DE102004034228A1

DE102004034228A1 - Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung und einer neuen Pyrimidinnucleosidverbindung

Info

Publication number: DE102004034228A1
Application number: DE102004034228A
Authority: DE
Inventors: Tadashi Mobara Araki; Hitoki Mobara Miyake; Toshihiro Mobara Oikawa
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-15
Publication date: 2005-07-28
Also published as: US20050074857A1; GB2403950A; GB0415551D0; KR20050009951A; CN1576371A

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnukleosidverbindung, das umfasst: Umsetzen eines Zuckerphosphats mit einem Pyrimidinbasenderivat unter Verwendung eines Enzyms mit Cytosinnukleosidphosphorylase-Aktivität, worin das Pyrimidinbasenderivat dargestellt ist durch die Formel (I): DOLLAR F1 worin R1 darstellt: eine Aminogruppe, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, oder einer Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann, eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Thiolgruppe; R2 eine Aminogruppe, Thiolgruppe, Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; R3 darstellt: eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, die mit einer Hydroxygruppe substituiert sein kann, eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom; R4 eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; vorausgesetzt dass, wenn R1 eine Aminogruppe, R2 eine Hydroxygruppe und R5 ein Wasserstoffatom ist, dann R3 weder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen noch ein Wasserstoffatom ist.

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung, die als künstliches Material in z.B. medizinischen Produkten nützlich ist, und eine Pyrimidinnucleosidverbindung.

2. Beschreibung des Gebiets

Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nrn. 59-213397 und 5-49493 offenbaren Verfahren zur Synthese einer Pyrimidinnucleosidverbindung unter Verwendung eines Pyrimidinbasenderivats in Gegenwart einer Nucleosidphosphorylase. Gemäß obigem Verfahren ist die Nucleinsäurenbase ein Uracilbasenderivat, das eine Carbonylgruppe in der 4-Position der Pyrimidinbase aufweist. Verfahren zur Herstellung einer Nucleosidverbindung, die dem Uracilbasenderivat entspricht, unter Verwendung von z.B. Uracil, 5-halogeniertem Uracil oder Thymin sind bekannt.

Als Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung unter Verwendung eines Zuckerphosphats und eines Pyrimidinbasenderivats in Gegenwart einer Cytosinnucleosidphosphorylase offenbart EP 1 254 959 A2 ein Verfahren zur Herstellung einer Cytosinnucleosidverbindung unter Verwendung von 5-Fluorcytosin, Azacytosin oder 5-Methylcytosin. Jedoch sind keine anderen Verfahren bekannt.

Bei der Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung, insbesondere wenn die Verbindung als Ausgangsmaterial von medizinischen Produkten verwendet wird, wird Kontamination aufgrund einer geringen Menge an Nebenprodukten ein ernsthaftes Problem. Bei der Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung durch organische Synthese wird im allgemeinen ein α-Isomer als Isomer gebildet. Die Bildung des α-Isomers erschwert die Reinigung und vermindert die Ausbeute der Pyrimidinnucleosidverbindung. Unglücklicherweise ist dies ein ernsthaftes Problem bei der industriellen Produktion.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese einer Pyrimidinnucleosidverbindung unter Verwendung eines Zuckerphosphats und verschiedener Pyrimidinbasenderivate in Gegenwart eines Enzyms mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität, und einer Pyrimidinnucleosidverbindung.

Um obige Probleme zu lösen, haben die Erfinder als Ergebnis intensiver Studien zur Herstellung einer Nucleosidverbindung unter Verwendung verschiedener Pyrimidinbasenderivate und eines phosphorylierten Zuckers in Gegenwart eines Enzyms mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität herausgefunden, dass die Verwendung einer Pyrimidinbasenverbindung, dargestellt durch Formel (I), die nachstehend beschrieben wird, die Herstellung einer entsprechenden Nucleosidverbindung ermöglicht.

Ferner haben die Erfinder die Reaktion zur Erzeugung einer Pyrimidinnucleosidverbindung unter Verwendung von 4-Acetamidopyrimidin und Pentose-1-phosphat in Gegenwart eines Mikroorganismus mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität untersucht. In dem Verfahren konnten die Erfinder bestätigen, dass eine Pyrimidinbase oder eine Pyrimidinnucleosidverbindung mit einer hydrolysierten Acetylgruppe in großer Menge erzeugt wird, wodurch die Ausbeute in der Reaktion signifikant vermindert wird.

Die Erfinder haben herausgefunden, dass diese Deacetylierung durch die Kombination folgender Reaktionen verursacht wird: (1) Eine Reaktion, die abhängig von den Reaktionsbedingungen chemisch fortschreitet, und (2) eine Reaktion aufgrund eines Enzyms mit Deacetylierungsaktivität und durch den Wirt erzeugt. Ferner haben die Erfinder, als Resultat intensiver Studien eines Verfahrens zur Unterdrückung der Deacetylierung, herausgefunden, dass die folgenden Verfahren erfolgreich sind: zur Unterdrückung des Fortschreitens der chemischen Deacetylierung wird der pH der Reaktionsmischung auf 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8 eingestellt, zusätzlich wird die Reaktionstemperatur auf 20 bis 60°C, vorzugsweise 30 bis 40°C eingestellt. Um das Fortschreiten der Deacetylierung aufgrund der Enzymdeacetylierungsaktivität des Enzyms zu unterdrücken, wird das Enzym vermindert in oder entfernt aus der bakteriellen Zelle des Mikroorganismus, einer Kulturlösung der bakteriellen Zelle oder einem verarbeiteten Produkt davon.

