CN112813148A - 飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是基于飞行时间质谱法联合氧化亚硫酸氢盐转化法建立的5‑羟甲基胞嘧啶的检测方法。相比较传统的亚硫酸氢盐转化检测甲基化方法,本方法在亚硫酸氢盐转化之前引入高钌酸钾氧化法,主要是利用高钌酸钾的强氧化作用,把5hmC转化为5‑甲酰基胞嘧啶5fC,然后在亚硫酸氢盐转化中5fC转化为尿嘧啶U,并在后续的PCR过程中转变成T;相对应的,5mC不被亚硫酸氢盐转化,在PCR中仍表现为C,所以检测到的C只是5mC;相比传统方法,本方法是一种简单可靠、准确而低成本对5hmC进行定量分析的方法。
Description
技术领域
本发明属于5-羟甲基胞嘧啶检测领域,特别涉及一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法。
技术背景
甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程,可形成各种甲基化合物,或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。我们所要研究的就是对脱氧核糖核酸DNA进行修饰形成的甲基化。
脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点,即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点),胞嘧啶C转化为5-甲基胞嘧啶5mC,这是由一个被称为DNA甲基转移酶并包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的酶家族催化。DNMT3a和DNMT3b是从头合成的甲基转移酶,能够甲基化之前未甲基化的CpG二核苷酸。相反,DNMT1是一种维持性甲基转移酶,在复制过程中修饰半甲基化的DNA。
人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化,但是在某些特定区域,如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化,这与包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。1%-2%的人类基因组是CpG岛,并且CpG甲基化与转录活性成反比,DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。研究证实,CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG),但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。
目前,将5mC视作一个完全稳定的DNA修饰这一想法尚不实际。整个基因组中的许多甲基化胞嘧啶,特别是基因体内的甲基化胞嘧啶,都会经历一个被称作DNA去甲基化的过程-这一过程最终会去除5mC,将甲基化胞嘧啶转化为未修饰的胞嘧啶(C)。DNA去甲基化能够通过以下两种方式中的任一种方式发生:DNA被动去甲基化:由于缺少甲基化维持酶,甲基化的胞嘧啶在基因组中被稀释掉。或DNA主动去甲基化:5mC被10-11易位(TET)酶氧化为5mC的氧化衍生物。
如图1所示,DNA主动去甲基化呈周期性,从5mC开始,以未修饰的C结束。5mC首先被氧化为5-羟基甲基胞嘧啶(5hmC),再进一步被氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC),后者最后再一次被氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)。该过程涉及Tet酶家族,包括Tet1、Tet2和Tet3。接下来,胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)与碱基切除修复(BER)共同将5fC和5caC从DNA中去除,产生一个未修饰的C。在该通路中,TDG可以修复5-hmC脱氨基后产生的5-羟甲基尿嘧啶。
在不同细胞周期中对5hmC含量的测定,显示5hmC是稳定的修饰,而不是瞬时中间体,而且还可以作为具有独特调节功能的表观遗传标记。例如,5hmC有自己独特的结合蛋白来读取其所携带的表观遗传信息,它还显示出与转录活性相关的独特基因组分布模式。同时对于小鼠不同组织中的hmC含量研究后,发现5hmC的含量也是稳定的,并与各组织的增殖代谢水平相关。
在人肝和肺的正常组织以及对应的肿瘤组织中对全基因组DNA甲基化和羟甲基化分析后,不但发现5hmC在CpG岛岸中显著富集,同时也发现在启动子,基因本体上的羟甲基化基因表达呈显著正相关,表明5hmC是活性基因的标记,可能通过介导DNA去甲基化调控基因表达。
目前,亚硫酸氢盐转化是检测甲基化的通用标准,但该方法无法区分5mC和5hmC,平常亚硫酸氢盐处理得到的所谓5mC其实是5mC与5hmC的集合。在亚硫酸氢盐转化处理中,5mC和5hmC不被转化,在后续扩增检测中都表现为C。而未甲基化的C、5fC、5caC都被转化为尿嘧啶,在后续扩增检测中表现为T。
随着对5hmC的研究深入,需要找到一种准确、稳定可靠、低成本的方法进行定量检测。传统的抗体免疫杂交法、薄层色谱、液相色谱或抗体富集法、限制性酶切等方法,只能对5hmC进行初步定性,甚至都难以达到单碱基分辨率的水平,更加无法进行定量检测。
