i*J t-jllaj-}^· piiarma^eutisah annehmbar ar Salze.

Di-5 neuartiger.! Produkte und -I-s orifinclungy.^amäase V jrr^v..^!-ii."Jij ,iu ihr«r il^xvstellung kör·neu durch die-folgende JPormi'üi -^:;a v-:i.."i^sou^alicitiΐ ./arier·:

903887/mi BAD ORIGINAL

NH₂

HOCH₂

l·

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A.

HO H H

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HOCH₂

H OAe,

OAc

TOCH₂

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0—P-OH

0-—CH₂

H₂

H Öl·

OH H

HO

VIII

1120831

NHAc'

HO—Ρ— 0—CH₂

OAc H H

VI

HAC

0· -CH₂

P-OH

O CH₂

H OAc

OAc

Ac¹¹O X«

VII

BAD ORIGINAL.

in der Ac, Ac¹ und Ac¹¹ Aeylreste von Kohlenwasserstoffkarbonsiiuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeuten, T Triphenylmethyl, (p-Methoxy2:>henyl)-diphenylmethyl ader Bis(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl) bedeutet, X Wasserstoff oder Hydroxy bedeutet, X¹ Wasserstoff oder Ac¹¹O bedeutet, wobei Ac" wie oben definiert ist, Y Cytosin-1-yl, Uracil-1-yl, Thymin-1-yl (oder auch 5-kiethy-l uracil-1-yl),. Adenin-9-yl (oder auch 6-Aminopurin-9-yl), Guanin-9-yl (oder auch 2-Amino-6-hydroxypurin-9-yl), 7-Deazaadenin-9-yl (oder auch 6-Amino-7-deaza- f purin-9-yl), 6-Mercaptopurin-9-yl, Uracil-3-yl, 5-Fluoruracil-

1-yl» 5-Chloruracil-l-yl, S-Bromuracil-l-yl, 5-Joduracil-l-yl, 5-Irifluorniethyluraeil~l-yl, Hypoxanthin-§-yl (oder auch 6-Hy Ircxypurin-9-yl)» Xanthin-9-yl (oder auch -2,6-Dihydroxypuri'n-9-yl) oJer Metnylcytosin-1-yl bedeutet, Y' wie Y definiert ist, ir dein Aminogruppen durch eine v/ie oben definierte Acylgruppe geschützt sind und Z. Wasserstoff oder Acyl, wie oben definiert, bedeutet. ■

Beispiele für Aeylreste von Kohlenvyasserstoffkarbonsäure, die hier verweirlet werden, sind Acetyl, Propionyl, Butyryi, Valferyl, Isovaleryl, Hexanoyl, Heptanoyl, Oetanoyl, ITonanoyl, Decanoyl, Undecanoyl, Lauroyl, Benzoyl, Phenylacetyl, Prisr.ylpropior.yl, Anieoyl, p-Toluoyl, c-Cyclopentylpropionyl unJ dergleichen»

Die heterccyclischen Reste Y '.rerlen erhalten, wenn aus der Stajim:verbindung in der durch die Zahl vor der Endung

BADORIQiNAL

!$20531

^M-yl" bezeichneten Stellung ein Wasserstoff entfernt wird. Die Reste Ϋ haben demnach die folgenden Formeln:

H-N

Cytosin-l-y1 (a)

rUraci 1-1-yl (b) Thymin-1-yl (c)

OH

H₂N

Adenfn-9-yl (d) (e)

-N^ ^N/

7-Öeazaadeni n-9-¹ Cf) -

6-Me rcaptopü r ί η-9-y

(g)

Cl

T⁰ i

iirzel |*3*y1 . 5-Fltioi>iir»cl T-;

BAD

H-

5-JodxJracl l-1-yl
(1)

5-Trif luoivmethyl· uracll-i-yl
(m)

OH

NH₂

N^ ^J N

CH₃

Bypoxanthf n-9*

y'

(X)

HO' ' N N I

Xanthln-9-y' . (o)

5-Me thy Icy tos in 1-vl

(ρ)

Die oben genannten «Uracilreste (b) und (h) und substituierten Uracilreste (c), Ci), (j)« (k), (1) und (m) werden in der Ketoform anstatt in der tautomeren Enolform geschrieben. In gleicher Weise können andere der oben aufgeführten Reste in der tautomeren Form geschrieben werden. Beispielsweise werden die Cytosin- und substituierten Cytosin-Reste (a) und (p) in der Aminoform geschrieben, sie können aber auch in der tautomeren Iminoform geschrieben werden. In chemischen Verbindungen, so auch in den erfindungsgemässen Verbindungen, sind solche Formen häufig nebeneinander im Gleichgewicht vorhanden.

Ziele der vorliegenden Erfindung sind ausser den Endprodukten der Formel VIII auch die neuartigen Zwischenprodukte der Formeln II, III, IV, VI und VII*

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BAD

1120631

Das erxindungsgemasse Veriaareri ist im wesertlichen darauf abgestellt, diejenigen Gruppen im Stickstoff haltigen ."'"» heterocyclischen Teil wie aucii im Zuck erteil des Moleltüls zu schützen, die mit Phosphorsäure oder dem Phösphorylierungs- mittel reagierer! können, und gleichzeitig diegewünschte- Hydroxy gruppe in der .Stellung 5' stehen zu lassen, ;d*h. die einzige priaäre alkoholische Gruppe im Zuck erteil, die einer Umsetzung mit dem Ehosphorylisimngsiiittel zugänglich ist. Obwohl daher das vorliegende Verfahren, je nach'dem gewählten Wukleosid unl schützenden Mittel geringfügig variieren kann, lässt si eil das grundlegende Verraiiren, Trie ir:4er oben stehsnien Ponaelfolge offenbart, in folgender Wei.se besc/.ri-sben:■-/.

l-{.-I)-AraMnofuranosyleytosin (l) wird als freie Base oder aia Sdz siner kinar al saure, z.B> dÄr-Gnlor wasserstoff säure, XT; dsr S'-St-älluxg be;" spiel aweise mit Chlortripnenylmethan zu -IeL. e^tspreciieriisn !-(s'-O-Tiriph&^lmethyl-la-D--arabinofuriinosylO-ctytosin (H) verethert,:; Danr. mird die V%r-Mndung II mit einea Acylieruri siaittsl aus der Gruppe SäureaniiyIride und Säureiialcgeni«Ie von. Eohlenwasserstοf fkarbpnsäi.reη mit 2 bis 12 KoLlenstoffatöiaen,^ wie Essi^säureanhydrid, Propionsäure an::ydrii, Benzoylehlox'ii und dergleieiien, umgesetzt, um die Hydroxy gruppen 2' und 3 V uirx die Aminogruppe Jes Cy tosiiiänteils zn acylieren. Das eriial-sene 5 '-verät&erte .Ν 2¹ ,3'-triaeylierte rsrodukt III vvird^ ohi-e weitere Heiiu,sU.ik; durch selektive Abspaltung der· 5«>-Ätk^rgruppe in das;; ej-tspreci^nie -l-i d^l , 5*-di-O-acyl-a-D-arablnefurandsyl )-.cytosin (IV)

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.--■--■""■ -,-■■■"■- BÄÖ

übergeführt. Die Verbindung IV wird darauf mit einem ausgewählten Phosphorylierungsmittel, z.B. 2-CyanOäthylphosphat, in Gegenwart eines ausgewählten Kondensierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, und anschliessend mit einer Alkalibase, wie verdünntem, wässrigem Lithi.uBihydroxyd, behandelt und so in l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-S'-phosphat (V) übergeführt. Bei diesem Schritt werden die Acylgruppeη in den Stellungen 2' und 3' entfernt, während die Acylgruppe an IT nur dann abgespalten wird, wenn kräftig hydrolysiert wird, beispielsweise indem die Base enthaltende Lösung auf Rückfluss temperatur -eruitzt wird. Die Verbindung V wird darauf wieder azyliert und ergibt das entsprechende N -Acyl-1-(2· , 3'~ di-O-acyl-j.i-D-arabinofuranosyli-cytosin-S '-phosphat der Formel VI. Uni ein acyliertes 5', S'-Dinukleosid-phsjophat der Formel VII zu gewinnen, wird die Verbindung VI darauf mit einem ß-B-deoxyribofuranosid oder μ-D-ribofuranosid, die man erhält, wenn ein Ribofuranosid oder Deoxyribofuranosid der Formel IX

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IX

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in derWeise geschützt wird, dass nur die 5'-Hydroxygruppe zur Umsetzung mit der Verbindung der Formel VI frei ist» kondensier", In der Formel IX sind die Parameter X und Y wie oben definiert, und der Schutz der 2'-und 3'-Hydroxylgruppen eines Ribofuränosids (oder der 3'-Hydroxygruppe ,eines Peoxyribofuränosids) und der Aminogruppen, die gegebenenfalls in Y vorliegen, kann

■-■--■ ' ■ - .;■ ■■■■- -* .in .-■ ■·■■. ■. ., . . ^: . ;,

durch schrittweise Acylierung, wie /dem früheren Verfahren. I ■ ■ II ill-—^IV gezeigt wurde, erreicht werden» Wenn X eine Hydroxygruppe ist, können die 2*- und 3'-Hydroxygruppen andererseits auch durch Bildung eines Acetals, beispielsweise von einem einfachen Keton,, wie Aceton, Methyläthy!keton,Diathylketon, DipröpyIketon, Cyclohexanon und dergleichen, ge-, schützt werden.^

Die/Ö-D-Ribofuranosid- und ^J-D-Deoxyribofuranosid-Reaktanten lassen sich daher durch die Formeln

QHäOH

X ·

und

CHaOH

R¹ R"

Xl

■· 9 -

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BAD

to

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beschreiben. In diesen haben Ac", X* und Y¹ die gleichen Bedeutungen wie oben, und R' und R" bedeuten Niederalkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. \

Wenn ein Reaktant der Formel XI verwendet wird, dann wird anstelle des Produktes VII ein Produkt der Formel XIi erhalten:

IAc¹

CH₂

O=P—OH

0—CH*

H OAc

OAc

/⁰N

' η η ^

0 0

^H X

R' R"

XII

in der Ac, AcV, R¹, R^M und Y¹ wie oben definiert sind. XII ergibt bei der Hydrolyse VIII sowie VII bei der Hydrolyse VIII ergibt.

- 10 -

9 03.38 7/1.7 6 6f~

BAD ORiGiNAL

._n ·■■■'.■■ 1520631

Andererseits können Verbindungen der Formel VlI und XII und daraus das Endprodukt VIII durch Kondensieren-eines' ....: H^-Acyl-l-U¹,3^f-di-O-acyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin-(lV) mit einem 5'-Phosphat der verbindungen X oder XI hergestellt werden, Solehe 5'-Phosphate werden hergestellt, indem Verbindungen der Formeln X und XI mit einem PhosphOrylierungsmittel, Kondensierungsniittel und einer Aiajjelimetallbase, wie bei der Umwandlung der Verbindung IV in V gezeigt wurde, .behandelt _t werden.

Die neuen Oil go nukleo ti de der Formel VIII zeigen eine, beträchtliche, oy to toxische Wirksamkeit in vitro, insbesondere gegen KB-Tumorzellen und gegßn Virus, insbesondere die verschiedenen Arten von Hei-pes, Goe und Vacciniavirus. Aus diesem Grund können die Produkte zum Reinigen von Glasgwraten : und Instrumenten, die zum Wachsenlassen von Gev/ebekul türen bei der Virus— und Tumorforschuns verwendet //erden, zum wasonen von herausgeschnittenem Tumorgewebe, das auf Tiere verpflanzt werden soll, um das w^xistum irgendwelcher KB-Tumorzellen zu verainderri, die sonst die umgebenden Gewebe zum Wuchern bringen könnten, oder zum Aufbringen auf andere Teile destieri-. sehen Körpers verwendet ,verden. Die Anti virus-Aktivität kann auch zum Bereiten von fiäikroorganiamenkultüren, dia frei von Virusgescnwulsten sind, z.B« gesciv/ralstfreien Streptomyceskulturen, die Antibiotika erzeugen, yerw-anäet werden. Verbindüngen der Formel-VIII heilten Herpeskeratitis im Auge von virusinfizierten Haustieren. -

909087/1766 ,

Die AusgangsVerbindung, Ι-μ-D-Arabinofuranosylcytosin, und die durch Porin el IX angegebenen Verbindungen gehören sum bekannten Stand der Technik. Siehe Michaelson, The Chemistry of Nucleosida-s und nucleotides, Academic Press, London und Few York, 1963, 7~Deazaadenin-9-yl-ribosid, das auch als Sparsomycin A bekannt ist (oder Tubercidin), wird weiter unten zusammen mit der Herstellung des 2',3'-0-Isopropylidenderivates offenbart.

Bei der Durchführung des erxindungsgemässen Verfahrens wird 1-p-D-Arabinofuranosylcytosin- (I) als Hydrochlorid, Hydrobromid oder ein anderes Salz oder als freie Base mit einem Veratherun^smittel in einem basischen organischen Lösir^Tiiitittel behandelt. Als Verätherungsmittel v/erden im allgemeinen Chlortripnenylmethan, Chlor(p-Methoxyphenyl)-diphenylmethan, Chlor-bi3(p-metnoxyphenyl)-phenylmethan oder die Brom— analoge, dieser drei Verbindungen verwertet. Als organische Base -,/ei'den Pyridin, Picoline, lutidine, Trialkylamine und dergl eich en verwendet. Pyridin findet dabei den Vorzug«, Die Reaktion jiar.n bei einer Temperatur zwiseilen O und 6O⁰C ausgeführt .v er den und wird vorzugsweise bei Raumtemperatur zwischen 20 und 3G⁰C durchgeführt. Die Reaktionszeit erfordert bei Raumteüipsratur einen Zeitraum von zv/ischen 6 und 10 Tagen. Bei der bevorzugter. Ausfünrunjsfοrm dieser Erfindung wird 1- -D-Arabinofuranosylcytosii: in Pyridinlösung mit ChIortriphenylmethan oder Bronitriphenylmethar 6 Stunden bis 10 Tage lang gerührt. Dar.ach ;virl las produkt durch übliche iiethoden, wie

- 12 -

9 0 9 8 8 7/1786 ' ^z bad omei_NAt

1&2063Ϊ

Eingiessen der Miachung.in Wasser und Abtrennen des Produktes, naeiidaiii.-es kristallisiert ist, isoliert. Ma Reinigung des. ."" " Produktes kann-ebenfalls vnachierkömiiiliehen Methoden, vwie Um-:. kristallisieren.,"-beispiels..'/eiss aus Aceton) yörgenomiiien /verden. - ■:." . Die Acylierung des so "erhaltenen Produktes^;;!-.(5'-O-■■-Triphen^lmethyl—p—D—arabinof uranosyl.)'—oy to sin,, - wird; mit: Äcylciiloriden, Acylbromiden.und :Säüreanhydriä&n ύοη Kohlenwa'sserstoifkarbonsdurgn mit 2 bis 12 Eohlenstoffatomen mittel durchgeführt. Repräsentative Äcylchloride und l broniide sind beispiela^eiso loetylchlorid/icatylhrojaid, zo/lchlorid, JoiisoylchloriJ,.. para-Äthylbenzoylchlorid,: para-Methylber-zo/1—bromid ^ p-Ggrclopentylpropionjlchlorid, Iiaüroyl— Chlorid, Deoanoylchlorid^ OetanoylChlorid uni der jjrclsentative, Säureanhyirila.-jsind'b^isjjielsf/eiae, Easi hjdrid, IPropionsuurean-^drid,, ;Butti;rsäureasuayd;ri;d_J,,; -Shenylessigaäuraanhydrid,■;Phenyl^ropipnsaur^ianhydrdd, -EescsnSciureanhydrid ■■ und dergleichen. Bei der" bevorzLigten Ausftlhruiio-sfomi dieser.- " Sr^indapj erfolgt die Acylierung in trockenem iyridiη^bei Raumtem-dr:%tur zvvischen 20 und 30^QG-untar beständigem Rühren-^ahrynd eines Zeitraums von 1 bis 4S-^Stunden^ ν^-πββ^ψία-ά das . /üt -vijl nach Standardarbeitsmethoden isoliert;, inism die Pyri-." dinlösun^ beiuiilelsv/eisa in Wasser gegossen wird»; das; Wasser α ,., irtiert /?ird und das zurückbleib endest -?Tät erial - durch herköx!^- lic'ie iÄetlioden, ^ie/CarOiiiäto^raphie,. Extr^tiph, Ute.-- . ■

Ä.rv;; buiii 3«fciar..- oder^ein« Koiiibiiiation dies ar ^ethöUdii und. der-■i jl^/iw, \s3relnljt wird. B-s so .örnaa ^;Ure f'⁴-ACyI-I-(S;¹-O-" · ■" ■

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Triphenylraethyl-2¹ ,2'-die-0-acyl- -D-arabinofuranosyl)-cytasin wird dann einer Äthyrspaltungsraaktion, beispielsweise mit. E „j a ig 3 coir e oder mit Halogenwasserstoff enth.iJ.fc ander Essigsäure, ■,vie Chlorwasserstoff, Broirivvass er,stoff o-ler -To-I.vy.s3s· ■:·, boff, urterr/orf en. Es entsteht d-a.3 e nt 3^-r soil er. le 2Γ-Acy l-l-( 2' , 3'-li-0-acyl- -D-arabinofuranosyl)-cytosin.

Die gleiche dethode (^a.h. Ver&tiisrn, Acyli ^ren und Ä tn er spaltung) //ird aucn ver..-endet, um solcke Grupper., die mit den Piiosphorylierurysmittel in Ribofur^nosiden und Deoxyribofuranosiden der .Fon:.el IX reagierer, können, zu jCj.iu.tzen. Eine andere Metho ie zum Schutz der Hydros gruppen "in der. 2'- und 3'-Stellungen des Ribofuranosids der Formel IX b-isteht darin, dass man die vicinal en Hydroxygruppen der Formel IX mit einem Keton, insbesondere Ä.ceton, Diätiiylkaton, A tny Im ethylketon, Tüprop/lkston ur. I der^leiohen, in Se -γ.,ΥαΤϊ eines Katalysators, 7ΓΧ3 sohlet"elscture zn den ent ^reclierien icatalvsrbindungsη umsetzt. Diese J.Iethoie v/ird im einzelner x'J.r d-iS Sparsomycin A auijsüi'ei^t.

Die Phosphorylierung des gesciiiitsten 1T^T-A.cyl-1-(2' , 3' ■ di-0-acyl- -D-arabinofuriinosyl)-cytosin ./ird naci einer von G.M. Tsrar, J.Am.Chem. Soc. 83, 159 (1959) bescLriace; en '."ithode durchgeführt. Für disse Arbeitswsise ver-//eiilete Lösu:i,:sr:.ittel sind wasserfreie, nicia thy dr oxy Ii sehe Lösungsmittel, in denen das Phosphorylierun^siaittel, ein Phosphatester, eben!..Ils löslich ist. Solche Lösungsmittel sind,zum Beispiel Pyridin, Picoline, Lutidine und dergleichen. Neutrale Lcsuii/3if.ittel, wie

9 0 9 8 if Π 7 8 6 ^8AD

"■■'·- ; .. IS . ■ Λ ':'■

Dim ethylsul foxy d, Tetrahydrofuran, N, -K-Dim ethyl- acetamid oder Dioxan kennen ver 'endet verden, vorausgesetzt, dass für jedes jIoI PiiospiiOryIierup^suittel eine Äquivalent Base zugesetzt wird. Repräsentative Basar/far diese Reaktion 'umfassen PyridiK, Picoline, lutidine und Tri alkyl amine.

Die VerVieniete;- Phospliatestjr sollten leicht durch eire Al* all base spaltbar sein undfür diese Reaktion !»-asonders geeignet siri 2-StIbStItuierte Ätnyldiiiyd!*ogenpliOspiiate der Formel - . : ;

Z _ GH-CH, - 0 - P - OH

in der R¹¹ ' Wasserstoff oder ITiedaralkyl; Z eirer stark elektro liejativen Sub s ti tu er. t er aus der Gruppe ,- . ■ , _:

• ο ο ■■■. α. .■;■■■ '" - -

--xi -GBr-; -Cl; -Br; -Fj 4^R¹;¹" ; -Iffi^i -lGgi -COOR

-Wp und !erbleichen; R¹'¹¹ Eiederalkyl oder Aryl; und R« «■«"·» Wasserstoff, "ielaralkyl oder Aryl c^leutjn. Düb bevorzugte ^-substituiert ÄTi-yldiiiydrogenpiieapiiat ist 2-Cyanoäthyldihydrogerpiio apliat.

