DE4111971C1 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung beschreibt ein generelles Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch enzymatische Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart von wahlweise vier verschiedenen Aldolasen. Diese Produkte und ihre Derivate interessieren als niederkalorige Süßstoffe, als Komponenten oder Vorstufen pharmazeutischer Wirkstoffe wie Antibiotika oder Glykosidase-Inhibitoren.
Aus der PCT/US82/00 534 (WO 83/03 846) ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von 6-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-L-sorbose bekannt, bei dem D- und/oder L-Lactaldehyd in Gegenwart kommerzieller Kaninchenmuskelaldolase mit Dihydroxyacetonphosphat oder D-Fructose-1,6-diphosphat und Triosephosphatisomerase bei pH 7 zur Reaktion gebracht wird. Die Nachteile dieses Verfahrens sind die Beschränkung auf eine einzige Form diastereomeren Produkts, nämlich derjenigen mit der absoluten D-threo-(3S, 4R)-Konfiguration, und der Instabilität der Reaktionskomponente Dihydroxyacetonphosphat bei neutralem oder alkalischem pH. Letztere weist jedoch eine signifikant höhere Stabilität in saurem Milieu auf (u. a. J. P. Richard, J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 4926-36).
Aus mehreren Quellen ist bekannt (u. a. G. M. Whitesides et al., J. Am. Chem. Soc. 11 (1989) 627-35), daß dieselbe Kaninchenmuskelaldolase (eine Aldolase der Klasse 1, die eine kovalente Bindung zur Substrataktivierung erfordert) ein breites Spektrum von Aldehyden umsetzen kann. Die Diastereoselektivität der Addition ist jedoch nur für wenige Beispiele gesichert worden; die Reinheit und chemischen Ausbeuten der Produkte, sowie die Stabilität des Enzyms unter den Reaktionsbedingungen zeigen allerdings einige Mängel. Eine aus Staphylokokken isolierte D-Tagatose-1,6-diphosphataldolase (Klasse 1) ist darüber hinaus als stereochemisch völlig unselektiv beschrieben worden (D. L. Bissett und R. L. Anderson, J. Biol. Chem. 255 (1980) 8750-55). Die Verwendung der D-Fructose-1,6- diphosphataldolase aus Escherichia coli (eine Aldolase der Klasse 2, die das Substrat ohne kovalente Bindung aktiviert) ist nur an drei eng verwandten Beispielen belegt (von der Osten et al., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 3924-27), über das mögliche weitere Einsatzspektrum und insbesondere über die Stereoselektivität ist jedoch nichts Näheres bekannt; auch hier waren die Ausbeuten zum Teil mangelhaft. Die Verwendung der L-Fuculose-1-phosphataldolase aus Escherichia coli ist an einem wenige ergiebigen Beispiel demonstriert (Ausbeute 42%, optische Reinheit ca. 90%), eventuelle weitere Einsatzmöglichkeiten jedoch nur anhand indirekter enzymatischer Assays mit wenigen Substratanaloga nahegelegt worden (A. Ozaki et al., J. Am. Chem. Soc. 112 (1990) 4970-71). Generell werden derartige Reaktionen bei neutralem pH (7.0) durchgeführt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein breit anwendbares enzymatisches Verfahren vorzuschlagen, mit dem alle vier möglichen Diastereomere unter milden Reaktionsbedingungen hoch diastereoselektiv und damit in hoher chemischer und optischer Reinheit hergestellt werden können.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß aus Aldehyden in Gegenwart von Dihydroxyacetonphosphat in wäßriger Lösung von schwach saurem pH durch bestimmte, bekannte Enzyme gezielt enantio- und diastereomerenreine, auf den eingesetzten Aldehyden basierende Ketose-1-phosphate bestimmter Konfiguration in besonders hoher chemischen Reinheit und besonders hohen präparativen Ausbeuten herstellbar sind. Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart eines Enzyms in wäßrigem Medium und nachfolgende Hydrolyse, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Aldehyden abzuleitende Ketose-1-phosphate aller vier absoluten Konfigurationen gezielt in Abhängigkeit der eingesetzten Enzyme-D- Fructose-1,6-diphosphataldolase ([EC 4.1.2.13]; D-threo=(3S, 4R)-Konfiguration), D-Tagatose-1,6-diphosphataldolase (noch nicht klassifiziert; L-erythro-=(3S, 4S)- Konfiguration), L-Fuculose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.17]; D-erythro-=(3R, 4R)-Konfiguration) bzw. L-Rhamnulose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.19]; L-threo= (3R, 4S)-Konfiguration) - erhalten werden.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die jeweiligen Ketose-1- phosphate in wäßrigem Milieu bei einem derartigen pH-Wert hergestellt, daß ausreichende Stabilität insbesondere der zweiten Reaktionskomponente Dihydroxyacetonphosphat und hohe enzymatisch katalysierte Reaktionsgeschwindigkeit unter Erhalt der typischen Diastereoselektivität garantiert werden.
