CN107326089A - 一种基于NGS检测Septin9基因启动子甲基化的方法及其应用 - Google Patents

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CN107326089A CN201710702040.4A CN201710702040A CN107326089A CN 107326089 A CN107326089 A CN 107326089A CN 201710702040 A CN201710702040 A CN 201710702040A CN 107326089 A CN107326089 A CN 107326089A
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primer
gene promoter
septin9 gene
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dna
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伍建
姬晓雯
李巧玲
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Makino (chongqing) Gene Technology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种基于NGS检测Septin9基因启动子甲基化的方法及其应用。本发明基于高通量测序(NGS)提供了一种检测septin9基因启动子甲基化位点甲基化状态的方法，包含甲基化位点测序深度、甲基化与非甲基化深度以及甲基化率。通过实验证明：本发明的方法可以准确、快速和高效检测septin9基因启动子甲基化位点的甲基化状态，并且本发明的方法操作简单、假阳性率低、成本较低，结果更加直观。在诊断或辅助诊断结直肠癌中具有很好的应用前景。

Description

一种基于NGS检测Septin9基因启动子甲基化的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于NGS检测Septin9基因启动子甲基化的方法及其应用。
背景技术
Septin9基因属于SEPT基因家族的一员，位于人类染色体17q25.3，在细胞质分裂、细胞极化、囊泡运输和细胞膜构建等多个生物过程发挥重要作用。相关的研究表明Septin9基因的甲基化与卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤存在密切关系。最近几年研究表明septin9基因甲基化可作为结直肠癌早期诊断的分子标志物。
目前已经报道的检测方法：甲基化特异性PCR、甲基荧光法和MS-HRM法。然而这些方法存在操作繁琐、假阳性率高和成本较高的问题。
发明内容
由于现有技术中的septin9基因甲基化的检测方法存在操作繁琐、假阳性率高和成本较高等问题，为了解决该技术问题，本发明首先提供了一种用于检测septin9基因启动子甲基化的引物对。
本发明提供的用于检测septin9基因启动子甲基化的引物对由引物1和引物2组成；
所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子。
上述引物对中，所述引物1和所述引物2的摩尔量比为1:1。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种用于检测septin9基因启动子甲基化的PCR试剂。
本发明提供的用于检测septin9基因启动子甲基化的PCR试剂包括上述引物对。
上述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种用于检测septin9基因启动子甲基化的试剂盒。
本发明提供的用于检测septin9基因启动子甲基化的试剂盒包括上述引物对或上述PCR试剂。
本发明的试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。所述阴性对照品为合成的非甲基化的重硫酸盐处理后序列(Bis-Raw-Seq质粒，Bis-Raw-Seq质粒的核苷酸序列为序列6)；所述阳性对照品为合成的甲基化的重硫酸盐处理后的序列(Bis-Methyl-Seq质粒，Bis-Methyl-Seq质粒的核苷酸序列为序列7)。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在如下1)-8)中任一种中的应用：
1)检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化；
2)制备检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化的产品；
3)检测或辅助检测septin9基因启动子中每个甲基化位点的甲基化状态；
4)制备检测或辅助检测septin9基因启动子中每个甲基化位点的甲基化状态的产品；
5)检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化率；
6)制备检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化率的产品；