Ar stelle eines 2-sub3titui ert en 4tiiyldihydrogenplxO3-piiaiis \icr.rx:'- undere I)ii_ydroge2iplio3pby.tes^-3r verwendet werden, ixe leicht I'urcii eire Bass geat-alten .yerden könr-en, z.B.

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ο- und p-subBtituierte Phenyldihydrogenphosphate, wie ο- und p-Carboxyphenyldihydrogenphosphat, o- und p-carbamoylphenyldihydrogenphosphate und o- und p-Cyanphenyldihydrogenphosphat.

In der Lösung, die das 2-substituierte Äthyldihydrogenphosphat odsr o- oder p-substituiertes Phenyldihydrogenphosphat enthält, wird das zuvor erwähnte acylgeschützte 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin, wenn nötig unter Erhitzen auf

30 bis 5O⁰C gelöst. Nachdem alles N^-Acyl-l-U«,3'-di-0-acylfs-D-arabinofuranosyl)-cytosin gelöst ist, wird ein Kondensierungsmittel, wie ein Alkyl-, Cycloalkyl- oder Aryl- substituiertes Karbodiiinid vorzugsweise Dicyclohexylkarbodiimid, zugesetzt. Andere nicht mit Karbodiimiden verwandte Verbindungen, die als Kondersiorungsruittel ver./endet v/erden können, sind p-Toluolsilfonylchlorid, Methoxyacetylen, Ketenimine, Trichloracetonitril, substituierte Cyanamide, α-substituierte Acetonitrile, Alkyl- und Arylisocyanate, Karbonsäurechloride, Aralkylchlorkarboriate und dergleichen.

Bevorzugte Temperaturen für diese Reaktion liegen bei oder etwas obymalb Raumtemperatur, d.h. zwischen 20 und 40⁰Cj jedoch kann die Reaktion auch bei niedrigeren Temperaturen, wie 5°C und bei höüeren Temperaturen bis zu etwa 75 C

ohne übermässige Hebenreaktionen durchgeführt werden. Bei einer

Temperatur zwischen 20 und 40⁰C und einer vernünftigen Konzentration beträgt -die zur Umsetzung benötigte Zeit ungefähr 6 bis 24 Stunden. Jedoch können Reaktionszeiten zwischen 1 und 60 Stunden verwendet werden; die Reaktionszeit sollte bei

. - 16 909887717β6

- BAD ORIGINAL

■ grösserer Verdünnung wesentlich, verlängert werden*

Die Konzentration, der Reaktanten ist nicht kritisch. Äquimolare Mengen von F -ieyl-l-(2S 3^l^di-Oracyl-p-Ii--arabino.-furanosyl)-cytosin, von 2-substituierteni Äthyldihydrogenphos-■ phat und dem Kondensiarungsmittel führen zu fast vollständiger Umsetzung, wenn die Reaktionsdäuer zur vollständigen Umsetzung asureiclit. Zur Verkürzung der Reaktionszeit wird ein 3 bis 4-fächer molarer Überschuss des 2-substituierten Äthyldihydrogenphosphats über T\r-4cyl-l-(2^!, Ji-di-O-acyl-ß-B-arabinofuranosyl)-cytosin bevorzugt* Nachdem die Eealction be·.Biadet ist, wird zur Desalctivierung des übersehüssigen Phosphorylierungsmittels und des überschüssigen Kondensierungsmittels eine geringe Menge wasser zugegeben. Die Lösung wird dann filtriert, um unlösliche Stoffe, wie aus der Umsetzung der Karbodiimide mit Wasser entstehende disubstituierte Harnstoffe, abzutrennen, und das Jiltrat wird für die nächste Stufe, die Hydrolysereaktion verwendet.

."". Zur Erzielung der gewünschten Hydrolyse -wird die aus der vorh,ergehenden Stufe erhalte^ie Lösung mit einer Alkalihydroxydlösung umgesetzt. Bei der bevorzugten. Ausführungsform der Erfindung wird di©"*aaa-^-AOyI-I-(^,J'-^'O^acyl^p^Skarä'biiiio·«--: furanosyl)-cytosin-5^t-yi-2-oyanäthyl-ph.osphat enthaliaide Lösung zunächst, vorzugsweise unter fakiium, bis auf ein kleines Volumen eingeengt. Wenn das Volimen klein genugvist uncl das gokölilta Material in einen viskosen Rückstand übergeht» wird eine Base, z.B. wässriges Lithium-» Natrium- oder Kaliumhydroxyd

BAD ORIGINAL

(0,4 bis 2 normal), zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung auf 12 bis 13 steigt. Auch konzentriertes Ammoniuiühylroxyd kann verwendet we -Jen. "Diese Umsetzung v/ird bei Temperaturen _ zwischen 0 C und dem Siedepunkt der wässrigen Lösung 10 LIinuten bis 24 Stunden lang durchgeführt. Nach Beendigung 'der Umsetzung wird die Mischung gekühlt und filtriert. Aus dem FiItrat wird das Produkt V nach üblichen Methoden, wie Extraktion, Verdampfung, Ausfällen in Form unlöslicher Phosphatsalze,. Absorption und Desorption auf den Harzen, Umkristallisation und dergleichen, isoliert. " ■

Je nach den Reaktionsbedingungen wird ein 1-p-D-Arabi no furanosylcy to sin-5'—phosphat erhalten, bei dem die Acylgruppe am IT gegebenenfalls abgespalten ist. Bei niedrigen Temperaturen, z.B. 0 bis 20⁰C und kurzen Reaktionszeiten, z.B. 10 bis 40 Minuten, bleibt die Acjlgruppe am N erhalten. Wenn die alkalische Lösung, welche das organische Cyanophosphat enthält, bei höheren Temperaturen, beispielsweise zwischen - * 75 und 10O⁰Q, genalten wird, wird die Acylgruppe am N⁴ entfernt. ■■■-.■ Das so erhaltene l-p-D-Arabinofuranosylcytosin-5¹-phosphat oder sein JT- Acyl derivat v/erden in der gleichen Weisa wie die Verbindung II, vorzugsweise in wasserfreiem Pyridin mit Anhydriden und Tralogeniden von Kohlenwasserstof Ckarbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen als. Acylierungsmittel, zu dem. H^-Acyl-l-(2¹ ,Ji-di-O-acyl-ß-D-arabinofuraEosylJ-cytosin-5'-phosphat (vl) τ/ieder'acyliert.

Das so ex-naltene produkt VI wird da^ur mit Eibo-

furanosi len oder Deoxj'ribofuranosiden der Form ein X und XI

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, · *¹⁸" BADORiGlNAL

- ^1S 1520631

kondensiert. Bei der bevorzugten AusführurgsiOrm dieser Erfindung ,wird„die Kondensation mit einer .äguimolareri lienge Jr-Acyl-l-(2' , J'-di-O-aeyl-fj-D-arabinofuranosyi )ey tösin-5¹-' phosphat und dem ausgewählten Ribofuranosid oder Deoxyribofuranosid der Formeln X oder XI in wasserfreiem Pyridin in Gegenwart eines Karbodiimidsz.B. Dicyclohexylkarbodiimids, bei flaumtemperatur (20 bis 30⁰C) durchgeführt. Anstelle von Pyridin als Lösungsmittel können alkyl substituier te Pyridine, wie Picoline, Lutidine usw., wie auch Dimethylformamid, Diäthylformaid und dergleichen verwendet werden. Die """Reaktion kann bei Temperaturen zwischen 0 und 60⁰C durchgeführt-werden; jedoch wird Raumtemperatur zwischen 20 und 30°;C bevorzugt« Bei Raumte'mperaturen liest die Reaktiensdauer zwischen 1 und 10 Tagen, gewöiinlich zwischen 4- und & Tagen. Nach Beendigung der Reaktion wird Wasser.zugegeben, unX die so hergestellte diaübstituierte Harnatoffverbiiiduno wird von dem Reaktionsgemisch abfiltridrt. D-iS produkt, ein Dinukleosidmonohydrogenphoaphat VII oder XII, wird nach üblichen Methoden isoliert, indem beispielsweise die Verunreinigungen mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, beispielsweise Petroläther, Benzol» Skellyisolve-Hexahe, Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid, Äther und'dergleichen, extraJaiart, und, die zurückbleibende wässrige Mischung lyophilisiert werden. Extraktion und Lyophili si erung werden ρ ft wi ederhöl t,. dami t die wassrige Mischung von allen Nebenprodukten-befreit wird. Nach dem Isolieren *kanr das Produkt VII oder XII nach üblichen Methoden-

^: " , ■■'.. '■■■-■ 19 - "■-■■ -. λ Λ.^: -^;: .

9^87 /1700

weiter gereinigt werden, indem es beispielsweise durch. Umkristallisieren, Chromatograph! e$?e*. oder Elektrophorese und dergleichen gereinigt wird.

Das so erhaltene Esterprodukt VII wird dann mit wasser.reiem, amino niakali sch em Methanol oder einer anderen nicht wässrigen Base behandelt, um die Acylgruppen hydrolytisch zu entfernen und das Dinukleosidphosphat VIII, indem einer der Kukleosidanteile l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-S'-yl ist, herzustellen* Das Esterprodukt XII wird zunächst alkalisch und dann sauer hydrolysiert, um das Dinukleosidphosphat VIII herzustellen.

Produkt VIII wird nach ähnlichen Methoden, wie sie

bei produkt VII und XII zur Anwendung kamen, isoliert und gereinigt, bisweilen unter zusätzlicher Verwendung von Elektrophoresee.

Durch die folgenden Beispiele werden das erfindungs-

gemässe Verfahren und die damit erhältliehen produkte näher veranschaulicht, jedoch nicht begrenzt.

Beispiel 1

1_(5«-O-jriphenylmethyl-ß-D-arabinofüranosyl)-pytosin.

Eine Lösung von 10 g l-j3-D-Arabinofuranosyl)-cytOBinhydrochlorid in 200 ml Pyridin wurde mit 12 g Chlortriphenvlmethän versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde'danach eine Woche

lang bei Haumtemperatur (23-26⁰G) gerührt. Es wurde dann lh 5 1 Eiswasser eingerührt, worauf sich 1-(5«-O-Triphenylmeiihylß-D-arabinofura2X(syl)-cytosin als OeI abschied. Das OeI

9 0 9 8 8Ύ A 7 8 6 ^8AD

kristallisierte beim Stehen mit Wasser üb:er njacüt, und die Kristalle wurden abfiltriert;, dann zerbrochen, gründlich mit Wasser gewaschen und bis zur Gewiciitskonstanz an Luft getrocknet. Der so erhaltene Feststoff wurde mit 200 ml sielendem Heptan verrieben, und die Fiscliur.g wurde filtriert, wobei die Kristalle auf einem Sinterglastr-ichter gebammelt wurden. Die Kristalle wurden nochmals mit zwei 150 ml Portionen siedendem Heptan gewaschen und nach dem rprocknen in 1 Liter siedenden Acetons, das Ig Aktivkohle (Darco G-6Ö) enthielt, eingetragen. Die heisse Suspension wurde zur Entfernung' der Holzkohle filtriert, uvjl das Mltrat wurde auf einem j/asserdampfbad bis auf ein Volumen von ungefähr 75 ml destilliert. Dieses ergab nach dem Abkühlen auf Baumtemperatur ein .uristallines produkt. Das kristalline prolukt wurde auf einem Si nt er glas trichter gesammelt und mit einer 50 ml-Portion eiskalten Acetons ge— . waschen. Das produkt wurde danr getrocknet und erg.ab-13 g; : 1-(5 ' -O-TriphenTlmethyl-ß-D-arabinofuranosyl )-cytosin (Schnielzpunlit 227,5 - 228⁰C unt^r/ Zersetzung}. . .-.-■ ■

In gleicher weise können l-/5'-0-(p-Methojcjrphenyl)-diphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosylJ-c/tosin oder l-/~5¹^O-" Bi 3 (p-fiiethoxyphenyl) -phenylniethyl-p-D-ar abinofurano^^sylj-cytosin orhalteri ,verden, indem man 1-(D-D-Arabinofuranosylcytosin odar sain Hydrochlorid in PyridinlösLing mit ChlOr(p-methoxyyi ?njl)-diphspylmethan bzw. Ghlor-bis(p-metripjQ¹ phenyl)-plienylm.'ithan bei P.r.iUüitempera.tur.z-.iischen^ 0 und 6Ό_ ο unter beständigem

sri umsetzt..

9 0 9 8 8 7 /1 76 6 . bad original

Ähnlich wie in Beispiel 1 kanr· mar anstelle von Chlortriphenylmethan Bromtriphenylmethan verwenden und erhält das gleiche Endprodukt l-(5 '-O-Tripherylme thyl-p-D-ara.birofuranosyli-cytosin.

Beispiel 2

l_(5«_0-Triphenylmethyl-p-D-ribofuranosyl)-uracil.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 1—,-■—

D-ribofuranosyluracil mit ChIortripher/lmethan in Pyridir zu

' l-(5'-0-Triphenylmethyl-p-D-ribofuran.o3yl)-uracil umgesetzt.

Beispiel 3

1- ( 5' -O-Tripiienylmethyl—p-D-r± bofurano3yl)-t.iymin.

. in der gleichen weide v/i β ir. Beispiel 1 vrarlrj 1-μ-

D-ribofuranosylthymir mit Chlortriprj.ei\/lmethan in Pyriiin zu 1-(5'-O-Triphenylmetx-yl-p-D-riboxuranosyl)-thymin umgesetzt.

Beispiel 4

L 9-(5' -O-Triphenylmethyl-p-D-ribofuranosyl )-a'ienin.

■ - In dar gleichen _moise ."/ie ir Zeispiel 1 vmri? 9—t--

D-Ribofuranosyladenin mit Chlortripherj-lnetnan ir Pyrilir. zu 9-( 5'-O-Triplienylmeti.-iyl-b-D-ribofux-ariOsyl)-adenin umgesetzt.

Beispiel 5

9- (5' -O-Tripiienylmetnyl-p-D-ribofuranosyl )-7-deazaadenin.

- 22 -

909887/1766

xn der gleichen- Tysise wie in Beispiel 1 wurde 9-p-

D-Ribofuranosyl-7-deazaadenin mit Chlortriphenylmethan in » ·

Pyridin zu 9-(S^O-Tripiionyimethyl-ß-D-ribofuranosyl,)-7-deazaadenin umgesetzt.
Beispiel 6

9-(5'-O-Triphe nylmethyl-ß-D-ribofurano3yl)-6-mercaptopurin.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 9-ß-D-ribofuranosyl-ö-mercaptopurin mit ChIortriphenylmethan in Pyridin zu 9-(5^l-0-Trii-lienylmethyl-ß-I)-ribofuranosyl)-6-mercaptopurin umgesetzt.
Beispiel 7

3-(5'-0-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-uracil.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 3-ß-D-ribofuranosyluracil mit Chlortriphenylmethan. in Pyridin zu 3-(5^f-0-Triphenylmethyl-p-D-ribofuranosyl)-uracil umgesetzt. Beispiel 8

1-(5'-O-TriÄrhenylmethyl-ß-D-ribofurano syl)-5-fluoruracil.

In der gleicaen Weise wie in Beispiel 1 wurde 1—ß-D-ribofuranosyl«-5-±Tuoruracil-mit Chlortriphenylmethan in Pyridin zu l~(5^l-0-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-5-fluoruracil umgesetzt.
Beispiel 9

1«(5»-O-Triphenylmethyl-ß-D-ribo'furanosyl )-5-trifluor-

methyluracil.

- 23 -

-909887/1786 BAD ORIGINAL .

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 1-ß-D-Ribofuranosyl-5-trifluormethyluracil mit Chlortriphenylmethan in Pyridin zu !-(S'-O-Triphenylmethyl-ß-D-rilDofuranosyl)-5-trifluormethyluracil umgesetzt.
Beispiel 10

!-(S'-O-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosylJ-S-inethyl-cytosin.

In der gleichen Weise'wie in Beispiel 1 wurde 1-ß-D-Ribofuranosyl-5-methylcytosin mit Chlortriphenylmethan in Pyridin zu l-CS'-O-Triphenylmethyl-p-D-ribofuranosyli-S-methylcytosin umgesetzt.
Beispiel 11

l-(5^l-0-Triphenylmethyl-ß--I>-ribofuranosyl)-cytosin.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 1-ß-D-Ribofuranosylcytosin mit Chlortriphenylmethan in Pyridin zu 1- (5 '-O-Triphenylmethyl-iH-D-ribofuranosyl )-cy to sin umgesetzt. Beiapiel 12

1-(5'-O-Triphenylmethyl-p-D-deoxyribofuranoasyl )-uracil.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 1-ß-D-Beoxyribofuranoayl-uracil mit Chlortriphenylmethan zu 1_( 5«_0-Triphenylmethyl-fi-D-deo3tyribofuranoeyl)-üraoil⁴ umgesetzt*
Beiapiel 13

1-(5ι-O-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranoayl)-cytosin.

- 24 -

909887/1706

In der gleichen Weise wie in Beispiel i wurde l-ß-D-l3eoxyribofuranoayl-cytpsin mit Chlortriphenylmethan zu 1-(5'-O-iriphenylmethyl-ß-D-deoxyribofurano syl)-cyto sin umgesetzt * Beispiel 14 , ; . ..

9- (5' -O-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofurano ayl )-.adenin«

In der gleichen Weise wi/e in Beispiel wurde-'9~ß-D-Deoxyri^ofuranosyladenin mit^ Chlortriphenylmethan zu 1-(5*-O-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranosyl)-ädenin umgesetzt. Beispiel 15 ' , "- ■

9«(51-O-Triphenylmethyl-p-D-deoxyribofuranosyl)-guanin. "-■ -■"_.: ' \

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 9-ß-IKDeoxyribofuranosylguanin mi t ChIortriphenylmethan zu 9-(5» -ö-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribo'furano^^syl )-guaßin umgesetzt« Beispiel 16 _: : " Λ

9-(5¹ ^O^TripheBylmethyl^ß-i^leoxyr^ meroaptopurin» ^ .-;-■-".■ :: . ...

"-":- Inder gleichen Weise wie in Beispiel i wurde 9- ß-

D-Deoxyribofuranos^l-G-meraaptoiiurin mit Chlortriphenylmethan ;

purin umgesetzt* . ^: \ ^:

B ei a pi el 17 ' ;

1-(5'-Ö-Tripher^lmethyi-p--I)-deo3tyrxbof uranosyl )-5-fluoruracil. ^

BAD ORIGINAL 909887/1766

In der gleichen 7/eise wie in Beispiel 1 wurde 1-ρ-D-Deoxyribofuranosyl-5-fluoruracil mit Chlortriphenylmethan zu* · 1_ (5« -O-TriplienylmetJayl-ß-D-deoxjrribof-uranosyl )-5-fluoruraoil umgesetzt,
Beispiel 18

1_(5»-O-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofurano 3yl)-5-chloruracil.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 1-ß-D-deoxyribofuranosyl-5-chloruracil mit Chlortriphenylmethan zu 1- (5' -O-Tripherjylmethyl-^-D-deoxyribofuranoayl )-5-chloruracil umgesetzt,
Beispiel ig *

l-(5^f-0-Triphenylraethyl-ß-D~deoxyribofuranosyl)— 5-"bromuracil.

In der gleiohen Weise wie in Beispiel 1 vmrie 1-p— D-Deoxyribofuranosyl-5-bromuraGil mit Chlortriphenyliaethan zu 1- (5'-.0-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranDayl )-5-bromuracil umgesetzt. .

Beispiel 20

l-(5'-O-Triphenylmethyl-ß-D^deoxyribofurano syl)~5-joduracil»

In gleicher Kreise wie in Beispiel 1 wurde 1-ß-D-deoxyribOfuranüsyl~5--;joduracil mit Öhlortriphenylmethan zu l-(5' -O-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranosyl )-5-;joduracil umgesetzt.

- 26 -

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Beispiel 21 , .

