DE1620757A1 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosidphosphaten - Google Patents

Description

ZELLSTOFFFABRI£ «ALÜHOF Mannheim, den 26, JuXi 1966 Mannheim - Waldftof Dr.vdB/Νβ (O₄N. 624)

Verfahren zur Herstellung yon tfucleosidphosphaten

Gegenstand vorliegender Anmeldung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Nucleosidphosphaten, insbesondere Di- und Trinucleosidphospnatenc

5*·* 5'-verknüpfte Uinucleosidphosphate und Trinueleosiddiphosphate sind die kleinsten niedermolekularen Bauelemente der Nucleinsäuren» die deren sämtliche Strukturmerkmale enthaltenο Sie werden u» a_o benötigt zum Studium Ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften« besondere der zwischen Purin- und Pyrimidinbasen in den Nucleinsäuren bestehenden verschiedenartigen Wechselwirkungen; als Substrat· zur Aufklärung der Speuifität und des Wirkungs- «•chanittiue nucltinsäurespaltender Enzyme (Nucleaaen), ferner als kleinstmögliche Modelleoleküle für mestenger-RNS bei der Kntsifferung dee genetischen Codes der Proteinbio-Synthese, sowie als Starter bei der enzymatischen Synthese von Oligo- und Polynucleotiden durch FoXynucleotid-Phospborylaseo

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Derartige Verbindungen wurden schon auf verschiedenen Wegen gewonnen» So kennt man die Farti&lhydrolyse von Ribonuclein-öäure mit Metallhydroxiden (K₉ Dimroth, H, «itsei« Liebiga Ann« Cheau 620» 109 (1959))« Bei diesem Verfahren erhält man ein Geai ^ch aller 16 möglichen Binucleoaidphoaphate sowie Triaucleosiddipboaphate» ferner hat man darin 2^l* 5'-Isomere, Nucleoside, Mono- und Dinucleotide sowie größere STucleinsäure-Bruchstücke gefunden. Nur durch eine sorgfältige und zu mehreren Malen durchgeführte Chromatographie an Ionenaustauschersäulen konnte man eine Auftrennung erzielen»

Ferner ist die ensymatische Synthese bekannt, die unter bestimmten Bedingungen die reversible ffirkung der Ribonucleasen ausnutzt („L.A* Heppel, F.R. ffhitfield, R» Markham, Biochem_o J= 60, 8 (1955)} M.R_O Bernfield, J.Biol«Chem« 240« 4753 (1965) ι 241, 2014 (1966))« Hierbei verwendet man als Ausgangs· Verbindung 2',3'-cyclische Nucleotide und Nucleoside· Infolge der vorwiegend hydrolysierenden Wirkung der verwendeten Enzyme ist dieser ifeg nur mit geringen Ausbeuten an Sondensatlonsprodukten verbunden und daher für präparatlve Zwecke wenig aussichtsreich.

Xn neuerer Zeit wurden chemische Synthesen durch Kondensation von 3¹- oder 5*~Mononucleotiden oder 2*, 3'-Cyclonucleotiden mit Nucleoaiden bekannt (F. Cramer, Angew· Chemie £§» ^¹⁸⁶ (1966))» Die chemische Synthese hat jedoch

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den Nachteil» daß wegen der vielen Möglichkeiten zur Bildung von Isomerengemischen vor der Kondensationsreaktion die Hydroxyl - und Aminogruppen der Auegangssubstanzen geschützt werden müssen bis auf diejenigen, die an der Kondensation teilnehmen« Als Schutzgruppen dienen u. a« Acetyl-, Benzoyl-, Benzyliden-, Tetrahydropyranyl- oder Trityl-reste«,· Nach erfolgter Kondensationsreaktion müssen diese Reste wieder abgespalten werden« Unter diesen Gesichtspunkten hat man vor allem bei dem Verfahren von E.G. Khorana and Mitarbeitern für kleine Mengen an Sinucleosidphosphaten und Trinucleosiddiphosphaten einheitliche Produkte erhalten (R. Lohrmann und HoGo Khorana, J.Amer.Chem.Soc. 86, 4188 (1964) und 88, 829 (1966); R. Lohrmann, D. Soll, H. Hayatsu, E. Ohteuka, H₀G₀ Khorana, J.Amer.GhesuSoc. 88, 819 (1966))« Obwohl die Kondensationsreaktlon selbst mit befriedigenden Ausbeuten verläuft, muß man auf dem Wege der Einführung der Schutzgruppen und ihrer nachfolgenden Abspaltung erhebliche Verluste in Kauf nehmen.

Aufgabe bei vorliegender Anmeldung war es nun, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Hucleosidphosphaten, insbesondere Sinucleosidphosphaten und Xrinueleosiddiphosphaten zu finden. .

