CN108424968A

CN108424968A - 结直肠癌的dna甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN108424968A
Application number: CN201810557079.6A
Authority: CN
Inventors: 李盛英; 陈颖; 罗浪; 宁争志; 龚伦军
Original assignee: Shenzhen Tai Ke Health Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Tai Ke Health Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2018-08-21

Abstract

本发明公开了结直肠癌的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒，所述标志物是基因FXYD1、DZIP3、RPS24、AKT2、UBTF、DAGLB、LPAR6、TP63、CX3CR1和TACC2序列的甲基化。本发明还公开了检测所述DNA甲基化标志物的探针、方法和试剂盒，以及利用上述DNA甲基化位点的数据预测结直肠癌发生风险的计算机模块。

Description

结直肠癌的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域。本发明涉及疾病检测；更具体而言，本发明涉及结直肠癌的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒。

背景技术

我国结直肠癌发病率和死亡率分别位居所有肿瘤发病率和死亡率的第5位，对于癌症，早期筛查的意义远超治疗。常规的结直肠癌诊断的金标准是肠镜，但创伤性，心理感受较痛苦，病人普遍比较抗拒；便潜血试验则需要多次采样，会给病人带来很多不便，从而造成受检者筛查意愿降低，依从性差。肿癌标志物的血液学检查，具有无创、采样方便的特点，可以大大提高受检者的依从性。如果能够有方法对结直肠癌的发生或复发风险进行评估，对于结直肠癌的防治而言，无疑更具意义。

对于合适的结直肠癌标志物研究一直是本领域中的重要问题，需要在结直肠癌标志物方面进行持续的研究。

发明内容

本发明人通过Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析技术研究结直肠癌患者外周血细胞基因FXYD1、DZIP3、RPS24、AKT2、UBTF、DAGLB、LPAR6、 TP63、CX3CR1和TACC2的甲基化水平与结直肠癌发生的关联，探讨其与结直肠癌发生、作为早期筛查标志物的应用前景。

经过努力，本发明人发现了人的体液中FXYD1、DZIP3和RPS24基因中的多个 DNA甲基化位点与结直肠癌发生显著相关，可以用于预测结直肠癌发生、作为早期筛查标志物。

因此，在第一方面，本公开提供了预测结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物包括如下基因至少一个的甲基化：DZIP3(cg14787155)和FXYD1 (cg17682828)。

在一个实施方案中，所述基因DZIP3(cg14787155)的甲基化包括 cg14787155_CpG_12。

在一个实施方案中，所述基因DZIP3(cg14787155)的甲基化还包括cg14787155CpG_3.4；CpG_5；CpG_6；CpG_7；CpG_8；CpG_9.10；CpG_11；CpG_12；CpG_14.15； CpG_16。

在一个实施方案中，所述基因FXYD1(cg17682828)的甲基化包括 cg17682828_CpG_11。

在更优选的实施方案中，所述基因FXYD1(cg17682828)的甲基化还包括如下中的至少一个：cg17682828_CpG_2.3(FXYD1)和cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)。优选地，还包括cg17682828CpG_4.5；CpG_7.8。

在一个实施方案中，所述标志物还包括基因RPS24(cg23620279)的甲基化：cg23620279_CpG_6.7.8(RPS24)或cg23620279_CpG_9(RPS24)。

在一个实施方案中，所述标志物还包括基因DAGLB(cg25513090)的甲基化：cg25513090_CpG_7；优选cg23620279_CpG_6.7.8；cg14787155_CpG_14.15； cg17682828_CpG_11；cg25513090_CpG_7。

在一个实施方案中，所述标志物包括基因TACC2(cg27089675)或AKT2(cg25333225)的甲基化：

(1)cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)-cg27089675_CpG_4(TACC2)；或

(2)cg17682828_CpG_7.8(FXYD1)-cg25333225_CpG_1(AKT2)。

(3)cg14787155_CpG_24(DZIP3)-cg25333225_CpG_4(AKT2)。

所述DZIP3(cg14787155)、FXYD1(cg17682828)、RPS24(cg23620279)、DAGLB(cg25513090)、TACC2(cg27089675)和AKT2(cg25333225)序列编号是基于SEQ ID NO.1-6中所示序列的编号。

在一个实施方案中，所述基因的核苷酸序列参见Genbank数据库：

DZIP3(Gene ID:9666)；

FXYD1(Gene ID:5348)；

RPS24(Gene ID:6229)；

DAGLB(Gene ID:221955)；

TACC2(Gene ID:10579)；

AKT2(Gene ID:208)。

在第二方面，本公开提供了用于检测本公开的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增SEQ ID NO.1-6的序列。

在一个实施方案中，所述引物对为SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.22。

在第三方面，本公开提供了一种检测本公开第一方面所述的DNA甲基化标志物的方法，所述方法包括

1)提取DNA样品，

2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，

3)用本公开第二方面所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物，

4)对所述扩增产物进行消化(例如采用SAP酶)，

5)对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，

6)采用质谱方法对所述转录和酶切产物进行检测，获得样品序列中本公开第一方面所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。

在一个实施方案中，在5)中包括对所述转录和酶切产物进行纯化。

在一个实施方案中，所述质谱方法是飞行质谱方法。

在第四方面，本公开提供了一种DNA甲基化标志物检测试剂盒，所述试剂盒包括本公开第二方面所述的引物对；所述试剂盒或者包括涵盖本公开第一方面中所述的甲基化位点的探针序列，其中本公开的CpG位点中的C保持不变或者被T替换。

在第五方面，本公开提供了一种利用本公开第一方面所述DNA甲基化位点的数据预测结直肠癌发生风险的计算机模块，所述计算机模块包括：DNA甲基化值情况接收模块、数据存储模块、用于诊断、筛查与预测结直肠癌发生风险的处理器模块和用于输出结果的输出模块，其中，所述数据存储模块存储接收到的数据、本公开第一方面所述的CpG甲基化情况，所述用于预测结直肠癌发生风险的处理模块将所接收的DNA甲基化情况与本公开第一方面所述的CpG甲基化情况进行比较。

在第五方面，本公开提供了一种利用本公开第一方面所述DNA甲基化标志物或者本公开第二所述的引物对用于癌症诊断、筛查与风险预测的用途，例如制备用于癌症诊断、筛查与风险预测的试剂的用途。