Geeignete Verfahren zur Herstellung auch größerer Mengen an Dihydroxyacetonphosphat sind bekannt (F. Effenberger und A. Straub, Tetrahedron Lett. 28 (1987) 1641-44; R. L. Pederson et al., Tetrahedron 47 (1991) 2643-48).
Die aus Escherichia coli (z. B. Wildtyp K-12 oder Varianten Crooke's Strain (ATCC 8739), Strain B (ATCC 11 303) bzw. Strain O111-B4; Bezugsquellen: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, oder American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20 852-1776, USA oder International Enterobacteriaceae Center, Kopenhagen, Dänemark) stammenden Enzyme, ihre Diastereopräferenz und Verfahren zu ihrer Isolierung sind u. a. aus den folgenden Arbeiten bekannt:
Fructose-1,6-diphosphataldolase: S. A. Baldwin et al., Biochem. J. 169 (1978) 633-641; Tagatose-1,6-diphosphataldolase: J. Lengeler, Mol. Gen. Genet. 152 (1977) 83-91; Fuculose-1-phosphataldolase: M. A. Ghalambor und E. C. Heath, J. Biol. Chem. 237 (1962) 2427-33; Rhamnulose-1-phosphataldolase: T.-H. Chiu und D. S. Feingold, Biochemistry 8 (1969) 98-108;
jedoch ist ihre Brauchbarkeit für eine breit variierbare Gewinnung diastereomerenreiner Ketosen und deren Derivate nicht dokumentiert.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die strukturell und mechanistisch im Vergleich zur Kaninchenmuskelaldolase andersartigen Aldolasen der Klasse 2 eine Vielzahl unterschiedlicher Aldehyde in vergleichbarem Maß als alternative Substrate umsetzen. Ebenso überraschend war der Befund, daß die Aktivität aller vier beschriebenen Aldolasen im Hinblick auf die Synthese von Ketose-1-phosphaten bei schwach saurem pH-Wert (6.0 bis 6.9) zwar etwas vermindert, aber für präparative Zwecke noch ausreichend ist und daß die jeweils charakteristische Diastereoselektivität unter diesen Bedingungen voll erhalten bleibt. Der optimale pH-Bereich wird mit von der Stabilität der aldehydischen Substrate bestimmt, liegt aber vorzugsweise bei pH 6.4 bis 6.7.
Das wäßrige Milieu kann dabei gegebenenfalls zur Verbesserung der Löslichkeit lipophiler Aldehyde bis maximal 50 Vol-% organisches Cosolvens wie niedere aliphatische Alkohole (Methanol, Ethanol, n- oder i-Propanol), Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Acetonitril enthalten. Da die Enzymaktivität jedoch durch die Anwesenheit organischer Lösungsmittel vermindert wird, sollte vorzugsweise ohne (0%), falls erforderlich aber bis maximal 30 Vol-% Cosolvens gearbeitet werden.