Die Erfinder haben die folgende Erfindung auf Basis obiger Tatsachen vollbracht.

Die vorliegende Erfindung ist wie folgt:

[1] Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung umfassend den Schritt: Umsetzen eines Zuckerphosphats mit einem Pyrimidinbasenderivat in der Gegenwart eines Enzyms mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität, worin das Pyrimidinbasenderivat dargestellt ist durch Formel (I)
worin R1 darstellt: eine Aminogruppe, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, oder einer Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann, eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Thiolgruppe; R2 eine Aminogruppe, Thiolgruppe, Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; R3 darstellt: eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, die mit einer Hydroxygruppe substituiert sein kann, eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom; R4 eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; vorausgesetzt dass, wenn R1 eine Aminogruppe, R2 eine Hydroxygruppe und R5 ein Wasserstoffatom ist, dann R3 weder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen noch ein Wasserstoffatom ist;
[2] Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Punkt [1], worin das Pyrimidinbasenderivat, dargestellt durch Formel (I), umfasst: 2-Hydroxy-4-methylpyrimidin, 4-Acetamidopyrimidin, 2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 2-Thiocytosin, 5-Hydroxymethylcytosin oder 4-Thiouracil;
[3] Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Punkt [1] oder [2], worin der phosphorylierte Zucker umfasst: Ribose-1-phosphat, 2'-Desoxyribose-1-phosphat oder 2',3'-Didesoxyribose-1-phosphat;
[4] Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß einem der Punkte [1] bis [3], worin das Enzym mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität aus E. coli erhalten wird;
[5] Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß einem der Punkte [1] bis [4], worin das Enzym mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität bereitgestellt wird durch eine bakterielle Zelle eines Mikroorganismus mit dem Enzym, oder ein verarbeitetes Enzym, das aus der bakteriellen Zelle oder einer Kulturlösung der bakteriellen Zelle hergestellt wird;
[6] Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung, umfassend den Schritt: Umsetzen einer Verbindung, dargestellt durch Formel (I), worin R1 eine Aminogruppe ist, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, substituiert ist, mit einem Zuckerphosphat unter Verwendung einer bakteriellen Zelle eines Mikroorganismus oder eines verarbeiteten Enzyms der bakteriellen Zelle des Mikroorganismus mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität, worin die Deacylierungsaktivität des Mikroorganismus auf die Acylgruppe in der Verbindung deaktiviert oder vermindert wird;
[7] Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Punkt [6], worin die Deacylierungsaktivität der bakteriellen Zelle des Mikroorganismus oder des verarbeiteten Enzyms durch Erwärmen oder in Kontaktbringen mit Wasser, das ein organisches Lösungsmittel enthält, selektiv deaktiviert oder vermindert wird; und
[8] Pyrimidinnucleosidverbindung, dargestellt durch Formel
worin R5 eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom, R6 eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt und R7 eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt.
[9] Verwendung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Punkt [8] als künstliches Material, insbesondere in einem medizinischen Produkt.
[10] Medizinisches Produkt, umfassend eine Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Punkt [8].

Bisher wurde eine Pyrimidinnucleosidverbindung lediglich durch organische Synthese synthetisiert. Die vorliegende Erfindung stellt dagegen ein Verfahren zur Synthese einer Pyrimidinnucleosidverbindung in Gegenwart eines Enzyms bereit.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Gemäß der Erfindung bedeutet ein Enzym mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität ein Enzym mit einer Aktivität zur Erzeugung einer Cytosinnucleosidverbindung unter Verwendung von Cytosin oder eines Cytosinderivats als Substrat. Das Enzym kann aus jedem Ursprung erhalten werden, wie Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, solange obige Bedingung erfüllt ist. Da ein Cytosinnucleosidphosphorylase genanntes Enzym nicht allgemein im Fachgebiet bekannt ist, dient obige Definition obigen Ausdrucks lediglich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.

Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen Cytosinnucleosidphosphorylase schließt ein Enzym ein, das bekannt ist als Purinnucleosidphosphorylase, erhalten aus einem Mikroorganismus wie Escherichia coli des Genus Escherichia, wobei das Enzym ebenfalls Cytosinnucleosidphosphorylaseaktivität besitzt. Zum Beispiel zeigt Sequenz Nummer 3 in folgender Sequenzliste die DNA- Basensequenz der Purinnucleosidphosphorylase, erhalten aus Escherichia coli und Sequenz Nummer 4 in der Sequenzliste zeigt die Aminosäuresequenz, die von der Basensequenz translatiert wurde. Außerdem kann aufgrund des neuesten Fortschritts in der Gentechnik die Aminosäuresequenz leicht durch Deaktivieren, Insertion oder Ersetzen eines Teils der Basensequenz modifiziert werden. Angesichts dieses Niveaus der Technologie schließt die erfindungsgemäße Cytosinnucleosidphosphorylase auch ein Enzym ein, worin die Aminosäuresequenz durch Modifizieren eines Teils der Basensequenz modifiziert ist, solange die gewünschte Enzymaktivität nicht beeinträchtigt wird, z.B. solange die Enzymaktivität erhalten oder verbessert werden kann. Zum Beispiel können in der in Sequenz Nummer 4 gezeigten Aminosäuresequenz ein paar Aminosäuren entfernt, ersetzt oder hinzugefügt werden, solange die gewünschte Enzymaktivität nicht beeinflusst wird. Das Enzym mit dieser modifizierten Aminosäuresequenz kann verwendet werden. In der in Sequenz Nummer 3 gezeigten Basensequenz kann die Basensequenz zum Beispiel durch Deaktivieren, Ersetzen oder Hinzufügen von Aminosäuren verändert werden, solange die gewünschte Enzymaktivität nicht beeinflusst wird, und außerdem kann die komplementäre Sequenz unter strigenten Bedingungen hybridisiert werden. Das Enzym kann die durch solch eine veränderte Basensequenz codierte Aminosäuresequenz besitzen.

