CN103060450B - 一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用哌啶水溶液检测DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法。用哌啶特异性地与带荧光标记DNA中的5-醛基胞嘧啶反应,可以检测出5-醛基胞嘧啶;而通过高钌酸钾将DNA中的5-羟甲基胞嘧啶氧化成5-醛基胞嘧啶后哌啶处理,通过比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带可以得到5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。本方法可以快速、有效和灵敏地实现5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用哌啶水溶液检测DNA中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法,属于DNA测序领域。
背景技术
表观遗传学作为遗传学的一门重要分支学科,主要研究基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,其主要内容包括DNA甲基化、基因组印记、RNA干扰和组织蛋白修饰等。近几年来,越来越多的人开始关注DNA甲基化,相关的研究更是如火如荼的开展起来。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,其存在与基因的沉默与表达有着密切的联系。通常在甲基化转移酶的作用下甲基化发生在胞嘧啶的C5位,形成5-甲基胞嘧啶(5mC),接着TET家族酶处理后,5mC转化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC可以进一步氧化成5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC),5caC被TDG酶切除,最后通过碱基缺失修复还原成胞嘧啶,这是一个完整的去甲基化过程。这些年来,5 mC得到广泛的研究,作为一种稳定且重要的表遗传修饰,参与基因表达调控、X-染色体失活、基因组印记、转座子的长期沉默和癌症的发生,被称为基因组第五碱基;而5hmC的存在,近年来应用了高精确的质谱分析和高通量测序方法,发现5hmC的形成与恶性血液肿瘤相关; 最新报导5fC的存在与RNA的转录酶Ⅱ的转录速率和底物特异性有着十分重要的联系。关于DNA甲基化检测的文章已经报导了很多,而作为2011年刚被发现的5fC却很少得到检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种快速、有效和灵敏的分别检测5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法。
本发明提供的技术方案是:一种DNA中5-醛基胞嘧啶的检测方法,具体为:向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液,至哌啶的最终体积浓度为5%~20%,加热后旋干溶剂,上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数;
一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法,具体步骤为:
1)向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液,至哌啶的最终体积浓度为5%~20%,加热后旋干溶剂,上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数;
2)将带荧光标记的DNA加入到高钌酸钾存在的氢氧化钠的水溶液中反应,分离出带荧光标记的DNA,然后加入哌啶的水溶液,加热后旋干溶剂,上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶位置和个数,与步骤1)中检测到的5-醛基胞嘧啶的位置和个数进行比较得到DNA中5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
哌啶特异性的与带荧光标记DNA中的5-醛基胞嘧啶反应,而经高钌酸钾氧化后的5-羟甲基胞嘧啶转化为5-醛基胞嘧啶,也可以与哌啶反应。通过比较变性胶中两个反应的DNA带可以清楚的看到5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
本发明是通过哌啶与DNA中5-醛基胞嘧啶特异性的反应,经过哌啶的热处理会使DNA中5-醛基胞嘧啶的位置特异性的断裂,从而会在20%的DNA聚丙烯酰胺变性胶上看到特异性的DNA断裂带,从而确定DNA中5-醛基胞嘧啶在DNA序列中的位置。而对于含有5-羟甲基胞嘧啶的DNA,它会被高钌酸钾(KRuO4)氧化成5-醛基胞嘧啶的DNA,同样经过哌啶处理后会在变性胶上显示出5-醛基胞嘧啶的位置。通过比较两条胶带可以看出经氧化剂氧化后新生成的DNA断裂带就是5-羟甲基胞嘧啶的位置。
本方法可以实现快速、有效和灵敏的分别检测5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。
附图说明
图1为实施例1~4的变性胶图结果比较,图中的泳道1代表实施例4中的对照实验的结果,2~5依次代表实施例1~4的结果。
图2为实施例5中步骤1)和步骤2)的照胶结果,其中,“-”代表步骤1)没有经过KRuO4处理直接哌啶处理,“+”代表步骤2)经过KRuO4处理后哌啶处理,图中的1234分别代表不同的DNA序列,其中,1代表只含有一个羟甲基胞嘧啶的DNA序列,2代表只含有一个甲基胞嘧啶的DNA序列,3代表只含有一个醛基胞嘧啶的DNA序列,4代表同时含有这三种特殊胞嘧啶的DNA序列;XYZ分别表示序列中的不同的位置。
具体实施方式
以下以具体实例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1:5-醛基胞嘧啶DNA与5% 哌啶的反应
