DE4111971C1 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung beschreibt ein generelles Verfahren zur Herstellung enantio-
und diastereomerenreiner Ketosen durch enzymatische Umsetzung von
Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart von wahlweise vier
verschiedenen Aldolasen. Diese Produkte und ihre Derivate interessieren als
niederkalorige Süßstoffe, als Komponenten oder Vorstufen pharmazeutischer
Wirkstoffe wie Antibiotika oder Glykosidase-Inhibitoren.
Aus der PCT/US82/00 534 (WO 83/03 846) ist bereits ein Verfahren zur Herstellung
von 6-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-L-sorbose bekannt, bei dem D-
und/oder L-Lactaldehyd in Gegenwart kommerzieller Kaninchenmuskelaldolase
mit Dihydroxyacetonphosphat oder D-Fructose-1,6-diphosphat und Triosephosphatisomerase
bei pH 7 zur Reaktion gebracht wird. Die Nachteile dieses Verfahrens
sind die Beschränkung auf eine einzige Form diastereomeren Produkts,
nämlich derjenigen mit der absoluten D-threo-(3S, 4R)-Konfiguration, und der
Instabilität der Reaktionskomponente Dihydroxyacetonphosphat bei neutralem
oder alkalischem pH. Letztere weist jedoch eine signifikant höhere Stabilität in
saurem Milieu auf (u. a. J. P. Richard, J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 4926-36).
Aus mehreren Quellen ist bekannt (u. a. G. M. Whitesides et al., J. Am. Chem.
Soc. 11 (1989) 627-35), daß dieselbe Kaninchenmuskelaldolase (eine Aldolase der
Klasse 1, die eine kovalente Bindung zur Substrataktivierung erfordert) ein
breites Spektrum von Aldehyden umsetzen kann. Die Diastereoselektivität der
Addition ist jedoch nur für wenige Beispiele gesichert worden; die Reinheit
und chemischen Ausbeuten der Produkte, sowie die Stabilität des Enzyms unter
den Reaktionsbedingungen zeigen allerdings einige Mängel. Eine aus Staphylokokken
isolierte D-Tagatose-1,6-diphosphataldolase (Klasse 1) ist darüber hinaus
als stereochemisch völlig unselektiv beschrieben worden (D. L. Bissett und R. L.
Anderson, J. Biol. Chem. 255 (1980) 8750-55). Die Verwendung der D-Fructose-1,6-
diphosphataldolase aus Escherichia coli (eine Aldolase der Klasse 2, die das
Substrat ohne kovalente Bindung aktiviert) ist nur an drei eng verwandten
Beispielen belegt (von der Osten et al., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 3924-27), über
das mögliche weitere Einsatzspektrum und insbesondere über die Stereoselektivität
ist jedoch nichts Näheres bekannt; auch hier waren die Ausbeuten zum
Teil mangelhaft. Die Verwendung der L-Fuculose-1-phosphataldolase aus Escherichia
coli ist an einem wenige ergiebigen Beispiel demonstriert (Ausbeute 42%,
optische Reinheit ca. 90%), eventuelle weitere Einsatzmöglichkeiten jedoch nur
anhand indirekter enzymatischer Assays mit wenigen Substratanaloga nahegelegt
worden (A. Ozaki et al., J. Am. Chem. Soc. 112 (1990) 4970-71). Generell
werden derartige Reaktionen bei neutralem pH (7.0) durchgeführt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein breit anwendbares enzymatisches
Verfahren vorzuschlagen, mit dem alle vier möglichen Diastereomere unter
milden Reaktionsbedingungen hoch diastereoselektiv und damit in hoher
chemischer und optischer Reinheit hergestellt werden können.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß aus Aldehyden in Gegenwart von
Dihydroxyacetonphosphat in wäßriger Lösung von schwach saurem pH durch
bestimmte, bekannte Enzyme gezielt enantio- und diastereomerenreine, auf den
eingesetzten Aldehyden basierende Ketose-1-phosphate bestimmter Konfiguration
in besonders hoher chemischen Reinheit und besonders hohen präparativen