在第六方面，本公开提供了一种采用基因芯片对基因组中序列为SEQ ID NO.1-6的片段进行检测方法。优选地，所述检测包括对基因组中序列为SEQ ID NO.1-6的片段进行CG位点进行甲基化情况的检测。

本公开对基因DZIP3(cg14787155)、FXYD1(cg17682828)、RPS24(cg23620279)、DAGLB(cg25513090)、TACC2(cg27089675)和AKT2(cg25333225)序列甲基化与结直肠癌之间的相关性进行评估，设计了一对引物，该引物扩增的DNA序列中覆盖了个DNA甲基化位点，利用此引物可对其中的DNA甲基化位点进行检测，评估结直肠癌的发生风险。

本公开的方法有如下优点：1)本公开选择检测的甲基化位点分布于基因DZIP3(cg14787155)、FXYD1(cg17682828)、RPS24(cg23620279)、DAGLB(cg25513090)、 TACC2(cg27089675)和AKT2(cg25333225)序列上，与结直肠癌发生显著相关，可对发生结直肠癌的风险进行预测。2)本方法具有检测方便，成本低廉、高通量的特点，适合推广。

附图说明

图1：应用单个区段内位点的组合对男性进行判断的模型。

图2：应用单个区段内位点的组合对女性进行判断的模型。

图3：多基因区段组合的线性模型对男性进行判断的模型。

图4：双位点模型对男性进行判断的模型。

图5：双位点模型对女性进行判断的模型。

具体实施方式

人类核糖体蛋白RPS24基因包括6个外显子，其编码核糖体蛋白S24，是核糖体蛋白40s组成部分。已有体外细胞研究表明，RPS24基因异常表达与结直肠癌细胞增殖、转移相关，具体机制尚不清楚。本发明人发现了结直肠癌与基因RPS24第一外显子转录起始点前后序列的甲基化有关。发明人推测，基因RPS24可能是通过DNA 甲基化调控基因表达，而这是导致结直肠癌发生的重要因素之一。

在公开中，提供了预测结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物包括如下基因至少一个的甲基化：DZIP3(cg14787155)和FXYD1(cg17682828)。

在一个实施方案中，所述基因DZIP3(cg14787155)的甲基化包括 cg14787155_CpG_12，特别是对于男性而言。

在一个实施方案中，所述基因DZIP3(cg14787155)的甲基化还包括cg14787155CpG_3.4；CpG_5；CpG_6；CpG_7；CpG_8；CpG_9.10；CpG_11；CpG_12；CpG_14.15； CpG_16，特别是对于女性而言。

在更优选的实施方案中，所述基因FXYD1(cg17682828)的甲基化还包括如下中的至少一个：cg17682828_CpG_2.3(FXYD1)和cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)。优选地，还包括cg17682828CpG_4.5；CpG_7.8。本实施方案特别是对于男性而言。

在一个实施方案中，所述标志物还包括基因RPS24(cg23620279)的甲基化：cg23620279_CpG_6.7.8(RPS24)或cg23620279_CpG_9(RPS24)。本实施方案特别是对于男性而言。

在一个实施方案中，所述标志物还包括基因DAGLB(cg25513090)的甲基化：cg25513090_CpG_7；优选cg23620279_CpG_6.7.8；cg14787155_CpG_14.15； cg17682828_CpG_11；cg25513090_CpG_7。本实施方案特别是对于男性而言。

(1)cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)-cg27089675_CpG_4(TACC2)；或

(2)cg17682828_CpG_7.8(FXYD1)-cg25333225_CpG_1(AKT2)。

(3)cg14787155_CpG_24(DZIP3)-cg25333225_CpG_4(AKT2)。本实施方案特别是对于女性而言。

在本公开中，DZIP3(cg14787155)、FXYD1(cg17682828)、RPS24(cg23620279)、DAGLB(cg25513090)、TACC2(cg27089675)、AKT2(cg25333225)、UBTF (cg25858983)、LPAR6(cg08377570)、TP63(cg25708695)和CX3CR1(cg04498110) 的序列为SEQ ID NO.1-10中(所述序列编号是基于SEQ ID NO.1-10中所示序列的编号)与结直肠癌发生有关，因此这些序列的甲基化位点可以作为预测结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，用于对癌症诊断、筛查与风险预测中，例如制备用于癌症诊断、筛查与风险预测的试剂。

不希望拘囿于任何理论，但发明人认为，这段序列的活跃程度决定了结直肠癌的发生。通过甲基化，恰当地阻断了有关基因的表达，从而避免结直肠癌发生。因此，这些序列的甲基化状态可以反映结直肠癌的情况。发明人通过实验数据证实了这一点。

在本公开中，对于基因DZIP3(cg14787155)、FXYD1(cg17682828)、RPS24(cg23620279)、DAGLB(cg25513090)、TACC2(cg27089675)、AKT2(cg25333225)、 UBTF(cg25858983)、LPAR6(cg08377570)、TP63(cg25708695)和CX3CR1 (cg04498110)序列的DNA序列编号基于SEQ ID NO.1-10。

在本公开中，由于甲基化的CpG在经亚硫酸盐处理后C会变成U，所以利用其中本公开的CpG位点中的C保持不变或者被T替换的两种探针序列的杂交情况可以得出该CpG位点的甲基化情况。

在本公开中，所述计算模块可以直接安装在检测设备上、手机app上、电脑软件上。例如，安装在便携设备中(例如可穿戴设备)，通过无线接收或者手动输入DNA 甲基化位点的数据，通过计算从而实现远端预测结直肠癌发生风险。

