WO1992018640A1 - Enzymatisches verfahren zur herstellung enantio- und diastereomerenreiner ketosen und deren 1-orthophosphatester - Google Patents

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WO1992018640A1 PCT/EP1992/000781 EP9200781W WO9218640A1 WO 1992018640 A1 WO1992018640 A1 WO 1992018640A1 EP 9200781 W EP9200781 W EP 9200781W WO 9218640 A1 WO9218640 A1 WO 9218640A1
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Wolf-Dieter Fessner
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C12P7/60—2-Ketogulonic acid

Definitions

  • Diastereomerically pure ketoses and their 1-orthophosphate esters The invention describes a general process for the preparation of enantio- and diastereomerically pure ketoses by enzymatic reaction of aldehydes with dihydroxyacetone phosphate in the presence of optionally four different aldolases. These products and their derivatives are of interest as low-calorie sweeteners, as components or precursors of active pharmaceutical ingredients such as antibiotics or
  • Dihydroxyacetone phosphate or D-fructose-l, 6-diphosphate and triose phosphate isomerase is brought to reaction at pH 7.
  • the disadvantages of this process are the limitation to a single form of diastereomeric product, namely the one with the absolute D-threo (3S, 4R) configuration, and the instability of the reaction component dihydroxyacetone phosphate at neutral or alkaline pH.
  • the latter has a significantly higher stability in an acidic environment (inter alia J.P. Richard, J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 4926-36).
  • Rabbit muscle aldolase (a class 1 aldolase that requires covalent binding for substrate activation) can convert a wide range of aldehydes.
  • the diastereoselectivity of the addition has only been secured for a few examples; the purity and chemical yields of the products, as well as the stability of the enzyme among the However, reaction conditions show some shortcomings.
  • a D-tagatose-1,6-diphosphataldolase (class 1) isolated from staphylococci has also been described as stereochemically completely unselective (DL Bissett and RL
  • the object of the invention is therefore to propose a broadly applicable enzymatic process with which all four possible diastereomers can be prepared under mild reaction conditions in a highly diastereoselective manner and thus with high chemical and optical purity.
  • the invention relates to a process for the preparation of enantio- and diastereomerically pure ketoses by reacting aldehydes with dihydroxyacetone phosphate in the presence of an enzyme in an aqueous medium and subsequent hydrolysis, characterized in that the one to be derived from the aldehydes
  • the respective ketose-1-phosphates are prepared in an aqueous medium at a pH such that sufficient stability, in particular of the second reaction component dihydroxyacetone phosphate, and high enzymatically catalyzed reaction rate are guaranteed while maintaining the typical diastereoselectivity.
  • Fructose-1,6-diphosphate aldolase S. a. Baldwin et al.
  • Fuculose-1-phosphataldolase M.A. Ghalambor and E.C. Heath, J. Biol. Chem. 237 (1962) 2427-33;
  • the optimal pH range is determined by the stability of the aldehyde substrates, but is preferably pH 6.4 to 6.7.
  • the aqueous medium can optionally improve the solubility of lipophilic aldehydes up to a maximum of 50 vol.% Organic cosolvent such as lower aliphatic alcohols
  • the stability of the enzymes in aqueous solution can optionally be increased by adding small amounts (concentrations up to 1 mM) of heavy metal salts such as Zn 2+ , Co 2+ , Ni 2+ or Mn 2+ acetate or formate. Higher concentrations can lead to the precipitation of phosphates.
  • Other anions e.g. chloride, bromide, sulfate
  • Zinc or cobalt acetate is preferably used in a concentration of 0.4 to 0.5 mM.
  • a measurable increase in activity is also achieved by adding alkali metal ions, preferably K + (e.g. as KOAc).
  • an inert gas atmosphere nitrogen, argon
  • degassed solvent water, cosolvent
  • thiols e.g. mercaptoethanol, cysteine
  • Glutathione 0.5 to 10 mM worked.
  • the use of soluble enzymes facilitates the dosing and determination of the residual activities.
  • immobilization on solid supports e.g. B. an.Eupergit R C, also advantageously increase the stability of the four above-mentioned enzymes.
  • the reaction temperature can be between - 5 ° C and 40 ° C
  • all substituted or unsubstituted aliphatic (type A or B), heteroaromatic (type C) and hetero ⁇ yclic (type D) aldehydes which are substrates for the aldolases, can be diastereomerically pure in their presence with dihydroxyacetone phosphate
  • Ketose-1-phosphates selectable absolute configuration can be implemented.
