CN108315418A

CN108315418A - 结直肠癌诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒

Info

Publication number: CN108315418A
Application number: CN201810211236.8A
Authority: CN
Inventors: 吴安东; 刘长宁; 宁争志
Original assignee: Shenzhen Tai Ke Health Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Taike Aerospace Intelligent Kangyang Technology Shenzhen Co ltd
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: CN108315418B

Abstract

本发明公开了诊断、筛查与预测男性结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列的如下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合发生甲基化：+22、+27和+29；(2)‑24、‑18、+89和+92；(3)+136，所述序列编号是基于SEQ ID NO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1。本发明还公开了检测所述DNA甲基化标志物的探针、方法和试剂盒，以及利用上述DNA甲基化位点的数据预测男性结直肠癌发生风险的计算机模块。

Description

结直肠癌诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒

技术领域

本发明涉及疾病检测领域；更具体而言，本发明涉及一种通过外周血细胞DNA甲基化检测进行结直肠癌诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒。

背景技术

我国结直肠癌发病率和死亡率分别位居所有肿瘤发病率和死亡率的第5位，对于癌症，早期筛查的意义远超治疗。常规的结直肠癌诊断的金标准是肠镜，但创伤性，心理感受较痛苦，病人普遍比较抗拒；便潜血试验则需要多次采样，会给病人带来很多不便，从而造成受检者筛查意愿降低，依从性差。肿癌标志物的血液学检查，具有无创、采样方便的特点，可以大大提高受检者的依从性。如果能够有方法对结直肠癌的发生或复发风险进行评估，对于结直肠癌的防治而言，无疑更具意义。

核糖体蛋白为核糖体重要组成部分之一，其在蛋白翻译过程中有重要作用。研究表明，核糖体蛋白异常能导致多种疾病的发生，如先天性再生障碍性贫血、肿瘤等，具体机制尚不清楚。

发明内容

发明人通过Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析技术研究结直肠癌患者外周血细胞RPS24基因甲基化水平与结直肠癌发生的关联，探讨其与结直肠癌发生、作为早期筛查标志物的应用前景。

经过努力，发现了人的体液中基因RPS24转录起始点前后序列中的多个DNA甲基化位点与男性结直肠癌发生显著相关。

因此，在第一方面，本发明提供了预测男性结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列的如下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合发生甲基化：

(1)+22、+27和+29；

(2)-24、-18、+89和+92；

(3)+136，

所述序列编号是基于SEQ ID NO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1。

在一个实施方案中，所述RPS24基因的核苷酸序列参见Genbank数据库(Gene ID:6229)。

在一个实施方案中，所述DNA甲基化标志物位于SEQ ID NO.1所示的核苷酸区段中。

在第二方面，本发明提供了用于检测本发明的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增含有本发明第一方面中第(1)组；第(1)组和第(2)组；或第一组(1)和第(3)组的DNA甲基化标志物的序列。

在一个实施方案中，所述引物对为扩增SEQ ID NO.1的引物对。

在一个实施方案中，所述引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

在第三方面，本发明提供了一种检测本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的方法，所述方法包括

1)提取DNA样品，

2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，

3)用本发明第二方面所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物，

4)对所述扩增产物进行消化(例如采用SAP酶)，

5)对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，

6)采用质谱方法对所述转录和酶切产物进行检测，获得样品序列中本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。

在一个实施方案中，在5)中包括对所述转录和酶切产物进行纯化。

在一个实施方案中，所述质谱方法是飞行质谱方法。

在第四方面，本发明提供了一种DNA甲基化标志物检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的引物对；所述试剂盒或者包括涵盖本发明第一方面中所述的甲基化位点的探针序列，其中本发明的CpG位点中的C保持不变或者被T替换。

在第四方面，本发明提供了一种利用本发明第一方面所述DNA甲基化位点的数据预测男性结直肠癌发生风险的计算机模块，所述计算机模块包括：DNA甲基化值情况接收模块、数据存储模块、用于诊断、筛查与预测男性结直肠癌发生风险的处理器模块和用于输出结果的输出模块，其中，所述数据存储模块存储接收到的数据、本发明第一方面所述的CpG甲基化情况，所述用于预测男性结直肠癌发生风险的处理模块将所接收的DNA甲基化情况与本发明第一方面所述的CpG甲基化情况进行比较。

在第五方面，本发明提供了一种利用本发明第一方面所述DNA甲基化标志物或者本发明第二所述的引物对用于男性癌症诊断、筛查与风险预测的用途，例如制备用于男性癌症诊断、筛查与风险预测的试剂的用途。