7)诊断或辅助诊断结直肠癌；
8)制备诊断或辅助诊断结直肠癌的产品。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种检测septin9基因启动子甲基化的方法。
本发明提供的检测septin9基因启动子甲基化的方法包括如下步骤：
(1)重硫酸盐处理待测样品基因组DNA，得到重硫酸盐处理后基因组DNA；
(2)采用上述引物对对所述重硫酸盐处理后基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)PCR富集DNA片段，构建DNA测序文库；
(4)将所述文库进行高通量测序并进行甲基化分析，得到待测样品基因组DNA的septin9基因启动子中的每一个甲基化位点的甲基化状态。
上述方法中，所述步骤(2)和(3)之间还包括纯化的步骤；所述步骤(3)和(4)之间还包括纯化的步骤；所述纯化的方法均为磁珠纯化。
上述方法中，所述步骤(2)中，所述PCR扩增为Touch-down PCR。
上述方法中，所述待测样品基因组DNA为受试者组织中的基因组DNA或血浆中游离的基因组DNA。
上述方法在诊断或辅助诊断结直肠癌中的应用也属于本发明的保护范围。
上述septin9基因启动子的核苷酸序列如序列3所示，共存在7个CpG位点。
本发明的有益效果：
1、本发明的检测样本可以是组织DNA也可以是血浆游离DNA；
2、本发明采用合成的两种Bis-DNA序列作为阴性对照和阳性对照，提高了检测的可参照性；
3、本发明采用Touch-down PCR的扩增方法，可以有效提高Bis-DNA扩增的准确性，降低非特异性扩增；
4、本发明可分析到每个甲基化位点的甲基化状态，并以甲基化率表示，更加直观。
本发明基于高通量测序(NGS)提供了一种检测septin9基因启动子甲基化位点甲基化状态的方法，本发明的方法对septin9基因启动子中的每个甲基化位点的甲基化状态进行分析，如是否发生甲基化及甲基化率。通过实验证明：本发明的方法可以准确、快速和高效检测septin9基因启动子甲基化位点的甲基化状态，并且本发明的方法操作简单、假阳性率低、成本较低，结果更加直观。在诊断或辅助诊断结直肠癌中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为2％琼脂糖凝胶电泳图。
图2为2％琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、septin9基因启动子甲基化的检测引物及检测Septin9基因启动子甲基化的NGS方法
一、septin9基因启动子甲基化的检测引物的设计与合成
本发明根据septin9基因启动子区利用Primer Premier3.0和Methyl PrimerExpress v1.0设计一对septin9基因启动子甲基化的检测引物(由华大基因合成)，引物序列如下：正向引物(septin 9FP)：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT(序列1)；反向引物(septin9RP)：CCCACCAACCATCATAT(序列2)。
本发明设计的septin9基因启动子甲基化的检测引物的扩增产物序列如下：CCCACCAACCATCATATCGAACCCCGCGATCAACGCGCAACTAAATAAAATCATTTCGAACTTCGAAAATAAATACTAAACTAACTACTAC(序列3)，序列3所述的扩增产物序列中共含有7个CpG位点，下划线标注的位点即为CpG位点。
二、检测Septin9基因启动子甲基化的NGS方法
1、样本信息及制备
本实施例检测样本为北京迈基诺医学检验所的正常人基因组DNA和一例临床结直肠癌Ⅲ期伴有肝转移患者(简称结直肠癌患者)的新鲜组织基因组DNA；同时以合成的非甲基化的重硫酸盐处理后序列(Bis-Raw-Seq质粒)作为阴性对照，以合成的甲基化的重硫酸盐处理后的序列(Bis-Methyl-Seq质粒)作为阳性对照。
阴性对照Bis-Raw-Seq质粒是将序列4所示的DNA分子插入PSBS1质粒(购买自北京赛百胜基因技术有限公司)中，且保持PSBS1质粒的其他序列不变后得到的质粒。阴性对照Bis-Raw-Seq质粒的核苷酸序列如序列6所示。
阳性对照Bis-Methyl-Seq质粒是将序列5所示的DNA分子插入PSBS1质粒中，且保持PSBS1质粒的其他序列不变后得到的质粒。阳性对照Bis-Methyl-Seq质粒的核苷酸序列如序列7所示。
上述质粒在使用时将其溶于Tris-HCl(10mM)中，得到质粒样品溶液。质粒样品溶液的浓度为3*E5copies/uL。
2、重硫酸盐处理样本
使用QIAGEN Epitect Bisulfite Kit(货号：59124)分别对步骤1中的正常人基因组DNA和结直肠癌患者基因组DNA进行重硫酸盐处理，分别得到重硫酸盐处理后样本(Bis-DNA)。具体步骤如下(下述实验中的离心步骤均在室温下进行)：
1)不同浓度的样品溶液的配制
按照表1中的配方，配制不同浓度的样品溶液，具体如下：
低浓度样品溶液的配制：将40μL DNA溶液、85uL Bisulfite Mix和15uL DNAProtect Buffer混匀，RNase-free Water补足140uL，漩涡震荡直至完全溶解；