  • Of particular interest is (partially) hydroxylated aliphatic aldehydes with regard to the use of the ketose products or their derivatives in the pharmaceutical field.
  • types A and B are, for example, acet-, propion-, n- or i-butyraldehyde, hydrocinnamon, hydratrop, or phenylacetaldehyde, glycol,
  • C 6 monosaccharides and especially their 2-deoxy derivatives such as 2-deoxytetrose, -ribose, -glucose or galactose; for type C pyridine, pyrazine, pyrazole, imidazole or pyrrole carbaldehyde; for type D tetrahydrofuran, thiazolidine or oxazolidine carbaldehyde, as well as acetone or formaldehyde acetals of glycerol or dihydroxybutyraldehyde.
  • 2-deoxy derivatives such as 2-deoxytetrose, -ribose, -glucose or galactose
  • type C pyridine pyrazine, pyrazole, imidazole or pyrrole carbaldehyde
  • type D tetrahydrofuran thiazolidine or oxazolidine carbaldehyde
  • the products can advantageously be isolated by precipitation as barium salts, absorption on anion exchangers and / or crystallization as cyclohexalammonium, (di (cyclohexyl) ammonium or lithium salts.
  • the free ketoses or derivatives are obtained by known processes for the hydrolysis of the phosphate esters enzymatic hydrolysis by acidic or alkaline phosphatase is used in the pH range from 5 to 7 or 8 to 9 and at temperatures between 25 and 30 ° C, since chemical hydrolysis requires more drastic conditions (lower or higher pH, higher temperatures), which leads to partial decomposition or isomerization of the products.
  • R 7 CH 3 , CH 2 CH 3 , benzyl
  • R 8 COCH 3
  • R 1 H or CH 3
  • R 2 H, CH 3 , CH 2 OH, CHO, CH 2 O alkyl, COOH,
  • the acidic product solution (after ion exchange, before neutralization) was diluted to 150 ml and adjusted to pH 6.0. After addition of acid phosphatase (5 mg, approx. 250 U), the mixture was left to stand at 25 ° C. and the reaction was monitored by thin layer chromatography. After 48 hours the reaction was complete, the solution was desalted (Dowex W50-X8 / H + and 1-X8 / OH-) and the solvent was removed on a rotary evaporator. Then the residue
  • Triethylammonium bicarbonate buffer 200 mM isolated and crystallized as bis (cyclohexalammoium) salt. Chemical yield: 368 mg (86% of theory). Enantio- or diastereomeric purity: »99% / ⁇ 97%.
  • reaction mixture is acidified directly with Dowex 50W-X8 / H + (15 mL), neutralized with cyclohexalamine and the solvent is removed on a rotary evaporator in vacuo.
  • Residue was crystallized from 95% ethanol to the bis (cyclohexylammonium) salt. Chemical yield: 2215 mg (95% of theory
  • Diastereomeric purity »99% / ⁇ 97%.
  • Eupergit R immobilized rhamnulose-1-phosphataldolase (1.0 g, approx. 20 U) was carried out with mechanical stirring of the reaction solution. The reaction was complete after 24 hours. The product was isolated as the bis (cyclohexylammonium) salt. Chemical yield: 1925 mg (84% of theory). Enantio- or
  • Diastereomeric purity »99% / ⁇ 97%.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart eines Enzyms in wässrigem Milieu und nachfolgende Hydrolyse, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Aldehyden abzuleitende Ketose-1-phosphate aller vier absoluten Konfigurationen gezielt in Abhängigkeit der eingesetzten Enzyme - Fructose-1,6-diphosphataldolase ([EC 4.1.2.13]; D-threo- = (3S, 4R)-Konfiguration), Tagatose-1,6-diphosphataldolase (noch nicht klassifiziert; L-erythro- = (3S, 4S)-Konfiguration), Fuculose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.17]; D-erythro- = (3R, 4R)-Konfiguration) bzw. Rhamnulose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.19]; L-threo- = (3R, 4S)-Konfiguration) - erhalten werden.

Description

Enzymatisches Verfahren zur Herstellung enantio- und
diastereomerenreiner Ketosen und deren 1-Orthophosphatester Die Erfindung beschreibt ein generelles Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch enzymatische Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart von wahlweise vier verschiedenen Aldolasen. Diese Produkte und ihre Derivate interessieren als niederkalorige Süßstoffe, als Kompoenenten oder Vorstufen pharmazeutischer Wirkstoffe wie Antibiotika oder
Glykosidase-Inhibitoren.
