DE1620636A1 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosidphosphaten - Google Patents

Description

r Beil 2_3lJunH986

Alfred Hoeppener ^α

Dr.Hans Joadim Wolff 1620639 Dr* Hans Chr. Beil

Frankfurt a. M.* Höchst AcUloiutxaJle 58'■ * Tel. 3t 3649

Unsere Nr. 12 735

The ITpijohn Company Kalamazoo (Michigan, V.St«A.)

■Verfahren zur Herstellung von Nucleösid-phosphaten

Die Erfindung "bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen organischen Verbindungen, insbesondere 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-(und 5-substituiertes-cytosin-) 2¹*· und ■ 3'V-phosphate·

Die neuen Produkte und die Verfahren zu ihrer Herstellung werden beispielsweise durch die folgenden Syntheseschritte A, Bund G erläutert!

H₂

HOCH₂

Hd

NHAc

TO-CH₂ r,

TO

TO-CH₂

Ac©

AcO

Nib

-2-

From JIIa From -I I Ib

NHAc NHAe

TO-CH₂

N.

IV

TO-CH₂

TO-

CH₂

h^N

HC

(HO)₂=P

ti

HO-CH₂

$H0j₂=P-0 H H

ViI HO-CH₂

HO

Vl

909887/1769

-5-BAD ORIG'NAU

TO-CH₂

TOCH

\r>—

P=(OH)₂

IX

Vl I I

HOCH₂

H 0

HO A I

909807/1709

OR/GINAL

H HO

HOOH

OH H

(HO)₂-P-O ff

«- II

; ο

XI - ^υ VII VIII Ρ»(0Η)₂

in denen Ao die Acylgruppe einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis einsehliesslich 12 Kohlenstoffatomen, T Triphenylmethyl, (p-Biethoxyphenyl)-(iiphenylmethyl oder bis-(p-Methoxy~ plienyl)-phenylmethyl und X Wasserstoff, llethyl, Trifluormethyl, Fluor, Chlor, Brom oder Jod bedeuten_e

Die Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäss der Erfindung umfassen: Verfahren A) Behandlung eines 1-fl-D-Arabinofuranosylcytosins (I) oder eines Salzes dieser Verbindung mit Triphenylchlormethan, Triphenylbrommethan oder p-methoxysubstituiertem Triphenylchlormethan und Triphenylbrommethan unter Bildung des Äthers der Formel II5 die Behandlung von II mit einem Acylierungsmittel aus der Gruppe der Säurechloride, Säurebromide und Säureanhydride von Kohlenwasserstoffcarbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen unter Bildung einer Ätheracylat-Verbir dung der Strukturformel lila oder HIb oder einer Mischung dieser Verbindungen, die Behandlung der Verbindungen der Formel ItIa und IHb mit einer Base wie Iabhiumhydroxyd, Natriumhy-

87/1719

BAD ORiGINAL

droxyd oder Kaliumhydroxyd bei niedriger Temperatur unter BiI- ._; dung des entsprechenden N^-Acyl-l-(5'-triphenylmethyl-$-I)-ara-, binoruranosyl)cytosine (IV)} die Behandlung der Verbindung IV. mit einem Phosphorylierungsmittel, vorzugsweise 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart eines Kondensationsmittels, vorzugsweise NjN-Dicyclohexylcarbodimid und anschliessende Behandlung mit;. einer Base bei niedi gen Temperaturen unter Bildung des entsprechenden lr-Acyl-l-(5 * -triphenylmethyl-1-ß-D-arabinof uranosyl)-cytosin-3'-Phosphats und -2'-phosphate (Verbindungen V und VI) j die Behandlung der Verbindungen V und VI, zusammen oder getrennt, mit 80 % wässriger Essigsäure und anschliessend mit wasserfreiem ammoniakhaltigem !.!ethanol oder Äthanol unter Bildung der gewünschten Produkte l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-3'-phosphat (VII) und l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin^'-phosphat (VIII).

Die Verbindungen VII und VIII können nach der Synthese B auch durch direkte Phosphorylierung der Verbindung II mit 2-Cyanoeäthylphosphat in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und anschliessende Behandlung mit einer Base unter Bildung von l-( 5' -Triphenylmethyl-ß-D-ar abinof uranosyl )-cy t ο sin-2^f -phosphat und 3'-phosphat (IX und X) erhalten werden, die durch Behandlung mit wässriger Essigsäure die gewünschten Verbindungen VII und VIII ergeben.

Die direkte Phosphorylierung (Synthese 0) der Verbindung I mit 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart von Carbodiimid ergibt das 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-2' -phosphat, -3' -phosphat und -5'-phosphat, Verbindungen, die chromatographisch voneinander getrennt werden können·

Die neuen Verbindungen, l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-2¹-pnosphat und 3'-phosphat (VII und VIII), die auch Substituenten in 5-Stellung enthalten können wie Methyl, Trifluormethyl^ Halogene wie Fluor, Chlor, Brom und Jod und dergleichen, besitzen eine wesentliche cytotoxische Wirkung in vitro, besonders gegen KB—Tumorzellen und gegen Viren, insbesondere gegen die ver—

9Q9&&7/1769 bad original

schisdenen f^pen iron Herpes-, Coe- und Vaaclnia-viren· Inders als bei dytosin-arabinosid-S*-phosphat werden das 2'-Phosphat und das J'^Biosphat der Formeln VXI und ¥111 durch menschliche Leberde amine³« nur sehr langsam de amini ert, so dass sie bei systelEiseher Verabreichung eine verlängerte Wirkung haben, weil sie nicht in unwirksame Uridinverbindungen «ngewandett werden· Ausserlich können diese Verbindungen zum Reinigen von Glas gegenständen und Instrumenten verwendet werden₉ die bei der Herstellung von Gewebekulturen für die Virus- und Smmorforschung benutzt werden, sowie zum Waschen von ausgeschnittehen fumorgewe« ben verwendet werden, die für die Verpflanzung in liere vorgesehen sind, um das Wachstum von (Duinorzellen zu verhindern, die sonst umgebende Gewebe impfen oder zu anderen feilen des Tierkörpers transportiert werden köimten. Die antiviraie Wirksamlceit kann auch verwendet werden, um Kulturen von Mikroorganismen herzustellen, die frei von Virusphagen sind, z.E· phagenfreie, Antibiotika bildende StreptomyceskulturenV Die Verbindungen sind weiterhin geeignete Zwischenprodukte für die Herstellung von Öligonucleotid-Polymeren,die den substituierten oder nichtsubstituierten l-ß-D^Arabinofuranosylcytosin-E'- oder J'-phosphatrest enthalten· Zu diesem Zweck werden die Verbindungen VII und VIII in Form der freien Bäure mit anderen Nucleosiden in -Gegenwart von Kondensat iönsmit te In kondensiert _s wie z_eE. Dialkyl· oder Dicycloalkylcarbodiimide wie NiH'-Dicyclohexylcarbodiimid·

Die antiviraie Wirksamkeit der Verbindungen VlI Und VIII kann =ζτιγ Behandlung von Herpes keratitis im Auge von virusinfizierten Haustieren verwendet werden«