基于亚硫酸氢盐转化法开发的TAB-seq能对5hmC进行定量检测。其基本原理是:利用甲基化胞嘧啶5mC主动去甲基化的流程,先用糖基化酶处理待测样本DNA,使DNA中的5hmC被糖基化修饰为糖基化胞嘧啶5gmC。然后用10-11易位酶(TET)进行氧化反应,使5mC经过一系列去甲基化过程而转变为5羧基胞嘧啶5caC。进而在亚硫酸氢盐转化中,5甲酰基胞嘧啶5fC和5caC被转化为U,而糖基化胞嘧啶5gmC仍保持为C不变。因此在后续测序中检测到的C即为原DNA样品中的5hmC。本方法能直接对5hmC进行定量分析,结果直观而可靠,但在应用中也存在一定的缺陷。
首先,5hmC的糖基化和5mC的氧化都依赖酶的催化进行。目前糖基化酶有成熟的商业产品,在价格和转化效率方面较为可靠。但5mC氧化依赖的10-11易位酶(TET)却很贵而且难以纯化,其转化效率最高也只能达到95%,那么剩下未被氧化的5%的5mC就会被检测为5hmC而导致假阳性的结果。
其次,样品DNA经过糖基化、纯化、TET氧化、纯化后,再进行亚硫酸氢盐转化,整个过程流程长、步骤多、DNA损失也多,要高效率转化并最终回收到足够的DNA进行检测也比较困难。
基于上述分析,需要找到一种准确、简单可靠、低成本的技术对5hmC进行定量分析。
发明内容
针对上述问题,本发明提出一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,具体来说是一种结合氧化亚硫酸氢盐转化法和飞行时间质谱定量检测5hmC的方法。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,包括以下步骤:
S1样品处理:取待检测样品的DNA两份,一份直接进行进行亚硫酸氢盐转化的样品为样品1;另一份依次经过初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化后,再进行亚硫酸氢盐转化的样品为样品2,样品2的整个处理方法即为本发明所述的氧化亚硫酸氢盐转化法;
S2引物设计:针对待检测的甲基化区域,设计一对特异性甲基化引物,两条引物的5’端分别加上Tag序列,其中下游引物添加的Tag包含T7转录启动子序列;
S3扩增:用设计的特异性甲基化引物,同时对样品1和样品2进行扩增;
S4酶切:扩增产物经过虾碱酶消化,用T7转录酶进行体外转录并用RNaseA进行酶切。酶切产物经树脂纯化后上质谱仪检测。通过酶切片段的分子量大小得到待测位点是C还是T,从而计算待测位点的甲基化程度。
S5比较:比较同一待测位点在样品1和样品2中甲基化差异,得到5hmC的甲基化结果。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S1中的初步纯化中,纯化试剂为Micro Bio-SpinTM P-6 Gel Columns,SSC Buffer。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S1中初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化的过程中使用的水为无DEPC的纯水。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S1中高钌酸钾氧化中,根据样品的颜色和状态判断氧化的成功与否,氧化成功的样品的颜色和状态保持不变。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S1中,氧化产物纯化中的纯化试剂为Micro Bio-SpinTM P-6 Gel Columns,SSC Buffer。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S1中,样品2的亚硫酸氢盐转化时间长于样品1的亚硫酸氢盐转化时间。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S2引物设计中,所述上游引物的Tag的作用是为了增加引物的分子量,使之超过质谱仪检测范围,避免对产物检测造成干扰;所述下游引物添加的Tag包含T7转录启动子序列,其作用是为了后续启动T7转录酶进行转录反应。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S4酶切中,所述虾碱酶消化之作用为除去体系中残留的dNTP,随后经过T7转录和RNaseA酶切,得到小片段RNA。得到的产物经树脂纯化后做飞行时间质谱,通过产物的分子量得到待测位点是C还是T,从而得到待测位点的甲基化程度。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S5具体为,样品2经过经过初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化、亚硫酸氢盐转化后,得到5mC的甲基化检测结果;样品1经过常规亚硫酸氢盐转化后,得到5mC+5hmC的甲基化检测结果;对两份检测结果进行比较,从而得到5hmC的检测结果。
进一步的,上述一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,所述步骤S2引物设计中,所述特异性甲基化引物中的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示;所述下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明与以往技术相比,具有以下优点:
(1)能区分5mC和5hmC,并且对两者分别定量检测;
(2)准确性高。整个过程中只有一步PCR反应,氧化、转化都是化学反应,反应效率可达到99%,使检测结果更准确。
(3)可操作性高。氧化、转化所需的试剂都可从商业途径获得,容易实现。