Ein erfindungsgemäßes Pyrimidinbasenderivat wird durch Formel (I) dargestellt. In Formel (I) stellt R1 dar: eine Aminogruppe, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, oder einer Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann, eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Thiolgruppe; stellt R2 eine Aminogruppe, Thiolgruppe, Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom dar; stellt R3 eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, die mit einer Hydroxygruppe substituiert sein kann, eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom dar; stellt R4 eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom dar. In Formel (I) ist jedoch, wenn R1 eine Aminogruppe, R2 eine Hydroxygruppe und R4 ein Wasserstoffatom ist, R3 weder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, noch ein Wasserstoffatom.

Es ist allgemein bekannt, dass Pyrimidinbasen in wässrigem Medium Tautomere bilden. Zum Beispielen bilden Cytosin, 2-Thiocytosin und 6-Hydroxy-4-aminopyrimidin, die typische Pyrimidinbasen sind, folgende Tautomere:

Entsprechend schließt ein erfindungsgemäßes Pyrimidinbasenderivat, dargestellt durch Formel (I), auch das entsprechende Tautomer ein.

Beispiele des durch Formel (I) dargestellten Pyrimidinbasenderivats schließen 2-Hydroxy-4-methylpyrimidin, 4-Acetamidopyrimidin, 2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 2-Thiocytosin, 5-Hydroxymethylcytosin und 4-Thiouracil ein.

In einem erfindungsgemäßen phosphorylierten Zucker ist Phosphorsäure an die 1-Position eines Polyhydroxyaldehyds, Polyhydroxyketons oder eines Derivats davon über eine Esterbindung gebunden. Bevorzugte Beispiele des phosphorylierten Zuckers schließen Ribose-1-phosphat, 2'-Desoxyribose-1-phosphat, 2',3'-Didesoxyribose-1-phosphat und Arabinose-1-phosphat ein.

Beispiele des Polyhydroxyaldehyds oder des Polyhydroxyketons, erhalten aus z.B. natürlichen Produkten, schließen ein: Aldopentosen wie D-Arabinose, L-Arabinose, D-Xylose, L-Lyxose und D-Ribose; Ketopentose wie D-Xylulose, L-Xylulose und D-Ribulose; und Desoxyzucker wie D-2-Desoxyribose und D-2,3-Didesoxyribose. Der Polyhydroxyaldehyd oder das Polyhydroxyketon ist nicht auf obige Beispiele beschränkt.

Diese phosphorylierten Zucker werden z.B. durch Phosphorolyse einer Nucleosidverbindung unter Verwendung einer Nucleosidphosphorylase (J. Biol. Chem. Vol., 184, 437, 1950) oder Anomer-selektive chemische Synthese hergestellt. Außerdem können die phosphorylierten Zucker durch ein Syntheseverfahren von Desoxyribose-1-phosphat in Gegenwart eines Enzyms wie beschrieben in WO 01/14566 hergestellt werden.

Gemäß der erfindungsgemäßen Reaktion zur Synthese einer Pyrimidinnucleosidverbindung wird eine bakterielle Zelle eines Mikroorganismus, eine Kulturlösung der bakterielle Zelle oder ein verarbeitetes Produkt davon verwendet und geeignete Reaktionsbedingungen wie pH und Temperatur ausgewählt. Der Mikroorganismus exprimiert eine Nucleosidphosphorylase, die eine Cytosinnucleosidverbindung synthetisiert unter Verwendung eines Cytosinderivats und eines phosphorylierten Zuckers als Substrate. Die Reaktion wird im allgemeinen bei einem pH von 4 bis 10, bei einer Temperatur von 10 bis 80°C und in wässrigem Medium durchgeführt.

Das wässrige Medium schließt ein aus Wasser oder hauptsächlich aus Wasser zusammengesetztes Lösungsmittel und mit pH-Pufferkapazität ein.

Die Konzentration des phosphorylierten Zuckers und des Pyrimidinbasenderivats in der Reaktion ist vorzugsweise ca. 0,1 bis ca. 1.000 mM. Das molare Verhältnis des Pyrimidinbasenderivats zum phosphorylierten Zucker oder Salz davon ist 0,1 bis 10. Angesichts der Konversion in der Reaktion ist das Molarverhältnis vorzugsweise ca. 0,95.

Beispiele der erfindungsgemäß erzeugten Pyrimidinnucleosidverbindung schließen ein: 4-Methylpyrimidinribofuranosyl, 2'-Desoxy-4-thiouridin, 2-Thiocytidin, 5-Hydroxymethylcytidin, N-Acetyl-2'-desoxycytidin und Pyrimidinnucleosidverbindungen, dargestellt durch Formel (II).

In Formel (II) stellt R5 eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom dar; R6 stellt eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom dar; und R7 stellt eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom dar.