Aus der PCT/US82/00534 (WO 83/03846) ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von 6-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-L-sorbose bekannt, bei dem D- und/oder L-Lactaldehyd in
Gegenwart kommerzieller Kaninchenmuskelaldolase mit
Dihydroxyacetonphosphat oder D-Fructose-l,6-diphosphat und Triosephosphatisomerase bei pH 7 zur Reaktion gebracht wird. Die Nachteile dieses Verfahrens sind die Beschränkung auf eine einzige Form diastereomeren Produkts, nämlich derjenigen mit der absoluten D-threo-(3S,4R)-Konfiguration, und der Instabilität der Reaktionskomponente Dihydroxyacetonphosphat bei neutralem oder alkalischem pH. Letztere weist jedoch eine signifikant höhere Stabilität in saurem Milieu auf (u. a. J. P. Richard, J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 4926-36).
Aus mehreren Quellen ist bekannt (u. a. G. M. Whitesides et al., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 627-35), daß dieselbe
Kaninchenmuskelaldolase (eine Aldolase der Klasse 1, die eine kovalente Bindung zur Substrataktivierung erfordert) ein breites Spektrum von Aldehyden umsetzen kann. Die Diastereoselektivität der Addition ist jedoch nur für wenige Beispiele gesichert worden; die Reinheit und chemischen Ausbeuten der Produkte, sowie die Stabilität des Enzyms unter den Reaktionsbedingungen zeigen allerdings einige Mängel. Eine aus Staphylokokken isolierte D-Tagatose-1,6-diphosphataldolase (Klasse 1) ist darüber hinaus als stereochemisch völlig unselektiv beschrieben worden (D. L. Bissett und R. L.
Anderson, J. Biol. Chem. 255 (1980) 8750-55). Die Verwendung der D-Fructose-1,6-diphosphataldolase aus Escherichia coli (eine Aldolase der Klasse 2, die das Substrat ohne kovalente Bindung aktiviert) ist nur an drei eng verwandten Beispielen belegt (von der Osten et al., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 3924-27), über das mögliche weitere Einsatzspektrum und insbesondere über die Stereoselektivität ist jedoch nichts
Näheres bekannt; auch hier waren die Ausbeuten zum Teil mangelhaft. Die Verwendung der L-Fuculose-1-phosphataldolase aus Escherichia coli ist an einem wenig ergiebigen Beispiel demonstriert (Ausbeute 42 %, optische Reinheit ca. 90 %), eventuelle weitere Einsatzmöglichkeiten jedoch nur anhand indirekter enzymatischer Assays mit wenigen Substratanaloga nahegelegt worden (A. Ozaki et al., J. Am. Chem. Soc. 112 (1990) 4970-71). Generell werden derartige Reaktionen bei neutralem pH (7.0) durchgeführt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein breit anwendbares enzymatisches Verfahren vorzuschlagen, mit dem alle vier möglichen Diastereomere unter milden Reaktionsbedingungen hoch diastereoselektiv und damit in hoher chemischer und optischer Reinheit hergestellt werden können.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß aus Aldehyden in Gegenwart von Dihydroxyacetonphosphat in wassriger Lösung vo schwach saurem pH durch bestimmte, bekannte Enzyme gezielt enantio- und diastereomerenreine, auf den eingesetzten Aldehyden basierende Ketose-1-phosphate bestimmter Konfiguration in besonders hoher chemischen Reinheit und besonders hohen präparativen Ausbeuten herstellbar sind. Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch Umsetzung von Aldehyden mit Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart eines Enzyms in wässrigem Medium und nachfolgende Hydrolyse, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Aldehyden abzuleitende
Ketose-1-phosphate aller vier absoluten Konfigurationen gezielt in Abhängigkeit der eingesetzten Enzyme-D-Fructose-1,6 diphosphataldolase ([EC 4.1.2.13]; D-threo = (3S, 4r)- Konfiguration), D-Tagatose-1,6-diphosphataldolase (noch nich klassifiziert; L-erythro- = (3S, 4S)-Konfiguration), L-Fuculose-1-phosphataldolase [EC 4.1.2.17]; D-erythro- =
(3R,4R)-Konfiguration) bzw. L-Rhamnulose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.19]; L-threo = (3R, 4S)-Konfiguration - erhalten werden.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die jeweiligen Ketose-1-phosphate in wässrigem Milieu bei einem derartigen pH-Wert hergestellt, daß ausreichende Stabilität insbesondere der zweiten Reaktionskomponente Dihydroxyacetonphosphat und hohe enzymatisch katalysierte Reaktionsgeschwindigkeit unter Erhalt der typischen Diastereoselektivität garantiert werden.