(4)快捷,通量高。可一次对多个样本进行同步处理,处理产物可对任意数量的位点进行检测,并且一次实验可同时得到5mC和5hmC的定量结果。
(5)对实验室要求不高。本发明所需的试剂都是常规分子生物学的要求,只需要MALDI-TOF质谱仪就可实现对5mC和5hmC的定量检测。
附图说明
图1:DNA的胞嘧啶甲基化修饰动态过程
图2:氧化亚硫酸氢盐检测5hmC的原理图
图3:氧化亚硫酸氢盐结合飞行时间质谱检测5hmC原理流程图
图4:常规亚硫酸氢盐处理结合飞行时间质谱检测5mC+5hmC甲基化的结果
图5:氧化亚硫酸氢盐处理结合飞行时间质谱检测5mC甲基化的结果。
具体实施方式
下面参照图2本发明的原理图和图3本发明的原理流程图,说明本发明的具体实施方式。
1)针对待测CpG岛设计甲基化特异性引物。因为DNA样本经过亚硫酸氢盐转化后,非甲基化的胞嘧啶C会转化为尿嘧啶U,并在后续PCR扩增中进一步转变为胸腺嘧啶T;而甲基化胞嘧啶5mC会保持C不变。同时由于甲基化胞嘧啶存在于CpG中,因此在设计扩增引物时,需要把CpG上的C考虑为C或T两种状态而避开,无法避开时则设计成C/T的简并碱基。而非CpG上的C都转化成T进行设计。设计完成后,在上游引物的5’端加上10个碱基的Tag,5’-aggaagagag-3’,序列编号为SEQ ID NO:1,使其分子量超出质谱仪的检测范围。在下游引物的5’端加上含T7转录酶启动子序列的Tag,5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggct-3’,序列编号为SEQ ID NO:2,用于启动PCR后的T7转录步骤。
2)取1ug DNA进行纯化,用高钌酸钾氧化之后再纯化,然后对纯化产物进行亚硫酸氢盐转化。同时另外再取1ug DNA直接进行亚硫酸氢盐转化。
3)两份转化产物分别用甲基化特异性引物进行PCR扩增,然后用SAP酶消化残留的dNTP。
4)消化产物同步进行T7转录和RNaseA酶切,得到小分子RNA片段。
5)产物经阳离子交换树脂纯化后,用自动点样仪转移到384芯片上,用质谱仪进行飞行时间质谱检测。根据小分子RNA片段的分子量和产量,由直接进行亚硫酸氢盐转化的样本结果获得5mC+5hmC定量结果,由氧化后进行亚硫酸氢盐转化的样本结果获得5mC定量结果,比较两者,进而得到5hmC定量结果。,
实施例1
设计一对引物检测SLC22A1-OCT1的启动子区甲基化
背景转运蛋白(OCT)是近年来备受关注的药物转运体,由SLC22A1基因编码。该基因的甲基化状况可以调控基因表达,从而对药物的吸收、转化、代谢造成影响。为检测该基因的甲基化状况,设计针对SLC22A1-OCT1的启动子区的甲基化特异性引物。具体步骤为:在NCBI搜索该基因的序列,截取转录起始位置的上游5000bp到下游1000bp的一段序列,利用CpG岛在线预测网站http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/预测序列潜在的CpG岛,然后用EpiDesigner程序对该序列进行引物方案设计,结果如下:上游引物SEQ ID NO:3=5’-aggaagagagTTTGAGGGAGATATTGTATTTGGTT-3’,
下游引物SEQ ID NO:4=
5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCTATCCCAAAAACTCCCATATTAC-3’。
实施例2
对待测样本进行氧化处理
取Micro Bio-SpinTM P-6 Gel Columns,SSC Buffer(Bio-Rad,cat.no.7326200)纯化柱,1000g离心2min,去除滤液。然后用500ul超纯水清洗柱子,1000g离心2min,去除滤液,一共清洗4次,最后一次1000g离心4min,去除滤液。取1ug基因组DNA,用超纯水补至22ul,加入纯化柱中1000g离心4min,收集滤液,滤液约21ul。
向纯化后的DNA滤液中加入2.4ul 0.5M NaOH,37℃水浴30min,后立即置于冰水混合物中5min冷却。向产物中加入1ul 15mM KRuO4(含0.05M NaOH),震荡混匀,1000g室温离心5s,冰上放置1小时,期间每隔20min震荡和离心一次。此反应体系的颜色在氧化完成后也应该保持橙色。
再取Bio-Rad Micro Bio-Spin P-6SSC column,1000g室温离心120s,去掉滤液。然后把氧化反应物加入柱子中,1000g室温离心480s,得到滤液即为氧化的DNA样本。
实施例3
亚硫酸氢盐转化处理
取1ug基因组DNA直接进行亚硫酸氢盐进行转化处理,处理试剂为EZ DNAMethylation Gold kit(ZYMO,cat.no.D5008),处理程序为98℃ 10min,64℃2.5h,4℃保存。后续根据试剂盒说明书对处理产物进行纯化,60ul洗脱。
同时对实施例2获得的氧化DNA样本进行亚硫酸氢盐转化处理,处理试剂为EZ DNAMethylation Gold kit(ZYMO,cat.no.D5008),处理程序为98℃ 10min,64℃ 2.5h,98℃10min,64℃ 2.5h,4℃保存。后续根据试剂盒说明书对处理产物进行纯化,40ul洗脱。
实施例4
PCR扩增、纯化、转录和酶切
用实施例1设计的甲基化特异性引物对实施例3转化的两种样本分别进行PCR扩增。扩增体系为:1ul 10×PCR Buffer,1ul dNTPs(200uM),0.2ul PCR Enzyme(5U/μL),上下游引物各0.2ul((10pmol/μL)),1ul DNA样本,超纯水补足10ul。反应条件为:94℃变性4minutes,(95℃ 20s,56℃ 20s,72℃ 1min)45个循环,72℃ 3min,4℃保存。