Die Stabilität der Enzyme in wäßriger Lösung kann gegebenenfalls durch Zusatz geringer Mengen (Konzentrationen bis zu 1 mM) an Schwermetallsalzen wie Zn2+, Co2+, Ni2+ oder Mn2+-Acetat oder -Formiat erhöht werden. Höhere Konzentrationen können zur Fällung von Phosphaten führen. Andere Anionen (z. B. Chlorid, Bromid, Sulfat) sind zwar ebenfalls mit der Enzymaktivität verträglich, können aber zur Verunreinigung der Produkte führen. Vorzugsweise wird Zink- oder Kobaltacetat in einer Konzentration von 0.4 bis 0,5 mM verwendet. Eine meßbare Aktivitätssteigerung wird auch durch Zusatz von Alkalimetallionen, vorzugsweise K⁺ (z. B. als KOAc) erreicht. Um der Enzyminaktivierung durch Oxidation vorzubeugen, wird vorteilhaft unter Inertgasatmosphäre (Stickstoff, Argon), in entgastem Lösungsmittel (Wasser, Cosolvens) und/oder unter Zusatz von Thiolen (z. B. Mercaptoethanol, Cystein, Glutathion; 0.5 bis 10 mM) gearbeitet. Der Einsatz löslicher Enzyme erleichtert die Dosierung und Bestimmung der Restaktivitäten, jedoch kann eine Immobilisierung an feste Träger, z. B. an Eupergit® C, die Stabilität der vier obengenannten Enzyme ebenfalls vorteilhaft erhöhen.
Die Reaktionstemperatur kann zwischen -5°C und 40°C variiert werden, zur Wahrung hoher Umsatzgeschwindigkeit bei hinreichender Enzym- und Substratstabilität wird im allgemeinen bei 25°C bis 30°C gearbeitet.
In Kauf genommen wird bei der erfindungsgemäßen Reaktion, daß sich die enzymatische Aktivität und die Haltbarkeit der Enzyme mit abnehmendem pH- Wert vermindern, jedoch sind die vier obengenannten Enzyme aus natürlich vorkommend induzierbaren oder konstitutiven Bakterien-Stämmen, insbesondere aber aus molekularbiologisch erzeugten Überexperimenten gut zugänglich (u. a. P. R. Alefounder et al., Biochem. J. 257 (1989) 529-534; E. C. C. Lin et al., J. Bacteriol. 171 (1989) 6097-6105; J. Badia et al., FEMS Microbiol. Lett. 65 (1989) 253-58), so daß der Einsatz erhöhter Mengen und eine Nachdosierung problemlos sind.
Gemäß der Erfindung können als Substrate alle substituierten oder unsubstituierten aliphatischen (Typ A oder B), heteroaromatischen (Typ C) und heterocyclischen (Typ D) Aldehyde, die Substrate für die Aldolasen sind, in deren Gegenwart mit Dihydroxyacetonphosphat zu diastereomerenreinen Ketose-1- phosphaten gezielt wählbarer absoluter Konfiguration umgesetzt werden. Ein besonderes Interesse gilt (teil)hydroxylierten aliphatischen Aldehyden im Hinblick auf die Verwendung der Ketoseprodukte bzw. ihrer Derivate im pharmazeutischen Bereich. Beispiele sind für den Typ A bzw. B zum Beispiel Acet-, Propion-, n- oder i-Butyraldehyd, Hydrozimt-, Hydratrop- oder Phenylacetaldehyd, Glykol-, 3-Hydroxypropion-, 3-Hydroxy-2-methylpropion-, 3- bzw. 4-Hydroxybutyr-, 3-Oxobutyr- oder 3,3-Diethoxypropionaldehyd, Glyoxylsäure oder Bernsteinsäuresemialdehyd, sowie Thioacet-, Chloracet-, Bromacet-, Acetylaminoacet-, Dimethylaminoacet- bzw. -propion- oder -butyraldehyd, enantiomerenreine Glycerin-, Lact- oder Weinsäuresemialdehyde, C₄- bis C₆-Monosaccharide und speziell deren 2-Desoxyderivate wie 2-Desoxytetrose, -ribose, -glucose oder -galactose; für den Typ C Pyridin-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Pyrazol-, Imidazol- oder Pyrrolcarbaldehyd; für den Typ D Tetrahydrofurfural, Thiazolidin- oder Oxazolidincarbaldehyd, sowie Aceton- oder Formaldehydacetale des Glycerin- oder Dihydroxybutyraldehyds.