Geeignete Verfahren zur Herstellung auch größerer Mengen an Dihydroxyacetonphosphat sind bekannt (F. Effenberger und A. Straub, Tetrahdron Lett. 28 (1987) 1641-44; R. L. Pederson et al., Tetrahedron 47 (1991) 2643-49). Die aus Escherichia coli (z. B. Wildtyp K-12 (DSM 498) oder Varianten Crooke's Strain (DSM 1576;ATCC 8739), Strain B (DS 613;ATCC 11303) bzw. Strain 0111-B4 (ATCC 12015); Bezugsquellen: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig, oder American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rock ville, MD 20852-1776, USA oder International Entero- bacteriaceae Center, Kopenhagen, Dänemark) stammenden Enzyme, ihre Diastereopräferenz und Verfahren zu ihrer Isolierung sind u. a. aus den folgenden Arbeiten bekannt:
Fructose-1,6-diphosphataldolase: S. a. Baldwin et al.,
Biochem. J. 169 (1978) 633-641; Tagatose-1,6-diphosphataldolase: J. Lengeier, Mol. Gen. Genet. 152 (1977) 83-91;
Fuculose-1-phosphataldolase: M. A. Ghalambor und E. C. Heath, J. Biol. Chem. 237 (1962) 2427-33;
Rhamnulose-1-phosphataldolase: T.-H. Chiu und D. S. Feingold, Biochemistry 8(1969) 98-108; jedoch ist ihre Brauchbarkeit für eine breit variierte Gewinnung diastereomerenreiner
Ketosen und deren Derivate nicht dokumentiert.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die strukturell und mechanistisch im Vergleich zur Kaninchenmuskelaldolase andersartigen Aldolasen der Klasse 2 eine Vielzahl unterschiedlicher Aldehyde in vergleichbarem Maß als alternative Substrate umsetzen. Ebenso überraschend war der
Befund, daß die Aktivität aller vier beschriebenen Aldolasen im Hinblick auf die Synthese von Ketose-1-phophaten bei schwach saurem pH-Wert (6.0 bis 6.9) zwar etwas vermindert, aber für präparative Zwecke noch ausreichend ist und daß die jeweils charakteristische Diastereoselektivität unter diesen Bedingungen voll erhalten bleibt. Der optimale pH-Bereich wird mit von der Stabilität der aldehydischen Substrate bestimmt, liegt aber vorzugsweise bei pH 6.4 bis 6.7. Das wäßrige Milieu kann dabei gegebenenfalls zur Verbesserung der Löslichkeit lipophiler Aldehyde bis maximal 50 Vol.% organisches Cosolvens wie niedere aliphatische Alkohole
(Methanol, Ethanol, n- oder i-Propanol), Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Acetonitril enthalten. Da die Enzymaktivität jedoch durch die Anwesenheit organischer Lösungsmittel vermindert wird, sollte vorzugsweise ohne (0 %), falls erforderlich aber bis maximal 30 Vol.% Cosolvens gearbeitet werden.
Die Stabilität der Enzyme in wassriger Lösung kann gegebenenfalls durch Zusatz geringer Mengen (Konzentrationen bis zu 1 mM) an Schwermetallsalzen wie Zn2+, Co2+, Ni2+ oder Mn2+-Acetat oder -Formiat erhöht werden. Höhere Konzentrationen können zur Fällung von Phosphaten führen. Andere Anionen (z. B. Chlorid, Bromid, Sulfat) sind zwar ebenfalls mit der Enzymaktivität verträglich, können aber zur Verunreinigung der Produkte führen. Vorzugsweise wird Zink- oder Kobalt- acetat in einer Konzentration von 0.4 bis 0.5 mM verwendet. Eine meßbare Aktivitätssteigerung wird auch durch Zusatz von Alkalimetallionen, vorzugsweise K+ (z. B. als KOAc) erreicht. Um der Enzyminaktivierung durch Oxidation vorzubeugen, wird vorteilhaft unter Inertgasatmosphäre (Stickstoff, Argon), in entgastem Lösungsmittel (Wasser, Cosolvens) und/oder unter Zusatz von Thiolen (z. B. Mercaptoethanol, Cystein,
Glutathion; 0.5 bis 10 mM) gearbeitet. Der Einsatz löslicher Enzyme erleichtert die Dosierung und Bestimmung der Restaktivitäten, jedoch kann eine Immobilisierung an feste Träger, z. B. an.Eupergit R C, die Stabilität der vier obengenannten Enzyme ebenfalls vorteilhaft erhöhen.