扩增产物取2ul用2%琼脂糖凝胶电泳,120V 30min,如结果良好可继续后续实验,如果扩增效果不佳,则调整扩增体系及反应条件进行优化直至最佳的PCR扩增结果。然后对剩余扩增产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase,虾碱性磷酸酶)消化,去除体系中游离的dNTPs。反应体系为:0.3ul SAP Enzyme,5ul扩增产物,1.7ul超纯水。反应条件为:37℃2minutes,85℃ 5min,4℃保存。
对SAP消化产物进行转录和酶切。反应体系为:0.89ul T7 Polymerase Buffer(5x),0.22ul T Cleavage Transcription Mix,0.22ul DTT(100mM),0.4ul T7RNA&DNAPolymerase,0.06ul RNase A,2ul SAP消化产物,超纯水3.21ul。反应条件为:37℃ 3h,4℃保存。
实施例5
飞行时间质谱检测
用阳离子交换树脂对上述转录和酶切产物进行纯化。每个产物中加入20ul超纯水和适量阳离子交换树脂,用旋转摇床20转/min运行30min,然后3000rpm离心5min。
通过自动点样仪把上述样品转移到384孔芯片上。然后进行飞行时间质谱分析,得到酶切后片段的质谱图,根据各片段的分子量得到CpG位点的碱基组成,从而得到相应的甲基化定量结果。一份样本经过氧化亚硫酸盐处理后得到的是5mC的定量结果,而直接经过亚硫酸盐处理后得到的是5mC+5hmC的定量结果,比较两者,从而得到5hmC的定量结果。
常规亚硫酸氢盐处理结合飞行时间质谱检测5mC+5hmC甲基化的结果见图4。待测位点的非甲基化产物峰和甲基化产物峰的分子量大小为5761.6422和5777.6419,与理论分子量大小5761.6596和5777.6589相差不到0.02Da(属于可接受的误差范围),其峰高分别为1.6108和214.3221,据此计算得到5mC+5hmC的甲基化结果为0.99(即5mC+5hmC的甲基化程度为99%)。
氧化亚硫酸氢盐处理结合飞行时间质谱检测5mC甲基化的结果见图5。待测位点的非甲基化产物峰和甲基化产物峰的分子量大小为5761.5442和5777.5435,与理论分子量大小5761.6596和5777.6589相差不到0.2Da(属于可接受的误差范围),其峰高分别为69.3618和504.5028,据此计算得到5mC+5hmC的甲基化程度为0.88(即5mC的甲基化程度为88%)。
根据以上两个检测结果,计算得到该位点的5hmC的甲基化程度为0.11(即5hmC的甲基化程度为11%)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 博淼生物科技(北京)有限公司
<120> 飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法
<130> 2021
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
aggaagagag 10
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
cagtaatacg actcactata gggagaaggc t 31
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<400> 3
aggaagagag tttgagggag atattgtatt tggtt 35
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> artificial
<400> 4
cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcctatccca aaaactccca tattac 56
Claims (10)
1.飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1样品处理:取待检测样品的DNA两份,一份直接进行进行亚硫酸氢盐转化的样品为样品1;另一份依次经过初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化后,再进行亚硫酸氢盐转化的样品为样品2;
S2引物设计:针对待检测的甲基化区域,设计一对特异性甲基化引物,两条引物的5’端分别加上Tag序列,其中下游引物添加的Tag包含T7转录启动子序列;
S3扩增:用设计的特异性甲基化引物,同时对样品1和样品2进行扩增;
S4酶切:扩增产物经过虾碱酶消化,用T7转录酶进行体外转录并用RNaseA进行酶切。酶切产物经树脂纯化后上质谱仪检测。通过酶切片段的分子量大小得到待测位点是C还是T,从而计算待测位点的甲基化程度。
S5比较:比较同一待测位点在样品1和样品2中甲基化差异,得到5hmC的甲基化结果。
2.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S1中的初步纯化中,纯化试剂为Micro Bio-SpinTMP-6 Gel Columns,SSC Buffer。
3.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S1中初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化的过程中使用的水为无DEPC的纯水。
