CN111088350A - Mt2基因启动子区甲基化用检测引物与检测方法以及应用 - Google Patents

Mt2基因启动子区甲基化用检测引物与检测方法以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种MT2基因启动子区甲基化用检测引物与检测方法以及应用，本发明的MT2基因启动子区甲基化用检测方法可以方便快捷地在分子水平上实现对抑郁症患者睡眠障碍的预测。本发明把用于检测MT2基因启动子甲基化程度与使用多导睡眠监测仪相结合，应用配对样本T检验对数据分析，预测抑郁症患者的睡眠障碍。通过新颖的甲基化检测方法，使MT2基因与多导睡眠监测仪相结合实现对抑郁症患者睡眠障碍预测，从而在全面、综合地考察抑郁症的睡眠障碍相关标记物的同时，实现标记物的合理筛选。

Description

MT2基因启动子区甲基化用检测引物与检测方法以及应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是指一种MT2基因启动子区甲基化用检测引物与检测方法以及应用。
背景技术
抑郁症是最常见的精神障碍，已位居中国疾病负担的第二位。睡眠障碍是抑郁症最常见的症状之一。90％以上的抑郁症患者存在不同程度的睡眠障碍。睡眠障碍与患者的低生命质量、社会功能缺陷、心血管疾病和高自杀率相关。多导睡眠图是目前临床上检测睡眠障碍的标准方法。然而，临床上尚缺乏预测抑郁症患者出现睡眠障碍的方法。因此，建立预测抑郁症患者睡眠障碍的技术方法，对抑郁症的诊疗有重大意义。
抑郁症是最常见的精神障碍，已位居中国疾病负担的第二位。睡眠障碍是抑郁症最常见的症状之一。90％以上的抑郁症患者存在不同程度的睡眠障碍。睡眠障碍与患者的低生命质量、社会功能缺陷、心血管疾病和高自杀率相关。其中早醒是抑郁症最具特异性的睡眠障碍。多导睡眠图显示为睡眠各期时相转换增多，I期睡眠增多，睡眠效率及睡眠维持率降低；慢波睡眠减少，快速动眼潜伏期缩短，快速动眼睡眠时程延长及快速动眼密度增加等快速动眼活力增强的表现。快速动眼潜伏期缩短被认为是重症抑郁的精神生物学指标。睡眠障碍的发生率和严重程度部分取决于抑郁症的严重程度。
抑郁症可导致褪黑素的合成减少。褪黑素作为一种节律信号，可以矫正人体生物钟，改善抑郁症患者睡眠和调整昼夜节律。通过与褪黑素受体2(MT2)结合，增加下丘脑GABA的含量，促进下丘脑GABA的释放，通过GABA受体起到缩短睡眠潜伏期和延长睡眠时间的作用。还可减少促肾上腺皮质激素释放激素等的分泌，负调节HPA轴，降低应激时血皮质醇浓度，从而调节生物钟发挥调节昼夜节律睡眠觉醒周期的独特作用，治疗睡眠节律障碍，改善睡眠，血浆褪黑素水平的高低具有作为抑郁症诊断标准的价值。
抑郁症出现睡眠障碍是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，表观遗传修饰可以为环境因素与基因组的相互作用机理提供直接的解释。DNA甲基化是最常见的表观遗传学修饰，启动子区域甲基化抑制基因转录，表现为外周蛋白质水平降低。DNA甲基化调节基因表达，引起抑郁症的发生。生物昼夜节律与睡眠障碍相关基因同样存在DNA甲基化差异。与对照组相比，抑郁症患者大部分脑区基因表达下调，基因启动子区存在高度DNA甲基化。
发明内容
本发明提出一种MT2基因启动子区甲基化用检测引物与检测方法以及应用，对现有技术中抑郁症出现的睡眠障碍的预测具有重要作用。
本发明的技术方案是这样实现的：一种MT2基因启动子区甲基化用检测引物，包括用于MT2基因启动子PCR扩增的上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为：SEQID NO.1，所述下游引物的核苷酸序列为：SEQ ID N0.2。
一种MT2基因启动子区甲基化用检测方法，包括以下步骤：步骤1，采集抑郁症患者静脉血，提取基因组DNA；步骤2，重亚硫酸盐处理DNA样品，低速短暂离心备用；步骤3，以步骤2中的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物扩增MT2基因启动子，获得PCR扩增产物；步骤4，琼脂糖凝胶电泳检测扩增成功的样品；步骤5，将扩增成功的样品进行SAP反应；步骤6，T切/RNase A消化反应；步骤7，树脂纯化；步骤8，芯片点样；步骤9，将点样后的芯片使用MALDI-TOF分析，计算出DNA样品的甲基化程度。