Gemäß der Erfindung schließen eine bakterielle Zelle eines Mikroorganismus, eine Kulturlösung der bakteriellen Zelle oder ein verarbeitetes Produkt davon ein: ein Produkt, hergestellt durch Aufschließen der bakteriellen Zellwand des Mikroorganismus oder der bakteriellen Zellen in der Kulturlösung mit z.B. Ultraschallwellen oder osmotischem Schock, ein Produkt, hergestellt durch Immobilisieren der bakteriellen Zellen oder obiger aufgeschlossener Zellen mit einem Immobilisierungsträger und ein Enzym gereinigt aus z.B. den aufgeschlossenen Zellen.

Um in der Reaktionsmischung erzeugte Phosphorsäure abzufangen, können Metallsalze, die in Phosphorsäure schwer löslich sind, oder ein Träger wie ein Ionentauscherharz zugegeben werden. Dadurch kann die Ausbeute erhöht werden.

Eine durch Formel (I) dargestellte Verbindung, worin R1 eine Aminogruppe ist, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, substituiert ist, wird mit einem phosphorylierten Zucker in Gegenwart einer bakteriellen Zelle eines Mikroorganismus, einer Kulturlösung der bakteriellen Zelle oder eines verarbeiteten Produkts davon umgesetzt, um die entsprechende Pyrimidinnucleosidverbindung zu bilden. In der bakteriellen Zelle des Mikroorganismus wird die Deacylierungsaktivität einer Aminogruppe, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, substituiert ist, deaktiviert oder vermindert.

Die Deacylierungsaktivität einer Aminogruppe, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, substituiert ist, kann durch Wärmebehandlung oder Reduktionsbehandlung deaktiviert oder vermindert werden.

Gemäß der Erfindung ist die Wärmebehandlung nicht limitiert, solange die Deacylierungsaktivität deaktiviert oder vermindert wird, ohne dass die Cytosinnucleosidphosphorylase deaktiviert wird. Zum Beispiel wird eine bakterielle Zelle des Mikroorganismus, eine Kulturlösung der bakteriellen Zelle oder ein verarbeitetes Produkt davon stehen gelassen oder in einem wässrigen Medium suspendiert für mindestens 10 min, vorzugsweise mindestens 30 min. In diesem Fall ist der pH der Mischung üblicherweise 4,0 bis 1,0,0, vorzugsweise 6,0 bis 9,0, und die Temperatur ist üblicherweise mindestens 50°C, vorzugsweise 60 bis 80°C. Es wird bevorzugter 40 h oder weniger erwärmt.

Die Cytosinnucleosidphosphorylase wird ferner durch Zugeben von mindestens 1 mM, vorzugsweise 10 bis 100 mM eines phosphorylierten Zuckers zur Lösung stabilisiert.

Gemäß der Erfindung ist die Behandlung zur Reduktion der Deacylierungsaktivität nicht limitiert, solange die Deacylierungsaktivität einer Aminogruppe, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, substituiert ist, deaktiviert oder vermindert werden kann, ohne dass die Cytosinnucleosidphosphorylase deaktiviert wird. Zum Beispiel wird eine bakterielle Zelle des Mikroorganismus, eine Kulturlösung der bakteriellen Zelle oder ein verarbeitetes Produkt davon, einem organischen Lösungsmittel ausgesetzt oder wird Wärmebehandlung unterworfen. Alternativ kann eine Lösung eines durch Aufschließen der bakteriellen Zelle hergestellten Enzyms z.B. mit einem organischen Lösungsmittel oder Ammoniumsulfat zum Ausfällen des Proteins behandelt werden. Die Enzyme werden fraktioniert, wodurch lediglich das Enzym mit Deacylierungsaktivität entfernt wird.

Gemäß der Erfindung ist das organische Lösungsmittel nicht limitiert, solange die Deacylierungsaktivität deaktiviert wird. Beispiele des organischen Lösungsmittels schließen ein: polare Lösungsmittel, wie Methylalkohol, Ethylalkohol, Propylalkohol, Butylalkohol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Methylethylketon und Aceton; Alkohole, wie 1-Hexanol, 2-Methyl-1-pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Ethyl-1-butanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 3-Heptanol, 1-Octanol, 2-Octanol und 1-Nonanol; Ester, wie Propylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, sec-Butylacetat, Pentylacetat, Isopentylacetat, Cyclohexylacetat und Benzylacetat; Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Cyclopentan, Hexan, 2-Methylhexan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, Cyclohexan, Methylcyclohexan, Heptan, Cycloheptan, Octan, Cyclooctan, Isooctan, Nonan, Decan, Dodecan, Petrolether, Waschbenzin, Ligroin, industrielles Gasolin, Kerosin, Benzol, Toluol, Xylol, Ethylbenzol, Propylbenzol, Cumol, Mesitylen und Naphthalin; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlormethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol; Phenole, wie Cresol und Xylenol; Ketone, wie Methylisobutylketon und 2-Hexanon; Ether, wie Dipropylether, Diisopropylether, Diphenylether und Dibenzylether; Amide, wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N,N-Dimethylbenzamid, N-Methyl-2-pyrrolidon, N-Methylformamid, N-Ethylformamid, N-Methylacetamid, Formamid, Acetylamid und Benzoesäureamid; Harnstoffe, wie Harnstoff, N,N'-Dimethylharnstoff, Tetramethylharnstoff und N,N-Dimethylimidazolidinon; und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid, Diethylsulfoxid und Diphenylsulfoxid.