Ausbeuten herstellbar sind. Dementsprechend betrifft die Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch
Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart eines
Enzyms in wäßrigem Medium und nachfolgende Hydrolyse, dadurch gekennzeichnet,
daß die von den Aldehyden abzuleitende Ketose-1-phosphate aller vier
absoluten Konfigurationen gezielt in Abhängigkeit der eingesetzten Enzyme-D-
Fructose-1,6-diphosphataldolase ([EC 4.1.2.13]; D-threo=(3S, 4R)-Konfiguration),
D-Tagatose-1,6-diphosphataldolase (noch nicht klassifiziert; L-erythro-=(3S, 4S)-
Konfiguration), L-Fuculose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.17]; D-erythro-=(3R,
4R)-Konfiguration) bzw. L-Rhamnulose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.19]; L-threo=
(3R, 4S)-Konfiguration) - erhalten werden.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die jeweiligen Ketose-1-
phosphate in wäßrigem Milieu bei einem derartigen pH-Wert hergestellt, daß
ausreichende Stabilität insbesondere der zweiten Reaktionskomponente Dihydroxyacetonphosphat
und hohe enzymatisch katalysierte Reaktionsgeschwindigkeit
unter Erhalt der typischen Diastereoselektivität garantiert werden.
Geeignete Verfahren zur Herstellung auch größerer Mengen an Dihydroxyacetonphosphat
sind bekannt (F. Effenberger und A. Straub, Tetrahedron Lett. 28
(1987) 1641-44; R. L. Pederson et al., Tetrahedron 47 (1991) 2643-48).
Die aus Escherichia coli (z. B. Wildtyp K-12 oder Varianten Crooke's Strain
(ATCC 8739), Strain B (ATCC 11 303) bzw. Strain O111-B4; Bezugsquellen:
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig,
oder American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville,
MD 20 852-1776, USA oder International Enterobacteriaceae Center, Kopenhagen,
Dänemark) stammenden Enzyme, ihre Diastereopräferenz und Verfahren zu
ihrer Isolierung sind u. a. aus den folgenden Arbeiten bekannt:
Fructose-1,6-diphosphataldolase: S. A. Baldwin et al., Biochem. J. 169 (1978) 633-641; Tagatose-1,6-diphosphataldolase: J. Lengeler, Mol. Gen. Genet. 152 (1977) 83-91; Fuculose-1-phosphataldolase: M. A. Ghalambor und E. C. Heath, J. Biol. Chem. 237 (1962) 2427-33; Rhamnulose-1-phosphataldolase: T.-H. Chiu und D. S. Feingold, Biochemistry 8 (1969) 98-108;
jedoch ist ihre Brauchbarkeit für eine breit variierbare Gewinnung diastereomerenreiner Ketosen und deren Derivate nicht dokumentiert.
Fructose-1,6-diphosphataldolase: S. A. Baldwin et al., Biochem. J. 169 (1978) 633-641; Tagatose-1,6-diphosphataldolase: J. Lengeler, Mol. Gen. Genet. 152 (1977) 83-91; Fuculose-1-phosphataldolase: M. A. Ghalambor und E. C. Heath, J. Biol. Chem. 237 (1962) 2427-33; Rhamnulose-1-phosphataldolase: T.-H. Chiu und D. S. Feingold, Biochemistry 8 (1969) 98-108;
jedoch ist ihre Brauchbarkeit für eine breit variierbare Gewinnung diastereomerenreiner Ketosen und deren Derivate nicht dokumentiert.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die strukturell und
mechanistisch im Vergleich zur Kaninchenmuskelaldolase andersartigen Aldolasen
der Klasse 2 eine Vielzahl unterschiedlicher Aldehyde in vergleichbarem
Maß als alternative Substrate umsetzen. Ebenso überraschend war der Befund,
daß die Aktivität aller vier beschriebenen Aldolasen im Hinblick auf die Synthese
von Ketose-1-phosphaten bei schwach saurem pH-Wert (6.0 bis 6.9) zwar etwas
vermindert, aber für präparative Zwecke noch ausreichend ist und daß die jeweils
charakteristische Diastereoselektivität unter diesen Bedingungen voll erhalten
bleibt. Der optimale pH-Bereich wird mit von der Stabilität der aldehydischen
Substrate bestimmt, liegt aber vorzugsweise bei pH 6.4 bis 6.7.