进一步，步骤1中采集抑郁症患者的静脉血和药物治疗后的静脉血，分别提取基因组DNA，每种静脉血至少提取两个样本。
进一步，步骤3中使用的PCR反应组分还包括双蒸水、10×PCR缓冲液、脱氧核苷、PCR扩增酶。
进一步，PCR反应组分中各组分的含量为双蒸水5.7μL、10×PCR缓冲液1μL、脱氧核苷1.5μL、5U/μL PCR扩增酶0.2μL、10pmol/μL上游引物0.3μL、10pmol/μL下游引物0.3μL、DNA模板1μL；PCR反应程序为A-95℃处理5min、B-95℃处理30sec、C-57℃处理40sec、D-72℃处理1min、E-72℃处理3min、F-4℃处理不小于30min，其中B、C、D循环45次。
进一步，步骤5中SAP的反应组分为去RNA酶双蒸水、SAP酶以及PCR产物。
进一步，SAP的反应组分各组分的含量为去RNA酶双蒸水2μL、SAP酶0.5μL以及PCR产物4.5μL，SAP反应程序为37℃处理25min、85℃处理5min、4℃处理不小于30min。
进一步，步骤6中T切/RNase A消化反应的反应组分为去RNA酶双蒸水、5×T7聚合酶缓冲液、T裂解混合液、二硫苏糖醇、T7 RNA&DNA聚合酶、核糖核酸酶以及PCR/SAP混合物。
进一步，T切/RNase A消化反应的反应组分中各组分的含量为去RNA酶双蒸水3.20μL、5×T7聚合酶缓冲液0.89μL、T裂解混合液0.21μL、100mM二硫苏糖醇0.23μL、T7 RNA&DNA聚合酶0.42μL、核糖核酸酶0.05μL以及PCR/SAP混合物2.00μL。
一种MT2基因启动子区甲基化检测方法的应用于预测患者是否患有抑郁症以及检测抑郁症患者患病程度。
本发明的有益效果为：本发明的MT2基因启动子区甲基化用检测方法可以方便快捷地在分子水平上实现对抑郁症患者睡眠障碍的预测。本发明MT2基因启动子区甲基化用检测方法利用MassARRAY的MALDI-TOF具有灵敏度高、准确度高及分辨率高，而且无需任何荧光标记，每个反应覆盖长达100-700bp多个CpG位点的目标序列，得到单个的CpG unit或CpG site的甲基化程度定量信息定量数据的标准差为0.05，既可检测低至5％的甲基化水平等特点、优点。避免了以往多个甲基化分析中的多个缺点：对甲基化不敏感、仅可定量几个已知CpG位点甲基化，且只能获得特殊酶切位点的甲基化情况等缺点。
第二、本发明把用于检测MT2基因启动子甲基化程度与使用多导睡眠监测仪相结合，应用配对样本T检验对数据分析，预测抑郁症患者的睡眠障碍。通过新颖的甲基化检测方法，使MT2基因与多导睡眠监测仪相结合实现对抑郁症患者睡眠障碍预测，从而在全面、综合地考察抑郁症的睡眠障碍相关标记物的同时，实现标记物的合理筛选。本方法对抑郁症人群出现睡眠障碍的早期预测和预后提供有利的技术支持。
第三、通过MT2基因启动子区甲基化程度的检测能够很好的判断患者抑郁症的程度以及预测是否患有抑郁症，以便早期治疗。
本发明MT2基因启动子的PCR扩增引物特异性强避开了GC区域，并且具有灵敏度高、扩增迅速，扩增效率高，非特异性产物量少的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明DNA样本PCR扩增后的凝胶电泳图；
图2为本发明MT2基因启动子区甲基化的检测方法的应用流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一.样品制备收集包括筛选入组符合DSM-IV诊断标准的抑郁症患者，汉密尔顿抑郁量表17项(HAMD-17)≥17分；3.年龄≥18岁。排除标准(如果受试者不能符合其中任何一条)：1.其他严重的神经精神疾病(阿尔兹海默病、精神分裂症、双向情感障碍等等)；2.排除物质依赖与滥用者，尼古丁与酒精使用除外；3.重度营养不良以及内分泌、严重心、肾功能疾病(肾病综合征、急慢性肾衰等)；4.服用相关药物过敏史；5.肿瘤和和其他系统性疾病。
二.基线(艾司西酞普兰片治疗前5日内)：对入组的抑郁症患者记录一般情况资料(住院病历摘录)，使用多导睡眠监测仪测量其睡眠。采集静脉血，提取基因组DNA。
三.在艾司西酞普兰片治疗后28±5日(第二次)时，使用HAMD-17工具测量其抑郁程度。以多导睡眠监测仪测量其睡眠。采集静脉血，提取基因组DNA。
四.提取的DNA放置-80°冰箱内保存。重亚硫酸盐处理后利用实时荧光定量PCR扩增后，测定MT2基因甲基化修饰程度。
PCR扩增所用引物使用EpiDesigner软件进行设计，并人工合成上游引物与下游引物。