所述计算模块也可作为app组成部分安装在移动电话中，通过无线接收或者手动输入DNA甲基化位点的数据，通过计算从而实现远端预测结直肠癌发生风险。

所述计算机模块也可作为软件的组成部分安装在计算机上，输入数据后通过计算得到结直肠癌发生风险。

在本公开中，预测结直肠癌发生风险的计算机模块是按如下方式工作的：

在本公开中，大约是指基础值的上下5％。

列举以下实例，说明本发明检测甲基化的实施方式，但这些描述不限制本发明的适用范围。

1、受试者选取和取样

结直肠癌组：发明人收集经电子肠镜确诊为结直肠癌患者49例，男：24例，女： 25例，平均年龄：61.92±12.76岁，排除高血压、糖尿病、心脏病等；健康对照组： 60例，男：23例，女：37例，平均年龄：59.10±13.44岁，电子肠镜未发现结直肠占位性病变，排除高血压、糖尿病、心脏病等健康患者。结直肠癌组与对照组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经伦理委员会审核批准，在采集外周血前宣教本研究的目的和意义，所有实验对象均签署知情同意书。患者均采集外周静脉血4mL，结直肠癌患者组在确诊肠癌后，手术治疗前空腹采集；健康对照组体检完成未发现结直肠占位性病变后空腹采集。所采集血标本按顺序统一编号以盲态检测。

2、SEQUENOM甲基化检测实验流程与方法

主要仪器与试剂

基因扩增：ABI GeneAmp9700 384 Dual；

质谱点样：MassARRAY Nanodispenser RS1000；

质谱分析：MassARRAY Compact System；

试剂：EpiTYPERRT Complete Reagent Set。

步骤阐述：

1)引物合成

根据预实验结果，预筛选Illumina HUMAN甲基化450K芯片探针cg23620279所在基因位置注释信息，进行特定基因启动子区CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)片段扫描及特异性PCR引物设计，所设置引物中不含有CpG位点。利用HPLC方法合成引物对：SEQ ID NO. 11-30。在反向引物5ˊ-末端整合T7-启动子序列(例如，SEQ ID NO.15：cagtaatacgactcactatagggagaaggctAACCCAAAAAAACTCACCATAATAA，小写字母所示)，在正向引物5ˊ-末端加入正向引物(例如，SEQ ID NO.16：aggaagagagTTGGTTTTGGATTGGTTAGTTTAGA)，平衡PCR反应体系。

2)DNA样品提取和DNA样品质检

(1)DNA样品提取

按照QIAmap Mini(Qiagen,Valencia,CA)全血提取试剂盒的说明书进行对样本DNA提取，所取得纯化后样品置于-20℃保存。

(2)DNA质检

通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度及是否降解；

通过NANODROP检测DNA浓度及纯度。

3)亚硫酸盐处理DNA样品

严格按照Methyl Detector^TM Bisulfite Modification Kit说明书的步骤对样品DNA 进行亚硫酸盐转换及纯化。经亚硫酸盐处理后DNA中尚未发生甲基化的胞嘧啶(C) 转换成尿嘧啶(U)，而已经发生甲基化的胞嘧啶(C)不能转换成尿嘧啶(U)保持不变。

4)PCR反应

反应体系：

其中所述正向引物/反向引物为SEQ ID NO.11-30，两两配对，分别扩增出序列SEQ ID NO.1-10。

以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，以上述序列为引物。反应条件：预变性94℃15min；变性94℃20sed；退火56-64℃30sed；延长72℃1min；一共45个循环；总延长72℃3min；4℃保存。PCR产物纯化：用碱性磷酸酶处理PCR产物。体外转录及 RNase A特异性酶切反应：本实验使用T切反应对样本进行切割，同时进行体外转录与酶切反应。脱盐处理：运用洁净树脂对产物进行脱盐处理。Dispensing点样：用 MassARRAY^TM Nanodispenser RS1000/Fusio(RS1000/Fusio点样仪)将样本点到 SpectroCHIP(芯片)上。甲基化检测：使用Sequenom MassARRAY甲基化检测软件自定义归类方法对检测区段严格按照MassARRAY系统平台要求使用Sequenom自动化检测技术对RPS基因进行甲基化检测，收集质谱图，利用EpiTyPER软件完成数据分析。最终获得位点有效数据。Sequenom MassARRAY自定义CpG岛位点归类分组如下：

DZIP3(cg14787155)的序列SEQ ID NO.1

GGAAGTCCCTAGGCACCCTAGGGGACCGTTCTCGGTGACGGCCGGGGTGGGCCAGGGGTCGAGGTGATTTGTGGGTCCAGGACGGGGGTTGGGAGCTGCCCCCGCTAACCCACCCTCGTCTGAGAGGCCGCGAGGTTTCGGCCTGAGATCCCGTGAAGGCGAGAAATCTCGCGATTTCTCGGGAGAGGAATCGGTTAGGAGAAGGGGGATTCCTCACTCAGCTGTGCGCTCTGATTTCGTGCGCTTCCTCGTCCTTCATGTTGGATGGCCAGTTTTTCGTTTGTGCGTCATCCTCTACCTGAGAAATGGTCGCTTGCCCCTAGTCTAGACACGGTGAGGAGCTCTGAGGAGAAGAATCTTGGGCCCTA

位点名称	CpG位置
		cg14787155_CpG_1.2	27:33:
cg14787155_CpG_3.4	39:43:
		cg14787155_CpG_5	60
cg14787155_CpG_6	83
		cg14787155_CpG_7	103
cg14787155_CpG_8	117
		cg14787155_CpG_9.10	129:131
cg14787155_CpG_11	139
		cg14787155_CpG_12	152
cg14787155_CpG_13	160
		cg14787155_CpG_14.15	170:172
cg14787155_CpG_16	180
		cg14787155_CpG_17	192
cg14787155_CpG_18	227
		cg14787155_CpG_19.20.21	238:242:250
cg14787155_CpG_22.23	278:286
		cg14787155_CpG_24	311

FXYD1(cg17682828)的序列SEQ ID NO.2

TGCCATGGCCCAAGCCTGGCCCTGGGACCAAGCGAGGAAAAAACCTCCCGCCCTTCCTGGCCGAGCTCCCAGCCTAGTGGAGGCGGTGGCCGTGGGTTCCAACAGCCCCACAGATAGAAAAATCACAAAGCGTGATAACACAAAGTGCAGGAAAGAAGAAACGGCGGTGAAATGAGATCATCTCACACGCGGCCCAGTTTAGCTTAGAGTCTTGTTCCTAGCTCTTTGATTCCTCTTCGAATAAAATGTTAAAGCATGGACAATGTATGAATATGTTAGAACAATTATAGATATTATCATAAGTAGTAGCTAATATTTACTGGGTGTGTACCACGTGTTAGATACGGTTTCACTTCCTCTGGGAGGGAGGTGCTG TTATTAACCCC