Das wäßrige Milieu kann dabei gegebenenfalls zur Verbesserung der Löslichkeit
lipophiler Aldehyde bis maximal 50 Vol-% organisches Cosolvens wie niedere
aliphatische Alkohole (Methanol, Ethanol, n- oder i-Propanol), Dimethylsulfoxid,
Dimethylformamid oder Acetonitril enthalten. Da die Enzymaktivität
jedoch durch die Anwesenheit organischer Lösungsmittel vermindert wird,
sollte vorzugsweise ohne (0%), falls erforderlich aber bis maximal 30 Vol-%
Cosolvens gearbeitet werden.
Die Stabilität der Enzyme in wäßriger Lösung kann gegebenenfalls durch
Zusatz geringer Mengen (Konzentrationen bis zu 1 mM) an Schwermetallsalzen
wie Zn2+, Co2+, Ni2+ oder Mn2+-Acetat oder -Formiat erhöht werden. Höhere
Konzentrationen können zur Fällung von Phosphaten führen. Andere Anionen
(z. B. Chlorid, Bromid, Sulfat) sind zwar ebenfalls mit der Enzymaktivität
verträglich, können aber zur Verunreinigung der Produkte führen. Vorzugsweise
wird Zink- oder Kobaltacetat in einer Konzentration von 0.4 bis 0,5 mM
verwendet. Eine meßbare Aktivitätssteigerung wird auch durch Zusatz von
Alkalimetallionen, vorzugsweise K⁺ (z. B. als KOAc) erreicht. Um der Enzyminaktivierung
durch Oxidation vorzubeugen, wird vorteilhaft unter Inertgasatmosphäre
(Stickstoff, Argon), in entgastem Lösungsmittel (Wasser, Cosolvens)
und/oder unter Zusatz von Thiolen (z. B. Mercaptoethanol, Cystein, Glutathion;
0.5 bis 10 mM) gearbeitet. Der Einsatz löslicher Enzyme erleichtert die Dosierung
und Bestimmung der Restaktivitäten, jedoch kann eine Immobilisierung an
feste Träger, z. B. an Eupergit® C, die Stabilität der vier obengenannten Enzyme
ebenfalls vorteilhaft erhöhen.
Die Reaktionstemperatur kann zwischen -5°C und 40°C variiert werden, zur
Wahrung hoher Umsatzgeschwindigkeit bei hinreichender Enzym- und Substratstabilität
wird im allgemeinen bei 25°C bis 30°C gearbeitet.
In Kauf genommen wird bei der erfindungsgemäßen Reaktion, daß sich die
enzymatische Aktivität und die Haltbarkeit der Enzyme mit abnehmendem pH-
Wert vermindern, jedoch sind die vier obengenannten Enzyme aus natürlich
vorkommend induzierbaren oder konstitutiven Bakterien-Stämmen, insbesondere
aber aus molekularbiologisch erzeugten Überexperimenten gut zugänglich
(u. a. P. R. Alefounder et al., Biochem. J. 257 (1989) 529-534; E. C. C. Lin et al., J.
Bacteriol. 171 (1989) 6097-6105; J. Badia et al., FEMS Microbiol. Lett. 65 (1989) 253-58),
so daß der Einsatz erhöhter Mengen und eine Nachdosierung problemlos
sind.