在第六方面，本发明提供了一种采用基因芯片对基因组中序列为SEQ ID NO.1的片段进行检测方法。优选地，所述检测包括对基因组中序列为SEQ ID NO.1的片段进行CG位点进行甲基化情况的检测。

本发明对基因RPS24转录起始点前后序列甲基化与男性结直肠癌之间的相关性进行评估，设计了一对引物，该引物扩增的DNA序列中覆盖了个DNA甲基化位点，利用此引物可对其中的DNA甲基化位点进行检测，评估男性结直肠癌的发生风险。

本发明的方法有如下优点：1)本发明选择检测的甲基化位点分布于基因RPS24转录起始点前后序列上，与男性结直肠癌发生显著相关，可对男性发生结直肠癌的风险进行预测。2)本方法具有检测方便，成本低廉、高通量的特点，适合推广。

附图说明

图1：基因RPS24转录起始点前后序列检测区段甲基化水平对比图(结直肠癌组与对照组)

图2：60例健康对照组RPS24基因检测区段甲基化水平男女对比图

图3：男性结直肠癌组(24例)与男性健康对照组(23例)RPS24基因甲基化水平对比图

图4：男性特异性直肠预测模型。

具体实施方式

人类核糖体蛋白S24(RPS24)基因包括6个外显子，其编码核糖体蛋白S24，是核糖体蛋白40s组成部分。已有体外细胞研究表明，RPS24基因异常表达与结直肠癌细胞增殖、转移相关，具体机制尚不清楚。本发明人发现了结直肠癌与基因RPS24第一外显子转录起始点前后序列的甲基化有关。发明人推测，基因RPS24可能是通过DNA甲基化调控基因表达，而这是导致结直肠癌发生的重要因素之一。

本发明人发现，基因RPS24转录起始点前后序列如下位置CpG三组中，第(1)组以及第(1)组与第(2)组或第(3)组组合：(1)+22、+27和+29；(2)-24、-18、+89和+92；(3)+136(所述序列编号是基于SEQ ID NO.1中所示序列的编号，其中第143位转录起点开始的A为+1)与男性结直肠癌发生有关，因此这些序列的甲基化位点可以作为男性预测结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，用于对癌症诊断、筛查与风险预测中，例如制备用于癌症诊断、筛查与风险预测的试剂。对于男性而言，第(1)组以及第(1)组与第(2)组区段甲基化水平显著高说明有结直肠癌组；这种情况并不适用于女性。

不希望拘囿于任何理论，但发明人认为，这段序列的活跃程度决定了结直肠癌的发生。通过甲基化，恰当地阻断了有关基因的表达，从而避免结直肠癌发生。因此，这些序列的甲基化状态可以反映结直肠癌的情况。发明人通过实验数据证实了这一点。

在本发明中，对于基因RPS24转录起始点前后序列的DNA序列编号基于SEQ IDNO.1，其中第143位转录起点开始的A为+1。

在本发明中，由于甲基化的CpG在经亚硫酸盐处理后C会变成U，所以利用其中本发明的CpG位点中的C保持不变或者被T替换的两种探针序列的杂交情况可以得出该CpG位点的甲基化情况。

在本发明中，所述计算模块可以直接安装在检测设备上、手机app上、电脑软件上。例如，安装在便携设备中(例如可穿戴设备)，通过无线接收或者手动输入DNA甲基化位点的数据，通过计算从而实现远端预测男性结直肠癌发生风险。

所述计算模块也可作为app组成部分安装在移动电话中，通过无线接收或者手动输入DNA甲基化位点的数据，通过计算从而实现远端预测男性结直肠癌发生风险。

所述计算机模块也可作为软件的组成部分安装在计算机上，输入数据后通过计算得到男性结直肠癌发生风险。

在本发明中，预测男性结直肠癌发生风险的计算机模块是按如下方式工作的：

在本发明中，大约是指基础值的上下5％。

列举以下实例，说明本发明检测甲基化的实施方式，但这些描述不限制本发明的适用范围。

1、受试者选取和取样

结直肠癌组：发明人收集经电子肠镜确诊为结直肠癌患者49例，男：24例，女：25例，平均年龄：61.92±12.76岁，排除高血压、糖尿病、心脏病等；健康对照组：60例，男：23例，女：37例，平均年龄：59.10±13.44岁，电子肠镜未发现结直肠占位性病变，排除高血压、糖尿病、心脏病等健康患者。结直肠癌组与对照组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经伦理委员会审核批准，在采集外周血前宣教本研究的目的和意义，所有实验对象均签署知情同意书。患者均采集外周静脉血4mL，结直肠癌患者组在确诊肠癌后，手术治疗前空腹采集；健康对照组体检完成未发现结直肠占位性病变后空腹采集。所采集血标本按顺序统一编号以盲态检测。