位点名称	CpG位置
		cg17682828_CpG_1	33
cg17682828_CpG_2.3	49:62
		cg17682828_CpG_4.5	84:91
cg17682828_CpG_6	131
		cg17682828_CpG_7.8	162:165
cg17682828_CpG_9.10	188:190
		cg17682828_CpG_11	238
cg17682828_CpG_12	334
		cg17682828_CpG_13	345

RPS24(cg23620279)的序列SEQ ID NO.3

CTGGTTCTGGATTGGTCAGTCTAGAGTTCCAGGGGTGTGGCCAAAAGTCTGTGAGGCGGGGCCGTAGGCAGCCTAAATCAGGCATCGGCGCGGTCAGCCTCGTGGCGCGCCCACGCCCCCACGCCGGCTCTTCCCGGGGTCCTTCCGTGCGCGTTGATATGATTGGCCGGCGAATCGTGGTTCTCTTTTCCTCCTTGGCTGTCTGAAGATAGATCGCCATCATGGTGAGTCTCCCTGGGCC

位点名称	CpG位置
		cg23620279_CpG_1.2	57:63
cg23620279_CpG_3.4.5	86:89:91
		cg23620279_CpG_6.7.8	101:106:108
cg23620279_CpG_9	114
		cg23620279_CpG_10.11.12.13.14.15	122:125:135:146:150:152
cg23620279_CpG_16.17	168:171
		cg23620279_CpG_18	176
cg23620279_CpG_19	215

DAGLB(cg25513090)的序列SEQ ID NO.4

AACCTCCTGAGTAGCTGAGACCAAAGGCACGTGCCACACTCCCGGCTAATTTATTTTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTAGAGACATAGTTTTGCTCTTGTTGCCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCGCGATCTTGGTTCACCACAACCTCCATCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGCATGTGTCACCATGCCCAGCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCTCCATAAATTTTCCTATTTTTTGTAGAGACCGGAGTCTCACTCTGTTGCCCAGGCCGGTCTTGAACTCCTGGCCTCAAACCATCCTCCCGCCGCAGCCTCCCAAAGTGCTGGTATTACAGGCGTGAGCCACTACACCTGACCGAAATTTTCATTTTATAAGGAGGGACGCTTCAGGCCTGGAGGAATTAGCTAGCCTAGAGACCCAGGCTGTCAATGG CAGGTGTGG

位点名称	CpG位置
		cg25513090_CpG_1	30
cg25513090_CpG_2	43
		cg25513090_CpG_3.4	136:138
cg25513090_CpG_5	178
		cg25513090_CpG_6	302
cg25513090_CpG_7	327
		cg25513090_CpG_8.9	360:363
cg25513090_CpG_10	393
		cg25513090_CpG_11	413
cg25513090_CpG_12	439

TACC2(cg27089675)的序列SEQ ID NO.5

ACCAATGTCTGGGTTCTTATTTGGGAGGAGTTGTTGTGTGTCCCATACTCCATGGAAAATTTGTTCCTGGTTGCTTTCTGATAAGACCGCACAAGTTTACAAGATGCCAAAATATAATTTATCATCTTGTTCCAGATGGTAACGACTTCAGCCAGCCTGAAGGGAAGCCACATCCTTTCCTAAGTTGGCAGTTCCTGTCAGAGGCGTGGACAAGAAAGTGGCTTCGTTTCTTTCCAGCTTGATAAAGCCGACATAAATAGGAGCACTTCATTTCTGAATTACACACCATTACTCTTATCACATACTAAACTGTTTGACTTCAGTTAATGGGTGGGACATAATGAAATGTAAAGTGCTTGTTACAAGGAAAATTGCCA GGTCCAGATGCTG

位点名称	CpG位置
		cg27089675_CpG_1	88
cg27089675_CpG_2	143
		cg27089675_CpG_3	205
cg27089675_CpG_4	225
		cg27089675_CpG_5	249

AKT2(cg25333225)的序列SEQ ID NO.6

TTGTTTTACTCAGTTCTGGGTTCTGACGCTCTTAAAGGACCCCGGAGCGGGAGTTAGTTAGGAGGGGTTTCCTTTTCAGTGTGCTCGTCATGGTTGAGCTCAGGCTCTGAAGCCACACAACCCCAGACTTGAATTTCCTCCTTTCTGGTGACTGTGGGCAGA AGGCTTGAC

位点名称	CpG位置
		cg25333225_CpG_1	27
cg25333225_CpG_2	43
		cg25333225_CpG_3	48
cg25333225_CpG_4	86

UBTF(cg25858983)的序列SEQ ID NO.7

AAGCCCTTGAAGAAGGGAGTGAGCCCCGCAGCCACGAGGGAAAGAGGGTTTAAGTTTCAGAGGGCCGGGGGTGGATGCCCCTACCTTGGCCTTTGGGGGCGGCCATTTCCAGGTCTGTGGGGCAGTCGGCTTCTCCGTTCATCCTCCAGCTGTCCAGCCACCTCCTCGGTCGTGCTGGCCGGGCAACCCGGGGTCAAAGCCACCTCACCCTTTGGAAGACATACCAGTTCCCACTCAGGAAGGCTGAGAGGTGAACGACTAACGACTTTCTAACCGCCCAGAGTAGAAGGGGGCAGGTCCACACTCTGAGAGACTCAGCCATGACCTTATTAGACTTAAGGGGTCTATGGG

位点名称	CpG位置
		cg25858983_CpG_1	27
cg25858983_CpG_2	35
		cg25858983_CpG_3	66
cg25858983_CpG_4	100
		cg25858983_CpG_5.6	127:136
cg25858983_CpG_7.8.9	167:171:180
		cg25858983_CpG_10	189
cg25858983_CpG_11	256
		cg25858983_CpG_12	263
cg25858983_CpG_13	275