Gemäß der Erfindung können als Substrate alle substituierten oder unsubstituierten
aliphatischen (Typ A oder B), heteroaromatischen (Typ C) und
heterocyclischen (Typ D) Aldehyde, die Substrate für die Aldolasen sind, in deren
Gegenwart mit Dihydroxyacetonphosphat zu diastereomerenreinen Ketose-1-
phosphaten gezielt wählbarer absoluter Konfiguration umgesetzt werden. Ein
besonderes Interesse gilt (teil)hydroxylierten aliphatischen Aldehyden im Hinblick
auf die Verwendung der Ketoseprodukte bzw. ihrer Derivate im pharmazeutischen
Bereich. Beispiele sind für den Typ A bzw. B zum Beispiel Acet-,
Propion-, n- oder i-Butyraldehyd, Hydrozimt-, Hydratrop- oder Phenylacetaldehyd,
Glykol-, 3-Hydroxypropion-, 3-Hydroxy-2-methylpropion-, 3- bzw. 4-Hydroxybutyr-,
3-Oxobutyr- oder 3,3-Diethoxypropionaldehyd, Glyoxylsäure oder
Bernsteinsäuresemialdehyd, sowie Thioacet-, Chloracet-, Bromacet-, Acetylaminoacet-,
Dimethylaminoacet- bzw. -propion- oder -butyraldehyd, enantiomerenreine
Glycerin-, Lact- oder Weinsäuresemialdehyde, C₄- bis C₆-Monosaccharide
und speziell deren 2-Desoxyderivate wie 2-Desoxytetrose, -ribose, -glucose oder
-galactose; für den Typ C Pyridin-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Pyrazol-, Imidazol- oder
Pyrrolcarbaldehyd; für den Typ D Tetrahydrofurfural, Thiazolidin- oder Oxazolidincarbaldehyd,
sowie Aceton- oder Formaldehydacetale des Glycerin- oder
Dihydroxybutyraldehyds.
Die Produkte können vorteilhaft durch Fällung als Bariumsalze, Absorption
an Anionenaustauschern und/oder Kristallisation als Cyclohexylammonium-,
Di(cyclohexyl)ammonium- oder Lithiumsalz isoliert werden. Durch bekannte
Verfahren zur Hydrolyse der Phosphatester werden die freien Ketosen bzw.
-derivate erhalten. Vorzugsweise findet dabei die enzymatische Hydrolyse durch
saure oder alkalische Phosphatase im pH-Bereich von 5 bis 7 bzw. 8 bis 9 und bei
Temperaturen zwischen 25 bis 30°C Verwendung, da chemische Hydrolyse drastischere
Bedingungen (niedrigeren oder höheren pH, höhere Temperaturen)
erfordert, was zu teilweiser Zersetzung oder Isomerisierung der Produkte führt.
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃, Phenyl, Halogen,
OH, OR⁷, OR⁸, SH, SR⁷, NH₂, NHR⁷, NHR⁸, NR⁷₂, N₃, =O, =NH, =NR⁷,
CH₂OH, CH₂OR⁷, CH₂OR⁸, CHO, COCH₃, COOH, COOR⁷, CONH₂
R⁷=CH₃, CH₂CH₃, Benzyl
R⁸=COCH₃
k, l, m, n unabhängig voneinander=0,1 oder 2
R⁷=CH₃, CH₂CH₃, Benzyl
R⁸=COCH₃
k, l, m, n unabhängig voneinander=0,1 oder 2
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃
k=0, 1, 2 oder 3
k=0, 1, 2 oder 3
a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N oder CH
f=NH, O, S oder CH₂
f=NH, O, S oder CH₂
a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N, O, S oder CH₂
R¹=H oder CH₃
R²=H, CH₃, CH₂OH, CHO, CH₂O-Alkyl, COOH, COO-Alkyl
R¹=H oder CH₃
R²=H, CH₃, CH₂OH, CHO, CH₂O-Alkyl, COOH, COO-Alkyl
Nachfolgende Beispiele sollen die verschiedenen Aspekte der Erfindung
näher verständlich machen.
