CN102759626A - 5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法 - Google Patents

5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102759626A
CN102759626A CN2011101076305A CN201110107630A CN102759626A CN 102759626 A CN102759626 A CN 102759626A CN 2011101076305 A CN2011101076305 A CN 2011101076305A CN 201110107630 A CN201110107630 A CN 201110107630A CN 102759626 A CN102759626 A CN 102759626A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouse
5hmc
mice embryonic
hydroxymethyl cytosine
arrhenokaryon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011101076305A
Other languages
English (en)
Inventor
陈蘋
贾微
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to CN2011101076305A priority Critical patent/CN102759626A/zh
Publication of CN102759626A publication Critical patent/CN102759626A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种5-羟甲基胞嘧啶的应用以及在小鼠胚胎中分布的检测方法。检测方法包括以下步骤：(a)小鼠自然受精或体外受精，提取小鼠胚胎；(b)小鼠胚胎的染色；(c)显微镜观察染色或进行定量分析。采用本发明的检测方法，分析了5hmc在小鼠着床前胚胎的分布情况，证实了5mc和5hmc在小鼠着床前胚胎的发育阶段在父源与母源染色体中的动态变化情况，揭示5hmc在此期间对表观遗传重编过程所起的重要作用，为DNA去甲基化的机制的研究开辟了新的前景，且5-羟甲基胞嘧啶能够用作雄核标记物或雌核标记物。