2、SEQUENOM甲基化检测实验流程与方法

主要仪器与试剂

基因扩增：ABI GeneAmp9700 384 Dual；

质谱点样：MassARRAY Nanodispenser RS1000；

质谱分析：MassARRAY Compact System；

试剂：EpiTYPERRT Complete Reagent Set。

步骤阐述：

1)引物合成

根据预实验结果，预筛选Illumina HUMAN甲基化450K芯片探针cg23620279所在基因位置注释信息，进行特定基因启动子区CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)片段扫描及特异性PCR引物设计，所设置引物中不含有CpG位点。利用HPLC方法合成引物对：SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3。在反向引物5ˊ-末端整合T7-启动子序列(SEQ ID NO.2：cagtaatacgactcactatagggagaaggctAACCCAAAAAAACTCACCATAATAA，小写字母所示)，在正向引物5ˊ-末端加入正向引物(SEQ ID NO.3：aggaagagagTTGGTTTTGGATTGGTTAGTTTAGA)，平衡PCR反应体系。

2)DNA样品提取和DNA样品质检

(1)DNA样品提取

按照QIAmap Mini(Qiagen,Valencia,CA)全血提取试剂盒的说明书进行对样本DNA提取，所取得纯化后样品置于-20℃保存。

(2)DNA质检

通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及是否降解；

通过NANODROP检测DNA浓度及纯度。

3)亚硫酸盐处理DNA样品

严格按照Methyl Detector^TM Bisulfite Modification Kit说明书的步骤对样品DNA进行亚硫酸盐转换及纯化。经亚硫酸盐处理后DNA中尚未发生甲基化的胞嘧啶(C)转换成尿嘧啶(U)，而已经发生甲基化的胞嘧啶(C)不能转换成尿嘧啶(U)保持不变。

4)PCR反应

反应体系：

以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，以上述序列为引物。反应条件：预变性94℃15min；变性94℃20sed；退火56-64℃30sed；延长72℃1min；一共45个循环；总延长72℃3min；4℃保存。PCR产物纯化：用碱性磷酸酶处理PCR产物。体外转录及RNase A特异性酶切反应：本实验使用T切反应对样本进行切割，同时进行体外转录与酶切反应。脱盐处理：运用洁净树脂对产物进行脱盐处理。Dispensing点样：用MassARRAY^TMNanodispenser RS 1000/Fusio(RS1000/Fusio点样仪)将样本点到SpectroCHIP(芯片)上。甲基化检测：使用Sequenom MassARRAY甲基化检测软件自定义归类方法对19个检测区段(甲基化芯片探cg23620279_CPG_1-19见表1，基于SEQ ID NO.1:

CTGGTTCTGGATTGGTCAGTCTAGAGTTCCAGGGGTGTGGCCAAAAGTCTGTGAGGCGGGGCCGTAGGCAGCCTAAATCAGGCATCGGCGCGGTCAGCCTCGTGGCGCGCCCACGCCCCCACGCCGGCTCTTCCCGGGGTCCTTCCGTGCGCGTTGATATGATTGGCCGGCGAATCGTGGTTCTCTTTTCCTCCTTGGCTGTCTGAAGATAGATCGCCATCATGGTGAGTCTCCCTGGGCC(起始密码子ATG(下划线)：position+143，转录起点AGG(斜体)为+1，此区域包括RPS24基因序列的-80至+162区段)。严格按照MassARRAY系统平台要求使用Sequenom自动化检测技术对RPS基因进行甲基化检测，收集质谱图，利用EpiTyPER软件完成数据分析。最终获得6组位点有效数据，包括CpG_1.2，CpG_3.4.5，CpG_6.7.8，CpG_9，CpG_16.17，CpG_19。

表1：Sequenom MassARRAY自定义CpG岛位点归类分组

4)统计学方法：采用R语言软件(版本3.4.1)进行统计，运用t检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1结直肠癌组与健康对照组RPS24基因检测区段甲基化水平对比

图1中49例结直肠癌与60例对照组进行t检验，可以看出以上6组CpG位点无统计显著差异(P>0.05)。

2.2 60例健康对照组中男性与女性RPS24基因甲基化水平对比

图2中CpG1.2，CpG3.4.5,CpG6.7.8,CpG9,CpG16.17女性甲基化水平显著高于男性(P<0.05)。CpG19女性甲基化水平高于男性，但差异无统计学差异(P>0.05)。