Eine wäßrige Lösung von Dihydroxyacetonphosphorsäure (4 mmol in 40 ml)
wurde mit Kalilauge auf pH 6.5 eingestellt und mit einer Lösung von L-Glycerinaldehyd
(5 mmol in 60 ml) vereinigt. Nach Zugabe von 11 mg Zinkacetat (0.5 mM)
und 50 mg Kaliumacetat (5 mM) wurde im Vakuum entgast. Danach
wurden 35 µl Mercaptoethanol (5 mM) und 200 µl einer wäßrigen Lösung von
Fuculose-1-phosphataldolase (ca. 20 U) zugegeben und unter Stickstoffatmosphäre
auf 25°C temperiert. Die Reaktion wurde mittels enzymatischem Assay auf
Dihydroxyacetonphosphat (H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3.
Auflage; Academic Press, New York 1984; Band 6, S. 342) verfolgt. Nach 20 h war
alles Dihydroxyacetonphosphat verbraucht und im Dünnschichtchromatogramm
(Kieselgel; Isopropanol/Ammoniak/Wasser 6 : 4 : 2) war ein neuer Fleck
entstanden. Das Produkt wurde an einer Säule mit Dowex 1-X8 (Hydrogencarbonat-
Form, 20 ml) gebunden und durch Elution mit Triethylammonium-
Hydrogencarbonat-Puffer (200 mM) isoliert. Nach Ionenaustausch (Dowex 50W-
X8, H⁺) wurde mit Cyclohexylamin neutralisiert und aus 95% Ethanol als
Bis(cyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 1.58 g (86% d.
Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%97% (bestimmt durch ¹H-
NMR bei 400 MHz).
Zur Esterhydrolyse wurde die saure Produktlösung (nach Ionenaustausch,
vor der Neutralisation) auf 150 ml verdünnt und auf pH 6.0 eingestellt. Nach
Zugabe von saurer Phosphatase (5 mg, ca. 250 U) wurde bei 25°C stehen gelassen
und die Reaktion dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 48 h war die
Reaktion beendet, die Lösung wurde entsalzt (Dowex W50-X8/H⁺ und 1-X8/OH-)
und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Anschließend wurde
der Rückstand, bestehend aus L-Tagatose, aus Ethanol kristallisiert. Chemische
Ausbeute: 570 mg (92% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit Bernsteinsäuresemialdehyd (2 Äquivv.) in Gegenwart von Fuculose-1-phosphataldolase
umgesetzt. Die Reaktion war nach 24 h beendet. Das Produkt wurde durch
Elution mit Ameisensäure/Formiat-Puffer (1.5 M, pH 2) isoliert und als Tris(Lithium)-
Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 233 mg (80% d. Th.). Enantio-
bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
2,3-Didesoxy-D-erythro-6-heptulosonsäure: 146 mg (95% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1, aber bei pH 6.0, wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol)
mit Pyridin-2-carbaldehyd (1.5 Äquivv.) in Gegenwart von Fuculose-1-
phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 18 h beendet. Das Produkt
wurde als Bis(dicyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute:
386 mg (84% d. Th.). Enantio- bzw. Diasteroemereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
4-(2-Pyridyl)-4-desoxy-L-erythro-tetrulose: 146 mg (88% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit Glykolaldehyd
1.2 Äquivv.) in Gegenwart von Tagatose-1,6-diphosphataldolase
umgesetzt. Die Reaktion war nach 12 h beendet. Das Produkt wurde durch
Elution mit Triethylammonium-Hydrogencarbonat-Puffer (200 mM) isoliert und
als Bis(cyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 368 mg
(86% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
L-erythro-pentulose (L-Ribulose): 118 mg (19% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (5 mmol) mit L-
Lactaldehyd in Gegenwart von Rhamnulose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die
Reaktion war nach 7 h beendet. Zur Isolierung des Produkts wurde die Reaktionsmischung
direkt mit Dowex 50W-X8/H⁺ (15 mL) angesäuert, mit Cyclohexylamin
neutralisiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum
abgezogen. Der Rückstand wurde aus 95% Ethanol zum Bis(cyclohexylammonium)-
Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 2215 mg (95% d. Th.).
Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
6-Desoxy-L-arabino-hexulose (L-Rhamnulose): 725 g (93% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit iso-
Butyraldehyd in Gegenwart von Rhamnulose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die
Reaktion war nach 20 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(cyclohexylammonium)-
Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 532 mg (88% d. Th.). Enantio- bzw.
Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
5,6-Didesoxy-5-methyl-L-threo-hexulose: 117 mg (91% d. Th.).
Eine wäßrige Lösung von Dihydroxyacetonphosphorsäure (1 mmol in 30 ml)
wurde mit Kalilauge auf pH 6.5 eingestellt, 9 mg Zinkacetat (0,5 mM) und eine
Lösung von Hydrozimtaldehyd (1.5 Äquivv.) in 5 ml Dimethylformamid dazugegeben.
Nach Zugabe von 100 µl einer wäßrigen Lösung von Fructose-1,6-diphosphataldolase
(ca. 10 U) wurde bei 25°C stehen gelassen. Die Reaktion war
nach 9 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(dicyclohexylammonium)-Salz
kristallisiert. Chemische Ausbeute: 620 mg (93% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit:
»99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
5,6-Didesoxy-6-phenyl-D-threo-hexulose: 200 mg (96% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (5 mmol) mit D-
Glycerindehyd umgesetzt, wobei mit an Eupergit® C immobilisierter
Rhamnulose-1-phosphataldolase (1.0 g, ca. 20 U) unter mechanischem
Rühren der Reaktionslösung gearbeitet wurde. Die Reaktion war nach 24 h
beendet. Das Produkt wurde als Bis(cyclohexalammonium)-Salz isoliert. Chemische
Ausbeute: 1925 mg (84% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit:
»99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
L-Fructose: 735 mg (97% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit 3,3-
Diethoxypropionaldehyd bei pH 6.8 und 20°C in Gegenwart von Fuculose-1-
phosphataldose umgesetzt. Die Reaktion war nach 16 h beendet. Zur Isolierung
des Produkts wurde die Reaktionslösung mit 380 mg (1.5 mmol) Bariumacetat
versetzt und die geringe Menge eines flockigen Niederschlags durch Filtration
durch Celite entfernt. Die Lösung wurde auf 4°C gekühlt, der pH auf 8.0
eingestellt und 50 ml Ethanol zugegeben. Das bei 4°C als Bariumsalz ausfallende
Produkt wurde durch Zentrifugieren isoliert und mit Ethanol, dann Ether
gewaschen und im Vakuum getrocknet. Chemische Ausbeute: 308 mg (68% d.
Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Nach Überführen des Produkts in das Natriumsalz durch Rühren einer wäßrigen
Suspension mit Dowex 50W-X8/Na⁺ und Filtrieren vom Austauscherharz
wurde mit Natronlauge der pH auf 8.5 eingestellt. Nach Zugabe von alkalischer
Phosphatase (ca. 100 U) wurde bei 20°C stehen gelassen und die Reaktion
dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 36 h war die Reaktion beendet,
die Lösung wurde entsalzt (Dowex 50W-X8/H⁺ und 1-X8/OH-) und das Lösungsmittel
am Rotationsverdampfer abgezogen. Chemische Ausbeute an 2-Desoxy-D-
erythro-hexos-5-ulose-1,1-diethylacetal: 140 mg (87% d. Th.).
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit 3-
Hydroxypropionaldehyd (1.5 Äquivv.) bei pH 6.8 in Gegenwart von Rhamnulose-
1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 15 h beendet. Die
Isolierung des Produkts erfolgte als Bis(cyclohexylammonium)-Salz. Chemische
Ausbeute: 411 mg (93% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit:
»99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an
5-Desoxy-L-threo-hexulose (5-Desoxy-L-fructose): 145 mg (95% d. Th.).