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin (I) in Form des Hydrochlorids, Hydrobromids oder eines anderen Salzes oder in Form der freien Base mit einem Verätherungsmittel in einem basischen organischen Lösungsmittel behandelte Als Verätherungsmittel werden im allgemeinen Triphenylchlormethan, (p"-Methoxyphenyl)-diphenylchlormetha3t bis-(p-Methd3qn)henyl)-phenylchlormethan und die Bromoanalogen dieser drei Verbindungen verwendet· Als organische Base können Pyridin, Pikoline, Lutidine,OCrialkylamine und dgl* verwendet

909887/1789;;.; '^^^

werden» wobei Pyridin bevorzugt wird. Die Umsetzung kann bei einer Temperatur zwischen O⁰ und 116⁰C durchgeführt werden und wird vorzugsweise bei Raumtemperatur zwischen 20 und 30⁰C durchgeführt· Die Umsetzung bei Raumtemperatur erfordert eine Zeitspanne zwischen 6 Stunden und 10 Tagen· Gemäss einer bevorzugten Ausführungsfozm der Erfindung wird das 1-ß-B-Arabinofuranosylcytosin in Pyridinlösung 6 Stunden bis 10 Tage mit Chlortriphenyloethan oder Bromtriphenylmethan gerührt· Danach wird das Produkt durch übliche Mittel isoliert, z.B. durch Eingieseen der Mischung in Wasser und Abtrennen des Produktes, nachdem es kristallisiert ist. Das Produkt kann durch übliche Massnabmeawie Umkristallisieren, z.B. aus Aceton, gereinigt werden·

Die Acylierung des auf diese Weise erhaltenen Produktes, l-(5'-0-Triphenylmethy 1-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin wird mit einem Aeylierungsmittel aus der Gruppe der Acy !chlor ide, Acy !bromide und ßäureanhydride von Kohlenwasserstoff carbonsäuren mit 2 bis einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen durchgeführt· Beispiele für Acy!chloride und Acy!bromide umfassen AcetylChlorid, Acetylbromid, Benzoylchlorid, Anisoylchlorid, p-Äthylbenzoylchlorid, p-Methylbenzoylbromid, S-Cyclopenty lpropionylchlorid, Lauroy 1-chlorid, Decanoylchlorid, Octanoylbromid und dgl· Beispiele für ßäureanhydride sind Essigsäureanhydride Propionsäureanhydrid, Buttersäureanhydrid, Phenylessigsäureanhydrld, Phenylpropioneäureanhydrid, Hexanoneäureanhydrid und dgl* Bei der bevorzugten Ausführungsform gemäss der Erfindung wird die Acylierungsreaktion in trockenem Pyridin bei Raumtemperatur zwischen 20 und 30⁰C unter kontinuierlichem Rühren für die Dauer von 1 bis 48 Standen durchgeführt· Nach dieser Zeltepanne wird das Material nach üblichen Verfahren, z.B. Eingiessen der Pyridinlösung in Wasser, Dekantieren des Wassers und Reinigung des verbleibenden Materials durch übliche Massnahmen wie Chromatographie, Extraktion, Umkristallisieren oder eine Kombination dieser Verfahren und dgl· unter Bildung dee entsprechenden IT-Acyl-l-(2 *, 3^f -di -rO-acyl-5 * -Q-triphenyl«^ethyl-ß-:D-»rebinof urano-

90988771719

BAD ORIGINAL

1620638

syl)-cytosins (Ilia) oder der entsprechenden Verbindung HIb gewonnen·

Bier auf diese Weise erhaltenen Ester, die der Formel HIa und/oder IITb entsprechen, werden durch übliche Mittel »·B. durch Behandlung mit tfatriuahydroxyd, Idthlumhydroxyd, kaliumhydroxyd, Natriummethosiyd, Natriumätho:xyd, Kaliumäthoxyd und dgl» bei kurzen Behandlungazeiten und niedrigen Temperaturen selektiv hydrolysiert, um eine Spaltung des lr-lffiido-teils zu vermeiden· Die Umsetzung wird durch Zugabe von Säure oder vor-* zugsweise eines lustaiascherharzes wie Pyridinium Dowex 30 W X beendet« Das Produkt wird durch übliche Verfahren wie Verdampfen des filtrierten Reaktionsgemische und Chromatographieren des Rohprodukts erhalten, Uakristallisierung und Chromatographie werden ebenfalls zur Reinigung des Produktes, eines U-Acyl~l-(5*-O-triphenylmethyl-B-D-arabinofurai οsyl)-cytosins (I?) , angewendet·

Die Phosphorylierung des Jf- arabinofuranosyl)-cytosins {17} wird nach dem Verfahren voa G.M. 3?ener, J.im»Chem,Soo*Baad 83* Seite 159 (1959) durchgeführt· Sie bei diesem Verfahren verwendeten Iiösungaaittel sind wasserfreie, nicht hydroxylgrmppenhaltige Lösungsmittel, in denen das Phosphorylierungsmittel, ©in Phosphatester,ebenfalls loslich ist« Diese Lösungsmittel umfassen Pyridin, Picoline _t. Lutidine und dgl· Neutrale Lösung mittel wie Dimethylsulfoayd, Tetrahydrofuran, N,N-2)imethylacetamid oder Dioxan können verwendet werden, vorausgesetzt, dass für jedes Mol des Phosphorylierungamittels ein äquivalent Base zugesetzt wird· !Dypische Basen für diöse Reaktion sind u.a· Pyridin, Picoline, Lutidine und Trialkylaaine·

Phosphatester» die leicht durch eine Alkalibase abgespalten werden, werden verwendet »und besonders geeignet für dies· Hase tzung sind 2-substituiextö Äthyl-dibydrogsn-phosphate der allgemeinen Formel

in der R^tlg Wasserstoff oder einen ηφ deren Alkylrest, Z ein stark elektronegativer Substituent aus der aus -0 2HSSEK;

¹¹¹¹I -C-R¹¹¹¹I -C-NHR¹¹"¹! -O-NR^tlM ₂| -CFj; -Cl1 -Brι -Pi-N H^1IM ₃» -NH₅I -1O₂| -COOR¹¹¹¹I -

und dgl· bestehenden Gruppe, R¹¹¹* einen niederen Alkyl- oder Arylrest und R¹··*· Wasserstoff, einen niederen Alkylrest oder einen Arylrest "bedeuten· Das bevorzugte 2-substituierte Äthyldihydrogen-phosphat ist ^-Cyan-äthyl-dihydrogen-phosphat.

Anstelle eines 2-substituierten Äthyl-dihydrogen-phosphats können auch andere Dihydrogen-phosphatester verwendet werden, die leicht durch eine Base gespalten werden, z.B. o— und p-Carboxyphenyi-dihydrogen-phosphat, o- und p-Carboamoylphenyldihydrogen-phosphat und o- und p-Cyanophenyl-dihydrogen-phosphat.