Insbesondere ist Aceton unter obigen organischen Lösungsmitteln bevorzugt.

Gemäß der Erfindung ist eine Behandlung in einem organischen Lösungsmittel zum Deaktivieren und Vermindern der Deacylierungsaktivität nicht beschränkt, solange die Deacylierungsaktivität deaktiviert oder vermindert wird, ohne dass die Cytosinnucleosidphosphorylase deaktiviert wird. Zum Beispiel wird eine bakterielle Zelle des Mikroorganismus, eine Kulturlösung der bakteriellen Zelle oder ein verarbeitetes Produkt davon stehen gelassen oder suspendiert in einem wässrigen Medium, enthaltend ein organisches Lösungsmittel für z.B. im allgemeinen 10 min bis 20 h, vorzugsweise 1 bis 20 h. In diesem Fall ist der pH der Mischung im allgemeinen 4,0 bis 10,0, vorzugsweise 6,0 bis 9,0. Die Konzentration des organischen Lösungsmittels im Wasser ist z.B. mindestens 10 Vol.-%, vorzugsweise mindestens 20 Vol.-% und bevorzugter mindestens 30 Vol.-%. Die Temperatur ist im allgemeinen mindestens 0°C, vorzugsweise mindestens 20°C und bevorzugter 50 bis 80°C.

Alternativ kann solch ein organisches Lösungsmittel zur Reaktionsmischung gegeben werden. Dieses Verfahren stellt die gleiche Wirkung bereit.

Eine Verbindung, worin R1 in Formel (I) eine Aminogruppe ist die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, substituiert ist, wird mit einem phosphorylierten Zucker unter Verwendung einer bakteriellen Zelle oder eines verdauten Enzyms umgesetzt, worin die Deacylierungsaktivität durch Reduktionsbehandlung deaktiviert oder vermindert ist. Als Ergebnis wird eine Pyrimidinnucleosidverbindung hergestellt. Beispiele der Pyrimidinnucleosidverbindung schließen N-Acetyl-2'-desoxycytidin ein.

Um die Pyrimidinnucleosidverbindung aus der Reaktionsmischung wiederzuerlangen, kann der Löslichkeitsunterschied in einem Lösungsmittel wie Wasser zwischen dem Derivat und dem Produkt verwendet werden. Ionenaustauscher oder Adsorptionsharz kann auch für denselben Zweck verwendet werden.