9_ (5 *-O-Triphenylmethyl-p-P-deoxyrilDofurano syl )-hypoxanthin. *

.,_■.■ In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde 9-ß-D-Deoxyribofuranosyl-hypoxanthi.n mit Chlortriphenylmethan zu 9- ("5 '-O-Triphenylmethyl-ß-.D-deoxyribofuranosyl )-rhypo xanthin umgesetzt.
Beispiel 22

9- ( 5' -O-Triphenylme thyl-ß-D^deoxyribofurario syl )-xanthin*

In der gleichen weise wie in Beispiel 1 wurde 9-p-D-Deoxyribofuranosyl-xanthin mit Chlortriphenylmethan zu 9-(S¹ -O-inripheftylmethyl-ß-D-deoxyribofuranosyl)-xanthin umr gesetzt.

In der gleicher; Weise wie in Beispiel 1 können andere 5V-0-Triphenylmethyl, 5^f-0-(p-HethoxyphenylO-diphenylmethyl- odier 5 f -O-bie- (p-Me thoxyphenyl )'-phenylme tliyl*ribof urano si de und.-Deoxyribofuracoside; der Formel XIII

XtIt

BAD

in der X, Y und T die 'gleiche Bedeutung wie oben haben, hergestellt werden, indem ein Ribofuranosid bzw. ein Deoxyribofuranosid der Formel IX mit Chlortriphenylmethan (Tritylchlorid) oder Bromtriphenylmethan, Chlor- oder Brom-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethan' bzw. -bi3(p-Methoxyphenyl)-phenylmethan umgesetzt werden. So hergestellte Verbindungen der Formel XIII sind beispielsweise ^-(S'-O-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-guanin, l-(5'-O-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)—5-chloruracil, l-CS'-O-Tripheriylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-5-bromuräcil, l-(5'-0-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranoayl)-5-joduracil, 9-(5'-O-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-hypoxanthin, 9-(5'-O-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-xanthin, l-(5'-0-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranosyl)-thymin, 9- ' (5'-O-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranosyl)-7-deazaadenin, 5-(5'-0-Triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuränosyl)-uracil, 1-(5'-O-Triphenylmetiiyl-p-D-deoxyribofuranosyl )-5-trifluormethyluracil, !-(S'-O-Triphenylmethyl-ß-D^deoxyribofuranosyl)—5-methyloytosin, !-^"S'-O-Cp-MethoxyphenylJ-diphenyliaethyl-ß-Iideoxyribofuranosyl_7-uracil, l-/~5^f-0-Bia-(p-methoxyphen|yl )-phenylmethyl-(i-D-deoxyribofuranosyl_7-^uracil, l-/~5* -O-Biβ (p-me thoxyphe nyl)-phe nylme thyl-ß-D-deoxyribof urat» syl^Z-oy to sin und dergleichen.

Beispiel 25 ■

ΪΓ-BeiizoJl-I-(Z* ,3'-di-0-benzoyl-ß-D-arabinofuranosyD-cytosin.

-28 -

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Eine Mischung aus 6,2 g !-(S'-Or-D-arabinofuranosyl !-cytosin, 40 ml trockenen Pyridins und 6 ml Benzöylchlorid wurde beil»· Raumtemperatur (24-26⁰C) 20 Stunden lang gerührt» „Das so erhaltene Reaktionsgemisah wurde dann in 500 ml kaltes Wasser gegossen und bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt., -!Der, wässrige Anteil wurde dann dekantiert, und der restliehe gummiartige Stoff wurde zweimal in Wasser durch Dekantieren gewaschen. Der Gummi und diefestenr Stoffe wurden in 150 ml Methylenchlorid gelöst, und- diese lösung wurde zweimal mit 50 ml—Anteilen- Wasser und einmal mit 50 ml einer gesättigten, wässrigen Fatriumchloridlösung extrahiert. Die Methylen-Qhloridlö sung wurde dann getrocknet j indem sie durch ,10 g wasserfreies Natriumsulfat^aUf einem Sinterglastrichter geleitet wurde. Das !Erocknungsmittel wurde dann mit 20 ml Methylenohlorid gewasöhen_r und die Waschlösungen wurden mit .dem trat vereinigt. Die Methyj.enöhlx>iridiösuiJg wurde dann bei 40⁰C

in Vakuum verdampf t» Der so erhaS*^ne Ru^kstk^ ml

Ohloroform gelöst und unter Rühren mit 6,/| ml einer liösung von Bromwasserstoff in Essigsäure ($0^ Wasserstoffferomid). toö» handelt. Fach 3 Minuten wurde das Reafctiohsgemiseh/bis zii einem Volumen von ungefähr 10 ml bei 40°_;0 im Vakuum eingeengt, Dieses. Eonaentrat wurde mit 10 ml ohloroform verdünnt uM ih eine chromatographische Säule, die mit 100 g Silikagel (Säulenvolumen 180 ml) gefüllt warj. gegeben. Das ver//endete Silikagel yvar Brinkmari-Kieselsäure für die Chromatographie_t undi es wurde mit Kohlenwasserstoff stabilisiertes, alkoholfreies Ohloroform '

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verwendet» Die Säule wurde dann mit 3 Säulenvolumina (540). ml-A'thanol stabilisierten Chloroforms bei einer Fli.essgeschwindigkeit von ungefähr 3,5 al Je Minute eluiert. Der Ablauf ■wurde-bei dieser Arbeitsweise verworfen. Die Säule wurde dann mit 1,2 1 mit Äthanol stabilisierten Chloroform:?, dem 3 *Völum-$ Methanol zugesetzt worden waren, bei einer Fliessge— schv/indigkeit von 3,5 ml Je Minute eluiert. Der Ablauf; wurde bei dieser Arbeitsweise in 20 ml-Fraktio nen gegammelt. Jede' Fraktion wurde auf die Anwesenheit von !Dripnenylkarbinol oder bis(£riphenylmethyl)-äther untarsucht, indem ein Tropfen jeder Fraktion auf ein Blatt Chromatographiepapier (Whatman JJo.40) gebracht und der Fleck auf Ultraviolettabsorption untersucht und hernach das Papier mit 50fo wässriger Schwefelsäure besprüht wurde. Aufgrund des Ergebnisses dieser Chromatographie scher Bestimmung wurden die Fraktionen 25 bis 43 vereinigt, mit 200 ml Wasser, das 0,5 ml Pyridin enthielt, gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum 0u einem Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand ivurde aus Ithylaeetat und Skellysolve B-Hexanen mit Kühlung auf 4⁰C umkriataLlisiert.·■ Is wurden 3 Kristallanschüsse ^esaiimielt,die, wie die Dünn- ^; schiehtchromatog^aphie unter Verwendung von Silikagel, 10^ Methanol und 90$ Benzol ergab, alle homogen waren» Die Sesamtausbeute in den 3 Anschüssen betrug 1,45 g, 0,94 g und, 0,74 g. Insgesamt wurden 3,13 g (44?έ) N^-Benzoyl-l-Ca¹ ^•-di-Ö-bei^oylß-D-arabinofuranosyll-cytosin mit einem Schmelzpunkt von 177,5 bis 178⁰C erhalten.

- 3,0 -■

BAD ORIGINAL

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BaiSDlal 24 ·-. / . V

N^-Acetyl-l- (2 *, 3 '-di-O-ac etyl-5' -O-t-riphenylme thylß-B-arabinof uranosyl )-ey tosin.

Eine Suspension von 750 mg l-CS'-O-Tripkeiiylmetnylß-B-arabinOfuranosyl)--cytosin in 9 ml Pyridin wurde mit 3 ml Essigsäureanhydrid so lange verrührt,/bis eine eiriheitliehe Lösung entstanden war. Dann wurde noch 2 Stunden lang weiter gerührt, worauf die liösung in eine kristalline Masse überging. Dieses Material wurde in 50 ml Wasser üb erg efülirt ^ worauf ein weisses kristallines Material durch Filtration abgetrennt wurde. Es wurde gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet und ergab 950 mg eines Peststoffs, der bei 24-8-249,5⁰O schmolz. Nach dem Umkristallisieren aus Äthanol wurden hieraus 800 mg farblo3er Kristalle von ϊΑ*Ac etyl-1-(2' ₁3« -di-O-acetyl-5·-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit ei ziem bchaielz-i puiÄt von 251-252⁰G erhalten.

Analyse: Berechnet für ⁰^AjN₃O₈: G 66,76| Ή; 5*4£| K 6,67. Gefunde» : G 67,04t H 5,47i N 7,00.-

Belapiel 25

. ■ ί

Ir«(fi-Cyolopentylpropionyl)-1-^"2¹,3'-di-0-(ß-oyolo-

penthylpropionyl)-p-D-arabinofuranoayl_-7-oy tosin.

' In der in Beispiel 23 angegebenen Weise wurde 1-(5«-0-!Triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranDsyl).cytosin mit ß-CyolopentylpropioKylchlorid in Pyridin umgesetzt und anschliessend mit in Essigsäure gelöstem Bromwasserstoff behandelt. Es

50 9 807/mS- ν ;^i- BAD OR₁QlNAL

wurde I⁴'-(|j-CyGlopentylpropioröri)-ß-/"2^l ,3'-di-O-( fa-cyclop entylpropionyl)-p-D-arabinoxuranosyl_7-oyfcosin erhalten.

Beispiel 26

Kr-Lauro_<y"l-1-(2^I , 3'-di-0-lauroyl-(3-D-arabinofuranosyl)-cytosin.

■Irr der in Beispiel 23 angegebenen Weise wurde 1-(5'-O-Triphenylmethyl-fj-D-arabinofuranosyl)-cy t.osin mit L^-uroylchlorid in Pyridin umgesetzt und anschliessend mit in Essigsäure gelöstem Bromwasserstoff behandelt, es wurde N -Lauroyl-l-(2', ii'-di-O-lauroyl-ß-D-arabinofuranosyli-cytosin erhalten.

Beispiel 27 ■

ΪΓ -Decanoyl-1- (2', 3' -di-O-decanoyl-p-D-arabino-furanosyl)-cytosin.

In der Iv. Beispiel 23 angegebenen Weise wurde 1-(5¹-O-Triphenylmethyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit Decanoylohlorid in Pyridin umgesetzt und anschliessend mit in Eijsigsäure gelöstem Broniwasaerstof C behandelt. Es wurde N-Decanoyl—l-(2·,3^l-di-0-deeanoyl-p-D-arahinofuranosyl)-cytosin erhalten. ·

B ei, 3 piel 28

möthyl-p-D-arabinofurarosyl)-Gytosin.

- 32 - ■

BAD

90 9887/1786

In der in:Beispiel 24 angegebenen weise wurde 1-(5«-O-!Eriphenylmetny^ mit Pro-

pionsäureanhydrid in Pyridin zu K^-propionyl-l-Cs»■,S'-di-O^ propionyi-S'^O^triphenylmethyl^ß-IJ-aralD umgesetzt. ■

Beispiel 29 ;: ' "/" - ; ' '

ΐΛ-Butyryl^l-* (2 S V -di^O-butyryl^'^Örtriphenylm e tnyl-β-D-ar abino f urano syl) ·-ay to si n.

In der in Beispiel/24.angegebenen Weise vmrde 1-(5^l-0-Triphenylmethyl-ß-ll-'ärabinofuranosyl)-cytosin mit Buttersäureanhydrid in Pyridin zu N -Butyryt-l-f {2*, ^«-di-O-butyryl-. 51-O-triphenylinethyl-ß-D-ara.binofur.anosyl)-oytosin umgesetzt,

Beispiel 30

phe nylme thyl-ß-D-arabinpf ur ano gyl )-cy to si n·

In der in Beispiel 24 angegebenen Weise wurde 1-(5^l-0-Tripnenylmethyl-ß-I>-arabinofuranosyl)-cytosin mit Phenyl es3igsäureahhydrid in Pyridin zu N -PhenylacetyI-l-(2' ,3'-idi-

i ■

O-phenylacetyl-S^-O-triphenylmethyl-ß-B-arabinofuranosyl )·· oytoöin umgesetzt, *

Beispiel 31

N⁴'--Hexanoyl-1-(2^I , 3'-di-0-h.exanoyl-5 '-O-triphenylmeth/l-jj-D-arabinofuranosyli-oytosin.

ÖÖS Ml1111?

1520631

In der in Beispiel 24 angegebenen Weise wurde Ϊ-(5«-O-Triphenylmethyl-ß-ü-aralpinofuranosyi )-oytoain mit Hexansäureanhydrid in Pyridin zu Ef »Hexanoyl~l-(£^r, 3'^di-O-hexanoyl-5 * -0-triphenylmethyl*-^~D-aral5inpf uranoayl )-cytosin umgesetzt, , · . *

Beispiel 32

Ir-Phenylpropionyl-1*(2* „ 3' -di-O-piienylpropionyl-5'-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-oytosin.

In der in Beispiel 24 angegebenen Weise wurde 1-(5*-0-Triplienylmet]:iyl-|j-D-arabinofuranosyl)-Oytosin mit Kienylpropionsäureanliydrid in Pyridin zu N -Phenylpropionyl-l-(2^t ,3^fdi-0-phenylpropionyl-5^l-0-tripnenylinethyl--ß-I)-arabinöfuranosyl)'-cytosin umgesetzt.

In der in Beispiel 24 bescliriebenen Weise können andere Sr-AOyI-I-(S¹ _f3¹-di-0-acyl-5'-0-triph.enylmethyl- und *(p-i»ethoxyphenyl)-diplienyliaetiiyl·» unät «Msip^m^tiiQxypliQnyli*- pbenylmethyl^ß*D-arabinofuranpsyl)*aytoi3in (III) hergestellt werden, indem 1-(5'-O-triphenylme^tliyl*ß*I)-arabin<3!furaiit>eyi)<«· cytoain oder die p-meiäiöxyeubstituierten Analoga mit einem. Säureanhydrid. einer Kohlenysrasse 3toffk ar bonsäure mit 2 bis Kohlsn9tofta|;öm#n umgesetzt werden.* Eepräsentatirö Cytosine der formel ΙΙίι die so hergestellt werden können, eindl N^-Valeryl*!*(2», 3«-di-Q-valsryl-S »-O-triphenylmethyl-p»!),-arabinofuranosyl)*oytosin^ li^-Heptanoyl-l-(2', 3«-di-O-heptanoyl-

in, Ir-Öotanoy'l-

- 34 0 Ö IS $-7-/.1 1 S S ßAD ORIGINAL

1- (2 V, 3'-di-O-ootanoyi-5' -Q-Iiriplienylme thyl-.[i-D'-ar abinof uranosyl )-cyto3in, N^-Ao etyl-l-^^¹, V -di-O-aaetyl-5'-Ο-βρ-πιβ-tlioxyphenyl )-diphenyimethyl-ß-D-arabinofurano syl_7-cy to sin, tf*-Acetyl-1-/"2«, V ^di-0-acetyl-5 '-0-M&(p-nie-fciioxyphenyl )-pher|ylmethyl-ii-*D-arabinofuranosyl_7-Gytosin_> Ti^pherylp l-^/~2',-3^f -di-0-i)henylpropionyl-5'-0-(p-metliox/phenylO-di-' plienylniethyl-p-I)-arabinofurano3yl7-oytosin und dergleichen.

Beiapiel 33

In der In Beispiel 25 angegebenen Weise wurde 1-(5t-O-Triphen/lmethyl-p-ü-ribofuranosyl)-uracil mit Benzoylclilorid umgesetzt, und das erhaltene Produict wurde dann mit einer Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure zu !-(2¹,3··-Di 0-beiizoyl-}i-D-ribofuranosyl)-uracil umgesetzt.

Beispiel 14 ' ,

1^(<>·, 3«-Di-O-benzoyl'-f,-D-ribofuranosyliitnymin. In der in Bei spiel 2'5 angegeberei; Weise wurde 1-(5t-O-Tripiier^rlinetayl-fes-Ü^ribofuranosyl)-thymin mit Benzoylchlorid umgesetz-t und das erhaltene Produkt wurde dann mit, einer Lö au ng toe BroBwaäaei-stoff in Essigsäure zu .-!-■( 2' ,^-Bl l*|i-i)-l*itiofurauosyX}·thymin ixmgesetzt, L'

Beispiel 55

uracil.

BAD

In der in Beispiel 23 angegebenen Weise wurde 1-(5«^0-Triphenylmethyl-ß-DTribofuraKOsyl)-5-fluoruracil mit
Benzoylchlorid umgesetzt, und daa erhaltene Produkt wurde dann mit einer Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure zu 1-(2^I,5^I-Di-0-benzoyl-ß-D-ribofuranosyl)-5-fluoruracil umgesetzt.
Beispiel 36

N --Renzoyl-9-(2' ,3'-di-0-benzoyl-ß-D-ribofuranosyl)-7-deazaadenin.

In der in Beispiel 23 angegebenen weise wurde 9-(5*- 0-Triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-6-deazaadenin mit Benzoylchlorid umgesetzt, und das erhaltene Produkt wurde dann mit

geiner Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure zu N -Benzoyl-

9-(2',3^l-di-0-benzoyl-ti-D-ribofuranosyl)-7-deazaadenin umge- "

setzt.

Beispiel 37

9-(2·,3'-Di-0-benzoyl-ß-D-ribofuranoeyl)-6-mercaptopurin.

In der in Beispiel 23 angegebenen Weise wurde 9-*(5'-0-Triphenylme,thyl-p-D-ribof urano syl )-6-mercaptopurin mit
Benzoylchlorid umgesetzt, und das erhaltene produkt wurde dann mit einer Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure sju 9—(2^l,3^f-Di-0-benzoyl-'ti-B-^kribofuranosyl)-6-mercaptopuriii umgesetzt.
Beispiel 3&

1-(3'-O-Bs nzoyl-p-D-deoxyribofurane3yl)-uracii.

In der ir. Baispiel 23 angegebenen Weise wurde !-(5¹-0-Triphsr^lmethjrl-ß-D-deoxyribOfuranosyl)-uracil mit Benzoyl-

9 0 9 ft 8$/_1 7 β 6

SAD ORfGiNAL

3+

Chlorid umgesetzt, und das -e.rlial.tene Produkt würde dann.-mit. ■ . einei⁴ Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure zu l-(3^!>0-Benzojri-p-Ii-deoxyriiJofuranösyl )-uracil umgesetzt. Beispiel 39 - ,"■

H-Benzoyl·-};- (3' -O-Benzoyl-ß-I^deosyribofuranos/l)-oytosin* " ■■ -, . _:." ■ -■""■"-" . .',.;■ . ■* - ' ' "■.-""."■ ^;.

In der in Beispiel 25 angegebenen Weise wurde 1-(5«-O-il^iplienyinietnyl-ß-D-deoxyribofuranoäyl)»-cytosin mit Benzöyleitlorid umgesetzt, und das erhaltene Produkt wurde dann mi\ einer Lösung von Bromwasse-csiioff in Essigsäure au Έ -Benzoyl~l-(3'— Ö-l)enzoyl-ß»I5-deQxyribof^uranosyl)-oytosin umgesetzt.

Beispiel 40 ; ', . ■.■ _: "

. " !-(S'^O-BenzQylTp-D^deoxyribofuranosyl)-^^ iiracil« . » ; , ,

In der in Beispiel 23 angegebenen ψβΐse wurde 1-(5¹^- -G-- Triphenylmethyl-ß-13^ mit

Benzoylehlorid umgesei^, mndt das-^^^ mit einer Lösung von Bromwassetpstoff in Essigsäure zu !-(j¹*-

Beispiel 41 ^: _: .; ; '■ ' :" ^: ~ -

N -Be^öyl-g-C?¹-^

7-deazaadeninm . - ' . · . ■ ;

I-n der in Beispiel 23 angegebenen Tjsreise wurde 9^(5^f-"0-Irip]aenylmethyl-ß-I)--deQx₁y'ribofuranosyl)-^r|-.deazaadenin mit Benzoylclilorid umgesetzt, und das erhaltene -produkt wurde dann

9098t?/1?lf

■ BAD ORIGINAL-

mit einer Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure zu Ή - ,,

Benzoyl-9- (3* -O-benzoyl-p-B-deoxyribofxxraflösyl )-7*deazaadeHin · umgesetzt. , , „: .

Beispiel 42 . . ■

9- (3' -O-Benzoyl-ß-D-deQxyribofurahogyl )-6-mert}aptQ— purin* "

In der in Beispiel 23 angegebenen Weise wurde 9-(5' — O-Triphenylmethyl-ß-D-deoxytibofuranosyl)—6-mereaptopurin mit Benzoylchlorid umgesetzt, und da3 erhaltene produkt wurde dann mit einer lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure zu 9-(3^f-0-Benzoyl-ß-D-deo3q^ribofuranosyl )-6-mercaptopurin umgesetzt.