Die Produkte können vorteilhaft durch Fällung als Bariumsalze, Absorption an Anionenaustauschern und/oder Kristallisation als Cyclohexylammonium-, Di(cyclohexyl)ammonium- oder Lithiumsalz isoliert werden. Durch bekannte Verfahren zur Hydrolyse der Phosphatester werden die freien Ketosen bzw. -derivate erhalten. Vorzugsweise findet dabei die enzymatische Hydrolyse durch saure oder alkalische Phosphatase im pH-Bereich von 5 bis 7 bzw. 8 bis 9 und bei Temperaturen zwischen 25 bis 30°C Verwendung, da chemische Hydrolyse drastischere Bedingungen (niedrigeren oder höheren pH, höhere Temperaturen) erfordert, was zu teilweiser Zersetzung oder Isomerisierung der Produkte führt.
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃, Phenyl, Halogen, OH, OR⁷, OR⁸, SH, SR⁷, NH₂, NHR⁷, NHR⁸, NR⁷₂, N₃, =O, =NH, =NR⁷, CH₂OH, CH₂OR⁷, CH₂OR⁸, CHO, COCH₃, COOH, COOR⁷, CONH₂
R⁷=CH₃, CH₂CH₃, Benzyl
R⁸=COCH₃
k, l, m, n unabhängig voneinander=0,1 oder 2
R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃
k=0, 1, 2 oder 3
a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N oder CH
f=NH, O, S oder CH₂
a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N, O, S oder CH₂
R¹=H oder CH₃
R²=H, CH₃, CH₂OH, CHO, CH₂O-Alkyl, COOH, COO-Alkyl
Nachfolgende Beispiele sollen die verschiedenen Aspekte der Erfindung näher verständlich machen.
Beispiel 1
Eine wäßrige Lösung von Dihydroxyacetonphosphorsäure (4 mmol in 40 ml) wurde mit Kalilauge auf pH 6.5 eingestellt und mit einer Lösung von L-Glycerinaldehyd (5 mmol in 60 ml) vereinigt. Nach Zugabe von 11 mg Zinkacetat (0.5 mM) und 50 mg Kaliumacetat (5 mM) wurde im Vakuum entgast. Danach wurden 35 µl Mercaptoethanol (5 mM) und 200 µl einer wäßrigen Lösung von Fuculose-1-phosphataldolase (ca. 20 U) zugegeben und unter Stickstoffatmosphäre auf 25°C temperiert. Die Reaktion wurde mittels enzymatischem Assay auf Dihydroxyacetonphosphat (H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3. Auflage; Academic Press, New York 1984; Band 6, S. 342) verfolgt. Nach 20 h war alles Dihydroxyacetonphosphat verbraucht und im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel; Isopropanol/Ammoniak/Wasser 6 : 4 : 2) war ein neuer Fleck entstanden. Das Produkt wurde an einer Säule mit Dowex 1-X8 (Hydrogencarbonat- Form, 20 ml) gebunden und durch Elution mit Triethylammonium- Hydrogencarbonat-Puffer (200 mM) isoliert. Nach Ionenaustausch (Dowex 50W- X8, H⁺) wurde mit Cyclohexylamin neutralisiert und aus 95% Ethanol als Bis(cyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 1.58 g (86% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%97% (bestimmt durch ¹H- NMR bei 400 MHz).
Zur Esterhydrolyse wurde die saure Produktlösung (nach Ionenaustausch, vor der Neutralisation) auf 150 ml verdünnt und auf pH 6.0 eingestellt. Nach Zugabe von saurer Phosphatase (5 mg, ca. 250 U) wurde bei 25°C stehen gelassen und die Reaktion dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 48 h war die Reaktion beendet, die Lösung wurde entsalzt (Dowex W50-X8/H⁺ und 1-X8/OH-) und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Anschließend wurde der Rückstand, bestehend aus L-Tagatose, aus Ethanol kristallisiert. Chemische Ausbeute: 570 mg (92% d. Th.).
Beispiel 2
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit Bernsteinsäuresemialdehyd (2 Äquivv.) in Gegenwart von Fuculose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 24 h beendet. Das Produkt wurde durch Elution mit Ameisensäure/Formiat-Puffer (1.5 M, pH 2) isoliert und als Tris(Lithium)- Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 233 mg (80% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 2,3-Didesoxy-D-erythro-6-heptulosonsäure: 146 mg (95% d. Th.).