Obwohl die Erfindung nachstehend mit Bezug auf Beispiele beschrieben wird, ist die Erfindung nicht auf folgende Beispiele eingeschränkt.
Die Identifikation der resultierenden Pyrimidinnucleosidverbindung wurde wie folgt durchgeführt: die Reaktionsmischung wurde ultrafiltriert und dann mit einer Kieselgelsäule gereinigt. Das Produkt wurde extrahiert und unter Vakuum getrocknet. Das resultierende Produkt wurde mit ¹³C-NMR und ¹H-NMR analysiert.
Alle resultierenden Pyrimidinnucleosidverbindungen wurden mit Hochdruckflüssigchromatographie quantitativ bestimmt. Die Analysebedingungen sind nachstehend beschrieben.
Referenzbeispiel 1
(Herstellung einer bakteriellen Zelle, die Cytosinnucleosidphosphorylase herstellt) E. coli-chromosomale DNA wurde wie folgt hergestellt: Escherichia coli K-12/XL-10-Stamm (Stratagene) wurde in einem LB-Kulturmedium (50 ml) inokuliert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die bakteriellen Zellen wurden gesammelt und mit einem Lysierungsmittel, enthaltend Lysozym (1 mg/ml), Bacteriolyse unterworfen. Das Lysat wurde mit Phenol behandelt. Anschließend wurde wie in einem üblichen Verfahren Ethanol zugegeben, um die DNA auszufällen. Die ausgefällte DNA wurde durch Spulen auf einen Glasstab wiedererlangt und wurde gewaschen, bevor sie Polymerasekettenreaktion (PCR) unterworfen wurde.
Oligonucleotide (in Kommission synthetisiert durch Hokkaido System Science Co., Ltd.) mit in Sequenznummern 1 und 2 in nachstehenden Sequenzlisten gezeigten Basensequenzen wurden als Primer für PCR verwendet. Die Oligonucleotide wurden auf Basis der Basensequenz (GenBank, Zugangsnummer AE000508, worin die Code Area den Basenzahlen 11.531 bis 12.250 entspricht) des deoD Gens gestaltet, das eine bekannte Purinnucleosidphosphorylase (nachstehend als PNP bezeichnet), erhalten aus E. coli, codiert. Diese Primer haben Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII in der Umgebung des 5'-Terminus bzw. 3'-Terminus.
Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der PCR-Lösung (0,1 ml), enthaltend obige E. coli-chromosomale DNA, die vollständig mit dem Restriktionsenzym (HindIII (6 ng/μl) verdaut wird, und die Primer (jeweils 3 μM). In der PCR schloss ein Zyklus ein: eine Denaturierung, durchgeführt für 1 min bei 96°C, eine Anlagerung, durchgeführt für 1 min bei 55°C, und eine Verlängerung, ausgeführt für 1 min bei 74°C. Der Zyklus wurde 30 Mal wiederholt.
Obiges Reaktionsprodukt und ein Plasmid pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden mit EcoRI und HindIII verdaut und wurden mit Ligation High-(Toyobo Co., Ltd.) ligiert, zur Bildung eines rekombinanten Plasmids. Escherichia coli DH5α wurde mit dem rekombinanten Plasmid transformiert. Die Transformante wurde in einem LB-Agarmedium, enthaltend Ampicillin (Am) (50 μg/ml) und X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) kultiviert, wodurch weiße Kolonien einer Transformanten mit Am-Resistenz hergestellt wurde.
Ein Plasmid wurde aus obiger Transformante extrahiert. Das Plasmid, worin das gewünschte DNA-Fragment insertiert wurde, wurde pUC-NPNP73 genannt. Die Basensequenzen des DNA-Fragments, das in Plasmid pUC-PNP73 eingeführt wurde, wurde gemäß einem allgemeinen Verfahren zur Bestimmung von Basensequenzen bestimmt. Sequenz Nummer 3 in der nachstehenden Sequenzliste zeigt die Basensequenz, und Sequenz Nummer 4 zeigt die aus der Basensequenz translatierte Aminosäuresequenz. Es ist bekannt, dass die Untereinheit dieses Enzyms ein Molekulargewicht von ca. 26.000 besitzt und das Enzym seine Aktivität als Hexamer exprimiert. Gemäß diesem Enzym ist die optimale Temperatur 70°C und der optimale pH von ca. 7,0 bis ca. 7,5. Obige Transformante wurde mit E. coli MT-10905 bezeichnet.
E. coli MT-10905-Stamm wurde über Nacht kultiviert, während bei 37°C in einem LB-Kulturmedium (100 ml), enthaltend Am (50 μg/ml) geschüttelt wurde. Die Kulturlösung wurde bei 13.000 U/min 10 min zentrifugiert. Die resultierenden bakteriellen Zellen wurden in 20 ml eines Phosphatpuffers (pH 7,5, 100 mM) suspendiert. Die Suspension wurde wieder bei 13.000 U/min 10 min zentrifugiert. Die resultierenden bakteriellen Zellen wurden in einer Lösung (10 ml) von 2'-Desoxyribose-1- phosphat-di(monocyclohexylammonium)-Salz (50 mM, SIGMA) suspendiert.
Referenzbeispiel 2
(Herstellung einer gereinigten Cytosinnucleosidphosphorylase) Die bakteriellen Zellen in der in Referenzbeispiel 1 hergestellten Suspension wurden mit einem Ultraschalldisrupter aufgeschlossen. Die resultierende Lösung 10 min auf 70°C erwärmt und dann zentrifugiert zur Herstellung einer Lösung des rohen Enzyms. Die Lösung wurde zu einer Säule (DEAE-Toyopearl von Tosoh Corporation, 3 cm × 10 cm) gegeben, die mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,5, 50 mM) äquilibriert wurde. Die Lösung wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl-Lösung von 50 mM bis 500 mM eluiert zur Wiedergewinnung der aktiven Fraktion. Das Eluat wurde als Niederschlag in einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (70 %) wiedergewonnen. Der Niederschlag wurde in einem Phosphatpuffer (pH 7,5, 10 mM) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zu einer Hydroxyapatitsäule (3 cm × 15 cm) gegeben, die mit Phosphatpuffer (pH 7,5, 10 mM) äquilibriert wurde. Die Lösung wurde mit einem linearen Gradienten von Phosphatpuffer (pH 7,5) von 10 mM bis 50 mM eluiert zur Rückgewinnung der aktiven Fraktion. Die Enzymlösung wurde als Niederschlag in einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (70 %) wiedergewonnen. Der Niederschlag wurde in 1 ml Phosphatpuffer (pH 7,5, 10 mM) gelöst. Die Lösung wurde in Tris-HCl-Puffer (pH 7,5, 10 mM) dialysiert zur Herstellung von 2 ml gereinigtem Enzym. Das analytische Ergebnis dieses gereinigten Enzyms durch Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese zeigte eine einzelne Bande.
Beispiel 1
Eine Reaktionslösung (1,0 ml), enthaltend Ribose-1-phosphat-di(monocyclohexylammonium)-Salz (50 mM, SIGMA), 2-Hydroxy-4- methylpyrimidin (10 mM, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.), Natriumacetatpuffer (pH 8,0, 100 mM) und die Suspension (0,1 ml) der in Referenzbeispiel 1 hergestellten bakteriellen Zellen wurde 1 h auf 50°C erwärmt, um die enzymatische Reaktion durchzuführen. Die Reaktionslösung wurde zur Analyse verdünnt. Gemäß der Analyse wurde eine entsprechende Pyrimidinnucleosidverbindung erzeugt (6,9 mM).
Beispiel 2