Die Reaktionstemperatur kann zwischen - 5°C und 40 °C
variiert werden, zur Wahrung hoher Umsatzgeschwindigkeit bei hinreichender Enzym- und Substratstabilität wird im allgemeinen bei 25 °C bis 30 °C gearbeitet. In Kauf genommen wird bei der erfindungsgemäßen Reaktion, da sich die enzymatische Aktivität und die Haltbarkeit der
Enzyme mit abnehmendem pH-Wert vermindern, jedoch sind die vier obengenannten Enzyme aus natürlich vorkommend induzierbaren oder konstitutiven Bakterien-Stämmen, insbesondere abe aus molekularbiologisch erzeugten Überexperimenten gut zugänglich (u. a. P. R. Alefounder et al., Biochem. J. 257 (1989) 529-534; E. C. C. Lin et al., J. Bacteriol. 171 (1989) 6097-6105; J. Badia et al., FEMS Microbiol. Lett. 65 (1989) 253-58), so daß der Einsatz erhöhter Mengen und eine Nachdosierung problemlos sind.
Gemäß der Erfindung können als Substrate alle substituierten oder unsubstituierten aliphatischen (Typ A oder B), heteroaromatischen (Typ C) und heteroσyclischen (Typ D) Aldehyde, die Substrate für die Aldolasen sind, in deren Gegenwart mit Dihydroxyacetonphosphat zu diastereomerenreinen
Ketose-1-phosphaten gezielt wählbarer absoluter Konfiguration umgesetzt werden. Ein besonderes Interesse gilt (teil-) hydroxylierten aliphatischen Aldehyden im Hinblick auf die Verwendung der Ketoseprodukte bzw. ihrer Derivate im pharmazeutischen Bereich. Beispiele sind für den Typ A bzw. B zum Beispiel Acet-, Propion-, n- oder i-Butyraldehyd, Hydrozimt-, Hydratrop- , oder Phenylacetaldehyd, Glykol-,
3-Hydroxypropion-, 3-Hydroxy-2-methylpropion, 3- bzw. 4-Hydroxybutyr-, 3-Oxobutyr- oder 3,3-Diethoxypropionaldehyd, Glyoxylsäure oder Bernsteinsäuresemialdehyd, sowie Thioacet-, Chloracet-, Bromacet-, Acetylaminoacet-, Dimethylaminoacet- bzw. -propion oder -butyraldehyd, enantiomerenreine
Glycerin-, Lact- oder Weinsäuresemialdehyde, C4 - bis
C6-Monosaccharide und speziell deren 2-Desoxyderivate wie 2-Desoxytetrose, -ribose, -glucose oder -galactose; für den Typ C Pyridin-, Pyrazin-, Pyrazol-, Imidazol- oder Pyrrolcarbaldehyd; für den Typ D Tetrahydro- furfural, Thiazolidin- oder Oxazolidincarbaldehyd, sowie Aceton- oder Formaldehydacetale des Glycerin- oder Dihydroxy- butyraldehyds.
Die Produkte können vorteilhaft durch Fällung als Bariumsalze, Absorption an Anionenaustauschern und/oder Kristallisation als Cyclohexalammonium-, (Di(cyclohexyl)ammonium- oder Lithiumsalze isoliert werden. Durch bekannte Verfahren zur Hydrolyse der Phosphatester werden die freien Ketosen bzw. -derivate erhalten. Vorzugsweise findet dabei die enzymatische Hydrolyse durch saure oder alkalische Phosphatase im pH-Bereich von 5 bis 7 bzw. 8 bis 9 und bei Temperaturen zwischen 25 bis 30 °C Verwendung, da chemische Hydrolyse drastischere Bedingungen (niedrigeren oder höheren pH, höhere Temperaturen) erfordert, was zu teilweiser Zersetzung oder Isomerisierung der Produkte führt.