Beispiel 43 ·

!-(^',^•-Di-O-acetyl-S'-O-triphenylmethyl-ß-D-ribofuranosyl)-uracil.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 24 wurde 1—(5¹-O-Triphenylmethyl-^-D-ribofuranosyl)-uracil mit Essigsäurean-

furano3yl)-uracil umgesetzt.
Beispiel 44 ·

1- (2 ■«■, 3 · -Di-Oxao e tyl- 5' -O-triph enylme thyl- ß-H-ribofuranosyl)-5-fluoruracil.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 24 wurde 1—(5*- 0-Triphenyliaethyl-p-D-ribofuranosyl)-5-fluoruracil mit Essigsäur e'anhy dri d zu 1- (2 * _T3^! -Di-0-ac etyl-5' -0- triph enylm ethyl-β-D-ribofur-cinosyli-iJ-fluoruracil umgesetzt,

909887/17S6

45

N⁶-Aeetyl-9-(2« ,S'-di-Ö-titopfuranoeqrl )-7«*d9azaadenin.

In der gleichen te-eise wie in Beispiel 24 wurde §~

mit

aäuraanhydrid au N⁶-Äcetyl-9-(2¹ _>3^l-'dl-0-aßety|»^rt-0»tΓipil·er]ylmethyl-ß-D-iilJofuranoayl)-?--deazaadenin^ umgesetzt. Beispiel 46 *

9-(2^r, 5 ^-Di-Q-aeetyl-S» -O-tripherorlmetiiyl-p-D-riliofiiranosyl)-6i-inercaptöpürin. ·

■- In der glQiQheM ^feise wie in Beispiel 2A vmrde 2"{5^% O-Triplienylmethyl-ß^lHriböfuranoayli^ö-mercaptopu^ mit Essigsäureariiydrid zu 9-^(2',^V-lJi^O-acetyl^S'-O-trip^eÄyliaetJayl-p-B-rlbafuranoayli-oHQiercaptdpurin umgesetzt* .

Beiapial 47 _ '.' _ - -- \ _' . /

l-(3«-0-Pfopionyl-5'-0-triphenylmethyl-|3-D-deoxyribofuranosyl)-uracil.

In der gleiciien weise wie in Beispiel 24 wurde 1-(S¹ O-Tripheiylmetiiyl-p-D-deoxyriboiuranosylJ.uracil mit propionsSuraanhydrid zu !-(^'-O-Propionyl-S'-O-tripuenylmethyl-fi-D-deoxyribofuranoeyl)-uracil umgesetzt,
Baiseiel 48

χ.(31-O-Prqpioryl-5'-0-triphe nylmethyl-ß-D-daoxyribofuranoayl)-5-fluoruraoil,,

In der gleichen ^eise >vie in Beispiel 24 wurde l-(5' O-Triphenylcethyl-p-D-deoxyribofiiranosyl)-5-fluoruraoil mit

- 39 -9 0988 7/t716

'<■ BAD ORIGINAL

propionsaureanhydrid zu 1-(3'-0-PrOPiOrIyI-S'-O-triphenylmethyl-μ-D-deoxyribofuranosyl)-5-fluoruraGil -umgesetzt. Beispiel 49

9- (3' -O-Propionyl-5' -O-triphenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranosyl)-6-inercaptopurin.

In der gleichen preise wie in B.eispiel 24 wurde 9—(5* — O-Tripiienylmetüyl-μ-D-deoxyribof ur anosyl)-6-merc aptopuriη mit Propionsäureanuydrid ^u S-O'-O-Propioriyl-S'-O-triphenylmethylj -D-daoxyribof uranosyl)-6-mercaptopurin umgesetzt. Bei S₁A el 50 ' ■-.... ivr;->-

Il - Ag e tyl-1-(2 ·, 3 '-di-0-ac etyl-p-D-arabinof uranosyl )-cytosin uni l-(2',^'-Bi-O-acetyl-p-D-arabinDfuranosylJ-cytösin.

Eine Suspension von 10 ml 80$iger, wässriger Tjjssig-Sdure und 1,3 g H⁴-Acetyl-l-(2^!,.3»-di^0-abe"tyl-5^f-0-triplieryliiiütiiyl-,b-D-arabirofuranosyl)-cytosin wurde am Rückfluss 10 Minuter lang erhitzt. Die Suspension wurde dann abgekühlt, frei vor Triphenylcarbinol filtriert und in Vakuum bei einer-rpemperatur zwiachen 30 uni 4O⁰C eingedampft. DaJ Produkt wurde in 20 ml iviethanol aufgenommen und auf eine Säule gegossen, die 200 ml Kieselsäure, -lie in Benzol aufgeschlämmt war, enthielt. Die Säule wurie dann mit 30 20 ml Fraktionen, die aus Methanol (2570 ur.d Benzol (l5'f°) bestanden, eluiert. Die Fraktionen 5-11 ' «Turien ver. inigt und a^s Aceton-Skellysolve-B-Hexanen umkristallisiert. Es v/urlen 240 mg eines bei 171-172,5 C schmelzenden Materials geworden. Dieses produkt wurde aus der gleichen

- 40

909887/1716

Mischung iron lastingsmittein. zu 'IS -Aeetyl-l-^;f2' -,3 ';-di-O-acetyl- -D-^arabinofurano SyX)-Cy to si-η umkristallisiert/(Schmelzpunkt 174,5bis 175,5⁰C). ■ V

Analyse für . ^ci5^HiA°8

Berechnet " C 48,7Sj H 5,19} N 11>38. : -V _; .Gefunden O 48,79; H 4,81$ Ii 11,66V _v ':

Die Fraktionen 26 Ms 29 enthielten eine geringe Menge l-(2',J'-Di-O-aoetyl-ß-B-arabihofuranosyli^cytosin.

'B ei a pi el 51 _: ",. ""■" : '_';'■ ., / ..-■:'■

H -Ani soyl~l- (2' , 3' ^di-O-b enzoyl- ρ-~ΰ-ärabinöfurano syl )-cytosin. _r

A Ii -AnisOyl-l-ß-D-.arabinofUranosylQytosin. 5 g l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin und 25 ffil Anisoylehlorid vvur-len in 100 ml. Pyridin gelöst, und die lösung ;mirde bei unge- ±^kähr 25°C 6 Stunden lang gerührt* Zu dieser MiscJaung wurde 400 ml 1,5 normale Chlorwasserstoffsäure gegeben und die so erhaltene Lösung blieb übernach bei Eaumteiaperatur zwischen 22 und 24⁰C stehen.' Die Peststoffe ^jnirden^^ dann f 11 triert, gewaschen und gründlich:mit Wasser gemahlen und an der Luft getrocknet. Sie »yur-Ian daratif in einer lisahung die aus 375 ml Wasser und 250 ml Jithanol bestand und die auf 70⁰G auf einem Dampfbad erhitzt wurde, suspendiert. Die rohe Suspension /wurde dann auf 4⁰C abgekühlt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von IN -

" "-' ^: - 41 - - ■■"■■■■■ ; :.^: : ;

SÄÖ ORJGiNAU

Matriumhydroxydlösung auf 8 eingestellt. Die unlöslich en Feststoffe wurden gleich danaqIt abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der luft getrocknet und //ieder mit 300 ml Äther gewaschen, filtriert und getrocknet. Es v/urlen 16,6 g rohes N -Anisoyl-l-ß-D-arabinofuranosylcytosin erhalten.

Dieses Rohprodukt wur ie mit 195 ml Pyridin und 65 ml Wasser aufgenommen und auf Eistemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde dann unter lebhaftem Rühren mit 350 ml 1,5 N Tjatriumhydroxyd eine halbe Stunde lang behandelt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 350 ml Dov/ex 50 χ 8 (50-100 Maschen) Pyridinharz beendet, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei einem pH—Wert von 7_r0 gerührt. Unlösliches Material wurie von dsr Lösung abfi.-.triert, und der erhaltene Rückstand wurde mit Wasse-r gewaschen. Die voreinigten Filtr3te wurden im Vakuum bei 5O⁰C zur Trockne eingedampft, und ler Rückstand wurde mit 3 200 ml Portionen Äther gerührt und filtriert. Der Feststoff wurde dann in 300 ml siedenden nassers suspendiert und filtriert. Dieser Voi'gang wurde dreimal wieJerholt. Die vereinigten Filtrate wurden zu einem kleinen Volumen unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 2,0 g eines Produktes erhalten, das nach dem Umkriistallisiaren aus Wasser bei 197-20O⁰G unter zersetzung schmolz. Dieses Rohmaterial wurde 4 mal aus Wasser und einmal aus Äthanol umkristallisisrt und lieferte reines ET -Anisoyl-1-ß-D—arabinofuranosylcytosin, dafe bei 200,5 bis 201,5⁰O unter 72rsetzung schmolz.

- 42 -

909887/1786 ■ ·

1620831

Analyse: Berech.net für C^Ii₁₉Ii₅O₇: C 54,11} H 5,08} Έ 11,14.

Gefunden . _; ' : G 54,38} H 4,82} H 11,31_T »

In der gleichen weise wie in Bei spiel 51A werden andere ir-AGyl-l-fi^II-axatoinofuranosylcytosin durch Erhitzen von l-p-D-Aräbinofuranosylcytosin mit einem wie oben definierten Säurechlorid einer Kohle nwass er st of fk arbonsäure und selektives Hydrolysieren des rnriacylderivates "des l-fi-D-Arabinofuranosylcytosins bei niedriger- !Temperatur mit einer Base zu N -Acyl-1-ß-D-arabinofuranosylcytosiii toergestellt.siSepräsentative Verbindungen, die so erhalten Y/erden, sind beispielsweise IT -Ben-, zoyl-_s Ir-Pheny!acetyl-, H -PhenylpropiozQrl-j Ef -lauroyl-, -, E⁴-propionyl-, W⁴-Butyryl-, I^-frexanoyl-^ Π^- Kd Ii -Decanoyl-l-ß-D-arabitiofuranosylcytosin.

B· K—Anisoyl-i-if^'-O-ip-ir.iith.oxyphenylKdipheriylme thyl- (5-D-arabi tof ^ur ano syl^J-cy to si η.

Eii'Q 'Lc suiig von 4»β g F -Anisoyl-l-fi-D-arabiiiofuranosylcytosin in 50 Eil Pyridin mirde iait Chlor-Cp-aetiioxyi-hen/l)-diphenylmethan behandelt. Räch 9 Stunden wurden 10 ml iiethanol zugegeben, und die Pyridinlösung wurde unter fiühren in 600 ml Wasser gegossen; ein Gumuii begann sieh zu bilden. Wenn das gesarnEite guimftiartige Material koaguliert war, wurde die Lösung dekantiert, der Güinmi wurde -mehrere Male mit passer" 'durch De'--kantier^en gev/aschen und dann in iiethylerchlorid gelöst. Die Methylenealoridlösung wurde zweimal mit Wasser gewaschen und einnal mit gesättigter Uatriumchloridlösung gewaschen. Dis Lc--

Θ09887/1766 *

BAD ORIGINAL

sung wurde -dann iiber wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 3O⁰C in Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in Benzol gelöst und dann auf einer Säule, die Silikagel (5,8. χ 48 cm), das in Benzol aufgeschlämmt war, enthielt , absorbiert, und die Säule wurde dann mit 20 100 ml Fraktionen aus 2$ Methanol und 98$ Benzol und dann mit 40 100 ml-Praktionen aus 5^cß> Methanol und 95 i<> Benzol eluiert» Die Fraktionen 49-60 wurden vereinigt und mit Äther verrieben. Der erhaltene kristalline Feststoff wurde vereinigt und mit Äther gewaschen. ]5]s wurden 4,21 g rohes Έ -Anisoy 1-1-/""5'-O-(ipmethoxyphenyl)-diphenylmethyl-i.b-D-arabinofuranosyl_7-^cy'tosiii emalten.

In der-gleichen weise wie in Beispiel 51B könnenandere IT -Acyl-1-,Γ"5' -0- (p-methoxyphenyl )-diphenylraethyl-j5-D-arabinofuranosyl7-cytosine hergestellt -werden, indem als Ausgangsstoff N -Acyl-l-j.—D-arabinofurano syl cytosine verwendet werden, in denen die Acylgruppe zu einer Kohlenwasserstoff- -karbonsäure mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen gehört» In dieser y/.eise werden N -peir.oyl (oder Phenylacetyl-, Ehenylprdpionyl—, Lauroyl-, Acetyl-, rropionyl-, Butyryl-, Hexanoyl-, Octanoyl; Decanoyl)-l-/~5 '-O-Cp-iaethoxyphenylJ-diphenyll-diphenylmethyljj-D-arabinofuranosyl7-cytosine erhalten.

C,.' N^-An-Lsoyl-1^(2«, 3«_ü_0-benzoyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cyte sin.

4 g N -Abisoyl-1-/5'-O-Cp^methoxyphenyl)-diphenylmethyl-p-D-arabinofuranos2;l7-cytosin in 20 ml trockenen Pyri-

- 44 -

6AD

909887/1766 ;

dinsrwurden mit 3 ml BQiizoylchlbrid behandelt.: Das ■Reaktions-.gemisch blieb in einem verschlossenem .Gefäsa.ia„situnden lang bei Raumtemperatur stehen und wurde dann in Eiswasser gegossen und 3 Stundenlang bei ungefähr. 25⁰C gerührt, wodurch sich ein gummiartiger Feststoff abschied. Dieses Rohprodukir wurde mit 50 ml—Portionen Methylenehlorid extrahiert, die Extrakte wurden vereinigt, 5 mal mit 'fasser und einmal mit gesättigter, wäss— ■ riger Fatriumdhloridlösung gewaschen, darauf über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde unter vexmindertem Druck zusammen mit Toluol· destilliert» um restliches Pyridin zu entfernen, und der so erhaltene Rückstand wurde in 50 ml Dioxän aufgenommen und mit SO^iger, wässriger Essigsäure behandelt* Zu dieser Lösung wurde so viel Chlorwasserstoffsäure gegeben,,- dass eine 0,03 F Lösung entstand. Die !iüchung blieb dann-5 Stunden lang stexisn. Die Lösungsmittel -wurden im. Vakuum bei 4Q⁰C abgedämpft, •und der Rückstand wurde mit 100 ml 1:1 Chloroform-lthanol- Mischung behandelt. Die Chloroform--Äthanol-^Mi3Cj;iung,;wurde dann abgedampft, Dei so erhaltene Rückstand wurde in Chlorofdrai auf-« genommen und auf einer Säule (2,8 cm Durchmesser," 40 cm; Hijhe, 250 ml Säulenvolumen), ,die mit Silikagel, das mit Chloroform aufgesehlämmt wurde, gefüllt war, absorbiert. Die Säule wurde dann mit 4 250 ml-Fraktionen Chlorofo'rm. das: 0,75^ Xthanoi enthielt* und anschliessend mit 6 25Ö. ml-Praktionen öhlordförm, das 3^ Methanol enthielt, eluiert. Die Fraktionen 5 bis 8 wurden vereinigt .und auf einer Silikagel-Säule- ,(2,8 cm χ 50 cm)

909887/1716

vereinigt« Diese Säule wurde dann mit vier Säulenvolumina Chloroform und anschliessrjed mit zwei Liter 3$igen Methanols in Chloroformlösung eluiert. Die Eluate wurden in Fraktionen zu je 20 ml bei einer Säulengesehwindigkeit von 5 ml je Minute aufgefangen. Die Fraktionen 46 bis 54 enthielten 220 mg des gewünschten Materials, das dann aus Äthylacetat-Skelly solve B-Hexanen auskristallisiert wurde (Schmelzpunkt 172 bis 173°C). Dieses Material war reiras if -Anisoyl-l-(2^f , 3'-di·*0-benzoyl-μ-D-arabinofuranosyl)-cytosin»

Analyse Berechnet für C₃₁H₂₇If₃OQ: C 63,58} H 4,65; Ii 7,18. Gefundaii : C 63,62; H 5,12; ti 7,23.

Im Bai spiel 51 und den nachfolgenden Beispielen werden verschiedene Ionenaustauschharze (Dow Company) verwendet, die wie folgt beschrieben werden können: Bowex 50 χ 8, Dowex 50 χ 8 ist ein starksaures Karfcionenaustauschharz, das aus Kernsulfonsäure-Austauschgruppen, die an ein Styrolpolymer-Gritter geknüpft sind, das mit ungefähr 8$ Divinylbenzol vernetzt ist, aufgebaut ist. -

Dowex AG 50 χ 8, ■

Dowex AG 50 χ 8 ist eine speziell gea?reintg1;e Form« bestimmter Grosse dieses Dow Company-Harzes und wird von Bio-Rad laboratories of Richmond, Kalifornien geliefert.

Dowex 50 W χ 8. .':"'t

Dowex 50 W χ 8 ist eine speziell gereimgte Form des Dowea: 50 χ 8, in dsr das Harz nicht die gelbbraune Farbe des

BAD 90 9 887/17i6

des Dowex 50 χ 8,' sondern eine weisse (W) Farbe äufi weist." ■■■'■"""■'":. - ■": ■ ''V _: ,- · · . -- "■· --■ ■ ■_■--■ Dowex 1 χ 8,^{; r} ···

Bowex 1 χ 8 ist ein starkbasisclxes

Anione«äustauschiiar2, das aus quaternär en Ammoniumaus^ tauseligruppen, die an ein Polymergitter der otien besoliriebenen Art geknüpft sind, aufgebaut ist. Dowex AG 1 χ 8. ' "^:

Do'wex AG 1x8 ist eine spaziell

gereilctgte Form besticiBiter trosse dies as Bow Goitipäriy-Harzes und wird von Bio-Rad Laboratories of Bicnmondi Kalifornien geliefert.

In dor ir» Beispiel 51C ängegeiienen

preise werden andere W -Acyl-l-C^·, iJ'—di-G-aeyi-fj-D-arabinofuränosyl:)-cyto3iiie liergest^ll t, inleri ein IT-Acy ΐ-1-^5' -O- (p-metxioxypiienyl J'-dii·'^^.?!?'-'" e thyl-b-B-arabi-nofuranoSylj^cytösin äoyliört und der /vther zu dem entsprecJiende-n priuiären Alkoiiol auiVifispäiltsii ',vii'd'l Repräsentative Verbirdüngen, die so smalten v/erden können, sind beispielsweise F^-_τϊβηζ;ον1--1-(2^ι _y3'-di~0-■ äcetyi-p-B-ärablliofUranösyl)cytosinj H—Phenylacetyl-

L-l-^;(2*, 3'^di~0-propionyl^S-3^ärabino-

furanösyl)-cy to sin, N -Pnenylpropiohyl-l--(2¹^ 5¹^dI-O-

'-." ;■■■«./" ■ '* ""; ^: ".'" ■.■■-■- 47 - "■■' ■■■."■ ' ..^:''■■". .

9 0 9 867/ ^l 716 ■ ι bad original

T620631

decanoyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cyto sin, N -Lauroyl-1-(2¹,3^l-di-0-valeryl-ß-D~arabinofuranosyl)-catosin, Ii -Ac etyl-1-(2¹, 3 '-di-O—benzoyl- ß-D-arabinof urano syl )-cytosin und dergleichen.
Beispiel 52 ' -

F -Butyryl-l-(2', 3^l-di-O-butyryä?l-ß-D-arabinOfuranosyl)-cytosin.

In der in Beispiel 50 angegebenen

4 ■ .

Weise wie IT -Buty"ryl-l-(2' ,.3^i;-"di-O-butyryl-5^l-O-triphenylmettLyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit wässriger Es tilg säure· erhitzt und liefert N -J3utyryl-1-(2', 3'-di-0-butyryl-p-D-araDinofuranosyl )-cytosin, Beispiel 55

F -Pi.'isnylacetyl-ß-(2^l _t3^l-di-0-phenylaceLy·l-|3-D-ärabir:of'αranosyl)-cytosin.

In der in Beispiel 50 angegebenen

Weiü3 wird H -Piienylacetyl-1-(2¹, 3^t-di-0-phenylaeetyl-5'-'O-triphenylm3thyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit wässriger Essi-skure örnitzt und ergibt ΪΓ-Phenylacetyl— l-(2' , 3^r-di-0-prieriylacetyl-ß-D-rarabinof urano sylJ-cytosin,

Beispiel 54

i7⁴-HexaKoyl-l-(2», 3'-di-O-hexanoyl-,-.-D-ai'abinofur iKosyl )-cytosin.

- 48 -

- 9 0 9887/1716

- . BAD ORIGINAL

hi.,^ν. :;■· :

:"'"■ In der: in Beispiel 50 angegebenen - ;.