Eine Reaktionslösung (1,0 ml), enthaltend 2'-Desoxyribose-1-phosphat-di(monocyclohexylammonium)-Salz (50 mM, SIGMA), 4-Acetamidopyrimidin (10 mM, ALDRICH), Kaliumacetatpuffer (pH 8,0, 100 mM) und die in Referenzbeispiel 2 hergestellte Enzymlösung (0,1 ml) wurde 1 h auf 50°C erwärmt, um die enzymatische Reaktion durchzuführen. Die Reaktionslösung wurde zur Analyse verdünnt. Gemäß der Analyse wurde eine entsprechende Pyrimidinnucleosidverbindung erzeugt (4,4 mM).
Beispiel 3
Destilliertes Wasser (15 g) wurde zu 2'-Desoxyribose-1-phosphatdiammonium-Salz (2,5 g), hergestellt durch ein in japanischer ungeprüfter Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 2002-205996, beschriebenes Verfahren, 2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidin (0,63 g, ALDRICH) und Magnesiumcarbonat (1,5 g) gegeben zur Herstellung einer Reaktionslösung. Die in Referenzbeispiel 2 hergestellte Enzymlösung (5 ml) wurde zur Reaktionslösung gegeben und 20 h bei 30°C gehalten zur Durchführung der enzymatischen Reaktion.
Die Reaktionslösung wurde durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) unter Verwendung des Elektronenspray-Ionisation (+) (ESI)-Verfahrens analysiert.
Bedingungen für die Flüssigchromatographie:
Die Elutionszeit des Produkts betrug 5,25 min, und das Resultat durch die Massenspektrometrie war wie folgt: Massenzahl (Intensitätspeak): 127 (80), 243 (100) und 485 (20).
Beispiel 4
Destilliertes Wasser (15 g) wurde zu 2'-Desoxyribose-1-phosphatdiammoniumsalz (2,5 g), hergestellt durch ein in japanischer ungeprüfter Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 2002-205996, beschriebenes Verfahren, 4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidin (1,5 g, LANCASTER) und Magnesiumcarbonat (1,5 g) gegeben zur Herstellung einer Reaktionslösung. Die in Referenzbeispiel 2 hergestellte Enzymlösung (5 ml) wurde zur Reaktionslösung gegeben und 20 h auf 30°C gehalten zur Durchführung der enzymatischen Reaktion.
Die Reaktionslösung wurde durch LC-MS unter Verwendung des ESI (+)-Verfahrens wie in Beispiel 3 analysiert.
Die Elutionszeit des Produkts betrug 6,68 min, und das Ergebnis der Massenspektrometrie war wie folgt: Massenzahl (Intensitätspeak): 127 (40), 243 (100) und 485 (10) Der Niederschlag wurde aus der Reaktionslösung durch Filtration entfernt und der pH der Lösung wurde dann durch Zugabe von Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Die Lösung wurde auf ca. 5 g eingeengt. Ein dreifaches Volumen von Isopropylalkohol wurde zu einem Volumen der Lösung gegeben und die Lösung wurde kristallisiert. Die Kristalle wurden filtriert und mit der gleichen Menge Isopropylalkohol gewaschen. Die Kristalle wurden im Vakuum getrocknet, wodurch die Kristalle des Produkts zurückgewonnen wurden (ca. 0,6 g).
Die Ergebnisse von ¹H-NMR und ¹³C-NMR waren wie folgt:
¹H-NMR (D₂O, 400 MHz, 20,1°C):
δ 8,29 (s, 1H), 6,31 (t, J = 6,3 Hz, 1H), 4,48 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 3,87 (dd, J = 3,4 & 12,5 Hz, 1H), 3,77 (dd, J=5,1 & 12,5 Hz, 1H), 2,54 (m, 1H), und 2,42 (m, 1H)
¹³C-NMR (D₂O) δ (ppm):
160,38, 156,12, 147,22, 102,61, 89,80, 88,60, 72,99, 63,74 und 42,58
Beispiel 5
Eine Reaktionslösung (1,0 ml), enthaltend 2'-Desoxyribose-1-phosphat-di(monocyclohexylammonium)-Salz (50 mM, SIGMA), 2-Thiocytosin (10 mM, SIGMA), Natriumacetatpuffer (pH 8,0, 100 mM) und die in Referenzbeispiel hergestellte Enzymlösung (0,1 ml) wurden 1 h auf 50°C erwärmt, um die enzymatische Reaktion durchzuführen. Die Reaktionslösung wurde zur Analyse verdünnt. Gemäß der Analyse wurde eine entsprechende Nucleosidverbindung hergestellt (0,3 mM).
Beispiel 6
Eine Reaktionslösung (1,0 ml), enthaltend 2'-Desoxyribose-1-phosphat-di(monocyclohexylammonium)-Salz (50 mM, SIGMA), 5-Hydroxymethylcytosin (10 mM, SIGNA), Natriumacetatpuffer (pH 8,0, 100 mM) und die in Referenzbeispiel 2 hergestellte Enzymlösung (0,1 ml) wurden 1 h auf 50°C erwärmt zur Durchführung der enzymatischen Reaktion. Die Reaktionslösung wurde zur Analyse verdünnt. Gemäß der Analyse wurde eine entsprechende Nucleosidverbindung hergestellt (0,1 mM).
Beispiel 7
Eine Reaktionslösung (1,0 ml), enthaltend 2'-Desoxyribose-1-phosphat-di(monocyclohexylammonium)-Salz (50 mM, SIGMA), 4-Thiouracil (10 mM, SIGMA), Natriumacetatpuffer (pH 8,0, 100 mM) und die in Referenzbeispiel 2 hergestellte Enzymlösung (0,1 ml) wurden 1 h auf 50°C erwärmt zur Durchführung der enzymatischen Reaktion. Die Reaktionslösung wurde zur Analyse verdünnt. Gemäß der Analyse wurde eine entsprechende Nucleosidverbindung hergestellt (4,2 mM).
Beispiel 8
(Ablauf zur Inhibierung der Deacetylierungsaktivität)
Eine Suspension, enthaltend die in Referenzbeispiel 1 hergestellten bakteriellen Zellen wurde 6 h auf 60°C erwärmt.
Die resultierende Suspension wird als wärmebehandelte Suspension der bakteriellen Zellen bezeichnet.
Aceton wurde zur Suspension, enthaltend die in Referenzbeispiel 1 hergestellten bakteriellen Zellen, gegeben, so dass das Verhältnis 70 % V/V wurde. Die Lösung wurde 1 h bei 30°C gerührt. Die Mischung wurde zur Rückgewinnung der bakteriellen Zellen zentrifugiert. Die bakteriellen Zellen wurden in Luft getrocknet. Die resultierenden bakteriellen Zellen werden als Aceton-behandelte bakterielle Zellen bezeichnet.
Die Suspension, enthaltend die in Referenzbeispiel 1 hergestellten bakteriellen Zellen, wurde mit Ultraschallwellen aufgeschlossen zur Herstellung einer Mischung des Rohenzyms. Aceton wurde zur Mischung des Rohenzyms gegeben, so dass das Verhältnis 50 % V/V wurde. Die Mischung wurde zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert. Aceton wurde ferner zugegeben, so dass das Verhältnis 80 % V/V wurde. Die Mischung wurde zur Rückgewinnung des Niederschlags zentrifugiert. Der Niederschlag wurde getrocknet. Das resultierende Enzympulver wird als Acetonpulver der bakteriellen Zelle bezeichnet.
Beispiel 9
(Reaktion des Enzyms, worin die Deacetylierungsaktivität inhibiert wird)
Destilliertes Wasser (16,5 g) wurde zu 2'-Desoxyribose-1-phosphat-di(monocyclohexylammonium)-Salz (1,3 g, SIGMA) und 4-Acetamidopyrimidin (0,6 g ALDRICH) gegeben. Magnesiumacetat (1,3 g) wurde weiter zur Lösung gegeben. (1) Obige wärmebehandelte Suspension der bakteriellen Zellen (4 g), (2) Aceton-behandelte bakterielle Zellen (1,2 g) und (3) Acetonpulver der bakteriellen Zellen (0,4 g) wurden nacheinander zur Lösung gegeben. Die drei Arten an Lösung wurden 6 h auf 30°C gehalten, um die enzymatische Reaktion durchzuführen. Natriumhydroxid oder Essigsäure wurde zur Lösung gegeben, so dass der pH der Lösung auf ca. 7,0 während der Reaktion eingestellt wurde. Im Vergleichsbeispiel wurde die in Referenzbeispiel 1 hergestellten bakteriellen Zellen enthaltende Suspension zur Lösung gegeben, um die enzymatische Reaktion ohne Kontrollieren des pHs durchzuführen.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 1