步骤一.低渗盐析法提取基因组DNA；
步骤二.NaHSO3处理待检测DNA样品；
步骤三.Agena MassArray系统甲基化检测步骤
1、PCR扩增反应
1)样本进行NaHSO3处理后，将样本DNA中没有甲基化的C全部转化为U(相当于DNA中的T)，低速短暂离心备用。
2)按表1所示配制PCR反应溶液(反应体系配制过程在冰上完成，防止在高温中长时间暴露而失活)。
表1.Agena MassArray系统甲基化检测扩增PCR反应组分
Figure BDA0002390147370000051
3)扩增PCR反应程序：
Figure BDA0002390147370000052
Figure BDA0002390147370000061
4)取PCR产物3μ1与1μl 6*loading buffer混匀，用1.5％琼脂凝胶电泳检测，160V、20min后观察结果，如结果良好可继续后续实验。
5)样本扩电泳图用以区分PCR扩增成功与否，B05、A08、A09与A10无扩增条带扩增失败，A03、B03、A04、B04、A05、B05、A06、B06、A07、B07为治疗后样本，A08、B08、A09、B09、A10、B10、A11、B11、A12、B12为治疗前样本。
2、SAP反应
1)SAP反应体系如下(表2)：
表2.MassArray系统甲基化检测SAP反应组分
试剂 每试剂终体积
去RNA酶双蒸水 2.00μL
SAP酶 0.50μL
PCR产物 4.50μL
总体积： 7.00μL
2)384反应板的每个孔中加入7μl SAP反应液，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序。
3)SAP反应程序：
37℃ 25min
85℃ 5min
4℃ 不小于30min
3、T切/RNase A消化反应，利用RNase A能够特异性识别并切割RNA中U 3’端的特性，将RNA片段切割成携带有CpG位点的小片段。
1)T切/RNase A消化反应体系如下(表3)：
表3.T切反应/RNase A消化反应组分
Figure BDA0002390147370000062
Figure BDA0002390147370000071
2)T切/RNase A消化反应条件：37℃孵育3h。
4、树脂纯化
1)在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。
2)向384样本板的每个孔中加16μl水。
3)将384样本板轻扣在Dimple板上，翻转后轻敲使树脂使之落入样本板的每个孔中。
4)将384样本板用封口膜密封后置于翻板离心机中室温旋转混匀30分钟。
5、芯片点样：启动MassARRAY NanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的产物移至384-well
Figure BDA0002390147370000072
bioarray上。
6、Massarray分析及数据输出。同一片段中，只有CpG和CpA之间16Da的分子量差别，即质谱图中两者峰的差距。将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析。检测结果使用EpiTYPERTM软件获取原始数据和圆点图，并检查数据文件的完整性和准确性。将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。
五.处理数据：对抑郁症患者治疗前后多导睡眠监测仪数据与MT2基因启动子甲基化水平的差异进行配对t检验；对抑郁症患者治疗前后多导睡眠监测仪数据与MT2基因启动子甲基化水平进行相关和回归分析。
六.甲基化程度根据原始数据是根据MALDI-TOF分析含G峰和含A峰的面积比较，计算出待检样品甲基化及非甲基化程度，属于两者相对定量比值。如B08与B09在第461bp附近处CpG_45的甲基化程度为0.19与0.15；A06与B06样本在第461bp处CpG_45的甲基化程度为0.07与0.01。用药后的MT2基因启动子甲基化程度降低。