Weise wird Ii^-Bexanoya-l-(2· ,3^l-di-0-hexäMoyl-.5^--0* tripiienylmethyl-ß-D-aratiinofUranosyl)cytosin" mi t ; wässriger Essigsäure erhitzt und liefert IT-fiexanoyl-1-

Beispiel 35 ;\ - _ ;,.-■'_.-./-

J^-Phe^lpropiOnyl-1- {2 ·, 3 ^r-di-öpropionyl-p-D-arabinofUranDSyl)*-Gytosin. ;: '"-'.." ■

In der in Beispiel 50" angegebenen -

Weise wird N -Pnenylpropiönyl-l-X^¹,3'-di-p-phenylpropionyi-S'-O-triphenylmethyl mit

wässriger Essigsäure erhitzt und;liefert N-Bisnylpropionyll-(2^f, 3'-dl—0-p]ienylpropionyl-ß-I)-aral)iHofuranosyl)-öytosin» -^; ^ .--/.. _: ".; ■",,...

In der gleialien Weise wie tn Beispiel 50 sind andere W-Äajl-l-(2* ^'-di-Q-acyl-ß^ furanosyl)~Qytosine ernältlicli, indem das

ara>inQfura.nosyl)-cytosin mil? 'Wässriger Es^g^äure er- ./ liitzt wird, Repräaentätivs ^HeirTiindungon^ die src> erlialten« vrerden aindj iJ^-Val eryl-1-(2>, Jt-di-0-p

)-cytosin,

9887/1706

BAD ORiQiNAL

(2',3'-di-O-heptanoyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cy tosin, lr-0ctanoyl-l-(2^l,3^r-di-0-oetanoyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, Jr-^enzoyl-l-CS¹ ,3^l-di-0-benzoyl-μ-D-arabinofuranosyl)-cytosin und dergleichen. Beispiel 56

l-(3'-0-Propionyl-ß-deoxyribofuranesyl)-uraoil.

In der in Beispiel 50 angegebenen

W ei se wird 1- (3' -O-Propionyl-5' -O-triphenylmethyl-fj-D-deoxyribofu.ranosyl)-uracil mit v/ässriger Essigsäure erhitzt und liefert l-(3^l-0-Propionyl-ß-D-deoxyribof ur ano"syl )-uracil.
Beispiel 57 · ·

1-(2',3¹-Di-O-propioryl-ß^D-riböfuranosyl)-5-fluoruracil.

In der in Beispiel 50 angegebenen

Weise wird l-(2%3'-I)i-0-jiOpionyl-5^r-*0-trip]iöj3(y-lmethyl» ij-D-ribofuranosyl)-5-fluoruracil mit wässriger Essigsäure erhitzt und liefert:.l-(2*,3'-Di-O-propionyl-p-P-ribofuranosyl)-5-fluoruracil*

Beispiel 58

9-(3·-0-propio nyl-p-D-ieoxyribofuranosyl)-

6-mercaptopurin, - .

8AD

909887/ΐ 786

■ In der in Beispiel 50 angegebenen

Weise wird 9-C3^l^0-PropiQnyi-5*-0--triplienyliaet]iyl-ß-I)--deoxyribofuranosyl)~6—mereaptopurin mit wässriger Essigsäure erhitzt und-liefert 9—(3'-O-Propionyl-p-D-deoxyribofiir ano sy 1) *- 6-inerc ap topuri n. Beispiel 59

1-( 5*-O-Ac e tyl-fi-D-deoxyribo f urano syl )— uracil.

In 1er in Beispiel 50 angegebenen

Weise \vird !-(^»-O-ÄGetyl^S'-O-triphenylmetliyl-js-D-deoxyribofuranDsyl)-uracil mit v/ässriger Essigsaur erhitzt und liefert !-(j'-O-Acetyl-ii-D-deoxyribofuranosyl)-uracil* ^Λ

Beispiel 60

ribofviranosyD-T-deazciadenin.

In der in Beispiel 50 angegebenen

Weise wird N -Aeetyl-9-(2' _f I'-di-ö-acetyl-S'-O-tripheiiyl iüethyl-i;-D-ribo-furanosyl)-7-deazaadenin mit" wässriger Essigsäure erhitzt und liJ3f ort .'lr-Äeetyl-3-"(2¹V-V-Oi-O-" acetyl^ß-D-ril)ofuranosyl)-7-deazäadenin.

Beispiel 61

1-(3'-0-Bütyryl-ß-D-äeexyribofuranosy1)-

5-ioduracil.

909887717t6

*Z_■ - : Λ_; BADORiGlNAL

In der in Beispiel 50 angegebenen

ViTeise wird l-(5^t-0-Butyryl-5^l-0-triphenyliiietliyl-ß-D-deOxyribofuranosylj-S-ioduracil mit wässriger Essigsaure erhitzt und liefert l-(3^l-0-Butyryl-ß-D-'deoxyribofuranosyl)-5-ioduracil.

In der gleichen preise können andere Bibofuraneside und .Deoxyribofuranoside der Formel X hergestellt werden, beispielsweise l-(2',3^l-Di-0-aeetylß-D-ribofuranosylj-uracil, l-(2',^'-Di-O-acetyl-p-D-riböfuranosyl )-5-fluoruracil „ 9- (2', 3' -Di-O-acetyl-jd-D-ribofuranosyl)-6-mercaptopurin, !-(^'-O-Benzoyl-fJ-D-deoxyribofurano syl)-5-chloruracil, 1-(3'-0-Phenylac etylß-D-deoxyribofuranosyl)-thyiriin und dergleichen. Beispiel 6.2 . - .

ί]"°-τ>βηζο7ΐ-2^ι-., S'-O-isopropylidentubereidin*

HOCH,

H H

- 52 -

90 9887/1716

V -H

1&20631

^-iS» ,5'—0-isopropyliden-ß-I)-. ^; -Λ ribof ur ano syl)- 7-deä2aadeni ;g7 " Ί-'-

■ ".·' · A) Herstellung yon SparsomycinA-

(tuberc-idin) dureh Vergärung, ,, . . :

, Ein StthragnahrbOden. von Streptomyoes

sparsogenes ygr. 3parso.^enes,t KKRIi 2940 wurde zum Impfen einer Eeihe von^ 500 ml Erienmeyer-Eolljen. verwenJetj von-denen jeder 100 nil eines ^eiinmediums- enthielt, das sioh aus folgenden Bestandteilen zusammenaet.itei . . ■ . - ■-■■ : .;"" ...- ν -

Glucose monoiiydrat; ^v ■". 25 g .

Eharmamedia 25;g;" /

Iieitungswasser q,s. " ■-.' .11'-

x Pharmamedia ist, ein teaianiseiles Baumwollsaatmeiil^ . das von. ir ad er s 011 All. Ca. Fort Worth lexäs iierge- - ".. stellt wird* ^; ' ■ - ;-'-- /

Der Vorsterilisierungs^pH—Wert des-

Keimiiiediums -war "7,2*- Die Keime wurden Zv^ei Sage lang bei 28⁰O- auf -einem¹ Gump-DrehsGliuttelairpparat, der^mIt: 250" Fmdrehungen Je Minute-.betrieben wurde, waohsen gelassen.

Ea iffurde ein Sehüttellfcolben der^: oben

besoariebeöen Keime (100 ml) zum Iapfen> eines: 2Q- 1'Keimtanks verwendet', der 15 1 des oben beseiiriebeiaen sterilen

9BB7/t7tS

BAD

εν

Keiiuinediums (S-I) plus 1 ml/l Speeköl enthielt. Die Keime in dem Tank Iie3s man 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 28°C, einer Belüftungsge3Cii?/indigkeit von 10 Standard/l/min* und bei einer Rüargesahwindigkeit »von 400 Umdrehungen je Minute wachsen.

Der oben beschriebene Keimtank wurde

dann zum. Impfen eines 380 1 Gärgefässes verv/enlet, das

'. 250 1 des folgenden sterilen Mediums entnielt:

^; Glucose monohydrat 10 g/l

Dextrin _t 15 g/l

Pharmamedia - .20 g/l

Wilsons Peptone Liquor Nr.159" 5 g/l

Speckbl 2 ml/l

Leitungswasser Re3t

χ WiI so ils Peptone Liquor Ir. 159 ist ein präparat

; hydrolisierter Proteine tierischen Ursprungs.

Die Gärung verlief dann 113 Stunden^ während welcher Zeit die Temperatur auf 28°G ■ eingehst eilt wurde, gefilterte Luft mit einer Gesciiwindigfceit von 100 Standard l/minute zugefüiirt Und das Rühren bei 28 Umdrehungen je Minute durchgeführt wurde. Im Laufe

f der Gärung .wurde 1850 ml Specköl als Artisonäumer zugegeben. '^: - . ' '"

- 54 - ■ ■■ . ' ■ -

....,'■- .-. B) Isolierung yon Sparsoinycin A.

: Die gesamte aus der;obigeE Gärung

stammende Brühe wurde mit 350 ml schwefel öäure (kehzen~ triert) von pH 7*1 auf p 2_f4 gebracht und unter Verwendung von 3,6$ Dlatomeenerde als PiItörliilfsini"ttel filtriert* Der Mlterküöheri wurde mit 0,2 Volumen deionisi ertem V/asser gewäsafien, die klare Brühe plus W^asch-r lösung (Volumen 280' l) wurde mit 300 ml 5Q?£igern wässrigem Hatriumliydroxvd auf einen pH Wert; von 7,35 ^eingestellt und /blieb über tracht bei 10⁰C stehen. Die klare Brühe wurde clani] mit "50 ml SO^igem wässrigem lIatriußiiiydröX7d auf pH S eingestsllt und eine Stunde lang mit,I^^ EntfärbUngskolile unl 3^& Diatomit gerülirt* Die iii so hung v/urde filtrier und der Kolilenatoffkucn-en Wurde mit ÖjZ^Voluaen 2Ö^igem Wässrigem Aceton- gey/asciien« Jüör gewascheue Kohlenstoffkuchen irarfie 2 mal*mit 0,4 Voluiiren $ 50/^igem wässrigem Aceton eluiert, mit konzentrierter Schwefelsäure ^.uf pH 2,5 angesäuert und die Eluate \yurden vereinigt»--. Das vereinigte 'Acetonelüat (72; l) wurde mit 30 ml SÖ^Igem wässrigem WatriumhydroXyd auf pH 6,4 eingestellt und au einer wässrigen Lösung (40 1) eingeengt. Das Konzentrat wurls auf einen pH Wert von 5*9 gebracht und au 447 g lyophilislerteil Material gefriergetroöknety -"-; .-' -" ■■ ftls' 4iie obeiioesciirieOene. Gärung und

-"■ -55 - -

0988771706

BAD ORlGiNAL

Isolierung zwei Mal wiederholt wurde, wurden weitere 1126 g erhalten. Das vereinigte lyophilisierte Material (1573 g) wurde in 10 1 Methanol bei 4O⁰C eine Stunde lang aufgeschlämmt* Unlösliches Material wurde abfiltriert und drei Mal. mit 500 ml warmem Methanol (40°C) gewaschen. Die Metiianolauszüge und Waschlösungen. wurden vereinigt (11,5 l) und im Vakuum zu einem trockenen Präparat eingeengt (321 g; HRV-25,3» Auswertung: 1,25 Proteus vulqaris Bioeinheiten/mg). ■■

G) Reinigung von Sparsoniycin A.

Trennsäule,

300 g des oben beschriebenen Präparates (HRV-25,3) wurden in eine Trennsäule gebracht, die in folgender ','/eise hergestellt wurde. Unter Verwendung _ö-leicner Volumina (350 l) Mollvaine-pH 6,0-Puffer und rvlethyldthylketon wurde ein Lösungsmittel syst em hergestellt. Eine Aufschlämmung, die 9,6 kg Kieselgur in 60 der oberen Phaseund 4,8 1 der unteren Phase des obenbesc^risbenea Lvsuntfsmittelsystems enthielt, wurde in eine '30,5 cm-Säule gegosser und mit einem Druck von 0,28 kg/cm Stickstoff gefüllt. Das Beschickungsgut der Säule wurde in 3 1 der unterer: Phas/e gelöst, mit 1920 g Kieselgur aufgesahlijniat* und mit so viel der oberen Phase versetzt,

- 56 - . ;■

909887/1f«6

dass sie beweglich wurde» Das Gut wurdesorgfältig .. von oben auf das Bett in der'Säule gegeben,-".-das mit einer Schicht Seeaand bedeckt wurde. Die Säule wurde mit dem Lösungsmittel der oberen Phase bei einer öeachwindiglteit von 2 l/ml η. eluiert,: 4-Liter- Fraktionen /wurien auf ge*- fangen; nur am Anfang und Ende; der Säule wurden 2Ö-Liter- -Fraktionen aufgefangen* Die Fraktionen :wurden eingeengt und die Bioaktivität wurden an P* vulgaris-Trögen beobachtet» In diesem Punkt-.des. Verfahrens erfolgte; die Trennung von Sparsomycin und Sparsomyein A.^; IDi eae; Best andteile wurden durch weitere Verarbeitung gereinigt;und es ergab sich schllesslich ein kristallines Material.

• Die Fraktionen 24-34 der obengenannten TrennungsäuleB. enthielten die Spar somy ein-(9-|*-E-Ribo— furanosyl—7^deazaadenxn)--Eompon^nte. ,; " ~\\-;;_; .,;.';.

Reinigung von Sparspmyain;; A. '_'-._ ^: ;^ -. Die Spärsomycinr-A-EompQnÄnte^wurde; in "-."" ■

folgender Weise gereinigt und kristallisiert, 'Di_e Fraktionen 11 bi» 20 aus der obenbeschriebenenlrennaäule-Teil 0 ΐ- enthielten die Sparsomycin Α-Komponente* Diese Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem; Druck eingeengt. Es wurden' l_f2 g kristallines Material isoliert. Diese Kristalle wurden in 40ü ml Wässer und 50 mirΘ,Γ B" HOl gelöatv Die Lösung wurde leicht erhitzt, um das

BAD

se

Auflösen zu erleichtern, und dann filtriert. Die klare Lösung wurde mit 5O$igem wässrigem Natriiutihydroxyd auf pH 9 »0 eingestellt und in einem Kühlsciirank 5 Stunden lang gekühlt. ."Die Kristalle wurden abfiltrisrt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 5,65 g des Präparates ADA-102.1 erhalten. 2 g dieses Präparates wurden dann in 75 ml Wasssr und 20 ml 0,1 IT HGl gelöst. Diese klare Lösung 7/urie mit 50$igexii wässrigem Fatriumh/droxyd auf pH 9,0 eingestellt» .Die Kristallisation setzte sofort ein. Die Lösung vnirie 7 Stunden bei 25 C stellen gelassen, und dam: wurden die Kristalle geaaßmielt, mit 25 ml ,Vasser gewaschen up_d getrocknet. Es wurden 1,52 g das Präparates ADA-105,1 sriialten (Schiaelzpunkt 247,8-250°C} optische. Drehung /57|⁵ -62° (c=0,718 in 0,1 H HOl); Äquivalentgewiciit 269} pKa·: 5,07 in Fasser; Ultraviolettabsorptior-sspactrum in

Wasser 270 mu, a - 4-4-,14

0,01 UH₂SO₄ 227 mu, a =85,28

271 mu, a = 40,82

0)01 N KOH 270 mu, a = 43.50

Eine charakteristische IR~Absorptior wurde bei folgenden Frequenz en _s ausgedrückt in reziproken Z3i:t;imet3rn, beobachtet:

9038877 17I.S

BAD Op.!Qi_NAL

5350 (S) 1475 (M) " .116OJ(W)

3250 (S) 145ο (S) (oil) 1134/(^)ϊ

3145 (S) 1445 (M) (sh) 1120 (M)

3095 (S) (Sh) 1426 (M) · - 1093 W)

2880 (S> (oil) 1370 (M) (oil) 1080 (W)

2810 (S) (oil) 1351 (M) - 1055 (M)

1895 (W) ■-, 1306 (M) V 1042 (S)

1640 (S) 1276 (W) ·...:■■ ' 1017 (S)

1592 (S) 1255 (S) VB92 (S)

1553 (M> :- 1241 (!) ■ 953 (W)

1502(M) ■_ ' 1198 (W) > 912 (W)

903	(M)
86.7	(M)
842	(W)
799	(W)
715	(W)
704;	(S)
675	(€)

--...■-. . ,.=-" : ;, ..Dio .lCIyEientara^ialyae ',rax wie i'olgb

-..■'.". V - Analyse ber^. für G₁^h .^.0. r C. 49*62;

Ϊ ^: H 5r30j N/21,04.

V - Sef*! G 49*Bli H 5,20} N 20,92.

: . Auoh 9^^D^i^bofüranosyl-7V(ieazaad,

(SjparspDiyciii A) wu^de in anderer Weise aus eiiiei? Gärungsbrittie isoli.ert U4d gsreinigt * Die Grärtiiis 'mir de,; wi e outer A baachrieVen, durGitgeführt. Die ganze Brühe (AJW-65) wurde L.it 365 elL konzentrierter Spiivisfelsüure auf pH 2,5 eir^estellt ttnd unter Ver.Ter.duKg^yo^ 6 fo Diatomeenerde als FiIterhilfsjnittel filtriert. Der Filterkuchen wirdmit 0,1 Volumen entipnisiertem Wasser gewaschen,

-: : ' ■ BAD ORIGINAL

und die Wa;chlÖsung wurde zu der klaren Brühe gegeben. Die klare Brühe wurde dann mit 400 ml 50$igem wässrigein Natriumhydroxyd auf pH 8 eingestellt und 1 Stunde lang mit Vfo Entfärbungskohle und jfo Kieselgur gerührt. Die Mischung wurde filtriert, und Jor Kohlenstoffkuchen wurde mit 0,1 Volumen entionisiertem Wasser und anschli essend iait 0,2 Volumen wässrigen Acetons gewaschen. Der gewaschene Kohlenstoff wurde zwei Mal mit 0,4 Volumen 40$igern wässrigen Aceton, das mit konzentrierter Schwefel säure auf pH 2,5 aniosL'uert wurden war, eluiert urd die Eluate wurden vereinigt. Die vereinigten Acetoneluate wurden dann mit 53 ml 50 ,tigern y/assrigein Fatriumhydroxyd auf pH 4»£ Gir-,3'jtellt, zu einer v/ässrigen Lösung- eingeei^'t ui;d gefriergütrocknet. Es wurden 284 g des PrEj--ar at es. WM[I-JZ, 6 er-Lalten (Auswertung 9KB u/mg in der Gewebekultur). 100 g dieses präparates wurden dann in 600 ml !Jatnanol gelöst uiid mit 4 Volumina Äther versetzt, um das inaktive :iaterio.l auszufällen. Aus dem Lib ei- ;t -Jli -i. i-5 η *- ^t.iarol-Ätlier wurden Z'/ei Tfristallansuhüsae isoliert, inIem d^s Lösungsmittel Iang3am v^riarapferi gel as s-ü. wur-.a.- Diese .prLparate '.vurden vereinigt ur.d ir? 35 ml · V/aa ό ,-r u.iJ 5 a,l 0,1 Il Chlor was s er s to ffsäura ',vi^lor. jylüst.. Dia Lösung wurie danj: filtriert und ii:it ^O.-igGm ■,/„..jüri.^,-Ji.. i-atx'iua.-iydx'o.syd auf \Ά 9»4 ein^e—

■- 60. - ■■■■ 90 9887/ 17 06

^BAD

fci

stellt· Das Sparsomyein A, das sich in Kristallforn^ abschied, wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet» Es.'wurden 4-80 mg; des Präiarates ADA^104,l er-: halten (Schmelzpunkt 247,6 bis 250,8⁰C, ο ρ ti sehe ^ Drehung a²⁵ — 61° (c=0,908 in Ο,ϊ F Hol); Aquiimlentgewiöht: 270\ pKa¹ i 5,05 in Wasser; und UltraViiolettabsorptio^ns-

spectrum	in	Wasser ' / - .	: 269.	mu,	r a = 44,	27
		υ,Ui. j» Mpüu, .	■■-' 227 ,271		. a k 86, r; a = 41,	06 35

0,01 ET KOE .■' "■ ; 270 mu, a =43;61

Eine charakteristische IR-Absorption wurde bei den folgenden Frequenzen, in reziproken Zentimetern ausgedrückt, beobecli feet: ^ ·

3400	(S)	1526	(S) ■-;..	;i2oo	(MX	r- /870 (S)	- -
3310	(S)	1510	-(M;)./ :. V .■■■■■	1164	.(»).;	852 (W)
3240	(S)	1480	(S) '/;	1137	(S)-	843 (W)
3220	(S)	1462	(S) (oil X	1125-	(M)	/ I 800 (M)	BAD ORJGiML
3140	(S)	s 1425;	Cs) -	1092	Cs)	715 CS)
2950	(S) (oil)	11370	(M) (oil)	1084	(M)	/ 702 (S)
2920	(S) (oil)	; 1355	(S); - ;	:/1057	(M):
2650	(S). (ail)	':. 1342	(Μ). ■■■■■;';	.1045	(S)	/ ■ ./-...
2620	(M)	131o	(S)	■r 1020	(S)
1910	(W)	1285	/(M)/ .;	; 995	(S)
1650	(S)	1280	«\ .-■■.. /	955 ■■-	(M)
1645	(S)	1260	(S)/	912	(M)
1600	(S)	1245 9 0	(S) 9 8&7/T7t	/905	(M)
			-.- 61 :--

Die Elementaranalyse war wie folgt:.