In der das 2-disubstituierte Xthyl-dihydrogen-phosphat oder o- oder p-substituierte Phenyl-dihydrogen-phosphat enthaltenden Lösung wird das vorgenannte lT-Acyl-l-(5'-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin (IV) gelöst, erforderlichenfalls unter Erhitzen auf eine !Temperatur zwischen 30 und 59°C· Nachdem das gesamte Material in Lösung, gegangen ist, wird ein Kondenaationsmittel, wie ζ·Β· ein alkyl-, cycloalkyl- oder arylsubstituiertes Carbodiioid, zugesetzt· Andere mit Carbodiimiden nicht verwandte Verbindungen, die als Kondeneationsmittel zugesetzt werden können, sind p-Toluolsulfonylchlorid, Methoxyacetylen, Keten-imine, Tr ic hl 01 acetonitril, substituierte Cyanamide, CX-substituiertes Acetonitril, Alkyl- und Arylisocyanate, Oarbonsäurechloride, Aralkylchiorcarbonate und dgl*

Die bevorzugten Temperaturen für diese Reaktion sind die (Temperaturen ua und etwas oberhalb von Raumtemperatur, d.h. Temperaturen zwischen 20 und 40°C| die Reaktion.kann jedoch bei nie—

9O9ÖÖT/I7f9

1620638

drigerea Temperaturen, wie ζ·Β. 5°6 und "bis zu iCemperaturen von etiwa 75°G ohne übermässige Kebenreaktionen durchgeführt werden. "Bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 4O⁰O und bei einer angemessenen Konzentration beträgt die für den Abschluss der Umsetzung erforderliche Zeit etwa 6 bis 24 Stunden· Reaktionszeiten zwischen etwa 1 und 60 Stunden können Jedoch angewendet werden; "bei stärkerer Verdünnung sollte die Reaktionszeit merklich verlängert werden.

Die Konzentration der Reaktionsteilnehmer ist nicht kritisch. Äquimolare Mengen von ir^-Acyl-^l-(5^l*-triphenylmethyl-ß'-I)-ara-· binofuranosyl)~cytosin, 2—substituiertem Äthyl-dihydrogen-phosphat und Kondensationsmittel ergeben eine etwa quantitative Umwandlung, falls eine ausreichende Zeit für eine vollständige Umsetzung zur Verfügung steht, tfm die Reaktionszeit abzukürzen, wird ein J- bis 4-facher molarer Überschuss des 2-substituierten Äthyldihydrogen-phosphats über das N -Acyl-l-CS^-triphenylmethylß-Dvarabinof uranosyl)-cytosin bevorzugt · Nach beendeter Umsetzung wird eine kleine Menge Wasser zugesetzt, um den Überschuss an PhOsphorylierungsmittel und an Kondensationsmittel zu inaktivieren· Die Lösung wird dann filtriert, um unlösliches Material wie die bei der Umsetzung von Carbodiimiden mit Wasser erhaltenen disubstituierten Harnstoffe zti entfernen, und das Filtrat wird für die nächste Verfahrensstufe, die hydrolytische Reaktion, verwendet«

Die bei der vorherigen Verfahrensstufe erhaltene Lösung wird mit einer Alkalihydroxydlösußg umgesetzt, um die gewünschte Hydrolyse zu erreichen. Bei der bevorzugten Aasführungsform der Erfindung wird die das Ü -Acyl-l-(5^l-0-triphenylmethyl-»ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin-2^l~yl-2-cyanoäthyl-phosphat und N-Acyl-l-(5" -O-triphenyl-methyl-Ö-D-arabinof uranosyl) -cytosin-5' yl-2-cyanoäthyl-phosphat enthaltende Lösung zuerst auf ein kleines Volumen eingeengt, wobei die Konzentration vorzugsweise unter Vacuum erfolgt· Wenn das Volumen klein genug ist, so dass das gekühlte Material ein viskoser Rückstand wird» setzt man eine 0,4- bie 2-normale ^se, *·Β· wässriges Lithium-, ITatrium- oder

BAÖ

- Xd, —

zu_g bis aer pH-Wert der Lösung auf zwischen 12 und 3.5 ansteigt» Konzentriertes Ainmoniumhydroxyd kann ebenfalls verwendet werden· Diese Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen O⁰O und dem Siedepunkt der wässrigen Lösung für die Dauer von 10 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt werden· Nach beendeter Umsetzung wird die Mischung gekühlt und filtriert« Aus dem Filtrat wird das Produkt V nach üblichen Verfahren wie Extraktion , Verdampfung, Ausfällung in Form von unlöslichen Phosphat·- salzen, Absorption und Desorption auf Harzen, Umkristallisieren und dgl. gewonnen·

In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen werden ein l-(5^!- 0-Triphenyl-methyl-ß-D-arabinof uranosyl) -cyt osin-2^r -phosphat und 1- ( 5' -O-Triphenylmet hy 1-ß-D-arabinof uranosyl) -cyt os in-3' phosphat erhalten, wobei die Acylgruppe am I¹T zurückbleibt oder entfernt ist. Bei niedrigen Temperaturen, · z.B₉ 0 bis 20°0, und kurzen Reaktionszeiten, z.B. 10 bis 40 Minuten, bleibt die Acylgruppe am IF erhalten. Palis die das organische öyanophosphat enthaltende alkalische Lösung bei höheren Temperaturen, ζ·Β· zwischen 75° und 10Q⁰O, gehalten wird, wird die Acylgruppe am Ir entfernt· ·

Das auf diese Weise erhaltene l-(5^l-0-Triphenylmethyl-B-D-arabinofuranoByl)-eytosin-2^l-phosphat und -3'-phosphat, bei dem in Abhängigkeit von den Temperaturen und der Zeit des Kontaktes mit der Base das H -Stickstoffatom acyliert oder nicht aeyliert ist, wird darauf einer Äther spaltung unterworfen, die am besten mit wässriger Essigsäure durchgeführt wird· Vorzugsweise wird 80-prozentige wässrige Essigsaure für die Dauer von 4 Stunden bis 4 Tagen bei Raumtemperatur verwendet. Das Lösungsmittel, Wasser und Essigsäure, wird im Vakuum entfernt, und die Rohprodukte werden mit wasserfreiem ammoniaaalkalischem Methanol oder Äthanol behandelt, wobei eine Mischung von 1-ß-D-Arabinofuranosyl« cytosin-2' -phosphat und 1-ß-D-Arabinofuran 0 sylcytosin-3' -phosphat erhalten wird, die voneinander durch übliche Mittel, wie z.B. Ionenaustauscher Chromatographie, getrennt werden. Bei einer Modifikation B dieses Verfahrens wird der A'ther der Forme I II

909807/1769

ί ■ BAD ORIGINAL

direkt phosphoryliert und ergibt das entsprechende 1«(5'-O~a}riphenylmethyl^ß-D-arabinofuranosyiy-cytqsin-S¹ -phosphat und -3'~ phOsphat, und diese Verbindungen werden" auf die vorstehend erwähnte Weise unter Verwendung von wässriger Essigsäure einer Ätherabspaltung unterworfen· Auf diese Weise werden die Ver» bindungen VII und VIII als Mischung erhalten, die chromatographisch getrennt wird. Als dritts Modifikation ergibt die Phosphorylierung dieses Ausgangsmaterials I l-ß-B-Arabinofuranosylcytosin-5·-phosphat, -3'-phosphat und 2*-phosphat« Biese Verbindungen werden ©hromatograpliisch© voneinander getrennt»

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert.