Beispiel 3
Entsprechend Beispiel 1, aber bei pH 6.0, wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit Pyridin-2-carbaldehyd (1.5 Äquivv.) in Gegenwart von Fuculose-1- phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 18 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(dicyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 386 mg (84% d. Th.). Enantio- bzw. Diasteroemereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 4-(2-Pyridyl)-4-desoxy-L-erythro-tetrulose: 146 mg (88% d. Th.).
Beispiel 4
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit Glykolaldehyd 1.2 Äquivv.) in Gegenwart von Tagatose-1,6-diphosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 12 h beendet. Das Produkt wurde durch Elution mit Triethylammonium-Hydrogencarbonat-Puffer (200 mM) isoliert und als Bis(cyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 368 mg (86% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an L-erythro-pentulose (L-Ribulose): 118 mg (19% d. Th.).
Beispiel 5
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (5 mmol) mit L- Lactaldehyd in Gegenwart von Rhamnulose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 7 h beendet. Zur Isolierung des Produkts wurde die Reaktionsmischung direkt mit Dowex 50W-X8/H⁺ (15 mL) angesäuert, mit Cyclohexylamin neutralisiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde aus 95% Ethanol zum Bis(cyclohexylammonium)- Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 2215 mg (95% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 6-Desoxy-L-arabino-hexulose (L-Rhamnulose): 725 g (93% d. Th.).
Beispiel 6
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit iso- Butyraldehyd in Gegenwart von Rhamnulose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 20 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(cyclohexylammonium)- Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 532 mg (88% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 5,6-Didesoxy-5-methyl-L-threo-hexulose: 117 mg (91% d. Th.).
Beispiel 7
Eine wäßrige Lösung von Dihydroxyacetonphosphorsäure (1 mmol in 30 ml) wurde mit Kalilauge auf pH 6.5 eingestellt, 9 mg Zinkacetat (0,5 mM) und eine Lösung von Hydrozimtaldehyd (1.5 Äquivv.) in 5 ml Dimethylformamid dazugegeben. Nach Zugabe von 100 µl einer wäßrigen Lösung von Fructose-1,6-diphosphataldolase (ca. 10 U) wurde bei 25°C stehen gelassen. Die Reaktion war nach 9 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(dicyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 620 mg (93% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 5,6-Didesoxy-6-phenyl-D-threo-hexulose: 200 mg (96% d. Th.).
Beispiel 8
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (5 mmol) mit D- Glycerindehyd umgesetzt, wobei mit an Eupergit® C immobilisierter Rhamnulose-1-phosphataldolase (1.0 g, ca. 20 U) unter mechanischem Rühren der Reaktionslösung gearbeitet wurde. Die Reaktion war nach 24 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(cyclohexalammonium)-Salz isoliert. Chemische Ausbeute: 1925 mg (84% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an L-Fructose: 735 mg (97% d. Th.).
Beispiel 9
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit 3,3- Diethoxypropionaldehyd bei pH 6.8 und 20°C in Gegenwart von Fuculose-1- phosphataldose umgesetzt. Die Reaktion war nach 16 h beendet. Zur Isolierung des Produkts wurde die Reaktionslösung mit 380 mg (1.5 mmol) Bariumacetat versetzt und die geringe Menge eines flockigen Niederschlags durch Filtration durch Celite entfernt. Die Lösung wurde auf 4°C gekühlt, der pH auf 8.0 eingestellt und 50 ml Ethanol zugegeben. Das bei 4°C als Bariumsalz ausfallende Produkt wurde durch Zentrifugieren isoliert und mit Ethanol, dann Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Chemische Ausbeute: 308 mg (68% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Nach Überführen des Produkts in das Natriumsalz durch Rühren einer wäßrigen Suspension mit Dowex 50W-X8/Na⁺ und Filtrieren vom Austauscherharz wurde mit Natronlauge der pH auf 8.5 eingestellt. Nach Zugabe von alkalischer Phosphatase (ca. 100 U) wurde bei 20°C stehen gelassen und die Reaktion dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 36 h war die Reaktion beendet, die Lösung wurde entsalzt (Dowex 50W-X8/H⁺ und 1-X8/OH-) und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Chemische Ausbeute an 2-Desoxy-D- erythro-hexos-5-ulose-1,1-diethylacetal: 140 mg (87% d. Th.).