Description

5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种5-羟甲基胞嘧啶的应用以及在小鼠胚胎中分布的检测方法。
背景技术
5-胞嘧啶的甲基化是表观遗传密码的重要组成部分。细胞分化、X染色体失活、重组和恶性转化是表观遗传发生显著变化的主要事件，其中包括DNA甲基化模式的重塑。尽管在体细胞中DNA甲基化具有相对稳定和可遗传的特性，基因组范围的DNA去甲基化在发展的原始生殖细胞和受精的卵(合子)中均发生。在合子中，父源与母源基因组的显著的非对称性的DNA的去甲基化似乎发生在相同的卵母细胞胞浆中，此过程在受精后6小时即开始，此时父源基因组经历活跃的DNA去甲基化而母源基因组并未明显的去甲基化现象。
一系列的证据表明，5mc转化为胞嘧啶可能是经由去氨基作用诱导，紧随DNA糖基化酶诱导的碱基切除修复作用。此外，除了DNA修复过程，5mc的去甲基化的另一可能机制是甲基集团通过氧化作用，再经过一系列连续的二级反映最终导致胞嘧啶的重生成。
近来，Kriaucionis and Heintz and Tahiliani et al.(Kriaucionis S，Heintz N(2009)The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons andthe brain.Science 324：929-930)发现在小鼠的Purkinje和颗粒神经细胞以及胚胎干细胞中存有丰富的5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)，5hmc之前一直被认为只是一个罕见的DNA受损后的产物而已。5hmc还未在合子中检测到。有实验证明5hmc可以由5mc通过氧化作用产生，而起作用的酶确定为TET1。TET2和TET3是哺乳动物TET1的两个其他同源物，他们都含有Fe(II)和α-酮戊二酸酯以及催化活性，并且实验证明拥有类似于TET1的功用。
发明内容
对于DNA 5-胞嘧啶的甲基化的全基因组范围的去除已经有所报道，指出其以一种明显的复制依赖型的方式在受精的卵的父系原核中发生，但是这个重编程过程的机制仍然是个谜。近来，5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)在一定的哺乳动物组织中被检测到，有人预测5hmc在活跃的DNA去甲基化作用中起到很重要的作用。
因此，本发明的目的在于提供一种5-羟甲基胞嘧啶在小鼠着床前胚胎中分布的检测方法，研究5-羟甲基胞嘧啶在小鼠着床前胚胎中的分布情况。
本发明的另一目的在于提供5-羟甲基胞嘧啶的应用。
本发明的5-羟甲基胞嘧啶在小鼠着床前胚胎中分布的检测方法，包括以下步骤：
(a)、小鼠自然受精或体外受精，提取小鼠胚胎；
(b)、小鼠胚胎的染色；
(c)、显微镜观察染色或进行定量分析。
根据本发明，所述自然受精提取小鼠胚胎是雌雄小鼠进行交配，选取见栓的雌鼠，直接提取受精卵，放入M2培养液中洗涤后放在M16液中，置于CO2培养箱，于37℃培养；所述体外受精提取小鼠胚胎是取未交配的雌鼠的未受精的卵和雄鼠的精子，在体外使二者结合进行受精，放入HTF培养液中，置于CO2培养箱，于37℃培养。
根据本发明，所述染色包括以下步骤：
(a)、将小鼠胚胎在4％PDF溶液中室温固定13～18分钟；
(b)、采用1XPBS溶液中进行清洗，并用0.2％Triton X-100室温处理13-18分钟
(c)、采用PBST进行清洗，并用2N HCl室温处理30分钟，之后立即用0.1M、pH为8.0的Tris-HCl处理15分钟，其中所述PBST溶液为含有0.05％ Tween20的1XPBS溶液；
(d)、采用PBST进行清洗，立即用含有1％ BSA的PBST溶液中进行封闭1小时；
(e)、将小鼠胚胎转入抗5mc/5hmc的抗体中，于37℃放置0.5～1小时。
根据本发明，所述定量分析是指采用ImageJ软件分析5hmc在小鼠胚胎原核期中雄核和雌核中的含量变化情况。
本发明利用免疫荧光染色等技术手段，对5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)在小鼠着床前胚胎的分布及生物学功能进行研究。发现在小鼠合子原核期的后期，雄原核含有丰富的5hmc，却缺少5mc；同理，在雌原核中含有5mc，但是鲜有或没有5hmc。5mc与5hmc在合子的原核期在雄原核以及雌原核中的相反分布，使得我们推测5mc的氧化作用得到5hmc有可能是DNA去甲基化(主要是5mc的去甲基化)的途径之一。除此，5hmc在之后的有丝分裂1-cell、2-cell及之后的胚胎发育期仍然存在。实验结果表明在哺乳动物着床前胚胎的发育过程中5hmc对DNA甲基化的重编程过程起到重要的作用。5-羟甲基胞嘧啶能够用作雄核标记物或雌核标记物。所述核标记物是指标记5-羟甲基胞嘧啶在雄核或雌核中的含量。所述标记5-羟甲基胞嘧啶在核中的含量是指从PN0期到PN5期，所述5-羟甲基胞嘧啶在雄核中的含量逐渐增多，所述5-羟甲基胞嘧啶在雌核中的含量逐渐减少。
附图说明
图1显示5hmC存在于小鼠受精卵的雄核中(所用抗5hmc的抗体为兔多抗)(图中红色列为5mc的染色结果，绿色列为5hmc的染色结果；☆-代表雌原核△-代表雄原核下同)。
图2显示5hmC存在于小鼠合子各个原核期的雄核中(所用抗5hmc的抗体为兔多抗)。
图3显示5hmC存在于小鼠合子各个原核期的雄核中(所用抗5hmc的抗体为鼠单抗)。