Figure imgf000010_0002
Typ A
R1, R2, R3, R4, R5 unabhängig voneinander = H, CH3, CH2CH3,
Phenyl, Halogen, OH, OR7, OR8, SH, SR7, NH2, NHR7, NHR8,
NR7 2 ' , N3. =O, =NH, =NR7,
CH2OH, CH2OR7, CH2OR8, CHO, COCH3 , COOH, COOR7, CONH2,
R7 = CH3, CH2 CH3 , Benzyl
R8 = COCH3
k, l, m, n unabhängig voneinander = 0, 1 oder 2
Figure imgf000010_0001
Typ B
R1, R2, R3, R4, R5 unabhängig voneinander = H, CH3, CH2 CH3 k = 0, 1, 2 oder 3
Figure imgf000011_0001
Typ C
a, b, c, d, e unabhängig voneinander = N oder CH
f = NH, O, S oder CH2
Figure imgf000011_0002
Typ D
a, b, c, d, e unabhängig voneinander = N, O, S oder CH2
R1 = H oder CH3 R2 = H, CH3 , CH2OH, CHO, CH2OAlkyl, COOH,
COOAlkyl
Nachfolgende Beispiele sollen die verschiedenen Aspekte der Erfindung näher erläutern. Beispiel 1
Eine wässrige Lösung von Dihydroxyacetonphosphorsaure (4 mmol in 40 ml) wurde mit Kalilauge auf pH 6.5 eingestellt und mit einer Lösung von L-Glycerinaldehyd (5 mmol in 60 ml) vereinigt. Nach Zugabe von 11 mg Zinkacetat (0.5 mM) und 50 mg Kaliumacetat (5 mM) wurde im Vakuum entgast. Danach wurden 35 μl Mercaptoethanol (5 mM) und 200 μl einer wässrigen
Lösung von Fuculose-1-phosphataldolase (ca. 20 U) zugegeben und unter Stickstoffatmosphäre auf 25 º C temperiert. Die Reaktion wurde mittels enzymatischem Assay auf Dihydroxyacetonphosphat (H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic
Analysis, 3. Auflage; Academic Press, New York, 1984; Band 6, S. 342) verfolgt, nach 20 h war alles Dihydroxyacetonphospha verbraucht und im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel; Isopropanol/Ammoniak/Wasser &:4:2) war ein neuer Fleck entstanden. Das Produkt wurde an einer Säule mit Sowex 1-X8
(Hydrogencarbonat-Form, 20 ml) gebunden und durch Elution mit Triethylammonium-Hydrogencarbot-Puffer (200 mM) isoliert.
Nach Ionenaustausch (Dowex 50W-X8, H+ ) wurde mit Cyclohexalamin neutralisiert und aus 95 % Ethanol als
Bis(cyclohexalammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 1.58 g (86 % d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomerenreinheit: » 99 %/≥ 97 % (bestimmt durch 1H-NMR bei 400
MHz).
Zur Esterhydrolyse wurde die saure Produktlösung (nach Ionenaustausch, vor der Neutralisation) auf 150 ml verdünnt und auf pH 6.0 eingestellt. Nach Zugabe von saurer Phosphatase (5 mg, ca. 250 U) wurde bei 25 ºC stehen gelassen und die Reaktion dunnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 48 h war die Reaktion beendet, die Lösung wurde entsalzt (Dowex W50-X8/H+ und 1-X8/OH-) und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Anschließend wurde der Rückstand,
bestehend aus L-Tagatose, aus Ethanol kristallisiert.
Chemische Ausbeute: 570 mg (92 % d. Th.). Beispiel 2
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat
(1 mmol) mit Bernsteinsäuresemialdehyd (2 Äquiw.) in Gegenwart von Fuculose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 24 h beendet. Das Produkt wurde durch Elution mit Ameisensäure/Formiat-Puffer (1.5 M, pH 2) isoliert und als Tris(Lithium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 233 mg (80 % d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomerenreinheit:
» 99 %/≥97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 2,3-Didesocy-D-erythro-6-heptulosonäsure: 146 mg (95 % d. Th.).
Beispiel 3
Entsprechend Beispiel 1, aber bei pH 6.0, wurde Dihydroxyacetonphosphat (1 mmol) mit Pyridin-2-carbaldehyd (1.5
Äquiw.) in Gegenwart von Fuculose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 18 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(dicyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 386 mg (84 % d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomerenreinheit: » 99 %/≥ 97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 4-(2-Pyridyl)-4-desoxy-L-erythro-tetrulose:
146 mg (88 % d. Th.). Beispiel 4
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat
(1 mmol) mit Glykolaldehyd (1.2 Äquiw.) in Gegenwart von Tagatose-1,6-diphosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 12 h beendet. Das Produkt wurde durch Elution mit
Triethylammonium-Hydrogencarbonat-Puffer (200 mM) isoliert und als Bis(cyclohexalammoium)-Salz kristallisiert. Chemisch Ausbeute: 368 mg (86 % d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomeren reinheit: » 99 %/≥97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemisch Ausbeute an L-erythro-pentulose (L-Ribulose): 118 mg (91 % d. Th.).