用药后睡眠效率增高，给药前睡眠效率80.09±7.705％，给药后睡眠效率88.36±3.432％，给药前后睡眠效率(％)具有显著性差异p＜0.001；用药后入睡潜伏期缩短，给药前入睡潜伏期39.60±20.17min，给药后入睡潜伏期32.45±11.23min，给药前后入睡潜伏期(min)具有显著性差异p＝0.039；用药后N1期睡眠效率降低，给药前N1期睡眠效率23.53±8.492％，给药后N1期睡眠效率9.74±7.803％，给药前后N1期睡眠效率具有显著性差异p＜0.001；用药后N2期睡眠效率增高，给药前N2期睡眠效率49.07±9.581％，给药后N2期睡眠效率61.68±3.632％，给药前后N2期睡眠效率具有显著性差异p＜0.001；用药后N3期睡眠效率增高，给药前N3期睡眠效率11.49±3.308％，给药后N3期睡眠效率13.18±2.851％，给药前后N3期睡眠效率具有显著性差异p＝0.011；用药后觉醒指数降低，给药前觉醒指数14.20±3.810，给药后觉醒指数12.53±4.046，给药前后觉醒指数具有显著性差异p＝0.045。其中N3期睡眠为深睡眠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002390147370000081

Claims (10)

1.一种MT2基因启动子区甲基化用检测引物，其特征在于：包括用于MT2基因启动子PCR扩增的上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，所述下游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。
2.一种MT2基因启动子区甲基化用检测方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，采集抑郁症患者静脉血，提取基因组DNA；步骤2，重亚硫酸盐处理DNA样品，低速短暂离心备用；步骤3，以步骤2中的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物扩增MT2基因启动子，获得PCR扩增产物；步骤4，琼脂糖凝胶电泳检测扩增成功的样品；步骤5，将扩增成功的样品进行SAP反应；步骤6，T切/RNase A消化反应；步骤7，树脂纯化；步骤8，芯片点样；步骤9，将点样后的芯片使用MALDI-TOF分析，计算出DNA样品的甲基化程度。
3.如权利要求2所述的MT2基因启动子区甲基化的检测方法，其特征在于：步骤1中采集抑郁症患者的静脉血和药物治疗后的静脉血，分别提取基因组DNA，每种静脉血至少提取两个样本。
4.如权利要求2所述的MT2基因启动子区甲基化的检测方法，其特征在于：步骤3中使用的PCR反应组分还包括双蒸水、10×PCR缓冲液、脱氧核苷、PCR扩增酶。
5.如权利要求4所述的MT2基因启动子区甲基化的检测方法，其特征在于：PCR反应组分中各组分的含量为双蒸水5.7μL、10×PCR缓冲液1μL、脱氧核苷1.5μL、5U/μL PCR扩增酶0.2μL、10pmol/μL上游引物0.3μL、10pmol/μL下游引物0.3μL、DNA模板1μL；PCR反应程序为A-95℃处理5min、B-95℃处理30sec、C-57℃处理40sec、D-72℃处理1min、E-72℃处理3min、F-4℃处理不小于30min，其中B、C、D循环45次。
6.如权利要求2所述的MT2基因启动子区甲基化的检测方法，其特征在于：步骤5中SAP的反应组分为去RNA酶双蒸水、SAP酶以及PCR产物。
7.如权利要求6所述的MT2基因启动子区甲基化的检测方法，其特征在于：SAP的反应组分各组分的含量为去RNA酶双蒸水2μL、SAP酶0.5μL以及PCR产物4.5μL，SAP反应程序为37℃处理25min、85℃处理5min、4℃处理不小于30min。
8.如权利要求2所述的MT2基因启动子区甲基化的检测方法，其特征在于：步骤6中T切/RNase A消化反应的反应组分为去RNA酶双蒸水、5×T7聚合酶缓冲液、T裂解混合液、二硫苏糖醇、T7 RNA&DNA聚合酶、核糖核酸酶以及PCR/SAP混合物。
9.如权利要求8所述的MT2基因启动子区甲基化的检测方法，其特征在于：T切/RNase A消化反应的反应组分中各组分的含量为去RNA酶双蒸水3.20μL、5×T7聚合酶缓冲液0.89μL、T裂解混合液0.21μL、100mM二硫苏糖醇0.23μL、T7 RNA&DNA聚合酶0.42μL、核糖核酸酶0.05μL以及PCR/SAP混合物2.00μL。
10.一种MT2基因启动子区甲基化检测方法的应用于预测患者是否患有抑郁症以及检测抑郁症患者患病程度。
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