In den Beispielen werden verschiedene Ionenaustauscherharze verwendet, die wie folgt besehrieben w@sd©a Isöimens

Dowex 50 X 8, ist ein. starkes Säureaustauscherharζ_s das aus nuklearen SuIfonsäur©austauschgruppen zusammengesetzt ist, die an eines Styrolpolymertngitter hängen, das ©it etwa 8 % Divinylbenzol vernetst

Dowex AGr 50 X 8 ist ©ine besonders gereinigte und grössenmässig sortierte Form des Harz@B ®qw®3e; 50 X 8 der Dowex Gompsoy, die von den Bio Had Haberatoxies in Hiclmond öaliforäiiÄ geliefert wird*

Dowex 50 W 18 ist eine besonders gereinigte Woim v©& Sowex 50 X 8, bei der das Harz eine weiss® (W) farbe anstelle der gelb-braunes Farbe von Do«wex j?0 X 8 hat»

Dowax 1 X 8 ist ein stark basisches Anionenaustauscherharz, das guaterßire jtomoniumaustausolagruppen aufweist_s die an einem Styrolpolymerengitter häng<gn₉ wie es bei Bowsx $0 X 8 beachri©» ben ist«

AS X- S 8 ist eine - speziell gereinigte und sortiert© Μοτη von Dowex IX 8 der Bew Company₉ das toä äea

in Richmond, Calif©EMia geliefert

/IiSi" .■".; BAD

Beispiel 1 1(5' -O-Triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-eytosin

Einer Lösung von 10 g l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-hydrochlorid in 200 ecm Pyridin wurden 12 g Triphenyl-chlormethan zugesetzt· Die Reaktionsmischung wurde danach "bei Raumtemperatur (23 bis 26°) eine Woche gerührt· Die Reaktionsmiöchung wurde dann unter Rühren in 3 Liter Eiswasser gegossen, worauf sich l-(5^f-0--Tripheny line thy 1-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin als öl abtrennte. Das öl kristallisierte nach Abstellen mit Wasser übernacht, und die Kristalle wurden abfiltriert, dann aerkleinert, gründlich mit Wasser gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz an der Luft getrocknet· Die auf diese Weise erhaltenen Feststoffe wurden mit 200 ecm siedendem Heptan zerrieben und nach dem Trocknen in 1 Liter siedendes Aceton gegeben, das Ig Aktivkohle (Darco G-60) enthielt. Die heisse Suspension wurde fil-· triert, um die Kohle zu entfernen, und das FiItrat wurde auf einem Dampfbad auf ein Volumen von etwa 75 ecm destilliert, das auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wurde, wobei ein kristallines Produkt erhalten wurde· Das kristalline Produkt wurde auf einem Sinterglastrichter gesammelt und mit 25 ecm eiskaltem Aceton gewaschen· Das Produkt wurde dann getrocknet und ergab 13 g l-(5*-0-Triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, das bei 227»5 bis 228⁰C unter Zersetzung schmilzt;·

Auf die gleiche Weise können l-^~5^l-0-(p-Methoxyphenyl)-dipJbtenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl^-cytosin oder l-^"5'-<^*Bis-(p-Metiioxyphenyl)-phenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl_7-cytoeiii durch Umsetzung von 1-ß-B-arabinofuranosylcytosin oder dessen Hydrochlorid in Pyridinlösung mit (p-Methoxyphenyl)-diphenylchlormethan oder bis-(p-Metho3q5rphenyl)-phenylchlormethaii bei einer Temperatur zwischen 0 und 60⁰C unter kontinuierlichem Rühren erhalten werden·

Ähnlich wie in Beispiel 1 kann anstelle von Triphenyichlonaethan TriphenylbraaBnethan bei Bildung des gleichen Endproduktes i*»(5.'-O-Trlphenyliaethyl-ß-.D-arabinofuranosyl)-cytosin verwendet werden·

9 09 807 /1 T · 9 BAD ORIÖINAL

Beispiel 2

Ma® Mischung;-von 5_a0 XlO₄J atttol).-

©!?0M"siofar©a_<0syl)'«eytosin₉ 35 ©em troefeeneii "3?y3?iai-a-Uöd 5 Bensoyle&Xor/id wus'de bei Baraatemperat.UK¹ (2Φ=>26^Θ0) etwa 03 den gerührt« Bis auf dies® Weise

wurde darm, in #00 eem Isaltes Wasser, gegtsstja und bei ratur 18 Stunden gerührte!· Her -wässrig« Seil ward©" $aan dekan ■feiert und das -ZOXUckbleibemie gummiartige Mg%©M@l öureb. tieren sweiffi©! mit Wasser .gewaschen»- ©es? Güaai, und di# fest stoff© woj?&eä ia 300 esa llethgrleiiahlöxid g®löst-«dad dies© siaag sweiraal mit Jeweils 50 e©a -Wasser 50 eeü gesättigter wässriges?
Sie Metbyleächloridlösmas -©BSde dann; getrocknet^ iad©a aaa si© durch 10 g wasserfreie isJTatriiamealfat leitet© ₉ and des

Der auf diese Weis© eriialte&e Hmekstaaä. mirds la 400 em solutem Methanol w& 2ÖÖ äcm.-tr.oc-Tfeeiie® SetsahjdroiEiaa' aufge-=· nommea«. Bie auf-diese Weise erhäX^i@^: "-u^suiagj.tsniiSrde ait Bis -auf O⁰G gekühlt« pie '!salt® ܧsus@. ward© taaa, ail» .1U- eem Sj % triummethoxyd in Meth©a©l^:behandelt

•wurden 110 ecm. Bowes $0 W % δ C^ g_

der. pH-Wert der Losung auf. ©twa ? fisi ο. Ä© attf äiese Weis© eiehäl tene Suspension wurde h©rzfEei^: filtrier_ö &ie Mengen Methanol gewaschen mid.· die 'vereinigten.-." ten and das Ultrat "hei 3O⁰G unter verringertem Pruek %-m kene eingedampft ₀ Der erhaltene Bückst-and. i?tirde in. einer kleinen Menge Benzol ge löst _e die Benzollösung nsa.rde. auf .·■ einer Kolonne von Silikagel · (58 mal %B cm) absorbiert-^ die ein Eolonnen^olumen von 1 Liter hatte. Diese Kolonne wurde iswansigmal ait ^eweils 1Ö0 ecm von 2 % Methanol in JBenzollSsung und anschliessend vierzigmal mit jeweils 100 ecm von 3 % Methanol in Benzollösung ausgewaschen. Wie durch Bünnschichtchroiaatographie festgestellt wurde, enthielten die Fraktionen 31-^1 das Produkt♦ Diese Frak·= tionen wurden vereinigt. Aceton sttges-etzt und die MischuDg in

9 0 9 m 1111S1

•Form von Mikrokristallen durch Zugabe von Skellysolve B-Hexanen kristallisiert· Das Material wurde aus Aceton-Skellysolve B-Hexanen umkiistallisiert und ergab reines lP-Benzoyl-(5'-O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofurano syl)-cytosin mit einem Schmelzpunkt von 210,5 bis 211,5⁰C.

Analyses Berechnet für 035H₅₁OgN₃: 0 71*9* H 5.32; N 7»19. Gefunden : 0 71,41; H 5,59* H 7,46.