图4显示5hmc存在于小鼠合子进入有丝分裂的1-cell期。
图5显示5hmc存在于2-cell、4-cell期。
图6为5hmc在雄核与雌核中的含量进行定量分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
以下实施例中采用的小鼠为BALB/c小鼠，购买于上海斯莱克实验动物有限公司；培养液M2，M16，HTF，购买于sigma公司；矿物油购买于sigma公司；超排激素PMSG/HCG购买于宁波第二激素厂。
本发明的5-羟甲基胞嘧啶在小鼠胚胎中分布的检测方法，包括以下步骤：
(a)、小鼠自然受精或体外受精，提取小鼠胚胎；
(b)、小鼠胚胎的染色；
(c)、显微镜观察染色或进行定量分析。
实施例1  小鼠胚胎的提取与处理
选取4～5周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(7.5IU)。
47～48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(7.5IU)，并与正常公鼠合笼。第二天上午9:00前观察雌鼠，有阴道栓者拿出备用。
10:30左右，断颈处死雌鼠，手术取出输卵管于M2培养液，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。用透明质酸酶消化，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5％ CO2，37℃培养箱培养。
实施例2  小鼠体外受精
选取4～5周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，每只小鼠腹腔注射PMSG(7.5IU)。
47～48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(7.5IU)。
注射HCG 12～13小时后，取一只成熟的雄鼠，断颈处死，取其附睾尾，在显微镜下取其精子，置于提前平衡好的HTF培养液中，置于5％ CO2，37℃培养箱获能1小时。
将雌鼠取卵(方法同上)，将其置于提前平衡好的HTF培养液中。待精子获能完毕后，取适量的精子于卵中进行受精。
受精4～6小时后，将卵在新的提取平衡好的HTF培养液中进行清洗，并继续在培养箱中培养。在设定的不同的时间取出一部分卵，从而得到PN0-PN5不同时期的胚胎。
实施例3  小鼠胚胎的免疫荧光染色
将所需胚胎在4％PDF溶液中室温固定15分钟。
在1 X PBS溶液中进行清洗，并用0.2％ Triton X-100室温处理15分钟。
在含有0.05％ Tween20的1 X PBS溶液(PBST)中进行清洗，并用2N HCl室温处理30分钟，之后立即用0.1M Tris-HCl(pH＝8.0)处理15分钟
在PBST溶液中进行清洗，马上在含有1％ BSA的PBST溶液中进行封闭(block)1小时。
将胚胎转入抗5mc/5hmc的抗体(用封闭液稀释后的)中，置于37℃ 0.5～1小时，阳性信号通过荧光抗体来观察。
实施例4  免疫荧光染色的定量分析
利用ImageJ软件将免疫荧光染色的结果进行定量分析，分析5hmc在小鼠胚胎原核期中雄核和雌核中的含量变化情况。结果如下：
(1)5hmC存在于小鼠受精卵的雄核中利用自然交配的方法得到小鼠的受精卵，对其进行5mc和5hmc免疫荧光共染色，如图1所示，5mc在胚胎原核期的后期中，在雄核中含量剧减，在雌核中仍有较高的含量；而5hmc在雄核中仍然有很高的含量
(2)5hmC存在于小鼠合子各个原核期的雄核中
利用体外受精技术，得到了小鼠合子的各个原核期的胚胎，并对其进行5mc和5hmc免疫荧光共染色，如图2，图3所示结果(染色所用5hmc的抗体为兔多抗(图2)和鼠单抗(图3))：5hmc在雌雄核中均存在；由PN0-PN5，雌核中5hmc含量逐渐减少，且越向后期，雌雄核的含量差异越大，这与之前报道的5mc的含量变化刚好相反；有报道指出5mc的全基因组范围的丢失在PN3时期开始发生，与本发明实验观察到的结果一致；同时由PN1～PN3的染色结果可以看到5hmc的增多与5mc的减少同步进行。
(3)5hmC存在于小鼠合子进入有丝分裂的1-cell期
同样利用体外受精技术，得到上述各个时期的胚胎，并对其进行5mc和5hmc免疫荧光共染色，如图4所示结果：在有丝分裂1-cell期，5hmc依然存在，并且与5mc的分布也有相反的趋势——5mc含量高的地方，5hmc相对较弱。
(4)5hmc存在于小鼠2-cell、4-cell、8-cell等小鼠着床前胚胎的各个时期
同样利用体外受精技术，得到上述各个时期的胚胎，并对其进行5mc和5hmc免疫荧光共染色，如图5所示结果：5hmc在2-cell、4-cell等着床前期胚胎中均存在。
(5)5hmc在雄核与雌核中的含量进行定量分析
如图6所示：利用特定的软件对原核期雌核、雄核中5hmc免疫荧光染色的荧光含量的比值进行了统计分析，结果显示：在小鼠胚胎原核期中，随着时期的发展，越往后期，5hmc在雄核与雌核中的比值越大。说明5hmc在雌雄核中的含量差异越大。这与之前报道的5mc的含量变化刚好相反。
综上所述，采用本发明的检测方法，分析了5hmc在小鼠着床前胚胎的分布情况，证实了5mc和5hmc在小鼠着床前胚胎的发育阶段在父源与母源染色体中的动态变化情况，旨在揭示5hmc在此期间对表观遗传重编过程所起的重要作用，为DNA去甲基化的机制的研究开辟了新的前景。