4.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S1中高钌酸钾氧化中,根据样品的颜色和状态判断氧化的成功与否,氧化成功的样品的颜色和状态保持不变。
5.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S1中,氧化产物纯化中的纯化试剂为Micro Bio-SpinTMP-6 Gel Columns,SSC Buffer。
6.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S1中,样品2的亚硫酸氢盐转化时间长于样品1的亚硫酸氢盐转化时间。
7.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S2引物设计中,所述上游引物的Tag的作用是为了增加引物的分子量,使之超过质谱仪检测范围,避免对产物检测造成干扰;所述下游引物添加的Tag包含T7转录启动子序列,其作用是为了后续启动T7转录酶进行转录反应。
8.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S4酶切中,所述虾碱酶消化之作用为除去体系中残留的dNTP,随后经过T7转录和RNaseA酶切,得到小片段RNA。得到的产物经树脂纯化后做飞行时间质谱,通过产物的分子量得到待测位点是C还是T,从而得到待测位点的甲基化程度。
9.根据权利要求1所述的的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S5具体为,样品2经过经过初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化、亚硫酸氢盐转化后,得到5mC的甲基化检测结果;样品1经过常规亚硫酸氢盐转化后,得到5mC+5hmC的甲基化检测结果;对两份检测结果进行比较,从而得到5hmC的检测结果。
10.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于,所述步骤S2引物设计中,所述特异性甲基化引物中的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示;所述下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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CN202110145645.4A Pending CN112813148A (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法 |
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103060450A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-04-24 | 武汉大学 | 一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法 |
CN104781422A (zh) * | 2012-09-20 | 2015-07-15 | 香港中文大学 | 从血浆无创测定胎儿或肿瘤的甲基化组 |
CN108841928A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-20 | 河北医科大学 | 一种人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒及其应用 |
CN109913530A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-06-21 | 武汉大学 | 一种识别检测dna中5-羟甲基胞嘧啶和5-甲酰胞嘧啶的方法 |
CN110578004A (zh) * | 2019-10-28 | 2019-12-17 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法 |
CN112029834A (zh) * | 2020-09-27 | 2020-12-04 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种核酸羟甲基化修饰的检测方法及其应用 |
-
2021
- 2021-02-02 CN CN202110145645.4A patent/CN112813148A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN104781422A (zh) * | 2012-09-20 | 2015-07-15 | 香港中文大学 | 从血浆无创测定胎儿或肿瘤的甲基化组 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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MICHAEL J. BOOTH等: "Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution", 《SCIENCE》 * |
方科等: "表观遗传学新标记—5-羟甲基胞嘧啶检测方法的研究进展", 《遗传》 * |
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