Beispiel 3 Iir-Acetyl-l-(5^l-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofura-—————— no syl)-cytosin

A. Ir-Acetyl-1-02¹ ^'-di-O-acetyl^¹ -O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin·

Eine Suspension von 750 mg l-(5^l-0-Triphenylmethyl-ß-D-arabi— nofurano syl)-cytosin (Beispiel 1) in 9 ecm Pyridin wurde mit 3 ecm Essigsäureanhydrid unter Rühren behandelt, bis eine gleichförmige Lösung erhalten wurde. Das Rühren wurde 2 Stunden fortgesetzt, wobei die Lösung eine kristalline Masse wurde· Dieses Material wurde in 90 ecm V/asser überführt und ergab ein weisses kristallines Material, das abfiltriert wurde; die Feststoffe wurden gründlich mit V/asser gewaschen und getrocknet und ergaben 950 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 249-259,5°C. Dieses Material wurde aus Äthanol umkristallisiert und ergab 800 mg farblose Rosetten aus N-Acetyl-l-(2·,3*-di-0-acetyl-5'-O-triphenylmethy 1-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin mit einem Schmelzpunkt von 251-252⁰C.

Analyse: Berechnet für ^σ32^Η33°9^Ν3^{: σ 66}»7⁶» ^H 5*44* K 6,87 Gefunden : 0 67,04; H 5,47; N 7,00.

B. ir-Acetyl-l-( 5' -O-triphenylme thy 1-ß-D-arabinof uranosyl )-cytosin·

Auf die in Beispiel 2 angegebene Weise wurde 1T'-Acetyl-1-(2¹,3'-di-O-acetyl-5' -O-triphenylme thy 1-ß-D-arabinof uranosyl) -cytosin bei Ö G mit Kaliumäthoxyd in Methylenalkohol von etwa O⁰O behandelt und ergab lr-Acetyl-l»(5'-O-triphenylmethy 1-ß-D-arabinofuranosyl)-oytosin·ι

9 0 98ß7/i789 bad original

4 Auf die in Beispiel 2 angegebene Weise können andere IT—Acyl-1« (5^¹ -O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin durch Umsetzung von l-(5' -0-Triphenylmethyl—ß-D-arabinofuranosyl")-cytosin mit einem Säürechlörid oder einem Saureanhydrid unter Bildung von Verbindungen der Strukturformel lila und IUb hergestellt werden, die bei Umsetzung mit einer Base bei niedriger Temperatur das entsprechende IT-Acy l-l-(5^l-O-t riphenylmethyl )-'ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin (17) ergeben. Typische auf diese • Weise erhaltene Verbindungen umfassen IT'-AnisOyl-l-(5^l-O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, fl^-Lauroyl—1-(5 '-o-triphenylmethyl-ß--D-arabin^|br^ianosyl)—cytosin, IT-Eropio— nyl-l-(5'-O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N-Butyxyl-l-(5'-O-triphenylmethy1-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, lP-Valeryl-l-(5^l-O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, ir"-Hexanoyl-l-(5^l-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, Ir'-Oct anoyl-1- ( 5' -O-triphenylmethyl -ß-D-arabinofuranosyl) cytosin, Ür-Pecyl-l-(5'-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, Έ -Dodecyl-l-C^ *-O-triphenylme thyl-e-»D-ar abinofuranosyl} cytosin, JN" -(ß-Oyclopentylpropionyl)-l-(5' -0-triphenylmethylß-D-#arabinof uranosyl )-cytosin, Ii —Phenyl acetyl-1-C5¹ -O-triphenylme thyl-ß-D-ar abinof uranosyl)-cyt osin, Ir l-(5'-O-triphenylmethyl-i-D-arabinofuranosyl)-cytosin, Ir-Acetyl-l-^"*5 ^lH?-(p-metho^phenyl)-diphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl^T-cytosin, lr-i^>ropionyl-l-^"5' -O-bis-(p-methoxyphenyl)* phenylmethyl'-ß-D'-arabinofUranosyl^^cytosin, N -Phenylacetyl-1-(5*-O-triphenylmethyl-B-iD-arbinofuranosyl)-5«-fluorcytosin, N — Butyryl-l-(5' -O-triphenylme thyl«-ß-D-arabinofuranosyi)*-'5-chlorcytpsin, F-Hexanoyl-l-^SV-0-(p-methoxyphenyl)^diphenylmethylß-D-arabinofuranosyl7-5^'bromcytosin, ir'-Octanoyl-l-^"$■·^-O-bis-(p-methoxyphenyl )-phenylmethyl--ß-l)-ar abinof uranosyl^-5-ί} odcytosin, 3Sr-Ijauroyl-l-^5' -O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofurano-

methylcytosin, lrWonyl-i-^5¹ -0-^-^etho3q7^enyi)-diphenylmethyl-ß-D-arabinofüranosy^-^-chlorcytosin, ΪΓ -TJndecanoyl-l·-

(5^l^-triph.eo7laethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-5-flu.orcytosin und dgl.

Beispiel 4 N Benzoyl-l-(5'-0-triphenylmethyl-ß-P-arabinO-■■ ' ' furanosyl)-cytosin-2' -phosphat und Ii -BenzQ/l«!-

(5' -0—triphenylmethyl-fl-D-aratinof uranosyl)-cyto-·

sin-3'-phosphat

Eine Lösung von 590 mg Iy -Benzoyl-l-(5^l-0-triphenylmethyl·-ß■"· D-arabinofuranosyl)~cytosin in 10 ecm Pyridin, die 1,5 ecm M 2-Cyanoäthyl-phosphat (1,5 Millimol) enthielt, wurde in Vacuum "bei 40⁰C eingedampft· Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, und danach wurde der Rückstand in 5 ecm gereinigtem Pyridin aufgenommen und 600 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und die Lösung bei Raumtemperatur in der Dunkelheit 2 Tage geschüttelt« Dieser Reaktionsmischung wurden 5 ecm Wasser zugesetzt und die Lösung dann bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden gerührt· Der unlösliche Feststoff wurde abfiltriert, mit 1,2 ecm Pyridin gewaschen und das vereinte Piltrat zweimal mit Skelyjfsolve E-Hexanen gewaschen. Die Skellysolve E-Hexanen wurden unter verringertem Druck entfernt und die verbleibende Pyridinlösung auf die Temperatur von Eis abgekühlt· Diese Lösung wurde dann mit 6,5 ecm 2-N-wässrigem Natriumhydroxyd 20 Minuten bei niedriger Temperatur (etwa O⁰O) behandelt» Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 15 ecm Pyridin Dowex 50 W X Θ-Harz beendet· Die harzfreie Lösung und drei Waschflüssigkeiten aus jeweils 5 ecm 50-prozentigem wässrigem Pyridin wurden vereinigt und dann bei 40⁰C unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft * Die auf diese Weise erhaltenen Rohmaterialien, eine sowohl das E'«· als auch das 3'-Phosphat von Έ -Benzoyl-1— (5»-O-tripbjenylmetJayl-ß-D-arabiiiofuranosyl)-cytosisi enthaltende Mischung wurde für die nächste Verfahrensstufe nicht getrennt»

Die Trennung von KT-Beiizöyl-l-C5^r~^>0-triphenylmethyl-ß-D-aräbi^ nofutranOsyl)-cytosin-2'-phosphat von dem entsprechenden 3'-i&eε« phat erfolgt chromatographisch auf die in Beispiel 5 für die Endprodukte, die 2¹- und 3'-Phosphate von l-ß-D-äräbinofuranö~ sylctytoBin, gezeigte Weise· Auf diese Weise wurden Ir-Benzoyl«

09887/1789 - _BAD

1020636

phat und ^'-phosphat erhalten· Auf die gleiche Weise werden andere 2'- und 3'-!Phosphate von N-Acyl-l-C^V-O-T-ß-D-arabinofuranosyl)-C3rtosi'n erhalten, wobei T die vorstehend angegebene Bedeutung hat» V .