Es wurdt nun gefunden, daß die Lösung der Aufgabe dadurch gelingt, wenn man solche als Kondensationspartner geeignete

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Nucleoside verwendet, deren OH-Gruppen ungeschützt sind. Die Erfindung besteht daher in einen Verfahren zur Herstellung von Nucleo8id/_nv~phoephaten/_n_4|\, wobei η vorsugaweie» den Wert 2 oder 3 besitzt, aus 2¹- oder vorzugsweise V-Mononucleotiden, die in Zuckerrest vollständig verestert sind« alt dem Kennzeichen, daß man die Mononucleotide mit solches Nucleosiden oder Nucleosides-phosphaten^^N (m«n-1), deren OH-Gruppen ungeschützt sind, in an sich bekannter Weise in Lösung kondensiert, die Kondensationsprodukte abtrennt, alt in Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln gelösten Alkalien behandelt und die gebildeten 3'-> 5 - beziehungsweise 2'* S'-Kucleosid^-phosphate^) _{ia m ütcü bekannter}

Weise .isolierte Als Aiisgangfisubstanzen für das erfindungegemäße Verfahren

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kommen die liononucleoti.de N , O » O^ -Tribenzoyladenylsäure, N⁴, 0^2> _t O⁵'-Triacetylcytidylsäure, N², O²', O⁵'-Triacetylguanylsaure, O _$. Cr -Dlbenaoyl-inosinphosphat, p« ei

O ν O^ -Diacetyluridylsäure in Betracht, aber auch alle synthetisch hergestellten Nucleotide mit abgewandeltem Baienteilο

Mit diesen Nucleotiden können alle natürlichen oder auf synthetischen Wege"gewonnenen nucleoside und 2'-Deo3cynucleoside kondensiert werden, z. B. Adenoein, Oytidin, Guano sin, U rid in» 3-H-Kethyluridin, Isoadenosin, Purinriboeid, H -Dinethyl-

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adenosin, 1-Benzyl-inosin, 6-MethylmercaptopurinribOBid,

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2-Fyridon-1~ril)oaid,

Beide Kondensationspartner müssen in gelöster Form vorliegen, Je nach ihrer Löslichkeit empfiehlt sich als Lösungsmittel Pyridin und/oder Dimethylformamid„ Als Kondensationsfflittel benutzt man vorzugsweise Sicyclohexylcarbodiimid (IXJC) oder Triisopropylbenzolsulfochlorid (TFS), doch eignen sich auch andere Carbodiimide oder Säurechloride. Die Reaktion als solche soll bei Raumtemperatur oder bei erhöhter Temperatur bis etwa 40° durchgeführt werden ο Hoch höhere Temperaturen sind zwar möglich, jedoch erhöht sich damit der Anteil an Nebenreafctionen und Nebenproduktenο

Nach der Eondensationsreaktion werden das Losungs- und Kondeneationsmittel entfernt, beispielsweise durch Ausfällen des Kondensationemittels» Extraktion der Lösung mit Petroläther, und Abdestillieren des Lösungsmittelsο Dae verbleibende Reaktionsprodukt wird danach mit Alkalien behandelt, die in Wasser oder organischen Lösungsmitteln gelöst sind» Hierbei hat sich als besonders vorteilhaft die Verwendung von wäßriger oder methanolischer Ammoniaklösung gezeigt» Im Anschluß daran erfolgt eine Auftrennung der Produkte nach den bekannten ohromatographis.chen Verfahren wie Papier-Chromatographie oder Anionenaustauechchromatographie.

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Es ist nach dem erfindungsgemä3en Verfahren zu erwarten, daS das eingesetzte 5'- oder auch 2'-Mononucleotid mit dem Nucleoaid sowohl in dessen 2'-, 3'- als auch 5'-Stellung reagiert» Dies 1st auch tatsächlich der Fall» Hierbei wird in nicht voraussehbarer Weise .die 5'-Bindung bevorzugt. Jedoch hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß bei der sich der Kon» densatioasreaktlon anschlieBenden Aufarbeitung des Reaktionsgemische s, nämlich bei der Hydrolyse, lediglich die 3¹^ 5'- bzw. 2'-> 5*~Nucleosidphosphate erhalten bleihen, während die beiden übrigen Isomeren in liononucleotid und Nucleosid ge spa" ten werden. Da die überschüssigen, nicht umgesetzten oder durch diese Spaltungsreaktion gebildeten Nucleotide und Nucleoside in reiner !form wiedergewonnen und erneut eingesetzt werden können, entsteht keinerlei Verlust an diesen Produkten. Bezieht man daher die Ausbeuten bei dem erfindungen gemäßen Verfahren auf das eingesetzte Mononucleotid, so erhält man eine Ausbeute, die etwa zwischen 25 und 40 % liegt„ Bei Berücksichtigung der Wiedergewinnung der Auegangsverbindungen, was insbesondere für wertvolle Ausgangssubstanzen von großem Vorteil ist, ist die Ausbeute mindestens doppelt so hocho

Das Verfahren nach der Erfindung »part nicht nur die viel Zeit, Arbeit und Material kostend· vorherige Einführung der Schutagruppen in das Nuoltoeidmolekül und deren ap&tere sukzessive Abspaltung ein, iondern liefert die gewünschten -

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Dinucleosidphosphate, Trlnucleosiddiphosphate usw. in hohen

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* Ausbeuten und großer Reinheit auf einem sehr einfachen ffegO Hierbei ist noch besonders hervorzuheben, daß die nach dim beanspruchten Verfahren entstandenen geringen Mengen an unerwünschten Nebenprodukten, nämlich .3'·* 3'- und/oder 5'«»2'-Diestern, ohne zusätzlichen Arbeitsgang bei der Aufarbeitung entfernt werden,.