高浓度样品溶液的配制：将20μL DNA溶液、85uL Bisulfite Mix和15uL DNAProtect Buffer混匀，RNase-free Water补足140uL，漩涡震荡直至完全溶解；
上述DNA溶液分别为正常人基因组DNA溶液和结直肠癌患者基因组DNA溶液(DNA溶液的溶剂为H2O，DNA浓度为230.4ng/uL)。
在实际操作中，可以根据选择的DNA样本来选择样品溶液的配制方法，例如选择来源于组织样本的基因组DNA的质量较高，可以按照高浓度样品配制样品溶液，选择血浆样本的基因组DNA的质量较低，可以选择低浓度样品配制样品溶液。
表1、样品溶液的配制
2)完成步骤1)后，关闭PCR管，彻底混匀，当DNA Protect Buffer与Bisulfite Mix混合时，颜色由绿变蓝，此时表示充分混匀且pH值正确；
3)完成步骤2)后，按照表2中的程序将不同浓度的样品溶液在PCR仪中进行反应。
表2、PCR反应程序
步骤 温度(℃) 时间(min) 备注
变性 95 5
孵育 60 25
变性 95 5
孵育 60 85
变性 95 5
孵育 60 175
Hold 20 Indefinite 可过夜保存，不会有损失
4)完成步骤3)后，取出PCR管，瞬离；将每个PCR管中的产物转移至一个新的1.5mLEP管内(注意：转移溶液中的沉淀物不会影响反应的结果和产量)；
5)完成步骤4)后，向EP管中加入310μL新配置的Buffer BL(含10μg/mL CarrierRNA)，漩涡混匀，瞬离(注意：如果DNA量大于100ng，则不需要添加Carrier RNA)；
6)完成步骤5)后，每管加250μL无水乙醇(96-100％)，漩涡15s混匀，瞬离；
7)完成步骤6)后，将混合液全部转移至MinElute DNA Spin Column(4℃保存)；最大转速离心1min；弃上清液，收集沉淀；
8)完成步骤7)后，向沉淀中加入500μL BW Buffer，最大转速离心1min，弃上清液，收集沉淀；
9)完成步骤8)后，向沉淀中加入500μL BD Buffer(4℃保存)，室温孵育15min。完成步骤9)时注意：A)若BD Buffer有沉淀，请避免吸取沉淀；B)吸取BD Buffer之后，请迅速关闭BD Buffer的瓶盖，以避免空气中的CO2对其中和作用；C)室温孵育时，请关闭spincolumn的盖子。
10)完成步骤9)后，最大转速离心1min，弃上清液，收集沉淀；
11)完成步骤10)后，向沉淀中加入500μL BW Buffer，最大转速离心1min，弃上清液，收集沉淀；
12)重复步骤11)一次；
13)完成步骤12)后，向沉淀中加250μL无水乙醇(96-100％)，最大转速离心1min；
14)完成步骤13)后，将Spin Column转移至一个新的收集管内(试剂盒提供)，最大转速离心1min；
15)完成步骤14)后，将Spin Column转移至一个新的1.5mL EP管中，向膜中间加入27μL RNase-Free H2O；
16)完成步骤15)后，室温孵育1min；
17)完成步骤16)后，12000rpm离心1min；
18)完成步骤17)后，再最大转速离心1min；
19)完成步骤18)后，得到产物即为重硫酸盐处理后样本(Bis-DNA)，做好标记，待下一步使用；或-20℃保存备用。
3、PCR扩增目的基因
以步骤2获得的产物(Bis-DNA)为模板，采用步骤一设计的septin 9FP和septin9RP引物进行Touch-down PCR，得到PCR产物。PCR反应体系如表3所示。PCR反应程序如表4所示。
表3、反应体系
组成 体积(μL)
2×Goldstar Best Mix 25
Septin 9FP(10μM) 2
Septin 9RP(10μM) 2
上步产物 100ng
Water Up to 50μL
表4、PCR反应程序
4、2％琼脂糖凝胶电泳
制备2％琼脂糖凝胶，取3.5μL步骤3获得的PCR产物进行凝胶电泳。电压设置：200V；时间：10min。凝胶成像系统观察电泳结果，目的条带约100bp左右(图1)。
5、磁珠纯化
琼脂糖凝胶电泳检测后，对剩余PCR产物进行磁珠纯化，得到纯化后产物。具体步骤如下：
1)向PCR产物中加入1.2倍体积的磁珠(BECKMAN公司的AMPure，货号是A63881)，上下抽吸混匀至少二十次；
2)完成步骤1)后，将混合液放在室温下5分钟，使DNA充分被吸附在磁珠上；
3)完成步骤2)后，吸附结束后，置于磁力架上室温放置5分钟(不要旋转tube)；
4)完成步骤3)后，待溶液变得清澈后，用移液器将澄清的液体移弃(注意：枪头不要碰到磁珠)。
5)完成步骤4)后，保持8连管在磁力架上不动，加入200μl 80％酒精(酒精配置时间在两周以内，并确保封闭好)，室温放置30秒后移弃澄清液。
6)完成步骤5)后，重复步骤5)一次，并将管底的残留液体彻底吸干。
7)完成步骤6)后，将反应管从磁力架上移开，室温放置5分钟(此步骤是为了彻底挥发掉残留的酒精，以免影响后续反应实验)。
8)完成步骤7)后，加入33μl的ddH2O，枪头吹打充分混匀，室温放置3分钟。
9)完成步骤8)后，将反应管置于磁力架上，室温放置5分钟。
10)完成步骤9)后，转移步骤9)反应管中30μl澄清液与对应的已经贴好条形码编号的离心管中，盖上管盖；
11)文库样本可置于-20℃长期保存。
6、PCR富集