Analyse berechnet-für: ^cii^HiA.°4^! ° 4-9*62} H 5,3Oj N 21,04

Gefunden : G 49,62; H 5,04; N 20,81,

Die οbenbeschriebenen Merkmale de3

Sparsoinyeins A sind in guter Übereinstimmung mit den in der Literatur für Tubercidin wiedergegebenen« Vgl. Anazai, K. j G. Fakamura und S. Suzuki: A new antibiotic, tubercidin. J. Antibiotics, Ser. A, pp. 201-204, Sept. 1957. Jedoch wird kein Yerfaiiren, durch" das Tubercidin hergestellt werden könnte, offenbart.

D) #~(2« ,J'-O-Iaopropylideri-p-D- .

ribofuranosyl)-7-deazaadenin; 2¹,3'-0~Iaopropylilen3parsoiaycin Aj 7-(2, J-O-Isopropy^liden-jj-D-ribofuranosyl)-7H-Pyrrolo 2,5-d -pyrimidin..

Eine liiaöhung von 1 g Sparsomycin At

die über Facht bei IQb⁰G unter vermindertem Druck von 0,3 mm getrocknet worden war, 7,5 g p-Toluolsulfonsäure-Monohyirat und 50 ml Aceton, das zuvor von iCaliumpermanganat und kaliumcarbonat (in. dieser Eeihenfolge) ab~ destilliert worden war, wurde bei Raumtemperatur zvvsi Stunden lang gerührt. Das Eeaktionsgeruisch wurde dann auf 3⁰G abgekühlt und mit einer Lösung von 200 ml 0,5 H ITatriumbicarbonat bei 3°C versetzt. Die erhaltene Lösung

-62 - ' ■■ ^:

909887/1786 BADORiQiNAL /

wurde bei 35°C unter veriuindertein Druck zur Trockne ein.-· gedämpft. Der so erliaitene Bücirstand wurde zunächst mit -zwei 100 ml. Portionen'siedenden Chloroforms und dann mit z.vei 100 inl -Portionen Ci^oroform bei Raumtemperatur extrahiert. Diese Auszüge wurdeneinzeln gefiltert, dünn vereinigt und eingedampf"fc* Der so erhaltene Rückstand wurde in 25 ml siedenden Wassers" gelöst, und die erhaltene Iiüsm/j wurde filtriert;. Beim ibkühlen des Filtrats <rard3 ein kristalliner !^ieieraoalag ■2^r,5^I-Ö--I-Sopropyliden3_!par3oiiiyciii A ernal-t'.en 0,75 g (65?i); schiiielzpunktt 1/0-173⁰G).

JfiAindem das produirt noch z?/$imal aus Y/ctsyer umkristall!siert worier: n-xc, wurüe 9-(£'»5¹-0-Isoprop₍yllieK-p-D-ribofuranös_i/l)-7-deazaadeKin {2^%. ,3'-0— Isopropyliiensparsoifiycln A) (2¹ , p'-TsOprop/lidentubsrcidirj) eriialt-är; ■(Schmelzpunkt 174 bis 177⁰Oj is.i-J.ys^ berechnet für G₁₄H₁₆Ii₄O₄: C 54,Ö9i H 5,S2; E lc,19v 0 20,92; -',

Göf. G -54.,72;-Ή: 5,^2; « .l«?»5l'i"0 21,2;

Eine Iiösung-ron 1,74^: ^'^ν^'τΟ iii ^O ai Pyridir:.-i:.-. si nein Sisnad/ ^

9098S7/17f6

BADORiGiNAL

1B20631

mit 4,35 g Benzoylchlorid zersetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad 90 Minuten lang gerührt und dann in 150 ml Eis und Wasser gegossen. Die Mischung wurde dann-mit 2 E Chlorwasserstoffsäure angesäuert und filtriert.. Der abfiltrierte Feststoff wurde aus Acetonffasser umkristallisiert. Es wurden 3,28 g eines Stoffes erhalten, der abermals aus Aoeton-Wasser umkristallisiert wurde und 2,76 g analytisch reines U ,N ,5'~Tribenzoyl-2',3'-0-isopropylidentubercidin mit einem Schmelzpunkt von 131,5 bis 133 C ergab.

Analyse ber. -JfUrVO₃₅H₃₁M₄O₇: C 67,84} H 5,O4j N 9.04. Gef, C 67,31? H 5,04j N 9,13.

P) if -Benzoyl-2¹, J'-O-isopropylidentubercidin. -.'■--,

Eine partielle Lösung von 0,5 g

ff,N⁶,5'-Tribenzöyl-2¹,3^!-O-isopropylidentubercidin ih 50 ml einer I.!isehung aus wasserfreiem Tetrahydrofuran und v/äs s erfrei em Methanol (1:1 Volumenverhältnis) in einem Eisbad wurde unter Rühren mit 0,2 ml 25^igem Natrium- -methoxyd in Methanol versetzt. Die M;>chung wurde aus dem Eisbad h ,rausgenonunen, und die Reaktion "vmrde durch Dünn« aanioiitchroniiitographie aus Silicagel mit 50$ Aceton^50^ Skellysolve B-Hexanen V2rfolgt. ITach 25 Minuten bei Raumtemperatur (ungefähr"25⁰C) wurden weitere 0,2 ml«

- 64 -

0 9 8 8 7/1766 bad original

^- 1620831

liatriummethoxyda zugegeben. JTaGh". 64 Minuten war der;"" grSsste Teil des Ausgangsmaterials: versclprande'n. Das ; Realcfeionsgemiacli wurde dann über Uaeht in'ei hem Kühl- . schrank zwischen' 0 und 5°ö ungefähr 17 Stunden lang abgekühlt und wurde dann mit Hilfe einesSäur eau st aus σ^ harzes (Dowex 50 W χ 8) Isis auf einen pH zwischen 5 und 6 angesäuert» Die Lösung wurde daarm unter eineiii verminderten Druck bei 40 - 45 0 zu einem Sirup eingeengt:, der über 50 g Silicagel mit einer Mischung, die aus 25-f> Aceton und 75^· Skellysolve B-Hexanen bestand, öhrömatogräphiert wurde, wobei Fraktionen von je 1 ml abgenommen; vmrden« Die JPrak-fcionen 80-115- wurden vereinigt und eingeengt,. ""':.-Es wurden 210 mg ΪΤ eidin erhalteni
Analyse bor. füri Og

" Aus Äther-Skellygolve "B-4iexahen um-

kristallisiart, hatte IT -Benzoyl-2¹ ,3'—Q-isbpropylidentubercidin einen Schmelspunktvoa 106,5 bis. 109, ß. ^?

. - -.- In der gleichen Weise wie in Beispiel

62 können andere !Nucleoside der formel ϊϊ in-der X Hydroxy bedeutet, mit Aceton, Methyläthylketon_r^ Dipropylketon und dargleichen zum Schutz der^ 2^r— und^: j-¹-

^ 65 ■"-'

909887/1^08

Stellungen vor der nachfolgenden . Pho 3phoryli erung in Aoetale übergeführt werden. Andere Gruppen, die mit PhosphorylierungsBiittel reagieren können, können dann, wie in Beispiel 62 gezeigt, duroh Herstellung der der Formel XI entsprechenden ?T-Acyl~Verbindungen geaehützt •//erden. .

Beispiel 63

Ι-μ-D-Arabinofur&nosylcy tosin-5 · "-phosphat. . -

Eine Lösung το η 40 au. Pyrilin, 0,325 M

in 2-cyanoäthyl-phosphat, wurde mit 2,5 g H^-Acet_<y-1-1-(2^I ,3*· di-0-aoetyl-ij-D-arabinofuranosyl)—cytosin, das eine gerinne Menge 1*(2* ,^'-Di-O-acetyl-p-D-arabinofuranosyl)-' cytosin,enthielt, versetzt. Zu dieser Lösung wurden weitere 20 ml Pyridin, die 5,6 g Dicyclohexylcarbοdi— iniid enthielten, ge^obon. Das Realctionse;eiGisoh mirde im Dunkeln zwei Tags la:ry geacliüttelt, .vorauf 10 ml Wasser zugesetzt und die Lesung auf 40 C ervfärmt wurde. Daa ReaktionSöepisch wurde eine Stunde larg geschüttelt, worauf wüetere 75 aO. V/asaer zugesetzt und die Lösung frei von unlöslichem Oicyclohexylharnstoff filtriert wurde. Das Mitrat wurde zur trockne ein^sdamift, axt 50 ml Wasser verdünnt urd v/ieisr ei^gedair-Xif t, um restliohes Pyridin zu entferr^eni Der so ernaltene Hüclcstand

- 66 -

S09887/t7iS

wurde dann z^-.YieöäeK wasser liüd Ithier, 150Ίη1..{ΐ-:1). verteilt und dar wässrige Anteil wurde naeii einer zweiten Extraktion im Vakjmm von Äther lief reit* Die zurüekbleibende wässrige Lösung (90 ml) wurde dann mit 2,16 g (90 Mole) Lithiumhydroxyd behandelt, und die LÖsuög wurde eine Stunde lang auf 100⁰O erhitzt. Danach wurde die Suspension abgekühlt und frei von Lithiumpliosfhat filtriert. Die Feststoff e wurden mit 0,01 H LithjUushydroxydlÖsung gewaschen, die dem ffiltrat zuge-

setzt wurde. Bas Pil trat wurde dann, .durch Zugabe eines Austausohharzea (Dovvex 50 χ 8,H⁺) auf pH 7 eingestallt. Die^ Mischung wurde dahaah filtriart, und die harzfreie , lib'sung wurde bei 50⁰G unter veiräindertem Druck auf ain Volumen von 25 ial eingöengt. Die Lösung wurdie dann durch 75 ml frischesDowex 50 χ 8 -Harz ,-«il ei te t.: Das Harz Wurde Mit Wasser so lange eluiert_f bia dar pH Wert des ELuats im Bereiöli ton 4 bis 5° ig. Der pH Wert der erhaltenen Lösung wurde durch Zugabe konzentrierten Aiimoniumhydroxyds auf /7,5 eingestellt. Die produkt entlialtelide-Iiösung (ungefuhr 200 ml) vnxrde auf einer Säule, die mit Dowex AS-IxS (Pöraat)-Earζ (125 ml) besenickt war_# absorbiert und diö Säule wur le. mit 125 ml Wasser eluiert* Danach wurde die Säule mit 0,15 M Ameisensäure--

909887/1786

BAD ORIGINAL

lösung eluiert, und das Eluat wurde in 20 ml -Fraktionen bei einer Fliessgeschwincligkeit von 2 ml j e Minute gesammelt. Raah einem Vorlauf von 200 ml, der verworfen wurde, wurden die Fraktionen 13-33 vereinigt und zu einem kristallinen Feststoff, der 250 mg wog, lyophilisiert. Dieses Material· ergab nach zweimaligen! Umkristallisieren aus 4°C warmem Wasser feine Fädeln von l-p-D-Arabinofuranosyl cy to si n- 5' -plio sphat.

Analyse ber. für G₉H₁₄N₅O₈P: 0 33,44} H 4,37} F 13,00} . · P 9,5b

Gaf. C 33,37} H 4,68; N 12,61;

' , .-■ ■ P 9,75.

Beispiel 64

E -"Benzoy-l-l-p-D-arabinofUranosvlcytosin 5 '-piiospriat. ..";"■

Es wurde eine Lösung hergestellt, die

50 Diruol Pyridinium-2-oyanoäthylpilo3pIIat enthielt. Diese Ll surg ,.ot-'de ii: 10 ml trockenem Pyridine aufgelöst und r.:it 2,77 s l\^-BeMoyl-l-(2^r ,^'-di-O-benzoyl-^-D-aratii of urano3.yl)-cytosiK versetzt. Danaoh wurde die Lüou:·.,;,· zur Trockne eiiyedym^-ft. Die Iiiscnu.:g wurde dann ir 25 ml Pyridin aufüelüst und mit 3,09 g (150 mmole} DicyclGliexylcx»rbodiimid versetze. Die ?,Ti .Oiiu/j₅ vmrde' bei Eauiriteiaperitur 5 l/2 Tage lang geschüttelt* Dann

-Sb-909887/ 1786.

BAD OR/g/m_al

1020631

wurderiι ungefähr 15 ώΐ Wasser zugesetst, und die/. ^: Mischung- wurde Evrai ;Matl mit Skellysolve B-Hexanexi :./ extrahiert und frei von unlöslichem Harnstoff filtriert. Die Lei sung -wurde dann, mit Pyridin auf40; inl/verdünnt, auf ungefähr O⁰C mit Ms alageküiilt und durcfc Zugabe von 40 ml eiskalter 2 F PFatriufflliydroxydlösuDg ungefiähr 1 Έ an ITatriumihydroxyd ;gemäclit,-I)ie EeaictioB wurde nach 20 jvii nut en durch Zugabe üb sröcliüssigen P^ridinium^· ' DoweiL 50 χ ö-rIonsiiauatäii3Ghhai^vzes beeridet. p^a.Harz v/urde abfiltriert, mit WasBor ge-vyascxienvXind die wässrige Wa^chlösung und- das liltrat wurden unter veruiin;dBrte|ii Druclt" auf uij^öfähr 23 ml eingeengt, worauf 200 mg AmßioniumrT b,ioarbonat zugegeben wurd*en. Der in der 25 ml Lösuiig ge— - bild -ta liedsrsöhlag wurde abfiltriert,,,-'Daa 2il4ir3af wurde Έΐηΐς,-r v-3riiiindQrtem Bruok^;eing.edampft, und 4er Süakstand /VUr-Ie in eineia Lösüngs itt el system aufgenommen, das sicn aus 1 M immomumacetat (pH; 6) und. Isopropylallcoiiol in aimeiii yerhaltnis von 2i5 zusaiimensetäte, tind dann auf einer Cellulosesäule'mit einem Säülenvolumeii vozl 1B50 ml unter Verw3ndun% des gleiorien - Xo susigsiuitt el ays t^ems-absorbiert. Die Säule iTurde; danäi mifr der molaren -Äina_toniumacetat-isoprojjylaikohol C2;53-Miöohung eluiert* Di,e ersten 600 ml des Eluats -TOrden verworfen^ und dann i-.n 20-iiil-Iⁱr.aktionen aufgefangen CinSgesamt.325 ^:lrak-

69 -

162Ü631

ticmen). Die Fraktionen 55 - 110 mir-len ν ar einigt urd enthielten ungefähr 90?£ (der.Theorie) der Gesamtmenge des U -Ben^oyl-l-fi—arabinöfuranosyleytosin—5^f-Die vereinigten Fraktio'nan vvurdan in ge^env/art von 10 ml Pyridin aux* sin kleines Volumen einmengt. Dor SuckataV.d wurde mit Wasser auf 50 ml verdünnt und das Produkt wurde auf einer Säule aus Pyridinium-Dov/ex 50 W χ 8 —Ionenaustauschharz absorbiert» Die Säule y/urde dann mit 5 1 entionisiertem f/asaer eluiert» Der gss.-aiite Abfluss ,yurde unter vermindert em Druck eingeengt und 4 Mal mit l^igem Pyridin verdänr.t und eiii^aengb, Der so ernaltene Rückstand wurde in verliuir.täöi :7hss£±™'jri. Pyridin auf^ercBüüen und zvei Mal aus liaseiu Losunjataittel lyoxjhilisiirt. Ea v/urie ein ffaitisvr Peststofi ir. ein.r Ausbeute votj. l,ol g (70 yo) eri'j alten* TJ .ui „roiufet .'/ar If^1---^ enzoy 1-1-μ-liar abino f arano sylc/to aiü-3' -piio spuat ... Analyse ber. fur G₁₆H₁₀IT₅O₀P^₂O. pyridin: P 5,95

Gef. P 6,06.

Bern 72"ständigen Erhitzen dieses

Sol vat es im Vakuum (15 im. Hg) auf IQO⁰C wurde Ir —<>3EZöyl-lp-D-arabinoi'uranofc!./!cytosin— 5'-^riostiiat er-iialten,

Ir dar -jloie^ör. weise ,via in den 3ai-3jpielen 65 und 64 körn en andere Triacyl—p— D—aj^abircfurano—

- 70

9098 87/ 1706 ÖAD oriqi_Nal

sylcytQsin phGspuorisiertwerden, wobei die Acylgruppen.' in den 2^fVTmd 3'-Stellungen und aitsserdeM die Äeylgruppe, die art di e itainogrupp e . des Oy to sins gebunden ist, Verloren geben, wenn dasgünäcast erhaltene Oyanoph&sphat lär-^ere Zeit mit ein«r starken Base, bei ungefähr 75°C behündelt wird. ' :/ :. -

BeJ s Ji el 65 ..."." /

pho&phat. ..-"."■ -

■-.-■ : In der in Beispiel &$

miv&Q Έ -(ß-Gyclopentgrlpropionyl)-l-£~2* ₁ 3'-di-0— (^rpahtylpropionyl)—p~I^arabinoirtiranosyl7--Gytosin iiiit 2-Oyanoäthylphospliat, DiGyolohexylaarbadiimid und dann mit Litiiiudiiydroxyd bei IQO⁰C behanlelt* -tjs:-;;wur*e

Beispiel 66 ■· ■ . ^; '

. M -Lauroyl-'p-D-arabinoXuranosylcytosin-

der in B^i^pisl 64 ai7^;e,^ebener \'!el^e wurde durch ^eniinieln von .K-^LciurQyl-^L^(2' ,3'-U-O- ■'. lauroyl-i-D«-ara&inoiuraTic>sjl)-'Oytcsin lait 2-Cyanoatiiyl-.phosphat» .dann iHit MGyQlohexylQarbodiiniid und souliesslicli mit Eatriumirydrcwsyd bsi IQ^G iP^L arabiMofuranosjfl-Gytosin-5^l-phospii.at hergestellt

- 71 -

9 09 8 87/1 716 _BAD original

der Arbeitsweise des B^-i-spieis wurden N -Dedanoyl-l-(2·, 3' -0—decanoyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin_T JSF -Propionyl-l-(2' , ^'-di-O-propioriyl-ß-D-arabinoiuranQsylj-eytosin, Έ-Butyryl-1-(2· ,3»-di-0-butyryl-j3«-D-arabinofuranosyl)-cytosin, ür-Phenyl-aeety 1-1-

-I-(S¹, 3^f-di-0-nexanoyl-ß-D-aral3inofuraixsyyl )-cytosin,, und Έ -Piienylpropionyl-l-(2', 3«-di-O-phenylx:)roxjionyl-|j-D-arabinofuranosyl)-cytosin ±χι die gewnscixten 1- IJ-D-Ar abi no f uraiio-sylcy to sin-5' -piipsphats ü"bergef ührt. BoIspiel 67 ■

li^-Beiisoyl-l- (2', 3' -di-0-acetyl-ß-D-ar abi ho x\ix\ino syl)-cy to si n-p'-pJao 3i>iiat,

Eiixe Lpsung von Ir-^eIiZOyI-I-Jb-D-

c,rafcinofurr.nb:3₁flcytosin-5^l-i;hOsxjIiat wurde in einer Mischung aus l^l3 jßl Pyriliri und 15 ml Issi^säureantiydrid suspendiorl. "Dies-5 Piidcixurf vmrde ungefähr 18 Stunden lang bei ßa.uraterax)er-j.tur (un^efäiir 25°ü) gerührt. Die homogene L.c3ur-o" »Turie darsn isi c 15 ml Wasser vex'dünnt und drei St»-u? iei.- V.-'ii iaiv";t3.„i siatur gerührt, ,Das Lösungsmittel vrurio dunr: bei 3O⁰C ijji ilochyakuum abgedampft, und der 2.U-JKStLJiI wurde mit Ätii«r verrieben, Es hinterblieb ein gUKü/JLartiges ^tzriuX, das lui vakuum von Äther befreit, In troQlceneis. Pyridin gelöst und als Lösung bei 4 C

-72 -

40*897/1?!*

aufbewahrt mir de. Die sich abscheidenden fristalle irardön auf einem Filter gesammelt und.stellten reines N -Benzoyl-l-(2',3'-di-O-acetyl-ß-D-arabinofuranosyl )-cytösin-5'-phosphat dar. ./

Beispiel 68 .