Beispiel 5 l^ß-D-Arabinofüranosylcytosin-2¹-Phosphat und-.-1-ß-—-————*- D-ara'binofuranosylcytosin-J'-'i'liosphät ·

Die Gesamtmenge des Produktes des Beispiels 4, das aus N *-Benzoyl-*l-( 5'-O-triphenylitLethyl-B-B-arabinofuranosyl) -cytosin— 2¹— und 3'-phosphaten "best and ,wurde mit 30 ecm SQ % wässriger Essigsäure aufgenommen und diese Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 56 Stunden, abgestellt» Die wässrige Essigsäure wurde darin bei 40⁰G in Vacuum entfernt und der trockene Rückstand in 100 ecm lasser suspendiert und filtriert, bis er frei von Tritylalkohol war«, Das Filtrat wurde düm Vacuum zur Trockene eingedampft, wobei ein hellgelbes gummiartiges Material erhaltenwurde, das gemäss Diinnschichtgromatographie aus zwei Hauptprodukten, ' IP-Benzoyl—1-ß-D-arabinofuranosylcytosin-2¹-phosphat und —3'—phosphat_t bestand· Dieser Rückstand wurde in 3 ecm gesättigtem, wasserfreiem ammoniakalischem Methahol aufgenommen und die erhaltene Lösung 18 Stunden bei Raumtemperatur (22-25⁰C) abgestellt· Das Lösungsmittel und Ammoniak wurden Unter verringertem Druck entfernt und der erhaltene Rückstand in einem kleinen Volumen Wassexfauf genommen und auf einer Kolonne von 2,8 mal 24 cm chromatographiert, die mit Dowex AG 1 X 8 (Pormiat)· Ionenaustauscherharz gefüllt war, wobei zuerst mit 2 Litern 0,01 molarer Ameisensäure und anschliessend mit 5 Litern 0,02 molarer Ameisensäure ausgewaschen wurde und Fräktionen von j eweils 20 ecm aufgefangen wurden· Die das 2^t-£hösphat enthaltenden Fraktionen kamen zuerst, wie anhand des NMR-Spektrums und der erwarteten Zurückhaltung des Produkts festgestellt wurde· . Diese Fraktionen wurden vereinigt, einer Gefriertrocknung unterworfen und aus Wasser umkristallisiert und ergaben 1-ß-D-Arabinofüranosylcytosin-E¹-phosphat mit eine^ ^ pH_5 you 2?4 wx_% dessen Struktur durch^ kernmagnetisehe Resonanas bestätigt wurde* _

In den späteren Fraktionen wurde das 1-ß-D-Arabinofurnfiosylcytosin-3'-phosphat erhalten, das ein £„_v von 274- ^u

ZIIcLtC /

Bei spiel 6 N-Ac e tyl-1- ( 5' -O-triphenylmethyl-ß-D-aräbino-— furanesyl)-cytosin-2'-phosphat und -3'-phosphat

Auf die in Beispiel A angegebene Weise wurde lT-Acetyl-1-(5««0-triphenyl-methyl-ß-arabinofuranosyl)-cytosin mit 2-$anoäthylphosphat in Gegenwart von liTjN'-Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt, und das Produkt mit Kaliumäthoxyd behandelt. Man erhielt eine Mischung von IT -Acetyl-l-Cy-Q-triphenylmethylß-D-arabinofuranosyl)-cytosin-2'-phosphat und Iv-Acetyl-I-C 5'-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofurano syl )-cyt osin-3' -phosphat.

Beispiel 7 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-2^r-phosphat und 1-ß-■■■ — D-Aräbinofuranosylcytosin^¹-phosphat

Auf die in Beispiel 5 angegebene Weise wurde die Mischung des 2¹- und 3'-Phosphats von IT-Acetyl-1-(5'-0-triphenylmethylß-D-arabinof uran οsyl)-cytοsin zuerst der Ätherabspaltung mit 80 % wässriger Essigsäure und darauf der Amminolyse mittels mit Ammoniak gesättigtem Methanol unterworfen und ergab 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-2¹-phosphat und 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-3¹-phosphat, die voneinander durch Ionenaustauscherchromatographie getrennt werden konnten.

Auf die in Beispiel 4 angegebene Weire konnten andere £i -Acyll-(5*-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-öytosin durch Behandlung mit 2-0yanoäthylphosphat in Gegenwart eines Carbodiimide und anschliessende Behandlung mit einer Base wie Lithiumhydroxyd, Natriuiahydroxyd, Kaliumhydroxyd für kurze Zeitspannen und bei niedriger Temperatur in ihre 2'- und 3'-phosphate umgewandelt werden· Typische Verbindungen, die auf diese Weise erhalten wurden, sind u.a. das 2'-Phosphat und das 3'-Phosphat von ΪΓ -L·auroyl-l-(5^l-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, lr-Anisoyl-l-(5' -O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, IT-Propionyl-l-(5· -O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, N⁴-Butyryl-l-(5·-O-triphenyl-ß-D-arabino-

909887/1769 _BAD

£uranosyl)«cytosin,

aral)ittofuranogyX)-cyi;osini y(r

ß-P-arabinöfüranosyl)*cytosin,,> H -Octanoyl-l-'CS'-O-tripiienyl-· methyl-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, Ν—Pecyl-l-CS'-O-triphenylme thy l-ß-D-arabinofuranosyl)-cytosin, IT-Dodecyl-l-C^¹-■O-triphenylmethyl^fi-D-arabinofuranosy 1)-cytosin, Ή-(ß-Cyclo-.ρ entyipropi OHyI)-I-C 5' -O-triphenylmethyl-ß-D-arabinforuanosyl)-oytosin, lT-iheöylace1^l-l-(5^l-O-tripJienylmetnyl-ß-D-arab furanosyl)-cytosin, N -Phenylpropionyl-l-C^' -0-tripli.enyimetnylß-D-arabinofüranosyl)-cytosin und dgl.

liach. ä&XL in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Verfahren können ir-Acyl-l-^"^' -0- (p-me thosqjrphenyl) -diphenylmethyl-ß-D-ar abinofur anoeyl7-oy t ο sine und H -Acyl-l-^~5' -0-bis- (p-me thoxyphenyl )·· phenylmetnyl-ß-D-arabinofuranosylZ-cytosine und deren ^-Substituierte Analoge hergestellt werden wie z.B. W -Anisoyl-l-^f"^*— 0- (p-aethoxyphenyl)-diphenylme thyl-ß-D-ar^^abinof uran osyl7-cytosin; ]F-Acetyl-l-^5^l-0-bis-(p-metho^phenyl)-phenylmethyl-ß arabinofuranosyl7-5-iίrifluormethylcy.tosin, IP-Acetyl-l-C^'-O-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-5-fiuorcytosin, ir-Benzoyll-^"5^f -0-(p-me thoxyphenyl )-diphenylmetbyl-ß-D-arabinof uranosyl7-5-chlorcytosin, ]Sr-Benzoyl-l-^~5' -Ö-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-fi-D-arabinofuranosy^-Si-bromcytosin, N -iPhenylacötyl-l— ( 5»-O-triphenyljaethyl-ß-D-arabinofuranosyl) -5-J odcytosin, IT-Lauroyl—l-vj[**5' -O-triphenylme thy if-ß-D-arabinofuran osyl7-5-f luor*- cytosin, lr-(ß-C^cl

phenyl) -phenylme thyl-ß-D-arabinofuranosyl7-tösin, IP-Acetyl-l-^J^O-Cp-methoxyphenyl^-dipnei^lmeth^ D-arabinofüranosy^-cytosin, ΪΪ^.Propionyl-l-^S'-Ö-bis-Cp-· methoxyphenyl)-pnenylmeth^l^ß-B-arabin u***