取5-醛基胞嘧啶DNA(10 μM)2 μL加入93 μL的水和5 μL的哌啶, 90℃热处理0.5小时后,旋干溶剂,上样至电泳槽,2 h后观察照胶结果,有10% 的5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
实施例2:5-醛基胞嘧啶DNA与10% 哌啶的反应
取5-醛基胞嘧啶DNA(10 μM)2 μL加入88 μL的水和10 μL的哌啶, 90℃热处理0.5小时后,旋干溶剂,上样至电泳槽,2 h后观察照胶结果,有35%的 5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
实施例3:5-醛基胞嘧啶DNA与15%哌啶的反应
取5-醛基胞嘧啶DNA(10 μM)2 μL加入83 μL的水和15 μL的哌啶, 90℃热处理0.5小时后,旋干溶剂,上样至电泳槽,2 h后观察照胶结果,有50%的 5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
实施例4:5-醛基胞嘧啶DNA与20%哌啶的反应
取5-醛基胞嘧啶DNA(10 μM)2 μL加入78 μL的水和20 μL的哌啶, 90℃热处理0.5小时后,旋干溶剂,上样至电泳槽,2 h后观察照胶结果,有50% 的5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
作为对照,取5-醛基胞嘧啶DNA(10 μM)2 μL加入98 μL的水,直接90℃热处理0.5小时后,旋干溶剂,上样至电泳槽,2 h后观察照胶结果,无5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
比较实施例1~4的照胶结果,可以看出,5-醛基胞嘧啶DNA直接热处理是无法观察到DNA中5-醛基胞嘧啶的位置和个数的,经过哌啶处理后,可以清楚的看到DNA中5-醛基胞嘧啶的位置和个数,如图1所示,说明该方法快速、灵敏且有效。
实施例5:5-羟甲基胞嘧啶的检测
1)带有不同胞嘧啶的DNA与哌啶的反应
取5-羟甲基胞嘧啶DNA序列1(10 μM)2 μL加入83 μL的水和15 μL的哌啶, 90℃热处理0.5 h后,旋干溶剂,上样至电泳槽,2 h后观察照胶结果,没有5-羟甲基胞嘧啶DNA发生断裂。
取5-甲基胞嘧啶DNA 序列2(10 μM)2 μL,处理方法同上,也没有出现5-甲基胞嘧啶DNA断裂。
取5-醛基胞嘧啶DNA 序列3(10 μM)2 μL,处理方法同上。有50%的5-醛基DNA发生了断裂。
取同时带有5-醛基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的DNA序列4(10 μM)2 μL,处理方法同上。只有5-醛基胞嘧啶的位置发生了断裂。
2)带有不同胞嘧啶的DNA先经KRuO4氧化然后与哌啶的反应
取5-羟甲基胞嘧啶DNA序列1(10 μM)2 μL 加入NaOH溶液(50 mM)19 μL和KRuO4(1.5mM) 4 μL,4℃反应1h后,除去KRuO4. 再加入85 μL的水和15 μL的哌啶90℃热处理0.5 h后,旋干溶剂,上样至电泳槽,2 h后观察照胶结果,有51% 5-醛基胞嘧啶DNA发生断裂。
取5-甲基胞嘧啶DNA序列2(10 μM)2 μL,处理方法同上。
取5-醛基胞嘧啶DNA序列3(10 μM)2 μL,处理方法同上。
取同时带有5-醛基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的DNA序列4(10 μM)2 μL,处理方法同上。
通过比较实施例5中步骤1)和步骤2)的照胶结果,可以看出,带有不同胞嘧啶的DNA直接与哌啶反应:DNA序列1在X和Z的位置都是胞嘧啶,在Y的位置是5hmC;DNA序列2在X和Z的位置都是胞嘧啶,在Y的位置是5mC;DNA序列3在X和Z的位置是胞嘧啶,在Y位置是一个5fC;DNA序列4在X的位置是胞嘧啶,Y位置是5hmC,Z位置是5fC,从电泳图的结果可以清晰的看出5fC存在于DNA序列3和DNA序列4中,如图2所示。而带有不同胞嘧啶的DNA先经KRuO4氧化然后与哌啶反应:DNA序列1在X和Z的位置是胞嘧啶,Y位置是一个5hmC,;DNA序列2在X和Z的位置是胞嘧啶,Y位置是5mC;DNA序列3在X和Z的位置是胞嘧啶,Y位置5fC; DNA序列4在X的位置是胞嘧啶,Y位置是5hmC,Z位置是5fC,如图2所示。对比图2左右两个图可以看到DNA序列1和DNA序列4在右图中出现了两条新的断裂带,此新增的断裂带刚好是预期的5hmC的位置。通过此种方法,我们可以达到分别检测5fC和5hmC的目标。
本实施例步骤2)中的哌啶水溶液的体积浓度替换为5%~20%中的任意浓度不影响本实施例的效果。
Claims (2)
1.一种DNA中5-醛基胞嘧啶的检测方法,其特征在于,具体为:向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液,至哌啶的最终体积浓度为5%~20%,加热后旋干溶剂,上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数。
2.一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的检测方法,其特征在于,具体步骤为:
1)向带荧光标记的DNA中加入哌啶的水溶液,至哌啶的最终体积浓度为5%~20%,加热后旋干溶剂,上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶的位置和个数;
2)将带荧光标记的DNA加入到高钌酸钾存在的氢氧化钠的水溶液中反应,分离出带荧光标记的DNA,然后加入哌啶的水溶液,加热后旋干溶剂,上样至电泳槽记录5-醛基胞嘧啶位置和个数,与步骤1)中检测到的5-醛基胞嘧啶的位置和个数进行比较得到DNA中5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
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