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen
durch Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart
eines Enzyms in wäßrigem Medium und nachfolgende Hydrolyse,
dadurch gekennzeichnet, daß die von den Aldehyden abzuleitende
Ketose-1-phosphate aller vier absoluten Konfigurationen gezielt in
Abhängigkeit der eingesetzten Enzyme - Fructose-1,6-diphosphataldolase
([EC 4.1.2.13]; D-threo-=(3S, 4R)-Konfiguration), Tagatose-1,6-diphosphataldolase
(nicht klassifiziert; L-erythro-=(3S, 4S)-Konfiguration), Fuculose-
1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.17]; D-erythro-=(3R, 4R)-Konfiguration)
bzw. Rhamnulose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.19]; L-threo-=(3R, 4S)-
Konfiguration) - erhalten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aliphatische,
heterocyclische oder heteroaromatische Aldehyde einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
einen Aldehyd der allgemeinen Formel vom Typ A, B, C oder D einsetzt
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃, Phenyl, Halogen,
OH, OR⁷, OR⁸, SH, SR⁷, NH₂, NHR⁷, NHR⁸, NR⁷₂, N₃, =O, =NH, =NR⁷,
CH₂OH, CH₂OR⁷, CH₂OR⁸, CHO, COCH₃, COOH, COOR⁷, CONH₂
R⁷=CH₃, CH₂CH₃, Benzyl
R⁸=COCH₃
k, l, m, u unabhängig voneinander=0, 1 oder 2 R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃
k=0, 1, 2 oder 3 a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N oder CH
f=NH, O, S oder CH₂ a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N, O, S oder CH₂
R¹=H oder CH₃
R²=H, CH₃, CH₂OH, CHO, CH₂O-Alkyl, COOH, COO-Alkyl
R⁷=CH₃, CH₂CH₃, Benzyl
R⁸=COCH₃
k, l, m, u unabhängig voneinander=0, 1 oder 2 R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃
k=0, 1, 2 oder 3 a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N oder CH
f=NH, O, S oder CH₂ a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N, O, S oder CH₂
R¹=H oder CH₃
R²=H, CH₃, CH₂OH, CHO, CH₂O-Alkyl, COOH, COO-Alkyl
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als aliphatischen
Aldehyd Acet-, Propion-, n- oder i-Butyraldehyd, Hydrozimt-,
Hydratrop-, Phenylacetaldehyd, Glykol-, 3-Hydroxypropion-, 3-Hydroxy-
2-methylpropion-, 3- bzw. 4-Hydroxybutyr-, 3-Oxobutyr- und 3,3-Diethoxypropionaldehyd,
Glyoxylsäure oder Bernsteinsäuresemialdehyd, sowie
Thioacet-, Chloracet-, Bromacet-, Acetylaminoacet-, Dimethylaminoacet-
bzw. -propion- oder -butyraldehyd, enantiomerenreine Glycerin-,
Lact- oder Weinsäuresemialdehyde, C₄- bis C₆-Monosaccharide und speziell
deren 2-Desoxyderivate (2-Deoxytetrose, -ribose, -glucose und -galactose)
einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als heterocyclischen
Aldehyd Tetrahydrofurfural, Thiazolidin-, Oxazolidincarbaldehyd,
Aceton- oder Formaldehydacetale des Glycerin- oder Dihydroxybutyraldehyds
einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als heteroaromatischen
Aldehyd Pyridin-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Pyrazol-, Imidazol-
oder Pyrrolcarbaldehyd einsetzt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß
man Aldolasen der Klasse 2 aus mikrobiellen Quellen verwendet.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Reaktion bei pH 6.0 bis 6.9 durchführt.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Reaktionstemperatur von -5° bis +40°C
wählt.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet,
daß man bis zu 50% organisches Cosolvens zusetzt.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet,
daß man als stabilisierende Zusätze Schwermetallsalze,
Alkalimetallsalze oder Thiolreagenzien einsetzt.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Enzyme in immobilisierter Form einsetzt.
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