IF-Benzoyi-l-(2·,3'-di-O-propionyl-ß-D-arabinofurano syl )-eyto.sin-5'-phosphat.

In der in Beispiel 67. angegebenen weis© wurde durch Behandeln'von Ή —!,enzoyl-l-ß-O-arabinofuranosylcytosih-5¹ -phosphat mit Propionsäureanhydri.d in Pyridin

"ά.""-■-· / ■■■.■■■·--- _t

Benzoyll-^·, S'-di-ö-propionyl-ß-D-arabinofuranosyi )-

, cy to sin-5 '—phosphat.. erhalten. Beispiel 69

ar abinof urano syl) -cy to sin-5 ' -pho sphat.

In_; der in Beispiel 67^ angegebenen vrard« durch Behandeln von Ir--penzoyl-1— p-D-ar abi no furane syl-cytosin-5¹-phosphat mit Buttersäureanhydrid: in Pyridin ^--qenfeoyl-l-(2^f , 3·-di-O-butyryl-jfJ-D-arabinofuranosyl )-cytosin-5 «-phosphat erhalten. ;

Beispiel 70 - ! ■

araBiiiof urano syl )-cy to sin-5'-phosphat. ■..'.:,■. In der in Bai spiel 67 angegebenen

Weise y/ur de durch Be ti aid ein von IT--qenzoyl-l-ß-D-

BAD ORIGINAL

arabinof uranosylcyto sin-5 * -P3iosjaiaat mit VaI eriansäure— anhydrid in Pyridin K -Benzoyl—Γ—(2¹ , 3¹— di-0-valeryl-iJ— D-arabinofurajaosylJcytosin-S¹ —pb.osph.at erhalten.

•Rei spiel 71 ■ '

ff ■-p3Z2ZO.7l-l-(2^l, 3i-di-0-benzoyl-p-l>ar ab i no f Ur ajao syl) - cy to si n—5 * — jdi^jb pliat.

In ler in Beispiel 67 ange^eberen

Weise wuraa lurch Beiiaiideln von Ii — Bsraoyl-1—p-D— '

arabeinofuranosylcytosir—5^f-piio3iiiiat mit Benzoesäiireanhydrid in Pyridin IT -Tjaiizoyl-l— (2*, ji'-di-O-ibenzoyl-μ-D-arabinoxTiraiiosyl)cytosin—5¹-Phosphat erhalten» , Beispiel 72 · .

H^-Benzoyl-l-i^¹, p'-di-O-piienylacatylp-D-arabinofuranosyl)-cytosiii-5'-piiospiiat.

Iia der in Beispiel 67 angegebenen

Weise wurde droraii Behandeln iron H -Be-nzoyl-l-ji—D— arabinofxira.nosylcytosin^'-piiospnat mit Phenylessigsäure amydri-I in I^^rridin. E^-TSSirszoyl-l-^¹, 5'-ii-0—pL·. ^u/lac e tyl-ß-D-arabinofuranosyl)—cy to sin-5' -pho spiiat sriml t er;, Beispiel 75 ' . .

ärabino furane syl )-cy tosinr-5 *—ßüo spliat In der in Beispiel 67

- 74 -

909887/17S6

Weise .würde: l-p-B-AriäöiMDfweapp.ayl-eyffcpsiK^S;¹—Eto mit. überschüssigem, Ifcsigsau^anl^drid In Pyri-iiii zii Ir-Acetyl—!-(S¹, 3*-ätl^Ö^aß_e^Z cytosin-S'-phosi.liat umgesetzt, Beispiel 74 ■■■'-

U -propiqi^ 1-1^(2*,5'—di-Ö-propio ß-D-arabinofiii'ano syl )-oy tGBin^-5' -pi

Iri der i^B-eispiaX'67 "Wei.s3 vraräe l-j!-D-l£ateirox"~ar&nosyl^ mit übersciiü-siöem Propieasäiirsaiihyd^iä N -iröpionrl-l- ( 2 *':, 3 · ■^di-O cytosiiii~5/-piiosxJiiat tüügesa'izt. Beis,:iel 15 . ; - _■

ph err^lpxopio ijyl—P-D, '

In dor in Bai Sii%l 6?; a Weise -iHi

mit überseimssigäm fce:^^

-phs^lpropie^i^^

K ■^hei^

Beispiel 76 , . ■'■-·■■.'' . '.-'■■"'_.

- 75

BAD ORIGINAL·

1520831

In der in Beispiel 67 angegebenen

Weise wurde l-ß-D-Arabinofuranosyl-cytosin^¹-phosphat, mit uber.sciiussig.eitt Benzoesäureanhydrid in Pyridin zu U -Tjenzoyl-1* (2', 3' -di-O-benzoyl-p-D-arabinofuranosyl )-cytosin^'-phosphat umgesetzt.
•R ei spiel 77 . . .

D-arabinofurd.no syl )*cy to sin-5 ^-pbo

In der ir; Beispiel 67. angegebenen Waise "-7ur «.e l-p-D-ArabiriOfuranosyl-cytosin^S^ mit über.sGi-iüssigem Hexansäureanliydrid in Pyridin zu Ir-HexariOyl-l-^'jS'-di-O-iisxanoyl-fi-D-arabinofuranosyl) cytosin-^5'-phoö^iaat umgeoetzt, . ;

Beispiel Ib . . -

M⁴- (p-Cyelopentylpropio nyl )-l-^~2 »■, 3« -'

-jj*-D—arabinofuranosyl 7-

. In. ier in Beispiel 67 a W3ise vmr Io l-_f>-D-/lrj.binofuranosyiicit üfc3rsci:Uü3igeii: G-Cyelopeni^rlpropionylohlorid in P-riain zu E⁴-(,;-CyclGpentylpropionyl)-l-/"2*,y-ai*O-( cy clopent/ipro pionyl) -p-D- arabir.o f urano syl_7-cy to sin-^5'

~ 76 *

9 0 a a 8 7 / 1 7 6 δ ^BA° 0P_ts_G,_mL

Beispiel 79

arähino£ ürano syl) -cy to sin-5^f -pho sphat.

' \.. ■ - In der in Beispiel 67 angegebenen Ij7eise wurde 1-ß-D-lrabiriofuranosyl-cytosiii-5' -pno.sphat mit überschüssigem Lauroylcnlorid in Pyridin zu U--I₁auroyl-1-(2^I, ^'-di-O-lauroyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin-5¹ -phosphat umgesetzt.- Beispiel 80 '

A^scättoyl-l-^¹ ,3* -di-a-decanoyl-ß-D-arabinofurahosyl)-cytösin-5'-phosphat.

- In der in Beispiel 67 angegebenen

weise vmrde 1-p— D-Aräbino'furanosyl-cytosln-5¹ -phosphat mit überschüssigem Decanoylehlorid in Pyridin .zu IT — DeGanoyl-l-(2',5'-di-O-decanoyl-ß-D-arabinofuranosyl)- ; cyto si n-5'-phosphat 'umgesetzt.; / ^:

Beispiel-Bl * . " . ' * ;■ " " ■' -.

arabinofuranosyl )-eyto sin-5 * -yl-IT' r-benzoyl-1- (2 ^r, 3 ^r-di-O-benzoyl-ß-D-r^bofiiranosyD-cytosin-S ^f-yl-phosphat (XIT) und 1- ß-B-Arabino/f ur ano syloy to sin-5 · -yl-1- p-D-ribof uranosyl-eyto sin-5¹ -phoaphat

if,'-

90 9 8 8Wi 7 iß - BAD ORIGINAL

NHAc

HO—Ρ HO

OAc

NHBz

HOCH₂

H j j BzO OBz

NHAc

VT. K

0-CH₂

Ch OAc/

DAc

0-Ρ-ΟΗ

NHBz

Vt

BzO OBz

XiV

- 78 -

196

1020631

XV

OH OH¹

EineLösung von 1 g* N⁴ di-O-acetyl-e^D-arabinofuranosyl)^cytosin-5*-phosphat und 1,0 g- Ν⁴-ΒθηΑθ7ΐ-1-ί2*>3'*ΰϊ-0^βηζθ7ΐ-β*ί)*Γί^!9ί^Εή^^ cytosin und 500 mg. trockenes ^yridlniiiia-BoweX SOW X 8-Aus* tauschharz in $5 ϊΐΛ* IPyrMin >mr^ bei 35°C sechs Mal unter Y^rwendting frischer

· te ·

BAD OBiGiNAL

Pyridins eingedampft. Nach dem sechsten Mal wurden 10 g Bicyclohexylcarbiodiimid, die in 25 ml trocknem Pyridin gelöst waren, zugesetzt. Der Kolben wurle dann mit einem Stöpsel verschlossen und mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt. Der Kolben wurde drei Tage lang geschüttelt. Danach wurden 10 ml Wasser zu der Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch blieb ungefähr 18 Stunden lang uhav wacht stehen. Ausgefallener Dieyclohexylharnstoff wurde dann von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und mit zwei 10-ml Anteilen einer IjI Mischung von Pyridin und Wasser gewaschen. Die Wa jchlösungen wurden der Lösung zugesetzt, und diese wurde danr- vier Mal mit 5Θ ml. Skellyselve B-Hexanen extrahiert. Die Extrakte wurden 'verworfen, und die wässrige Mischung wurde bei 34°C in einem rotierenden Verdampfer eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde ciit 50 ml Wasser versetzt und die Mischung ■.vurde eingoiampft, um das· Produkt von Pyridin zu befreien. Das trockene Produkt wurde wieder mit wasser behandelt und nochn.als -ein^eiaiapft und mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe getrocknet. Bas so erhaltene Έ -Acetyl-l-(2',3*~αΐ— 0-ac etyl-p-D-arabir-ofuranosyl} . cy tosin-5 * —yl-lP-benaoyl—1— (2*,3^l-di-0-bsnzoyl-p-D-ribofuranosyl)-cytosin-5^t-ylphosphat (XlV) -vuris ohne weitere Reinigung zur Herstellung von !-,j-D-Arctfeii-afuranosylcytosin-S^-yl-l-ß ribofursLnosyicytosir,—5^|;-yl-phO'Sphat (XV) verwendet.

- SQ -

88 7/1706

1610631

&weGk ww$,ß die erste /XIY in 50 ml Methanol, das 4ipmQMate war, gelöst und/bllqh /bei Bäumt emperatur(2.4 *26%). ." gO Stum^sri larig aijehßB- Pie !lösung iyurdedann in ?5 ml Wasser- gelöst und mit/vier OQ^mI Anteilen Jlth/e.r Die wässrig? losiing <mrcl^ .dann mit Hilfe ©ines >oti den Verdampfers. t>el 34⁰O, fast

Der so erhalten^ Eüökstand .wurde in 6QO ml Wasser wieder , gelöst und,Iyophilisiert. per Eüokstand wurde, in, 25.nO,.. Wasser, gelöst ^und mit., ^r ei 25, »1- Anteilen.Äther" . extrahiert. Die' Ä the re^c träte te wurden verworfen,' und die. wässrige Fraktion wurde zu. einem Feststoff^lyophllisiert. " Danach .wurde der/Feststpf f., noch drei EaI mit 500 .ml . zur Beseitigung flüchtiger Lösungsmittel, und Hebenprodukte lyophil^siert. Der so. erhaltene Feststoff wurcle dann ⁽

einer kontiaiuierlicheii Fliesselektrpphörese (unter Yer-wendung. eines„mit ,kontinuierliohem Fluss arbeitenden Pufftr-Yqrgh.ang--Elektrophoresapparat.es,; der von der Firma Brinkma^L^.Iiistr^JAents Oömpa^/hergestellt wird) .unter folgendanoBedij^ungentunterzogent liaalid^m der Feststoff in genügend'T?iel Q ,5 M Essigsäure, {pH- ungefähr 2) ge--. lost worden w^ar, ;.wur-de_%,die Elektrophorese bei IQ: G und , 90 Irülli.ampejCA und 2QQ0.Yoit ..durchgeführt., I>is -Fr^ctioiien 26 -^" .^L, ,djue; gemj-ss .Di^nsah^htchr^ ge- .

■.-.■-■..■■-. ·" sQsmViVÄ^£:? ν ^;; ":■'■"

BAD ORIGINAL

1610631

entkie&tsn*

eimgt mid wieder -

zn einem weisssn

■>

D-rib ο fiiranosyl) ""Uf^QiIwS'"^lwplxospiiat uni •■I'^fi furanosyQ-cyto'sin^'p¹-;^ ; -

ph.oQptiat,. - ■""■ \ ■■■■- ■' ^; '"'■ - " "■ ' - ■ -'--- "·. -"--■ ^r'_;r ··..... ■■-■· -v -.^

• ■ lädst in -Bel-a^i^l St' ajageystosiian Wsige: ;τ

in Pyridiiilösung iEit l-(2^f, 5''-^Di-Q-.,{-.., o-syX)->-ura(iii in Ge^anVYart von DiGyelOhexyiearboi3a:iiiricl ^:ζϊι IT -^aEiSOyI-1—('2¹, 3'-d;i-0-. .:-.■-.

-l-( 2'" ,3'—'Ii- ,

3&d-sd e^ialüsne Es ter^rollifct' mir de,

^!.7ie in ."Beispiel 81 'gszei,gtV Äit ammoniak all solieci Ilstnari zu l-ß-D-^abir!Oiui*äHosylGytogin^5^f^yi^l^

Beis-piel 85

l-1-( 2ΐ 3-^f ^di-O-

-p-I)-

- 82:-

arabinof urar^o sy 1 }*-ey tosiu^- 5* -yl-1- ( 2', 3' -di-ö-b eiisoyl- £- Β—ribof 'urajMsyl}-^^thyitin— 5 * -yi-—plnpspiiat iiiid 1—fs—Ii-Arabir,ofura K>sylcytosin-5.*—yl—I*-^^ß-Ü-iribofuraiiosyltIiyinin-5' -

Ie der in Beis^iel 81 angegebenen

Weise- wurle IT — AüLsoyl—1—(2^I r3V— di—0-b-eHzoyl—μ—D— arabino— füranosyl)-cyi;osin-5^f—pnospiiat in Pyridinlösuüg mit 1-(2.* 13^l-I3i-0-benzoyl-p--D-ribpfuracösyl)-tnimia Ie Gegenv/ar t vo ώ Dicyel oli exylcarbö diiiai d zu 13*—Ani soyl—1— ( 2 *, 3 · di-O—benzoyl—-3—D-arabinoCxiraiiösyl J-cy to siij-*5 > -yl—1— ( 2' ,3^f — di—0—bei3zoyl—Jj-I)-ribofurafco syl)—tbymin—5'."-yl—pii

so eriiaitene Eaterirodukt wurde _t iix Bsisviel 81 gezeigt_s mit ciinaiomaleLisciiem listii zu Ι-/—D-ÄrabiiiOcCiira.iiosylcytosiE-p' -yl-l-p-D-ribofuranosyl tbyi5in-5 * -yl-pü.o"siruät iiy ire I^ sisrt. Beispiel 84

Jf*-ABisqyl-l-(2^f,3«-di-C-b arabiKofiiraiicsyl^cytosiii-S'-Tyl—1—(i¹ , 3^Γ-B-ribofuranosyl >^S-fliioroia'aeil-5*-yl-piiospziat uni 1-p-D-ArabinaxaräiK) sylcytosir-5 "-¹TyI-I- f-I>-ri bofuranosyl-5-fl\iorouracll-5¹-yl-piaosp]xät- \

In dar in Beispiel ίίΐ aiigegebeiien Weise -raräe ST^Arisoyl-dU-C^¹ _#3*-^χ-0~0Ώ>ζογ1-p-B-arabino-

900807/1786

; . ;■■-·--■ BAD

furanosyl^cytosin-^'-piiospliat in Pyridlnlb'sung mit 1^(2', J'-Di-O-benzoyl-ß-D-ribQfuranosyl)-5-i^>luorouracil in Gegenwart von Dieycloliexylcarbodiiinid zu ΪΓ - Anisoyl-1-(2^f _r 3'-di-Q-benzoyl-p-U-arabinofuranosyl)-cytosin-5·-yl-

yl-pJaospiiat umgesetzt».

. Bas so erhaltene Esterprootufet wuräe,

viie In Beispiel. 81 gezeigt, mit ammoniakalisch.em Methanol zu 1- p-D- Ar abino furane sylcyte sin-5' -yl-1- ^-D-ribof ttr ano^^^syl S-fluoruracil-S'-yl-piiospiiat hydrolysiert.,, Beispiel 85 . . '.._-.-· . .

#-Ani soyl-1- (2', V di-Q-benzoyl-^J-D-

arabinofuranosyl )-o.y tosin-5'-yl-lr-benzoyl-S-(2' , 3^r-di-Q-b enzoyl-1> -D-ri b.o-furanosyl )-7-deazaadeni n- 5 ^- phat und- l-p-D-lrabinofuranosylcytoain-S^ furo-rosyi-T—deazaadeniK-S'-yl—Pfi-Qspiiat.

In der in Beispiel 81 Waise 7/urde. I^-Aniscyl-l-(2^r _f 3^l-di-0-benzoyl^p-D--arabino-.fiiranGSyi)-c/to3:in-5'-piiosp2iat in Pyridinlösung-mit JT⁶-Ber.zejfl-9- (2', 3' -di-O-benzoyl-ß-D-ribofuranosyl >-?-

deazaaderiiii in G-e-^jen^art vom McycloheXylcarbodiiitid zu K^-Anisoyl-1-(2*, j'-ai-Q-benzoyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytcsin-S-'-yl-H^-benzoyl-9-(2' ₁ 3^f-di-O-benzoy-l-ß-I)-ribofuranosyl)--7-deazaadenin-5*-yl-pßosphat umgesetzt»

- 84 -

1820631

*:.". ■ ..:";·"- Bas ■' so eriial "fcene·
wie- in» Beispiel· 81^r .g.82sigiJVVmi.ir
zn -l-jJ-D-ArabinöfuräBöSylGjtosin-5 * r^l^H^IP^ibjofiiranosyl-

Beispiel 86

arabinöffuranosyl)-cytöSin-S*-^--9-C2',3\-di-0-benzojl-ß
D^ribofui'aiiosyli-i-.ö-mercaj.tDpia.rlp.^i—ji^-^liospliat. und 1—f

In 4er in Beispiel 81 angegebenen.:

furano syil-ö^tösin-S ' -piioäplia-t in Pyridinlösung. -mit;> - :. ... 9- (2* ν 5*-^Di-^-benaöyi·^ß-D-ribofmranösyl^ .--6-mereag topurim '. in.' #s*"effi7ärtV^OB. ■ .t)icydlöliexy^l

(2*, 3^! -di-O-benzoyl-p-B-aiaipinQ.faranosylS)-.Gy^osilni-5' ^yI-.
.9-{2'^! , 3¹-'äi~O-b3nzQ^l-j3^1-ribQ

5*~yi^'pMösp^iat--üfflge3§tz%».-: · . ,."" .--..- .ί v._:-- - ·... - -■:*.. :-.!^j- . ■- ■■. ν ^ - ^! Z;.^. ^ ^r---Bas^öö ^riialiene Esterprodpk^.mirds^ .- · -. .τ! ein -B ei spi el ■ Wk · igeiml-gt * ^mx t·--aaamoniakte all $en em. Me tlianol zu l-p-l^AMMiiofuir^&^ ;

spiia-fc^ kyajOlysiert, , .^, »'.-; . -_:

g^a?^^

ORIGINAL

axabinofMranosyl )--cjto3iii-5^f-yl-l-C3^f-0-l)sn2oyX--p-D-' deoxyribofiiraiapsy.l )-u^aeil-5 »—yX-phos ßfcat und 1—p-B- . Arabl no f ur anosyley to sIb—5 * -yX-X—p—1)- deoxyritoofura*© syX-uraeIX-5*—yl—pliosiÄat. - /

. - -■-...-.- \ In dar in Beispiel 81 ■lfei.se■ wards.. W -Aiiisoyl—1—(2¹ ,3'-3.1-O-banzojl—ρ fur ano SJl)-Cj to siii-5¹—^piios^nat in Pyr-iliiilösuiig sa.1; 1- { ^ *-O-rBenzojl-p-B-deoxxriöofaranqs^l^-uracil In wart von Blejcilpke^lcarboiiiiMicl zu B^-ilcispjl—\—i2*~i* dl-O-b önzöjl-rß-p-arabiBp.Euri.i^sjl )-cy tosir_;~3^f-|rl—l-(3* 0-b eazojl-p-D-dsoxyribofuraED^l)—oiracil—5* —jl—Pitospfea Hinge setz tr· - ..--._...