Beispiele«

Man löst 03 alfol Nucleosld in der eben ausreichenden Menge Pyrldin (wasserfrei) oder Pyridin/WLmethylformamid 1:1, fügt Ö»2 rnMol acetyliertes 3'-J£ononucleotid und 2 mliol Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und läßt je nach der angewandten LÖsungsmittelmenge 8 bis 14· Tage bei Raumtemperatur oder 350° stehen.. Dann wird bis zur Trübung Wasser zugesetzt, nach 12-stündigem Stehen von ausgefallenem Dicjclohexylharnstoff abfiltriert, mit Petroläther das restliche überschüssige Dicyclokexylearbodlimid extrahiert und die Pyridin-fässer-Phase Ik Vakuua zur Trockne eingedampfte Der Rückstand wird 12 - 20 Stunden alt Aaaoniak in Methanol (bei Raumtemperatur gesättigt) behandelt, naoh Abdampfen ia Vakuua in 100 al fässer aufgenommen, filtriert und auf eint SlIuIe gegeben, die alt 50 ml eines unter dea Handelsnaaen *Dom*x 1 χ 2" (50-100 mesh) bekannten Austauacbexharzes in der Formiatform gefüllt ist. Es wird zuerst mit lasser nachgewaschen.

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Der Durchlauf enthält übersciüssiges und zurückgebildetes Nucleoside Anschließend wird mit Ameisensäure steigender Konzentration eluiert und die getrennt erscheinenden Dinucleosidphosphate sowie die nicht umgesetzten bzw* neuge« bildeten Nucleotide durch Gefriertrocknung oder Eindampfen im Vakuum bei Raumtemperatur (unter Zusatz von Methanol) isoliert und über -E^⁰S getrocknete

Die Ausbeuten betragen durchschnittlich 0,05 mMol (20 - 30 mg) • 25 %_s bezogen auf eingesetztes Aeetyl~nucleotid„

Auf diesem Wege hergestellte Verbindungen:

3J -Nucleotid	Nucleosid	Dinucl^ phosphat	eluiert E^' bei pH	0,35	pH 1 max.-,	US ο
N ,0 c.O^ -Tri~ acetyl-Cytidyl- säure	Adenosin	GpA	3,05	0,29	265	24%
dito	Isoaöenoain	CpIsoA	3,48	Oj 36	275"	20#
dito	Purinriboßid	CpPu	2t7-	0s44	270.
dito	adenosin	CpA (OH,) ?	3,0-1	0,33	273	26%
dito	Cytidin	CpC	3t25	0,31	278	24#
dito	üridin	OpTJ	2S95	0947	26S	2?^
dito	uridin	CpU(OH3)	2,95	0t42	269	26%
dito	2' -Deoagr- adenosin	CpdA	3S25	0,45	265	28%
dito	Thymidin	CpdT	2S94	...	272	30%
N2 O^O-'-Tri-	Cytidin	GpC	2,75		25%

acetyl -Guanyl-

O²\o⁵°-Di- N⁶-Dimethyl" UpA(CH,)₂ 2,61 0,50 264 30%

acetyl-üridyl- adenosin ^

x) in Isopropanol:Wasser:2 η NH, » 7:2:1

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Claims (1)

162075? Patentansprüche

1.) Verfahren zur Herstellung von Nucleoside N wobei η vorzugsweise den Wert 2-oder 5 besitzt, aus 2'-, vorzugsweise 3*~Mononucleotiden, die im Zuckerrest vollständig verestert sind, dadurch gekennzeichnet) daß man die Mononucleotide mit solchen Nucleoside!! oder Nucleoside ν phosphaten/ ^ \ (m « n-1), deren OH-Gruppen ungeschützt sind) in an sich bekannter ieise in Lösung kondensiert, die Kondensationsprodukte abtrennt_s mit in Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln gelösten Alkalien behandelt und die gebildeten 2'·^ 5'- bzw« 5"«^ J'-Nucleosid,· \-phosphate in an sich bekannter Weise isoliert»

2o) Verfahren nach Anspruch 1_S.dadurch gekennzeichnet, daß man die Kondensationspartner in wasserfreien Lösungsmitteln mit Hilfe eines Carbodiimide oder SuIfosäurechloride kondensiert ₀

5o) Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Beseitigung der unerwünschten Kondensations· produkte mit wäßrigem oder methanolischem Ammoniak vornimmt_o

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