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung umfassend den Schritt: Umsetzen eines Zuckerphosphats mit einem Pyrimidinbasenderivat in der Gegenwart eines Enzyms mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität, worin das Pyrimidinbasenderivat dargestellt ist durch Formel (I):
worin R1 darstellt: eine Aminogruppe, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, oder einer Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann, eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Thiolgruppe; R2 eine Aminogruppe, Thiolgruppe, Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; R3 darstellt: eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, die mit einer Hydroxygruppe substituiert sein kann, eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom; R4 eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt; vorausgesetzt dass, wenn R1 eine Aminogruppe, R2 eine Hydroxygruppe und R5 ein Wasserstoffatom ist, dann R3 weder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen noch ein Wasserstoffatom ist.
Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Anspruch 1, worin das Pyrimidinbasenderivat, dargestellt durch Formel (I), umfasst: 2-Hydroxy-4-methylpyrimidin, 4-Acetamidopyrimidin, 2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidin, 2-Thiocytosin, 5-Hydroxymethylcytosin oder 4-Thiouracil.
Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der phosphorylierte Zucker umfasst: Ribose-1-phosphat, 2'-Desoxyribose-1-phosphat oder 2',3'-Didesoxyribose-1-phosphat.
Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Enzym mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität aus E. coli erhalten wird.
Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Enzym mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität bereitgestellt wird durch eine bakterielle Zelle eines Mikroorganismus mit dem Enzym, oder ein verarbeitetes Enzym, das aus der bakteriellen Zelle oder einer Kulturlösung der bakteriellen Zelle hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung, umfassend den Schritt: Umsetzen einer Verbindung, dargestellt durch Formel (I), worin R1 eine Aminogruppe ist, die mit einer Acylgruppe, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweist, substituiert ist, mit einem Zuckerphosphat unter Verwendung einer bakteriellen Zelle eines Mikroorganismus oder eines verarbeiteten Enzyms der bakteriellen Zelle des Mikroorganismus mit Cytosinnucleosidphosphorylase-Aktivität, worin die Deacylierungsaktivität des Mikroorganismus auf die Acylgruppe in der Verbindung deaktiviert oder vermindert wird.
Verfahren zur Herstellung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Anspruch 6, worin die Deacylierungsaktivität der bakteriellen Zelle des Mikroorganismus oder des verarbeiteten Enzyms durch Erwärmen oder in Kontaktbringen mit Wasser, das ein organisches Lösungsmittel enthält, selektiv deaktiviert oder vermindert wird.
Pyrimidinnucleosidverbindung, dargestellt durch Formel (II)
worin R5 eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom, R6 eine Aminogruppe oder ein Wasserstoffatom und R7 eine Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt.
Verwendung einer Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Anspruch 8 als künstliches Material, insbesondere in einem medizinischen Produkt.
Medizinisches Produkt, umfassend eine Pyrimidinnucleosidverbindung gemäß Anspruch 8.