;_C. - Pas isp, eriialteiie^.Sster^roduJit imrde, wie in E ei spiel Sl gezeigt, Eit amiapriiafcallseiiem llethar zu l-{i-I)-Abifl|I

"V

Beispiel 88

arabino £uran© sjl) cy "fcuslii— 5 *.—yl-H"Vba-Ezo^l.—1- { 3* — p—b'sr.sp

wurde..^-

Iu der:-iii. lisispiel, 81 acg^ebac^n. ü^-ie, , —1-.(2* ,-5¹ -dir<>-be:nzpJl.--μ-_:I)-a■lcabir_iox^it.*·tiϊc

- 86 -

OR/G/NAL

Ie J^ridiiilcsuiig mit H -

syl )-cyi;GSiii in iron Dicyeelolieayicarbodiimisi zu Ή <>~Αχΐϊ$ο$ί-1—

5 * -yl-paöspiiat

Bcu» so sriialtsrLe Eütsrprolulct wurde, wie in Beispiel 81 ^ezieigi, mit zxi 2^p-B-iS^^ino3^^

Beispiel 89

-cytösiij-5 *-yl^l- { >* Arabi nefur ano syl c^!itesii>^^ ^r-y 1-1- .".-

In 1^^ Ir: ^sia^^i £1 Weise wurle ^-Α^ϊ3θ/1^1~(2^ι3* furancs^l)—cy to3in-5*--idiOopi:at

vcm EicyclGhax^lcarfceaiiEil zu E^^i^jl

SAD ORIGINAL

162063t

Das so erhaltene Esterprodukt wurde,

wie in Beispiel 81 gezeigt, mit ammo niakali seit em Methanol zu l-p-D-ÄrabiEofuranosyicytosin-S *-yl—1—p-D-deoxyribofuranösylthymin-S'—yl—phosphat hydrolysiert. Beispiel 90

K^-Anisoyl-1- (2 ^r, 3 ^-di-O-b&nzoyl-p-B-

arabinofuranesyl )-ey tosiH-5 *-yl-1- (3^f-Q--benzoyl-ß-D-deoxy ribofuranosyl}-i-fluoruracil—5'-yl-phosphat und 1-(3-D-Arctbirofurarjosylcy to sir-5 *-yl-1—μ—^]>-deoxyribo-

Ik der in Beispiel^81 angsgeberen

Waise ifaria 1 -Arisoyl-l-Cii¹ ,3*-äi -O-bSrriZoyl—^-D-arablnoⁱft;ra.i;os/ll-e/to3irt-5*-iJiiosphat in PyriäiiitösuBg mit 1-(3'-0-Ji^ZiZO-Jl-. -B-deoxyriboiuranesyl)**5-£luorttracil in Gre^en-vart von Dicyclohexylcarbodiiiiaid zax W—Axtlsogl— 1-C 2^r f 5' -di-Q-b enzoy1-p-B-arabi nofurano sy1)-cyt&sin-5'-yl-1-(5*-0-ber;2ojl-^-D-decxyribofurarosyl)—5—fLiiöruracxl-5 ^fyl-piiG3-pr".at umgesetzt. . _ ! ; .

■ . ._--■■ DüSi so eritaltene: Est^r^ro //ie ir Bais^iul \'cl. .^assigt, mit. aßEsioniakalisohem zu 1 - ii-D-Aribiii© fur ·ίη© sy lay to si η—5»-yl-l-p-Ih-d eoxy ri*bofuranosyl—S—xiuoruraail—5^r-yl—i^oSi-Iiat hyctrolysiert· ispiel 91 .. ' ...""■ ..·-/■

M⁴^Ani sbyl-X.- (2·-, J^-Ü-O-

- 88 - "

^BADORlQmAL

MfX )^^%gMiT^^x*^^^Q^$mmy%^B^i 3* ^-

ÄÄ^

v/i§■ in Beispiel 81 .gaa.öigt_:, mi"fe^:-oiEiuyiÄ.ai&aJtä^liem ;Metiia2io.l" zu l^fj-i-AraSi^^ramsylc^tosin-5'^rl"S^wP^D-d« f ura.no syl^7^ä eazaädeniii--^5 *^ ^f l^pliospliat^

und tosin-5 * ^1^9*^

Si^arep^puXinS^^^pfioap^ "■

^iä^I^

. BAD, ORIGINAL

fuvmosp 1 )~cy tosim-5^f-jsiwsBfeat ir; sy-ridiialU sung mit

Sioycloii9J{ylcaix*Tbo<liimii zu cytosin«·!?'-7X-9-(^*-0^ei?s<^i-!^I>*l^oj^riboiurai»3ji")--€--■

so/ οί-ώώΧtere"" 1stärpi-ücltiJct mix-

tü

wie In Bsisi^X^eXaez^igi;» Juxt aii»oiiiakaiiscb.'eia^: Mstüasat zu X- μ-D-arabinofuraEQ s^Xeytosisj-^^f -^X~9-ια-Β-άβοχ^ϊ furώηο syX-S-meits ap top^ric-S*-jX~i:-iiospüat' kydbolysi'erW

araoinofU-CänaayX)-cytosin-5^f-jX-X-(2* ,5''-di-O-benz D-ribofurarfJsyX)-uraeiX^5^f-yX-pKospliat uiia X-ß-Ö-'Aa-ilciEe— fur&iio syX cyto 3in-5 '·—yX—X-;--D-ril>oxurä2io sjXuraciX—5^g -/X— piiospiiat.

• ' Xm ά&τ in Baisi^iaX" Sfa^e^söenöi»^" ';

Weise v/urde IT -Äce^X-X-^aSi'-di-O-^Vfya-p-D-äraüiriO-.'"' furaiasyXj^cytooin-^^-piitispilAt Ίϊί PyridinXÖsling"Elit¹"''' ^;""'' X_(2»,5'-M~0-benzoyX->>-Ii-aritGXtirajiosyt )-üiaciX "iii Segenvyart von DicycXoliexyXcarlioIiiEiii zu ϊί «Äc^tyX—X—(2¹, 3*—di— 0-ac etyX-p-ii-arabiiKjfurarLO^rX )-cy tösii3r-5' -yX-X- ( 2¹, 3*-*ί-O-benzoyX-p-D-ribofuranoayX ) .uraciX-5 *-yl~pliosjiiat ukgfe^· ■ setzt,

Das 3O erhaltene Ester/ro dukt wurde,

,vie in Beispiel 81 gezeigt, mit guEiiioiiiafcaliaciiem Methanol' zu 1—μ-D-ArabinofuraEOsyleytosin-5 * -yl—1—p—B-ribof uro.no syl uracil-5'-yl—ph&spiat hydrolysiert, IUs erhaltene Produkt ist las ^leieiaa -«ie das Endprodukt de3 Beispiels 82. Beispisl 94

Ir-Arisoyl-1- ( 2· _r 3! -di-O-beriiioyl-p-

bejizoylS-CS¹, 3^l-O-

yl·}—_7-d eazaaleiiirt-5 · -yl-

er.χ 1—ή—D—Ar3,bino-furano3yloytosir-5-*-yl—9-tJ-O— ri bo furL.no syl—7—ö-eaz iaderäu—5 *—y 1—ρηο spüat ·

Ir dar. ir neisciel 61 ar.s3i.,ei;aneJB Viaije ffurie it -ÄKisoyl-l-(2· _a ^-di-O-feeiaiQyl-ia-D-arabir syl)—cy/tosiii—55 ^t-phospha1r ir. iVridirlösuu: stit K-^-i 9—(2* ,^^-ia-O-iaoj^ro^pyliieiie-o—B-riboxUritHosyl )-7-deaz<*aie

rdn wäi-reiid 5 Tagair aei 24 bis 2&°G ir. aejer-.vart iron Dicyclohejylcarboiiiinid au B*-Äid.soyl-l-(2· _f J'-di-O-ban f.—D-arabirorjüranosyl )-eytosir.-5 *-yl-K°-b arisoyl—9*-(2^l, 5¹ 0-i sopropyli J ar-_: -D-ri bof urano syl )-7-deazaaierd.n-5 * -ylumgesetzt·

.Das 30 erhalt 3^ö Esteri.-rodtikt war ie

rsscas"«, -.-la ir "Beispiel i.1 -j-.-s-ijt,, Eiit aBuaoriiakalidCli lletaancl cjdcel* siert» ;;nd iaa se er.icO.ter:-3 Proiukt \7ur-

- 91 -

de mit einer Methanollösung, die 5f° Chlorwasserstoff enthielt, zu l~ß-B-Arablnofuranosylcytosin-5^l-yl-9-ß--D-. ribofuranosyl-7-deazaadenin-5'-yl-phosphat hydrolysiert. Das erhaltene produkt war das gleiche wie das in Beispiel 85 erhaltene produkt. ·

Beispiel 95

Kr-Benzoyl-l-(2^t,V-di-O-acetyl-ß-D-

arabinofurano syl) -cy to sin-5' -yl-9- (2', 3' -0-i sopropylidenß-D-ribofuranosylJ-liypoxanthin-S'-yl-pho sphat und 1-ß-D-Arabino furane syloy tosin-5¹ -yl-9-ß-D-riböfuranosyl"" hy poxänthin-5' -yl-pho sphat ·

In der in Beispiel 81 angegebenen

Weise wurde N^-^enzoyl-l-^¹,3^e-di-0-aoetyl-ß-D-arabino- furanosyl)-oytosin-5'-pliosphat in Pyridinlösung mit 9-(2·,3'-di-0-Isopropyliden-ß-D-ribofuranoayl)-hypoxanthin in Gegenwart von Dicyolohexylcarbodiimid zu H^'-B« nzoyl-1- (2¹ ,3'-di-O-acetyl-ß-D-arabinof urano syl )-cytosin-5 ^f-yl-9-(2^f, J'-O-isopropylideia-ß-D-ribofuranosyl)-hypoxanthin-5¹-yl-phosphat umgesetzt.

Das so - erhaltene Esterprodukt wurde,

wie in Beispiel 94 gezeigt, mit ammoniakalisehern Methanol und dann mit Ghlorwasserstoff enthaltendem Methanol zu l-p-D-Arabinofuranosylcytosin-5' -yl-9-ß-D-ribofurano sy 1-hypoxanthin-5¹-yl-phoephat hydrolysiert.

- 92. 909887/1786

-■;-■ In jiery in wthergeiienden Beispieletn: ^v

81' ·* 95^ veranscliaulictiijen f eise teöiinen andereu5* , 5-*-/ Dinucleosidpliosphates-fcer der Formel TIII^ die als/einen Hue 1 eo aidanjteil 1~β-Φ»1ί?abinotur^anqsjrlpyi^sin und als anderen ein ß-H-Biböfüranosid oder p^I^DeoXy^rifebfuranoai enthalten, hergestellii werden» RepräsentatiTre Üioleoside dieses Typs^: sind bei spiel s#eiser l-ß-I)*AraMnofuranosyl-

1-ß-D-Arabinofüranosyloy tosi raS_ ^t-yl-'9'-ß-I>-«-ri"böf üranösylguanin-5^! -yl-phospliat^ l-§—D-Arabinöfuranosyleyto sln-5¹Z-yl-. 1«.p-D-ribofuranosyl-S-ioduraoil-S'Hyl-pliosphat, l-ß-D-Irabinofuranosyloy tosin-5' ^l-l-ß--I)--ri'b£ifuraiiQsyl-5-

5 ' ^yl^l-ß~I)~ribofuranosyl-'5«-'trifluorme1;liyluracil-5'-yl— phosphat * 1- ß-D—Arabinoferanosyley to s|.n-5 V-^yI-I- ■β-ϋ''-". dea^ribof uranQsyl-5-ioduracil^5'-yl-pfaospnatj Arabinofuranosyloyto sin-5■' -yl-l.«ß-I)-^:de0xya?ibofüranosyl-5-brQmuraeil-5.¹—yl-pb-osplmt, l-p-JD^Arabino;furanösylGytosi_Jti~ ii'—^-1^1*· ß-D-d eöxyribö furano syl^-Gliloruraoilf-S^s -yl-

* · dao^ribofuranosylxantMn^^-^l-plioapiiatj :l^ß~1>%A.räbino--

5 ^Λ *yl:*^-p—D—deoxyril3p^:£u'ra-n^5yl—ädeiäii-- und

ΒΑΪ3 ÖBJGäNAL

Claims (1)

1. 620Wt

   Patentansprüche ;

   1. Verfahren zur Herstellung eines

   Oligonucleotids der Formel VIII,

   2 ^a OH

   H H

   YIII

   H OH X
   in der X f assers boff oder Hydrojqy und Y Cytosin-1-yl,

   Uracil-1-yl _f Thyiain-yl, Adenin-9-yl_f Guanin-9-yl _f ^;

   - 94 -909807/1766

   ^BA[>GRlQi_NAL

   _.. ' . . ■■ ■■ 3s ■·■ ;

   7~Deazaadenin-9-yl» o-Mercaptopurin-^-yl? üraGil-»3-yl₈ 'S-Ctiloiniraoil-l-yl, 5-Bromuracil-l-yl, ♦

   S-TrifluormethyluraGil-l-yr, Hypoxanth±ö*-9-yl, Xanthin-9-yl oder 5-Methylaytosin~l-yl, bedöutet?»^ dadurch, geskeniizeiclinetp dass man l)l-ß—J)-Arabinofura.nosjylqytositt mit eiiieia Veratheruiigamittel aus der Gruppe der Ohio ride raid Bromide vo η Iriplieiiylme-fchyl, (p-Metlioaörph,eftyl)-dipheBylmethyl und bis' (p-Methoxyplieiiyl)-

   behandelt, um das entspreciiende l-(5^f-0«--. ^ herzuatellenj

   2) diesen. Äther mi* einem Aoylierungsmittel aus der Sruppe der Säureanliydride und Saurehalogenide von KohlenwaöSerfiftoffdarbons&uren mit 2 bis Ig Kohlenstoffatomen

   acyliert, um das entsprechende N "-AOyI-I-(Z¹ _f3^f--di--0-aoyl-5^f -O-triphenyimethyl-{i-D-arabinof uranosyl3-oy tosin iierzustelXeof 5~) die Hthergruppe durGli Behandlung der XtkertriaßylTerbindung mit Halo^ö^wassßi'S'to-ff spaltet, um das entsprechende N⁴;-Acyl-l-(2« ,3'-di-O-acyl-fi-D-arbinofuranosyl3-cytosfin herzustellen} 4) die Triacylverbindung mit einem Phosphoi'ylieruiiesmittel in G.egenv?art eines Kondensierunsemittels uni dann mit einer Ale$clibase behandeit, um ein l-(i<-B-.Arabinofurano3ylcytpsin-5^<-piⁱo3pnat - herzusteilen| 5) das so erlialtene 5'-Phosphat wieder

   90980/1786 ^_{AD QR!G},_NAL

   3 V

   einem Acylierung ami ttel aus der Gruppe Säureanhydride und Säurehalogenide von Kohlenwasserstoffcarbonsäuren der oben definierten Art acyliert, um das entsprechende Ή -Acyl-l-(2' , 3'-di-O-acyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin-5'· phosphat herzustellen; 6) dieses Phosphat mit einer Verbindung der Formel

   CH OH _Y ι

   Ac¹¹O X«

   ir der Ac" a±i:e Acyl ^ruppe einer Kohlenvvasserstoffoarbonsl-iure mit 2 bis 12 KohlenstoiTatomen, X¹ Wasserstoff oder OAc", wobei Ac" -iine vae oben definierte Ac/lgruppe iut, und Y' Y, ir. -loir. toiinüß'rupperi durch Acyl^ruppen der obanange^eLener. Definition geschützt sird, bedeuten, zu einer Verbindur.^ der Formel VII

   - 96 -

   909887/1786

   Bad

   'AL

   HHIc'

   QH

   Oj

   .GH,

   OAc

   /Ο ι

   τ*-

   -HH

   ^: H

   Ae¹¹O X¹

   r Ac, Ap'. iirtct Ag* Ac/lgruppen der ."Del'imtioVi sinl, X' tiiii "IT¹/, wie oben dsfi ae'tiit·; und 7) 4ί
   el. VIII

   -iiasiG.t^-iiit;^ dass üistn l) l^_P-

   l ^:aus

   -97

   9 0988 7/17S6

   BAD ORIGINAL

   rile und Bromide von Triphenylmethy1, (p-Methoxyphenyl)-■ diphenylmethyl- und Bi^-(p-methoxyplienyl)-plienylmetnyl behandelt, um das ent3}.rsollende !-(fi'-Q-iriphenylmethylß-D-arabinofuranosylj-cytosin heraus teil en; 2) diesen Ätlur mit einem Acyliarungsmittel aus der Gruppe der Säureanhylride und Säurehalogenide von Kohl en»vas a er stoff carbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen acyliert, um das enta^reohende ΓΤ -Acyl~-l-(2·,^•-di-O-acyl-S'-O-triphenyliaeth.yl-ß-D-ärabir.of uranosyl)-cytosin herzustellen; 3) die Äthorsru/y^e Itirch BeJiürdlung der ÄtnertriaGylverbiiiiur'ü' ωϊΐ Chlorv/ai3arstoff spaltet, um dao entspr&cxiende Ή -Ao/l-l-(2¹ ,3 '-di-O-acyl-jj-D-araDirofurai^osyl)-gjtosin

   4) Ii>? Triacylverbindung mi fc si;ie.T, Piiosi-lioryljtel in G-e j iv::ivxt eine3 Koriersi jxiir^smi «tsls ui': 1 i-rr lüit oii-r-jr Alkali base beharl'jlfc, vru ein 1- -—D-Ax'abi ''.oftir^iiotiyloytorfin-5 *— i-rxo3_x.jtat aarEua !,elleii} 5) daa so «raaltene .5'-Pi_o:-;_ .x-^t mit sin-iu kojl±-iV'.,i _;^::i";tel um 1 Ji* Grapse ϊϊί ^ ; ..iSij irllv und Sö.ur ^h al o'j ^ nid 3 τοη Ko .il an.Yaa Q era to f :'c ^.r bc nsiiur en der ob enarje ^ebener T)e f i ni tio η äcyli'irt-, um'däs BiiU^rooaanis H -kayl-l-d' , S'-di-O-L.c/l-D-ar-.-oinofurar.os.jl) -o,/ go sin-5' -pho spiiat ii irzv.s tol.l ar·; 6) it mi ^ oi-iur V'irbii d l'l

   90 9887/178 6 ^Bad OFiigi_Nal

   HO-QH

   in der R¹ und H" Alkyl gruppen mit 1 bis. 5 Konler.otoffatomen bedeuten und Y* wie Y definiert ist, in dein die Aiiiii"!Ogru2per5 dursh Acyl^rui3pe·. von "ioblemesserütoi'foarbonsäuren mit 2 bis 12 Ko-il 3:.ötoffatoiueti -^dsciiut^t sind, zu einer Veroiiiäu^:g der Fei^rol

   _ Ov₁ „

   909 8.8^7/1786

   BAD ORIGINAL

   Ιο©

   ρ —on

   CH,

   ,0

   OAc

   Vi-

   R"

   XII

   in der Ao und Ao* Aoyi gruppe η" von Kohlenwasserstoff carbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeuten und II¹» R" und ¥' Y19 obQn definiert aini, umsetzt} 7) diese PolyacylvarbiiiduKg mit einer Base und hiernach mit einer Mineralsäure zu der Veröindung der Formel VIII hydrolysiert.

   Pur

   The TTpgolii: Company K al aniazo ο (Mi chi ^- an, V S t A)

   ORIGINAL

   90988-7/Ί