CN108841928A - 一种人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒及其应用，所述试剂盒中包括PCR扩增试剂盒，所述PCR扩增试剂盒中包括37对PCR扩增引物，所述37对PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.74所示。本试剂盒灵敏度、准确性、稳定性、扩增特异性以及高通量等方面均能满足对人类线粒体基因组甲基化检验实际工作的要求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒及其应用。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传修饰、调节基因表达的重要方式之一。线粒体是一种具有半自主性的细胞器,有自身独特的DNA(线粒体DNA，mtDNA)。有些研究认为线粒体DNA内有甲基化发生，并且与一些疾病密切相关。但由于检测方法的灵敏度与精确性等原因，另有一些研究认为线粒体DNA甲基化程度极低，甚至几乎没有甲基化发生。
目前常用检测DNA甲基化的方法有以下几种：甲基化DNA免疫共沉淀测序技术、甲基化芯片技术、全基因组甲基化测序技术、焦磷酸测序法和质谱法。甲基化DNA免疫共沉淀测序技术能够覆盖全基因组范围，但精确度较低，只能检测大约在150-200bp片段区域内的甲基化程度，不能达到单碱基分辨。甲基化芯片技术能够同时检测大量的CpG位点，但其弊端主要是不能覆盖全部的甲基化位点。全基因组甲基化测序法能够检测基因组内所有CpG位点甲基化程度，但检测的物力人力成本相当高，数据分析量庞大，难以进行大规模推广应用。焦磷酸测序法被认为是DNA甲基化检测的金标准，能精确检测每个CpG位点的甲基化程度，但此方法通量低，一次实验只能检测200bp碱基内的3至6个CpG位点。
发明内容
针对现有检测方法存有或灵敏度低或准确性不佳或通量低的技术问题，本发明提供了一种人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒。
以及，本发明还提供了一种人类线粒体基因组甲基化测试方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增试剂盒，所述PCR扩增试剂盒中包括37对PCR扩增引物，所述37对PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.74所示。
本试剂盒中PCR扩增引物的每个上游引物5’端均设有10mer tag，用于平衡PCR反应条件，每个下游引物5’端均设有T7-Promoter序列，用于后续的体外转录。本试剂盒灵敏度、准确性、稳定性、扩增特异性以及高通量等方面均能满足对人类线粒体基因组甲基化检验实际工作的要求。
优选地，所述试剂盒还包括体外转录和碱基特异性酶切试剂盒。
优选地，所述体外转录和碱基特异性酶切试剂盒中包含虾碱性磷酸酶和RNase A。虾碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，在反应完成后最容易灭活。RNase A为核酸内切酶，对核糖核酸有水解作用，在C端和U端残基处专一地催化RNA的核糖部分3’-与5’-磷酸二酯键的裂开。
优选地，所述检测试剂盒还包括PCR产物纯化试剂盒，用于对PCR产物进行纯化。
优选地，所述检测试剂盒还包括血液抽提试剂盒和DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒，用于从待测组织、细胞或血液中提取DNA和对提取后的DNA进行亚硫酸氢盐转化。
以及，本发明实施例还提供了一种人类线粒体基因组甲基化检测方法，用上述检测试剂盒以及质谱分析方法对人类线粒体基因组甲基化进行检测。质谱分析方法具有无需任何荧光标记、灵敏度高、通量大和检测时间短的优势，是同时进行检测多个CpG位点甲基化程度的优选方法，而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。
优选地，所述检测方法包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测组织、血液或细胞的全基因组DNA；
步骤b、对所述全基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化；
步骤c、用上述37对PCR扩增引物对亚硫酸氢盐转化后的全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤d、采用虾碱性磷酸酶对所述PCR扩增产物进行处理，去除反应体系中游离的核苷酸；
步骤e、将虾碱性磷酸酶处理后的PCR产物进行体外转录和RNase A酶切；
步骤f、将步骤e所得体外转录和RNase A酶切的产物进行纯化，芯片点样及质谱检测分析。
本方法将待测DNA经过亚硫酸氢盐转化后，利用上述37对PCR扩增引物进行PCR扩增后，引入T7-启动子，再经T7DNA聚合酶的体外转录过程得到RNA产物，然后经RNase A酶切处理后，可得到RNA小片段，再通过芯片点样及质谱检测分析，即可获得每个CpG位点甲基化程度。