LPAR6(cg08377570)的序列SEQ ID NO.8

GGGGGAAAAATTAGAGTCCTGCCTTGGAACAGGTTAAAGGAGGGCAAGAGAAGGTCCGAGGCCTGCCCCTGAGGCCTACCACACCAAACGTTATAACAACACAACAGTTTTTATATATTTTCAGTTTTGCATAATATGAAGTTAAAGACTTAAGTAAATTGAGTAAATAGTAGTTTTTTTTTTTTTAATTTCACAGATCAATAGAGTTAACTCCTGAGTTATATGCATACAACCCCAAAGTTGTTTGCTGTCTGGAGCTGTGCCTACACCCGCCTGGCATATTCTTGAGACATTGGAGCTAGGAAGTTGGAAATTGATAGAAAATTTTGTCACTTGTAACAGAGCTAAAGCAATATGGATTATGGTGGACCCTATC ACTTGG

位点名称	CpG位置
		cg08377570_CpG_1	67
cg08377570_CpG_2	89
		cg08377570_CpG_3	271

TP63(cg25708695)的序列SEQ ID NO.9

AAGGCAGATGCAGCTCTGTGTTGGGCGTCCTTCACTTGCTCCTCCACATCTGCTCTTTTTCTTTCTCATTCTTTGCCTCAAGAAGCTGCCTCCTGATAATTGCTTTAACAGGTCTTTTCTTCTCTGGTTTCCTGTTGAATTCAACCAGCAGCAATCTCCTGCAGGAGAGTGAAGTTGGAATATTGGTTTCCCTGGCTGACTCCCTGTTGGTTTTTGGCTAAAGGCTGCAGATCCTCTCAGAGGCCCTTGCTGCAGGTCCGAGTCCCCTGACTTTGAGTAGTTACTCCCTCCCCTTCCTTTTCTTCAAGCTTAGGAGGAGTAACC

位点名称	CpG位置
		cg25708695_CpG_1	26
cg25708695_CpG_2	259

CX3CR1(cg04498110)的序列SEQ ID NO.10。

GTCCCAAGCTACTGGAGTTGGGGTTGGAATCCATCCCTTCTTATTTGGGGGCAGGGTTTTTCTATTTCCCTTACTGGCCTGGGAGCAGGTGGAGATGCATGAGGTCATATGGAAGAGACAGGCTGATAGGATGGGTGGAGTCCTTTGGGAAGGAGGAGGCAATGGGGAATCTATTGGTAGGACCCCATGGTGGACGTATGAGAAGCCAAGCATTTGAGTTTTGACTCGATGCAGTAGGCAGTGGGGAGCCCTTGCAGGTTTGGGGACATGATGGAAGAGGGCTTAATGAAGACGAGGCTGGTGTAATCAGGGGAGAGGCT GGATCAGGCACATGGT

位点名称	CpG位置
		cg04498110_CpG_1	195
cg04498110_CpG_2	227
		cg04498110_CpG_3	293

5)统计学方法：采用R语言软件(版本3.4.1)进行统计，运用t检验进行分析， P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1应用单个区段进行判断

男性：针对健康人、亚健康人群的健康监测、预警与肠癌风险筛查，发明人计算了该区段甲基化信息用于肠癌筛查的风险比值比(odds ratio计算)：以表格第5行为例，基于cg14787155_CpG_12的甲基化程度beta值，以0.03为阈值，高于0.03 为甲基化程度较高组，低于0.03为甲基化程度较低组，计算男性的肠癌风险比值比为12.27。即，甲基化程度高的男性，肠癌风险是甲基化程度低的男性的12.27倍。

下表还给出了各个位点建立线性拟合模型对癌症、对照组样本进行分类诊断的ROC 曲线下面积AUC。

对于女性而言：针对健康人、亚健康人群的健康监测、预警与肠癌风险筛查，发明人计算了该区段甲基化信息用于肠癌筛查的风险比值比(odds ratio计算)：以表格第1 行为例，基于cg17682828_CpG_13的甲基化程度beta值，以0.05为阈值，高于0.03为甲基化程度较高组，低于0.03为甲基化程度较低组，计算女性的肠癌风险比值比为3.3。即，甲基化程度高的女性，肠癌风险是甲基化程度低的女性的3.3倍。

下表还给出了各个位点建立线性拟合模型对癌症、对照组样本进行分类诊断的ROC 曲线曲线下面积AUC：

位点名称	AUC	风险比值比(OR)	阈值	基因
					cg17682828_CpG_13	0.65	3.3	0.05	FXYD1
cg25513090_CpG_7	0.61	2.2	0.93	DAGLB

2.2应用单个区段内位点的组合进行判断

针对男性而言：对各基因区段内位点之间的线性组合建立模型，所得的AUC与风险比值比如下表所示。以第一行cg17682828为例，其所在的基因为FXYD1。通过 lasso方法所建立的模型，选用了5个位点的甲基化值作为输入值，即CpG_2.3；CpG_4.5；CpG_7.8；CpG_9.10；CpG_11。各位点甲基化值前的系数列表为1.5；1； 8.3；-7.9；0.2；-4.4。其中第一项为截距。因此建立的优选模型为：score＝1.5+ 1*CpG_2.3+8.3*CpG_4.5–7.9*CpG_7.8+0.2*CpG_9.10-4.4*CpG_11。如前所述，用该模型所计算得到的score作为个人的肠癌风险系数，利用该风险系数的平均值作为阈值，将个人的肠癌风险系数分为“高风险”、“低风险”个体，风险比值比为23。即高风险人群肠癌风险是低风险人群的23倍。根据该风险系数，建立肠癌的诊断模型，其AUC为0.83，其ROC曲线如图1所示。

其中：a.AUC；b.风险比值比(OR)。

针对女性而言：对各基因区段内位点之间的线性组合建立模型，所得的AUC与风险比值比如下表所示。以第3行cg25333225为例，其所在的基因为AKT2。通过 lasso方法所建立的模型，选用了4个位点的甲基化值作为输入值，即CpG_1；CpG_2； CpG_3；CpG_4。各位点甲基化值前的系数列表为0.62；-3.1；-2.5；13；-6.5。其中第一项为截距。因此建立的优选模型为：score＝0.62–3.1*CpG_1–2.5*CpG_2+ 13*CpG_3-6.5*CpG_4。如前所述，用该模型所计算得到的score作为个人的肠癌风险系数，利用该风险系数的平均值作为阈值，将个人的肠癌风险系数分为“高风险”、“低风险”个体，风险比值比为5。即高风险人群肠癌风险是低风险人群的5倍。