Beispiel 5
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat
(5 mmol) mit L-Laσtaldehyd in Gegenwart von
Rhamnulose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 7 h beendet. Zur Isolierung des Produkts wurde die
Reaktionsmischung direkt mit Dowex 50W-X8/H+ (15 mL) angesäuert, mit Cyclohexalamin neutralisiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abgezogen. Der
Rückstand wurde aus 95 % Ethanol zum Bis(cyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 2215 mg (95 % d.
Th.). Enantio- bzw. Diastereomerenreinheit: » 99 %/≥97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 6-Desoxy-L-arabino-hexulose (L-Rhamnulose):
725 mg (93 % d. Th.): Beispiel 6
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat
(1 mmol) mit iso-Butyraldehyd in Gegenwart von
Rhamnulose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 20 h beendet. Das Produkt wurde als
Bis(cyclohexylammonium)-Salz kristallisiert. Chemische Ausbeute: 532 mg (88 % d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomeren-reinheit: » 99 %/97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 5, 6-Didesoxy-5-methyl-L-Threo-hexulose: 117 mg (91 % d. Th.).
Beispiel 7
Eine wässrige Lösung von Dihydroxyacetonphosphorsaure (1 mmol in 30 ml) wurde mit Kalilauge auf pH 6.5 eingestellt, 9 mg Zinkacetat (0.5 mM) und eine Lösung von Hydrozimtaldehyd (1.5 Äquiw.) in 5 ml Dimethylformamid dazugegeben. Nach Zugabe von 100 μl einer wässrigen Lösung von Fruc- tose-l,6-diphosphataldolase (ca. 10 U) wurde bei 25 °C stehen gelassen. Die Reaktion war nach 9 h beendet. Das Produkt wurde als Bis(dicyclohexalammonium)-Salz kristallisiert.
Chemische Ausbeute: 620 mg (93 % d. Th.). Enantio- bzw.
Diastereomerenreinheit: » 99 %/≥ 97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 5,6-Didesocyx-6-phenyl-D-Threo-hexulose: 200 mg (96 % d. Th.). Beispiel 8
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonhphosphat
(5 mmol) mit D-Glycerindehyd umgesetzt, wobei mit an
Eupergit R immobilisierter Rhamnulose-1-phosphataldolase (1.0 g, ca. 20 U) unter mechanischem Rühren der Reaktionslösung gearbeitet wurde. Die Reaktion war nach 24 h beendet. Das Produkt wurde als Bis (cyclohexylammonium)-Salz isoliert. Chemische Ausbeute: 1925 mg (84 % d. Th.). Enantio- bzw.
Diastereomerenreinheit: » 99 %/≥ 97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemisch Ausbeute an L-Fructose: 735 mg (97 % d. Th.).
Beispiel 9
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat
(1 mmol) mit 3,3-Diethoxypropionaldehyd bei pH 6.8 und 20 ºC in Gegenwart von Fuculose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 16 h beendet. Zur Isolierung des Produkts wurde die Reaktionsmischung mit 380 mg (1.5 mmol) Barium-acetat versetzt und die geringe Menge eines flockigen Niederschlags durch Filtration durch Celite entfernt. Die Lösung wurde auf 4 ºC gekühlt, der pH auf 8.0 eingestellt und 50 ml Ethanol zugegeben. Das bei 4 ºC als Bariumsalz ausfallende Produkt wurde durch Zentrifugieren isoliert und mit Ethanol, dann Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Chemische Ausbeute: 308 mg (68 % d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomerenreinheit: » 99 %/≥97 %. Nach überführen des Produkts in das Natriumsalz durch Rühren einer wäßrigen Suspension mit Dowex 50W-X8/Na+ und Filtrieren von Austauscherharz wurde mit Natronlauge der pH auf 8.5 eingestellt. Nach Zugabe von alkalischer Phosphatase (ca. 100 U) wurde bei 20 °C stehen gelassen und die Reaktion dunnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 36 h war die Reaktion beendet, die Lösung wurde entsalzt (Dowex 50W-X8/H+ und 1-X8/OH-) und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Chemische Ausbeute an 2-Desoxy-D-erythro-hexos5-ulose-1,1-diethylacetal: 140 mg (87 % d. Th.).