Beispiel 10
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit 3- Hydroxypropionaldehyd (1.5 Äquivv.) bei pH 6.8 in Gegenwart von Rhamnulose- 1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 15 h beendet. Die Isolierung des Produkts erfolgte als Bis(cyclohexylammonium)-Salz. Chemische Ausbeute: 411 mg (93% d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomereneinheit: »99%/97%.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 5-Desoxy-L-threo-hexulose (5-Desoxy-L-fructose): 145 mg (95% d. Th.).

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart eines Enzyms in wäßrigem Medium und nachfolgende Hydrolyse, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Aldehyden abzuleitende Ketose-1-phosphate aller vier absoluten Konfigurationen gezielt in Abhängigkeit der eingesetzten Enzyme - Fructose-1,6-diphosphataldolase ([EC 4.1.2.13]; D-threo-=(3S, 4R)-Konfiguration), Tagatose-1,6-diphosphataldolase (nicht klassifiziert; L-erythro-=(3S, 4S)-Konfiguration), Fuculose- 1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.17]; D-erythro-=(3R, 4R)-Konfiguration) bzw. Rhamnulose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.19]; L-threo-=(3R, 4S)- Konfiguration) - erhalten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aliphatische, heterocyclische oder heteroaromatische Aldehyde einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Aldehyd der allgemeinen Formel vom Typ A, B, C oder D einsetzt R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃, Phenyl, Halogen, OH, OR⁷, OR⁸, SH, SR⁷, NH₂, NHR⁷, NHR⁸, NR⁷₂, N₃, =O, =NH, =NR⁷, CH₂OH, CH₂OR⁷, CH₂OR⁸, CHO, COCH₃, COOH, COOR⁷, CONH₂
R⁷=CH₃, CH₂CH₃, Benzyl
R⁸=COCH₃
k, l, m, u unabhängig voneinander=0, 1 oder 2 R¹, R², R³, R⁴, R⁵ unabhängig voneinander=H, CH₃, CH₂CH₃
k=0, 1, 2 oder 3 a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N oder CH
f=NH, O, S oder CH₂ a, b, c, d, e unabhängig voneinander=N, O, S oder CH₂
R¹=H oder CH₃
R²=H, CH₃, CH₂OH, CHO, CH₂O-Alkyl, COOH, COO-Alkyl
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als aliphatischen Aldehyd Acet-, Propion-, n- oder i-Butyraldehyd, Hydrozimt-, Hydratrop-, Phenylacetaldehyd, Glykol-, 3-Hydroxypropion-, 3-Hydroxy- 2-methylpropion-, 3- bzw. 4-Hydroxybutyr-, 3-Oxobutyr- und 3,3-Diethoxypropionaldehyd, Glyoxylsäure oder Bernsteinsäuresemialdehyd, sowie Thioacet-, Chloracet-, Bromacet-, Acetylaminoacet-, Dimethylaminoacet- bzw. -propion- oder -butyraldehyd, enantiomerenreine Glycerin-, Lact- oder Weinsäuresemialdehyde, C₄- bis C₆-Monosaccharide und speziell deren 2-Desoxyderivate (2-Deoxytetrose, -ribose, -glucose und -galactose) einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als heterocyclischen Aldehyd Tetrahydrofurfural, Thiazolidin-, Oxazolidincarbaldehyd, Aceton- oder Formaldehydacetale des Glycerin- oder Dihydroxybutyraldehyds einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als heteroaromatischen Aldehyd Pyridin-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Pyrazol-, Imidazol- oder Pyrrolcarbaldehyd einsetzt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß man Aldolasen der Klasse 2 aus mikrobiellen Quellen verwendet.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei pH 6.0 bis 6.9 durchführt.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reaktionstemperatur von -5° bis +40°C wählt.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß man bis zu 50% organisches Cosolvens zusetzt.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß man als stabilisierende Zusätze Schwermetallsalze, Alkalimetallsalze oder Thiolreagenzien einsetzt.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzyme in immobilisierter Form einsetzt.
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