其中：a.AUC；b.风险比值比(OR)。

在女性模型中，诊断模型性能最佳为DZIP3基因的cg14787155所在的区段，其 AUC为0.87，其风险比值比为15.其ROC曲线如图2所示。

2.3多基因区段组合的线性模型

发明人研究了对多个基因区段进行任意线性组合得到的优选模型。

对于男性而言：通过lasso方法所建立的模型，优选了4个位点的甲基化值作为输入值，即'cg23620279_CpG_6.7.8；cg14787155_CpG_14.15；cg17682828_CpG_11；cg25513090_CpG_7'。建立的优选模型为：score＝2.7+7.1*cg23620279_CpG_6.7.8 +1.7*cg14787155_CpG_14.15-3.3*cg17682828_CpG_11–1.8*cg25513090_CpG_7。如前所述，用该模型所计算得到的score作为个人的肠癌风险系数，利用该风险系数的平均值作为阈值，将个人的肠癌风险系数分为“高风险”、“低风险”个体，风险比值比为10。即高风险人群肠癌风险是低风险人群的10倍。根据该风险系数，建立肠癌的诊断模型，其AUC为0.87，其ROC曲线如下图3所示。

2.4双位点模型

作为一种简化模型，发明人研究了位点两两组合，即对两个甲基化位点进行简单的加、减操作所得到的诊断与预警模型性能。

对于男性而言：以第一行为例，其风险score＝ cg23620279_CpG_6.7.8(RPS24)-cg17682828_CpG_11(FXYD1)。即score为 cg23620279_CpG_6.7.8(RPS24)与位点cg17682828_CpG_11(FXYD1)甲基化值的差值，其风险比值比为16，AUC为0.84，ROC曲线如图4所示。

其中：a.AUC；b.风险比值比(OR)；c.阈值。

女性的模型：以第一行为例，其风险score＝ cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)-cg27089675_CpG_4(TACC2)。即score为 cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)与cg27089675_CpG_4(TACC2)位点甲基化信息的差值，其风险比值比为15，AUC为0.82，ROC曲线如图5所示。

位点组合公式	a	b	c
				cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)-cg27089675_CpG_4(TACC2)	0.82	15	0.13
cg25333225_CpG_3(AKT2)-cg25333225_CpG_4(AKT2)	0.78	6.2	-0.03
				cg14787155_CpG_18(DZIP3)-cg17682828_CpG_4.5(FXYD1)	0.76	4.50E+17	-0.03
cg17682828_CpG_7.8(FXYD1)-cg25333225_CpG_4(AKT2)	0.74	9.7	0
				cg25858983_CpG_3(UBTF)-cg25858983_CpG_10(UBTF)	0.74	3.7	0.03
cg14787155_CpG_11(DZIP3)-cg17682828_CpG_4.5(FXYD1)	0.73	5.8	-0.02
				cg17682828_CpG_7.8(FXYD1)-cg25333225_CpG_1(AKT2)	0.73	11	0.01
cg25858983_CpG_1(UBTF)-cg27089675_CpG_4(TACC2)	0.73	3.4	0
				cg14787155_CpG_7(DZIP3)-cg25333225_CpG_4(AKT2)	0.71	4.10E+17	0
cg14787155_CpG_11(DZIP3)-cg25858983_CpG_10(UBTF)	0.71	9.7	0.01
				cg14787155_CpG_24(DZIP3)-cg17682828_CpG_4.5(FXYD1)	0.71	5	-0.02
cg14787155_CpG_24(DZIP3)-cg25333225_CpG_4(AKT2)	0.71	11	0
				cg25858983_CpG_4(UBTF)-cg25858983_CpG_10(UBTF)	0.71	5.8	0.13
cg14787155_CpG_7(DZIP3)-cg17682828_CpG_4.5(FXYD1)	0.7	5.8	-0.01
				cg14787155_CpG_9.10(DZIP3)-cg17682828_CpG_4.5(FXYD1)	0.7	3.8	-0.04
cg14787155_CpG_9.10(DZIP3)-cg25333225_CpG_4(AKT2)	0.7	5.8	-0.02
				cg14787155_CpG_17(DZIP3)-cg27089675_CpG_4(TACC2)	0.7	3.4	-0.08
cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)-cg25858983_CpG_10(UBTF)	0.7	2.9	0.29
				cg25858983_CpG_1(UBTF)-cg25858983_CpG_10(UBTF)	0.7	2.2	0.14

其中：a.AUC；b.风险比值比(OR)；c.阈值。

针对健康人、亚健康人群的健康监测、预警与肠癌风险筛查，或针对肠癌病人的治疗前中后的监测，发明人计算了该区段甲基化信息用于肠癌筛查的风险比值比(oddsratio)：基于cg23620279_CpG_6.7.8的甲基化程度beta值，以0.03为阈值，高于0.03为甲基化程度较高组，低于0.03为甲基化程度较低组，计算的肠癌风险比值比为8.4。即，甲基化程度高的，肠癌风险是甲基化程度低的的8.4倍。

本发明人的结果发现，对男女混合人群，所有检测区段甲基化水平结直肠癌组与健康对照组无显著差异(P>0.05)；对健康对照组人群，5个区段甲基化水平女性显著高于(P<0.05)；对人群，3个区段甲基化水平结直肠癌组显著高于健康对照组 (P<0.05)；对女性人群，2个区段甲基化水平结直肠癌组显著低于健康对照组(P<0.05)。 RPS24基因转录起始区多个区段甲基化可能与结直肠癌发生有关，且存在性别差异；研究检测的甲基化区段有望成为性别特异的结直肠癌诊断筛查潜在生物标志物。

引物SEQ ID NO.11-30序列及配对情况如下：

DZIP3(cg14787155)扩增引物：

SEQ ID NO.11：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctTAAAACCCAAAATTCTTCTCCTCA

SEQ ID NO.12：

aggaagagagGGAAGTTTTTAGGTATTTTAGGGGAT

FXYD1(cg17682828)扩增引物：

SEQ ID NO.13：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctAAAATTAATAACAACACCTCCCTCC

SEQ ID NO.14：

aggaagagagTGTTATGGTTTAAGTTTGGTTTTGG

RPS24(cg23620279)扩增引物：

SEQ ID NO.15：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctAACCCAAAAAAACTCACCATAATAA