Pheny Iac etyl-fl-(3' -0-triphenylme thyl-ß-D-arabinof uranosyl)-5-» fluorcytosin, 13ⁱ^^BUtyi7l-l«(5^t^-triphen^ furanosyl)-5-ohlorcytösin, li^y^^ Cppy dipnenylmethyl-ß-Ii-arabinofuranosyl7-5-t»rOmeytosin, IP"-Octanoyll-^^t-0-bis-(pHitteth03qy^henyl)-phe^
5-ij odcytosin, H^Üauroyl-^L-^5' ^O-

9Ο98$7/17β9 bad "

furanosyl/^-methylcytosin, IF-Decanoyi-I-C 5' -Q-triphenylmethylß-D~arahinofuranosyl ) -5-trifluormethylcyt osia_t N -Heptanoyl-1- ^~5»~0-(p-methoxyphenyl)-diphenylmethyl-ß~])-arabinof uranosylT-5-methylcytosin, N -Kooyl~l-^^-5' -0-(p-methoxyphenyl)<--ph.enyl«» methyl-ß-D-aralDinofuranosyl/^-cIilorcytosin, Jf^-Uhdeoanoyl-l-( 5' -0-t ripkenylmetliy 1-ß-D-arabinof ur ano syl)—5-f luor cy t ο sin und dgl. ·

Diese Verbindungen können mit 2-Cyanoäthy!phosphat in Gegenwart eines Carbodiimide phosphoryliert werden, worauf wie in Beispiel 4 angegeben die Behandlung mit einer Base unter Bildung des entsprechenden 2¹- und 3'—Phosphats des vorgenannten 1τ-Αο^1«=Χ<«(5' -Q-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuraa osyl)-cytosine erfolgt·

Diese Verbindungen ergeben bei Behandlung mit wässriger Essigsäure und anschliessend Methanol oder Äthanol, das mit Ammoniak gesättigt ist, in kaltem Zustand auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise das 2 *-Phosphat und 3'-Phosphat von 1-ß-D-Arabino·· f urano sy lcyt ο sin.

Beispiel 8 !«(^V-O-Oiiyiphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)«- ' cytosin-2¹-phosphat und 1-(5^I-O-Triphenylm©thylß-D-ärabinofuranosyl)-cytosin-3'-phosphat.

Auf die in Beispiel M- beschriebene Weise wurden 970 mg 1-(5*- O-Triphenylmethyl-fi-D-arabinofuranoByl^-cytosin mit 2-Gyanoäthyl-phosphat in (Segenwart von lijH-Dieyelohexylcarbodiimicl b«—. handelt und das Produkt mit wässrigem Nat: ' umiiydroxyd bei einer !Temperatur von O⁰C behandelt· Man erhielt eiu© Mischung des 2¹-Phosphats und des 3»-Phosphats von l-CS'-TriphenylEethyl-B-B-arabinofuranosyl)-cytosin.

Beispiel 9 l-ß^D-Arabinofuranosylcytosin-2'-phosphat und, 1-ß«

IK-AraMnofuranosylcytosii]e-3^r-phosphat·

Die Mischung der 2^f- und J'-Phosphate von l-p'-O-Triphenylmethyl-ß-D^arabinofu5ajiosyl)-cytosin (aus Beispiel 8) wurde in 100 ecm 80 % wässriger Essigsäure gelöst. Diese Mischung wurde

909087/

BAD ORiGlNAL

4 Tage "bei Raumtemperatur abgestellt* Danach, wurde das lösungsmittel unter verringertem Druck bei 40 C entfernt und man erhielt einen trockenen Rückstand» der in einer kleinen Menge Wasser- aufgenommen, durch Filtrieren von Triphenylcarbinol befreit und auf einer 2,8 mal 24 cm Kolonne von Dowex AG 1 Z 8 (Föriüiät) -lonenaustauscherharz absorbiert und mit 7 Litern 0,01 molarer Ameisensäure gefolgt von 5 Litern 0,02 molarer Ameisensäure ausgewaschen wurde, wobei Fraktionen von jeweils 20 ecm aufgefangen wurden. Die Fraktionen 195 bis 210 wurden vereinigt und aus gefj'orenem !Zustand getrocknet und ergaben 10 mg 1-ß-D-ArabinofuranosylcytosIn-2' -phosphat· Die Fraktionen 426 bis 470 wurden vereinigt, aus gefrorenem Zustand ^getrocknet und isoliert und ergaben 112 mg 1-ß-D-Arabinof"uranosylcytosin-3' -phosphat · ,

Βείφίβΐ 10 l-ß-D-ArabinöfuranOsyloytosin-2'-phosphat, 1-ß-B-

■■■ Arabinofuranosylcytosin-3'-phosphat und 1-ß-D-

Arabinofuranosylcytosin-5¹-phosphat ,

Es wurde eine Losung hergestellt, die 2,8 g 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-hydrochlorid, 34 ecm 0,325 ^molares lyridin-cyanoäthyl* phosphat (11 Millimol), dem weitere 16 ecm trockenes lyridin zugesetzt worden waren, und 4,75 g Dicyölohexylcarbodiimid (22 Millimol) enthielt. Diese Lösung wurde im Dunkeln 48 Stunden gerührt» Der erhaltenaifarblosen Suspension wurden 10 ecm Wasser zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Räumtemperatuf (etwa 24°C) eine Stunde gerührt, danach wurde mit weiterem Wasser (20 ecm) verdünnt und der unlösliche Harnstoff abfiltriert· Das FIltrat wurde dann im Vakuum zur trockene eingedampft, erneut in 50 ecm "Wasser gelöst und zur Entfernung des zurückgebliebenen Pyridino wiederum zurTrockene eingedampft» Der Rückstand wurde zwischen 75 ecm Wasser und 75 ecm.Äther^getrennt· Der Ätherteil wurde verworfen und der wässrige Teil im Vakuum.-destil»- liert, bis er frei von Äther war und dann mit 2,16 g Lithiumhydro2cyd (90 Millimol) bei 100°0 1 Stunde behandelt und danach die gekühlte Suspension durch Filtrieren von Lithiumphosphat befreit» Die Lösung wurde dann durch Zugabe von Dowex 50 X 8 Harz (HT-Form) auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Losung