2.3男性中结直肠癌组与健康对照组RPS24基因甲基化水平对比

图3中CpG1.2，CpG6.7.8，CpG16.17三组CpG岛位点结直肠癌组甲基化水平显著高于健康对照组(P<0.05)。CpG3.4.5,CpG9,CpG19三组位点结直肠癌组甲基化水平高于健康对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4男性特异性直肠预测模型

图4中示出了基于基于该区段若干位点甲基化值建立线性拟合模型对癌症、对照组样本进行分类诊断的ROC曲线性能图。图中所示，基于CpG6.7.8，CpG19建立的模型，ROC曲线下面积AUC为0.8，该模型在特异性0.78的情况下对应的灵敏度为0.77。如果只用CpG6.7.8甲基化信息建立模型，AUC为0.76。值得注意的是，基于该基因区段所有位点的各种组合、计算，建立的诊断、筛查预警模型和试剂盒都在本专利的保护范围之内。

针对健康人、亚健康人群的健康监测、预警与肠癌风险筛查，或针对肠癌病人的治疗前中后的监测，发明人计算了该区段甲基化信息用于肠癌筛查的风险比值比(oddsratio)：基于cg23620279_CpG_6.7.8的甲基化程度beta值，以0.03为阈值，高于0.03为甲基化程度较高组，低于0.03为甲基化程度较低组，计算男性的肠癌风险比值比为8.4。即，甲基化程度高的男性，肠癌风险是甲基化程度低的男性的8.4倍。

本发明人的结果发现，对男女混合人群，所有检测区段甲基化水平结直肠癌组与健康对照组无显著差异(P>0.05)；对健康对照组人群，5个区段甲基化水平女性显著高于男性(P<0.05)；对男性人群，3个区段甲基化水平结直肠癌组显著高于健康对照组(P<0.05)；对女性人群，2个区段甲基化水平结直肠癌组显著低于健康对照组(P<0.05)。RPS24基因转录起始区多个区段甲基化可能与结直肠癌发生有关，且存在性别差异；研究检测的甲基化区段有望成为性别特异的结直肠癌诊断筛查潜在生物标志物。

序列表

<110> 深圳市太科健康科技有限公司

<120> 结直肠癌诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒

<130> CF170521S

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 241

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ctggttctgg attggtcagt ctagagttcc aggggtgtgg ccaaaagtct gtgaggcggg 60

gccgtaggca gcctaaatca ggcatcggcg cggtcagcct cgtggcgcgc ccacgccccc 120

acgccggctc ttcccggggt ccttccgtgc gcgttgatat gattggccgg cgaatcgtgg 180

ttctcttttc ctccttggct gtctgaagat agatcgccat catggtgagt ctccctgggc 240

c 241

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taacccaaaa aaactcacca taataa 56

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

aggaagagag ttggttttgg attggttagt ttaga 35

Claims

1.男性结直肠癌诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列中的如下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合发生甲基化：

(1)+22、+27和+29；

(2)-24、-18、+89和+92；

(3)+136，

2.用于检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增含有权利要求1或2中第(1)组；第(1)组和第(2)组；或第(1)组和第(3)组的DNA甲基化标志物的序列。

3.根据权利要求1的引物对，所述引物对用于扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸区段。

4.根据权利要求2或3的引物对，所述引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

5.检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的方法，所述方法包括

1)提取DNA样品，

2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，

3)用权利要求2-4任一项所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物，

4)对所述扩增产物进行消化(例如采用SAP酶)，

5)对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，

6)采用质谱方法对所述转录和酶切产物进行检测，获得样品序列中权利要求1所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。

6.一种DNA甲基化标志物检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2-4任一项所述的引物对；所述试剂盒或者包括涵盖权利要求1所述的甲基化位点的探针序列，其中本发明的CpG位点中的C保持不变或者被T替换。

7.一种利用权利要求1所述DNA甲基化位点的数据预测男性结直肠癌发生风险的计算机模块，所述计算机模块包括：DNA甲基化值情况接收模块、数据存储模块、用于预测男性结直肠癌发生风险的处理器模块和用于输出结果的输出模块，其中，所述数据存储模块存储接收到的数据、权利要求1所述的CpG甲基化情况，所述用于预测男性结直肠癌发生风险的处理模块将所接收的DNA甲基化情况与权利要求1所述的CpG甲基化情况进行比较。

8.权利要求1或2所述的DNA甲基化标志物或者权利要求2-4任一项所述的引物对用于癌症诊断、筛查与风险预测的用途。

9.一种采用基因芯片对基因组中序列为SEQ ID NO.1的片段进行检测方法。

10.根据权利要求9的方法，所述检测包括对基因组中序列为SEQ ID NO.1的片段进行CG位点甲基化程度的检测。