SEQ ID NO.16：

aggaagagagTTGGTTTTGGATTGGTTAGTTTAGA

DAGLB(cg25513090)扩增引物：

SEQ ID NO.17：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCACACCTACCATTAACAACCTAAAT

SEQ ID NO.18：

aggaagagagAATTTTTTGAGTAGTTGAGATTAAAGG

TACC2(cg27089675)扩增引物：

SEQ ID NO.19：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctCAACATCTAAACCTAACAATTTTCC

SEQ ID NO.20：

aggaagagagATTAATGTTTGGGTTTTTATTTGGG

AKT2(cg25333225)扩增引物：

SEQ ID NO.21：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctATCAAACCTTCTACCCACAATCAC

SEQ ID NO.22：

aggaagagagTTGTTTTATTTAGTTTTGGGTTTTGA

UBTF(cg25858983)扩增引物：

SEQ ID NO.23：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCCATAAACCCCTTAAATCTAATAAAA

SEQ ID NO.24：

aggaagagagAAGTTTTTGAAGAAGGGAGTGAGTT

LPAR6(cg08377570)扩增引物：

SEQ ID NO.25：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCAAATAATAAAATCCACCATAATCC

SEQ ID NO.26：

aggaagagagGGGGGAAAAATTAGAGTTTTGTTT

TP63(cg25708695)扩增引物：

SEQ ID NO.27：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctAATTACTCCTCCTAAACTTAAAAAAAA

SEQ ID NO.28：

aggaagagagAAGGTAGATGTAGTTTTGTGTTGGG

CX3CR1(cg04498110)扩增引物：

SEQ ID NO.29：

cagtaatacgactcactatagggagaaggctACCATATACCTAATCCAACCTCTCC

SEQ ID NO.30：

aggaagagagGTTTTAAGTTATTGGAGTTGGGGTT

序列表

<110> 深圳市太科健康科技有限公司

<120> 结直肠癌的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒

<130> CF180257S

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 368

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ggaagtccct aggcacccta ggggaccgtt ctcggtgacg gccggggtgg gccaggggtc 60