Beispiel 10
Entsprechend Beispiel 1 wurde Dihydroxyacetonphosphat
(1 mmol) mit 3-Hydroxypropionaldehyd (1.5 Äquiw.) bei pH 6.8 in Gegenwart von Rhamnulose-1-phosphataldolase umgesetzt. Die Reaktion war nach 15 h beendet. Die Isolierung des Produkts erfolgte als Bis (cyclohexalammonium) -Salz. Chemische Ausbeute: 411 mg (93 % d. Th.). Enantio- bzw. Diastereomerenreinheit: » 99 %/≥97 %.
Die Hydrolyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Chemische Ausbeute an 5-Desoxy-L-threo-hexulose (5-Desoxy-L-fructose): 145 mg (95 % d. Th.).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung enantio- und diastereomerenreiner Ketosen durch Umsetzung von Aldehyden mit
Dihydroxyacetonphosphat in Gegenwart eines Enzyms in wässrigem Medium und nachfolgende Hydrolyse, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Aldehyden abzuleitende Ketose-1-phosphate aller vier absoluten Konfigurationen gezielt in Abhängigkeit der eingesetzten Enzyme - Fructose-1,6-diphosphataldolase ([EC 4.1.2.13]; D-threo = (3S, 4R)-Konfiguration),
Tagatose-1,6-diphosphataldolase (nicht klassifiziert; L-erythro- = (3S , 4s) -Konfiguration) , Fuculose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.17]; D-erythro- = (3R, 4R)-Konfiguration) bzw.
Rhamnulose-1-phosphataldolase ([EC 4.1.2.19]; L-threo- = (3R, 4S)-Konfiguration - erhalten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aliphatische, heterocyclische oder heteroaromatische Aldehyde einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aldehyd der allgemeinen Formel vom Typ A, B, C oder D einsetzt.
Figure imgf000019_0001
Typ A
R1 , R2 , R3 , R4 , R5 unabhängig voneinander = H, CH3 , CH2 CH3 ,
Phenyl, Halogen, OH, OR7, OR8, SH, SR7, NH2 , NHR7, NHR8 ,
NR7 2, , N3, =O, =NH, =NR7,
CH2OH, CH2OR7, CH2OR8, CHO, COCH3 , COOH, COOR7, CONH2 ,
R7 = CH3 , CH2 CH3 , Benzyl
R8 = COCH3
k, l, m, n unabhängig voneinander = 0, 1 oder 2
Figure imgf000019_0002
Typ B
R1, R2, R3, R4, R5 unabhängig voneinander = H, CH3, CH2 CH3 k = 0, 1, 2 oder 3
Figure imgf000020_0001
Typ C
a, b, c, d, e unabhängig voneinander = N oder CH
f = NH, O, S oder CH2
Figure imgf000020_0002
Typ D
a, b, c, d, e unabhängig voneinander = N, O, S oder CH2
R1 = H oder CH3R2 = H, CH3, CH2OH, CHO, CH2OAlkyl, COOH,
COOAlkyl
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als aliphatischen Aldehyd Acet-, Propion-, n- oder i-Butyraldehyd, Hydrozimt-, Hydratrop-, Phenylacet- aldehyd, Glykol-, 3 Hydroxypropion-,
3-Hydroxy-2-methylpropion-, 3- bzw. 4-Hydroxybutyr-, 3-Oxobutyr- und 3,3-Diethoxypropionaldehyd, Glyoxylsaure oder Bernsteinsäuresemialdehyd, sowie Thioacet-,
Chloracet-, Bromacet-, Acetylaminoacet-,
Dimethylaminoacet- bzw. -propion- oder -butyraldehyd, enantiomerenreine Glycerin-, Lact- oder Weinsäuresemialdehyde, C4 - bis C6-Monosaccharide und speziell deren 2-Deoxyderivate (2-Deoxytetrose, -ribose, -glucose und - galactose) einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als heterocyclischen Aldehyd Tetrahydrofurfural, Thiazolidin-, Oxazolidincarbaldehyd, Aceton- oder Formaldehydacetale des Glycerin- oder Dihydroxybutyraldehyds einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als heteroaromatischen Aldehyd Pyridin-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Pyrazol-, Imidazol- oder Pyrrolcarbaldehyd einsetzt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Aldolasen der Klasse 2 aus
mikrobiellen Quellen verwendet.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei pH 6.0 bis 6.9 durchführt.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reaktionstemperatur von - 5 °C bis + 40 ºC wählt.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
9, dadurch gekennzeichnet, daß man bis zu 50 %
organisches Cosolvens zusetzt.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
10, dadurch gekennzeichnet, daß man als stabilisierende Zusätze Schwermetallsalze, Alkalimetallsalze oder Thiolreagenzien einsetzt.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzyme in immobilisierter Form einsetzt.
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