优选地，所述质谱检测分析为采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析法能够检测单个CpG位点甲基化水平，并且能够同时检测多个CpG位点。线粒体基因组内共含有435个CpG位点，本发明通过碱基特异性切割结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析法能够检测到线粒体基因组内292个CpG位点，与现有技术相比，能够更灵敏而准确获得待测人类组织、细胞或血液的线粒体基因组甲基化的水平。
优选地，步骤c还包括采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行特异性检验，若获得多条明亮的目的条带且无拖尾现象，则证明PCR扩增产物特异性良好，以便保证最终结果的准确性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种用于人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒，包括37对PCR扩增引物，所述37对PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.74所示。试剂盒中还包括血液抽提试剂盒(QIAamp Blood Midi Kit，QIAGEN)、DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit，ZYMO)、PCR扩增试剂盒(PCR Accessory Set，SEQUENOM)、体外转录和碱基特异性酶切试剂盒(MassCLEAVE Kit，SEQUENOM)、PCR产物纯化和质谱检测试剂盒(Spectro Arrays and Clean Resin Kit，SEQUENOM)。
实施例2
本发明实施例提供了一种人类线粒体基因组甲基化的检测方法，包括以下操作步骤：
a)收集样本，提取DNA
采用QIAamp Blood Midi Kit试剂盒，提取待测组织、细胞或血液样本的DNA。用分光光度计对于提取所得DNA进行定量检测，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带≥20kb，电泳主带无明显降解，A260/A280＝1.7～2.1，总量不小于2ug。质检合格的DNA分装，-20℃储存备用。
b)亚硫酸氢盐处理DNA
用EZ DNA Methylation-Gold Kit对DNA进行亚硫酸氢盐转化。
(1)Wash Buffer溶液中加24ml无水乙醇，室温保存；
(2)CT Conversion Reagent中加入900ul无核酶水、300ul M-Dilution Buffer和50ul M-Dissolving Buffer，充分混匀至完全溶解，室温保存。
(3)取1.5ug DNA样品，用无核酶水补足至20ul，加130ul配制好的CT ConversionReagent溶液，混匀；在PCR仪上进行孵育，程序是：98℃，10min；64℃，2.5h；4℃forever；
(4)取EZ纯化柱，编号，加550ul M-Binding Buffer柱中，将(3)中孵育好的样品转移到对应的纯化柱中，颠倒混匀后13000rpm离心30sec；
(5)弃去离心后的上清液，加100ul Wash Buffer，13000rpm离心30sec；
(6)弃去离心后的上清液，加190ul M-Desuphonation Bffer，室温放置15min，13000rpm离心30sec；
(7)弃去离心后的上清液，加200ul Wash Buffer，13000rpm离心30sec；重复一次；
(8)弃去离心后的上清液，空离，13000rpm离心1min；
(9)将EZ纯化柱放在一个干净的1.5ml离心管中，加20ul M-Elution Buffer，室温放置10min，13000rpm离心1min；
(8)测定亚硫酸氢盐处理后的样品浓度。
c)PCR扩增
用PCR扩增试剂盒(PCR Accessory Set，SEQUENOM)对亚硫酸氢盐转化后的DNA进行PCR扩增，该PCR扩增试剂盒中包括37对PCR扩增引物，所述37对PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.74所示。当需进行多重扩增时，则将引物进行前期准备，将5’-Primer及3’-(T7)Primer混合成Primer Mix作为引物混合物，终浓度均为1μmol/L。PCR扩增体系见表1，PCR循环程序见表2。
表1
表2
PCR扩增后，取1ul PCR产物，用2％琼脂糖凝胶进行电泳检验，获得多条明亮的目的条带且无拖尾现象。
d)虾碱性磷酸酶(SAP)处理
采用MassCLEAVE Kit中的虾碱性磷酸酶(SAP)对步骤c)所得扩增产物进行处理，去除反应体系中游离的核苷酸。按表3配制虾碱性磷酸酶处理体系，将配好的体系充分混匀，1000rpm，4℃离心1min，放入PCR仪，PCR仪程序：37℃，20min；85℃，5min；4℃，forever。
表3
e)体外转录(IVT)和RNase A酶切