gaggtgattt gtgggtccag gacgggggtt gggagctgcc cccgctaacc caccctcgtc 120

tgagaggccg cgaggtttcg gcctgagatc ccgtgaaggc gagaaatctc gcgatttctc 180

gggagaggaa tcggttagga gaagggggat tcctcactca gctgtgcgct ctgatttcgt 240

gcgcttcctc gtccttcatg ttggatggcc agtttttcgt ttgtgcgtca tcctctacct 300

gagaaatggt cgcttgcccc tagtctagac acggtgagga gctctgagga gaagaatctt 360

gggcccta 368

<210> 2

<211> 386

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

tgccatggcc caagcctggc cctgggacca agcgaggaaa aaacctcccg cccttcctgg 60

ccgagctccc agcctagtgg aggcggtggc cgtgggttcc aacagcccca cagatagaaa 120

aatcacaaag cgtgataaca caaagtgcag gaaagaagaa acggcggtga aatgagatca 180

tctcacacgc ggcccagttt agcttagagt cttgttccta gctctttgat tcctcttcga 240

ataaaatgtt aaagcatgga caatgtatga atatgttaga acaattatag atattatcat 300

aagtagtagc taatatttac tgggtgtgta ccacgtgtta gatacggttt cacttcctct 360

gggagggagg tgctgttatt aacccc 386

<210> 3

<211> 241

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

ctggttctgg attggtcagt ctagagttcc aggggtgtgg ccaaaagtct gtgaggcggg 60

gccgtaggca gcctaaatca ggcatcggcg cggtcagcct cgtggcgcgc ccacgccccc 120

acgccggctc ttcccggggt ccttccgtgc gcgttgatat gattggccgg cgaatcgtgg 180

ttctcttttc ctccttggct gtctgaagat agatcgccat catggtgagt ctccctgggc 240

c 241

<210> 4

<211> 498

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

aacctcctga gtagctgaga ccaaaggcac gtgccacact cccggctaat ttatttttat 60

ttatttattt atttatttat ttatttattt agagacatag ttttgctctt gttgccccag 120

gctggagtgc aatggcgcga tcttggttca ccacaacctc catctcctgg gttcaagcga 180

ttctcctgcc tcagcctcct gagtagctgg gattacaggc atgtgtcacc atgcccagct 240

aattttgtat ttttagtaga gatggggttt ctccataaat tttcctattt tttgtagaga 300

ccggagtctc actctgttgc ccaggccggt cttgaactcc tggcctcaaa ccatcctccc 360

gccgcagcct cccaaagtgc tggtattaca ggcgtgagcc actacacctg accgaaattt 420

tcattttata aggagggacg cttcaggcct ggaggaatta gctagcctag agacccaggc 480

tgtcaatggc aggtgtgg 498

<210> 5

<211> 390

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

accaatgtct gggttcttat ttgggaggag ttgttgtgtg tcccatactc catggaaaat 60

ttgttcctgg ttgctttctg ataagaccgc acaagtttac aagatgccaa aatataattt 120

atcatcttgt tccagatggt aacgacttca gccagcctga agggaagcca catcctttcc 180

taagttggca gttcctgtca gaggcgtgga caagaaagtg gcttcgtttc tttccagctt 240

gataaagccg acataaatag gagcacttca tttctgaatt acacaccatt actcttatca 300

catactaaac tgtttgactt cagttaatgg gtgggacata atgaaatgta aagtgcttgt 360

tacaaggaaa attgccaggt ccagatgctg 390

<210> 6

<211> 171

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

ttgttttact cagttctggg ttctgacgct cttaaaggac cccggagcgg gagttagtta 60

ggaggggttt ccttttcagt gtgctcgtca tggttgagct caggctctga agccacacaa 120

ccccagactt gaatttcctc ctttctggtg actgtgggca gaaggcttga c 171

<210> 7

<211> 351

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

aagcccttga agaagggagt gagccccgca gccacgaggg aaagagggtt taagtttcag 60

agggccgggg gtggatgccc ctaccttggc ctttgggggc ggccatttcc aggtctgtgg 120

ggcagtcggc ttctccgttc atcctccagc tgtccagcca cctcctcggt cgtgctggcc 180

gggcaacccg gggtcaaagc cacctcaccc tttggaagac ataccagttc ccactcagga 240

aggctgagag gtgaacgact aacgactttc taaccgccca gagtagaagg gggcaggtcc 300

acactctgag agactcagcc atgaccttat tagacttaag gggtctatgg g 351

<210> 8

<211> 382

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

gggggaaaaa ttagagtcct gccttggaac aggttaaagg agggcaagag aaggtccgag 60

gcctgcccct gaggcctacc acaccaaacg ttataacaac acaacagttt ttatatattt 120

tcagttttgc ataatatgaa gttaaagact taagtaaatt gagtaaatag tagttttttt 180

ttttttaatt tcacagatca atagagttaa ctcctgagtt atatgcatac aaccccaaag 240

ttgtttgctg tctggagctg tgcctacacc cgcctggcat attcttgaga cattggagct 300

aggaagttgg aaattgatag aaaattttgt cacttgtaac agagctaaag caatatggat 360

tatggtggac cctatcactt gg 382

<210> 9

<211> 324

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

aaggcagatg cagctctgtg ttgggcgtcc ttcacttgct cctccacatc tgctcttttt 60

ctttctcatt ctttgcctca agaagctgcc tcctgataat tgctttaaca ggtcttttct 120

tctctggttt cctgttgaat tcaaccagca gcaatctcct gcaggagagt gaagttggaa 180

tattggtttc cctggctgac tccctgttgg tttttggcta aaggctgcag atcctctcag 240

aggcccttgc tgcaggtccg agtcccctga ctttgagtag ttactccctc cccttccttt 300

tcttcaagct taggaggagt aacc 324

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

gtcccaagct actggagttg gggttggaat ccatcccttc ttatttgggg gcagggtttt 60

tctatttccc ttactggcct gggagcaggt ggagatgcat gaggtcatat ggaagagaca 120

ggctgatagg atgggtggag tcctttggga aggaggaggc aatggggaat ctattggtag 180

gaccccatgg tggacgtatg agaagccaag catttgagtt ttgactcgat gcagtaggca 240

gtggggagcc cttgcaggtt tggggacatg atggaagagg gcttaatgaa gacgaggctg 300

gtgtaatcag gggagaggct ggatcaggca catggt 336

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 11

cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttaaaaccca aaattcttct cctca 55

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 12

aggaagagag ggaagttttt aggtatttta ggggat 36

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 13

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaaattaat aacaacacct ccctcc 56

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 14

aggaagagag tgttatggtt taagtttggt tttgg 35

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 15

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taacccaaaa aaactcacca taataa 56

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 16

aggaagagag ttggttttgg attggttagt ttaga 35

<210> 17

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 17

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccacaccta ccattaacaa cctaaat 57

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 18

aggaagagag aattttttga gtagttgaga ttaaagg 37

<210> 19

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 19

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcaacatcta aacctaacaa ttttcc 56

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 20

aggaagagag attaatgttt gggtttttat ttggg 35

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 21

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tatcaaacct tctacccaca atcac 55

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 22

aggaagagag ttgttttatt tagttttggg ttttga 36

<210> 23

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 23

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcccataaac cccttaaatc taataaaa 58

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 24

aggaagagag aagtttttga agaagggagt gagtt 35

<210> 25

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 25

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccaaataat aaaatccacc ataatcc 57

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 26

aggaagagag gggggaaaaa ttagagtttt gttt 34

<210> 27

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 27

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taattactcc tcctaaactt aaaaaaaa 58

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 28

aggaagagag aaggtagatg tagttttgtg ttggg 35

<210> 29

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 29

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taccatatac ctaatccaac ctctcc 56

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 30

aggaagagag gttttaagtt attggagttg gggtt 35

Claims

1.预测结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物包括如下基因至少一个的甲基化：DZIP3(cg14787155)和FXYD1(cg17682828)。

2.根据权利要求1的DNA甲基化标志物，所述基因DZIP3(cg14787155)的甲基化包括cg14787155_CpG_12。

3.根据权利要求1或2的DNA甲基化标志物，所述基因DZIP3(cg14787155)的甲基化还包括cg14787155CpG_3.4；CpG_5；CpG_6；CpG_7；CpG_8；CpG_9.10；CpG_11；CpG_12；CpG_14.15；CpG_16。

4.根据权利要求1-3任一项的DNA甲基化标志物，所述基因FXYD1(cg17682828)的甲基化包括cg17682828_CpG_11；优选所述基因FXYD1(cg17682828)的甲基化还包括如下中的至少一个：cg17682828_CpG_2.3(FXYD1)和cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)；优选地，还包括cg17682828CpG_4.5；CpG_7.8。

5.根据权利要求1-4任一项的DNA甲基化标志物，所述标志物还包括基因RPS24(cg23620279)的甲基化：cg23620279_CpG_6.7.8(RPS24)或cg23620279_CpG_9(RPS24)。

6.根据权利要求1-5任一项的DNA甲基化标志物，所述标志物还包括基因DAGLB(cg25513090)的甲基化：cg25513090_CpG_7；优选cg23620279_CpG_6.7.8；cg14787155_CpG_14.15；cg17682828_CpG_11；cg25513090_CpG_7。

7.根据权利要求1-6任一项的DNA甲基化标志物，所述标志物包括基因TACC2(cg27089675)或AKT2(cg25333225)的甲基化：

(1)cg17682828_CpG_9.10(FXYD1)-cg27089675_CpG_4(TACC2)；或

(2)cg17682828_CpG_7.8(FXYD1)-cg25333225_CpG_1(AKT2)。

(3)cg14787155_CpG_24(DZIP3)-cg25333225_CpG_4(AKT2)。

8.用于检测权利要求1-7任一项的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增SEQ IDNO.1-6的序列，所述引物对优选为SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.22。

9.检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的方法，所述方法包括：

1)提取DNA样品，

2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，

3)用权利要求8所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物，

4)对所述扩增产物进行消化(例如采用SAP酶)，

5)对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，

6)采用质谱方法对所述转录和酶切产物进行检测，获得样品序列中权利要求1-7任一项所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。

10.一种DNA甲基化标志物检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求8所述的引物对；或者所述试剂盒包括涵盖权利要求1-7任一项所述的甲基化位点的探针序列，其中本公开的CpG位点中的C保持不变或者被T替换。