.wurde zur Erzielung einer harzfreien Lösung filtriert, deren Volumen unter verringertem Druck auf 25 ecm eingeengt wurde. Dieses Konzentrat wurde durch eine 75 ecm Kolonne aus Dowex 50 X 8 -Harz gegeben, die dann mit Wasser ausgewaschen wurde, Ms der pH-Wert des Eluats etwa 5 "betrug. Das abfliessende Material (ca 250 ecm) wurde mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7»5 eingestellt. Das Volumen der Lösung wurde auf 25 ecm verringert und die Lösung auf einer Kolonne von Dowex AG 1 X 8 (Formiat) absorbiert, die ein Kolonnenvolumen von ecm hatte. Die Kolonne wurde mit einem Kolonnenvolumen Wasser und 'dann 0,02 molarer wässriger Ameisensäurelösung ausgewaschen, bis aus der Kolonne eine Lösung erhalten wurde, die für Ultraviolettlicht undurchlässig war (Vanguard 1056 O,D•Kolonnenmonitor bei 260 mu) Das abfliessende Material wurde bei einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ecm pro Minute in Fraktionen von 20 ecm aufgefangen. Die Fraktionen 90 bis 160, die das Hauptprodukt l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-5'-phosphat enthielten, wurden vereinigt, aus gefrorenem Zustand getrocknet und ergaben 40 mg dieses Materials. Die Fraktionen 125 bis 152 v/urden vereinigt und lyophilisiert und ergaben einen farblosen Gummi, der aus dem 2'- und 3'-Phosphat von 1-ß-D-ArabinofuranosylcytO-sin bestand. Die Abtrennung des 2'-Phosphats von dem 3'-Phosphat des 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosins wurde auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise durchgeführt.

Beispiel 11 l-ß-D-Arabinofuranösyl-5-fluo:raethylcytosin-2'-— phosphat und -^'-phosphat*

Auf die in Beispiel 8 angegebene Weise wurde l-(5'-0-!Driphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)-5-trifluormethylcytosin mit 2-Cyanoäthylphösphat in Gegenwart von !!,if'-Dicyclohexylcarbodiimid and danach mit Lithiumhydroxyd behandelt und ergab eine Mischung des 2'-Phosphats und des 3'-PhOSPhBtS von l-(5'-0-Triphenylme thy i-ß-D-arabinofurano syl)-5-trifluormethylcytosin.

Die Behandlung die ser Mischung wie in Beispiel 9 *ait wässriger Essigsäure ergab die 2¹- und 3'-Phosphate von 1-ß-D-Arabinofurm osyl-5-trif luorme thylcytosin, die durch Chromatographie in

909687/1789

BAD ORIGINAL

die Komponenten, l-ß-D-Arabinofuranosyl'-5-trifluormethylcytosin-2¹-phosphat und l-fl-D-Arabinofuranosyi^-trifluoriaethyl-« cytosin-3¹-phosphat, getrenntwerden konnten. .

Beispiel 12 1-ß-D-AraMnofuranosyl-5-f luorcyt osin-2¹-phosphat,

— 1-ß-D-Ara^binofuranosyl»-5-iluorcytosin-3'-phosphat,

l^B-D-Arabinof urano syl.-5-f luorcyt osin-5^^l-phosphat.

Auf die in Beispiel 10 angegebene Welse wurde 1-ß-D-Arabinof ur^io syl-5-f luor cyt bs in mit 2-Cyanoäthyl-phosphat in Gegenwart von !!,li-Dicyclohexyloarbodiimid phosphoryliert und danach mit Iiithiumhydroxyd unter Bildung einer Mischung der drei möglichen Phosphate 'behandelt, die durch Chromatographie in ihre Bestandteile, l-ß-D-Aratinofuranosyl-5-fluorcytosin-2¹-phosphat, i-ß-D-Ara'binofuranosyl-5-fluorcytosin-3^l-pnosphat und 1-ß-D-Ara"binofuranosyl-5-f luorcyt osin-5¹ -phosphat getrennt würden·

900887/1719

Claims (1)

PATENTANSPRÜCHE ;

1. Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-phosphaten der allgemeinen Formeln

HOCH

HOCB

(HO)-P-O H .

"H- ■■■ .

VII VIII

in denen !Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Fluor, Chlor, Brom oder Jod bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man ein l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin der allgemeinen Formel I

HO

BAD ORiGiNAL

HO H H

in der X die vorstehende Bedeutung hat, mit Triphenylchlormethan, Triphenylbromäthan, (p~Methoxyphenyl)—diphenylmethylchlormethan oder bis-(p-Methoxyphenyl)—phenylchlormethan zu einer Yerbindung der allgemeinen Formel II

0?O-CH

■II --;.■_ ■: ■_■■ ^: HO; H H -

veräthert, in der X die vorstehend angegebene Bedeutung hat und T Triphenylmethyl, (p-Methoxyphenyl)-diphenylmethyl oder bis-(p-Methoxyphenyl)-phenylmethyl bedeutet, die Verbindung II acyliert und die erhaltene Verbindung mit einer Alkalibase bei einer Temperatur von -10° bis +10⁰O weniger als 60 Minuten zu einer Verbindung der allgemeinen Formel IV

" ■ ■'■■■'■■ "NHAc ' ^:- ' ·

TO-GH

OH H' H 90 9887/It09

_BAO

α#

umsetzt, in der AC die Acylgruppe einer Kohlenwasserstoff carbonsäure mit 2 bis einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen bedeutet und T und X die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben, die Verbindung IV mit einem Phosphorylierungsmittel in Gegenwart eines KondensatiOnsmittels und dann mit einer Alkalibase 25U einer Mischung des entsprechenden 2'-Phosphats und 3'"Phosphats der allgemeinen Pormeln

ITHAc

MAc

Ϊ0-0Η

TO-CH

umsetzt« in denen AC* T und X die vorstehend angegebenen Bedeutungenhaben und man diese Mischung mit wässriger Essigsäure und anschliessend mit ammoniakalischem Alkohol behandelt und die dabei erhaltene Mischung chromatographisch trennt·

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ; als Ausgangsmaterial l-ß-D-Arabinofuranosylcytosin verwendet und als Endprodukte l-ß-D-Arabinofüranosylcytosin-2^l-phosph.at und l-ß-D-Arabinofuranosyl-cytösin^'-phosphat gewinnt. ;

3· Verfahren nach Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindung II mit einem Phosphorylierungsiaittel

98877 176t

BAD ORIGINAL

43 ■;:■.':■■■ -^: ::-^: '

"behandelte

Λ. Abänderung des Verfahrens nach. Anspruch 1, dadurch gelcennzeichnet, dass man das 1-ß-D-AraMnoMranosylcytosin der !Formel I mit einem Phosphorylierungsiaittel in Gegenwart eines
Kondensationsmittels und dann mit einer Alkali"base unter Bildung einer Mischung des entsprechenden^'Phosphats und J¹-Phosphats und 5' -Phosphats der Verbindung der formel I "behandelt und diese Phosphate chromatographisch voneinander trennt»

5e Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial 1-ß-D-AraMnofuranosylcytosin verwendet
und als Endprodukte l-ß-D-AraMnofuranosylcytosin-2¹-phosphat und l-ß-P-AraMnofuranosylcytosin-J¹ -phosphat gewinnt*

Für The TJp j ahn Company

Kalamazoo (Michigan, V.

tilt

Ee cht s anw a It

BAO
909887747*9