Claims (7)

1.一种5-羟甲基胞嘧啶的应用，其特征在于，用作受精卵雄核标记物或雌核标记物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核标记物是指标记5-羟甲基胞嘧啶在雄核或雌核中的含量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标记5-羟甲基胞嘧啶在核中的含量是指从PN0期到PN5期，所述5-羟甲基胞嘧啶在雄核中的含量逐渐增多，所述5-羟甲基胞嘧啶在雌核中的含量逐渐减少。
4.一种5-羟甲基胞嘧啶在小鼠胚胎中分布的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)、小鼠自然受精或体外受精，提取小鼠胚胎；
(b)、小鼠胚胎的染色；
(c)、显微镜观察染色或进行定量分析。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述自然受精提取小鼠胚胎是雌雄小鼠进行交配，选取见栓的雌鼠，直接提取受精卵，放入M2培养液中洗涤后放在M16液中，置于CO2培养箱，于37℃培养；
所述体外受精提取小鼠胚胎是取未交配的雌鼠的未受精的卵和雄鼠的精子，在体外使二者结合进行受精，放入HTF培养液中，置于CO2培养箱，于37℃培养。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述染色包括以下步骤：
(a)、将小鼠胚胎在4％PDF溶液中室温固定13～18分钟；
(b)、采用1XPBS溶液中进行清洗，并用0.2％Triton X-100室温处理13-18分钟
(c)、采用PBST进行清洗，并用2N HCl室温处理30分钟，之后立即用0.1M、pH为8.0的Tris-HCl处理15分钟，其中所述PBST溶液为含有0.05％ Tween20的1XPBS溶液；
(d)、采用PBST进行清洗，立即用含有1％ BSA的PBST溶液中进行封闭1小时；
(e)、将小鼠胚胎转入抗5mc/5hmc的抗体中，于37℃放置0.5～1小时。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述定量分析是指采用ImageJ软件分析5hmc在小鼠胚胎原核期中雄核和雌核中的含量变化情况。
CN2011101076305A 2011-04-28 2011-04-28 5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法 Pending CN102759626A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011101076305A CN102759626A (zh) 2011-04-28 2011-04-28 5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011101076305A CN102759626A (zh) 2011-04-28 2011-04-28 5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102759626A true CN102759626A (zh) 2012-10-31

Family

ID=47054144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011101076305A Pending CN102759626A (zh) 2011-04-28 2011-04-28 5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102759626A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060450A (zh) * 2013-01-09 2013-04-24 武汉大学 一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1576371A (zh) * 2003-07-18 2005-02-09 三井化学株式会社 制备嘧啶核苷的方法和新的嘧啶核苷化合物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1576371A (zh) * 2003-07-18 2005-02-09 三井化学株式会社 制备嘧啶核苷的方法和新的嘧啶核苷化合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARK WOSSIDLO ET AL.: "5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
杨敏等: "胚胎干细胞来源神经前体细胞在缺氧缺血性脑损伤海马内的分化", 《上海交通大学学报（医学版）》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060450A (zh) * 2013-01-09 2013-04-24 武汉大学 一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法
CN103060450B (zh) * 2013-01-09 2014-03-12 武汉大学 一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Casanovas et al. Double-stranded sperm DNA damage is a cause of delay in embryo development and can impair implantation rates
Rubio et al. Clinical validation of embryo culture and selection by morphokinetic analysis: a randomized, controlled trial of the EmbryoScope
Yoshida Elucidating the identity and behavior of spermatogenic stem cells in the mouse testis
Santos et al. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo
Robertson Derivation and maintenance of embryonic stem cell cultures
Yang et al. Cleavage pattern predicts developmental potential of day 3 human embryos produced by IVF
Tanaka et al. Completion of meiosis in human primary spermatocytes through in vitro coculture with Vero cells
Reis e Silva et al. Alteration of DNA demethylation dynamics by in vitro culture conditions in rabbit pre-implantation embryos
Barboni et al. In vitro grown sheep preantral follicles yield oocytes with normal nuclear-epigenetic maturation
Luciano et al. Changes of large-scale chromatin configuration during mammalian oocyte differentiation
CN103361304B (zh) 孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用
Callery There's more than one frog in the pond: A survey of the Amphibia and their contributions to developmental biology
Gambini et al. Horse ooplasm supports in vitro preimplantation development of zebra ICSI and SCNT embryos without compromising YAP1 and SOX2 expression pattern
CN109234278A (zh) 构建ApoC2基因敲除仓鼠模型的试剂盒和方法
Guangmin et al. Asymmetric somatic hybridization between haploid common wheat and UV-irradiated Haynaldia villosa
Liao et al. Susceptibility loci for umbilical hernia in swine detected by genome-wide association
CN102759626A (zh) 5-羟甲基胞嘧啶的应用及在小鼠胚胎中分布的检测方法
Woodward et al. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality
Hou et al. Genomic DNA methylation patterns in bovine preimplantation embryos derived from in vitro fertilization
CN103074297A (zh) 家畜精原干细胞培养液
CN104140951B (zh) 一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法
Standing et al. Mortality of Cryptocaryon irritans in sludge from a digester of a marine recirculating aquaculture system
Bolondi et al. Single-cell technologies: a new lens into epigenetic regulation in development
CN103468639A (zh) 组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用
Pigozzi A bird´ s-eye view of chromosomes during meiotic prophase I

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121031