用MassCLEAVE Kit将经虾碱性磷酸酶处理的PCR产物进行体外转录和RNase A酶切，获得不同片段长度的转录产物。配制体外转录及RNase A酶切处理体系见表4，将配好的体系充分混匀，1000rpm，4℃离心1min，放置PCR仪中进行孵育，孵育条件：37℃，3h；4℃，forever。
表4
f)纯化、点样及质谱分析
用Spectro CHIP Arrays and Clean Rrsin Kit对步骤e)所得转录产物进行纯化。
(1)将酶切后的转录产物进行离心，1000rpm，4℃离心1min；
(2)加入18ul无核酶水使用移液器吹打5～6下，使混合均匀，1000rpm，4℃离心1min；
(3)加6mg树脂于样品中，放进杂交炉，室温，10rpm，30min，使树脂与样品充分作用；
(4)3000rpm，4℃离心3min。
芯片点样及质谱检测：使用点样仪(MassARRAY Nanodispenser RS1000，SEQUENOM)将纯化后产物点至384格式的芯片(SpectroCHIP，SEQUENOM)上，将点制好的芯片放入MassARRAY Compact System(SEQUENOM)进行检测。SpectroCHIP芯片使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization–time offlight，MALDI-TOF)分析技术，检测数据通过EpiTYPER软件(SEQUENOM)分析并输出结果。线粒体基因组内292个CpG位点的具体信息见表5。
表5
由结果可见，本发明实施例提供的人类线粒体基因组甲基化的检测方法能够检测到线粒体基因组内292个CpG位点，从而能够更准确地反应出人类线粒体基因组甲基化的水平。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学
<120> 一种质谱法检测人类线粒体基因组甲基化的试剂盒及其应用
<130> 20180528
<160> 74
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cagtaatacg actcactata gggagaaggc tatctacaca accactttcc acacaa 56
Claims (9)
1.一种人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括PCR扩增试剂盒，所述PCR扩增试剂盒中包括37对PCR扩增引物，所述37对PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.74所示。
2.根据权利要求1所述的人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括体外转录和碱基特异性酶切试剂盒。
3.根据权利要求2所述的人类线粒体基因组甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述体外转录和碱基特异性酶切试剂盒中包含虾碱性磷酸酶和RNase A。
4.根据权利要求2所述的检测人类线粒体基因组甲基化的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括PCR产物纯化试剂盒。
5.根据权利要求4所述的检测人类线粒体基因组甲基化的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括血液抽提试剂盒、DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒。
6.一种人类线粒体基因组甲基化的检测方法，其特征在于：用权利要求4或5所述检测试剂盒以及质谱分析方法对人类线粒体基因组甲基化进行检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法至少包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测组织、血液或细胞的全基因组DNA；
步骤b、对所述全基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化；
步骤c、用权利要求1中所述37对PCR扩增引物对亚硫酸氢盐转化后的所述全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤d、采用虾碱性磷酸酶对所述PCR扩增产物进行处理，去除反应体系中游离的核苷酸；
步骤e、将虾碱性磷酸酶处理后的PCR产物进行体外转录和RNase A酶切；
步骤f、将步骤e所得体外转录和RNase A酶切的产物进行纯化，芯片点样及质谱检测分析。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述质谱检测分析为采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：步骤c还包括采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行特异性检验。
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