PCR富集DNA片段，构建DNA测序文库。PCR富集的反应体系如表5所示，反应体系中所使用的试剂购自Thermo公司(货号为F549L)；PCR富集的反应程序如表6所示。
表5、PCR反应体系
表6、PCR富集的反应程序
7、2％琼脂糖凝胶电泳
制备2％琼脂糖凝胶，取3.5μL PCR产物进行凝胶电泳。电压设置：200V，时间：10min。凝胶成像系统观察电泳结果，目的条带约200-300bp左右(图2)。
8、磁珠纯化
详细步骤参见步骤5中的磁珠纯化。
9、高通量测序及生物信息分析
磁珠纯化后，测定文库浓度，使用NextSeq 500进行高通量测序。并使用专业的甲基化测序分析软件Bis-Marker对下机结果进行分析。
检测结果如表7和表8所示。从表中可以看出：正常人基因组DNA中的septin9基因启动子的7个CpG位点均没有发生甲基化，且无论是低浓度的正常人基因组DNA样品溶液还是高浓度的正常人基因组DNA样品溶液，检测结果均一致。而结直肠癌患者组织的基因组DNA中的septin9基因启动子的7个CpG位点均发生了甲基化，且无论是低浓度的结直肠癌患者基因组DNA样品溶液还是高浓度的结直肠癌患者样品溶液，检测结果均一致。阴性对照Bis-Raw-Seq质粒的检测结果与正常人基因组DNA检测结果一致，阳性对照Bis-Methyl-Seq质粒的检测结果与结直肠癌患者组织的基因组DNA检测结果一致。说明本发明的甲基化检测结果准确、可靠。
表7、甲基化程度检测结果
表8、甲基化位点分析结果
序列表
<110>迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司
<120>一种基于NGS检测Septin9基因启动子甲基化的方法及其应用
<160>7
<210>1
<211>26bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gtagtagtta gtttagtatt tatttt 26
<210>2
<211>17bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cccaccaacc atcatat 17
<210>3
<211>91bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
cccaccaacc atcatatcga accccgcgat caacgcgcaa ctaaataaaa tcatttcgaa 60
cttcgaaaat aaatactaaa ctaactacta c 91
<210>4
<211>291bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
aggggttttg ttttttttta gtgtattttt gttttttttt agtgtatttt tgttttgtgt 60
taggtttatt tgtagggttt tttttagtat gtttgtggtt gtagtagtta gtttagtatt 120
tatttttgaa gtttgaaatg attttattta gttgtgtgtt gattgtgggg tttgatatga 180
tggttggtgg gtagtgggtt gtgtggaggg tagtggtgag gaagtgtttt tggtggggtt 240
tgggttttgt gtgttggttg gggtgttgtg tttgtgtttt tgtagtgtag a 291
<210>5
<211>291bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
aggggtttcg ttttttttta gcgtattttc gttttttttt agcgtatttt cgtttcgcgt 60
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cgggttttgc gcgttggttg gggcgtcgcg ttcgcgtttt tgtagtgtag a 291
<210>6
<211>3467bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60
cgacaggttt cccgactgga aagctaatac gactcactat agggcagtgt aaaacgacgg 120
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tgtatttttg ttttttttta gtgtattttt gttttgtgtt aggtttattt gtagggtttt 300
ttttagtatg tttgtggttg tagtagttag tttagtattt atttttgaag tttgaaatga 360
ttttatttag ttgtgtgttg attgtggggt ttgatatgat ggttggtggg tagtgggttg 420
tgtggagggt agtggtgagg aagtgttttt ggtggggttt gggttttgtg tgttggttgg 480
ggtgttgtgt ttgtgttttt gtagtgtaga gctgaggctg tcaagtgtaa agtgtagcgg 540
tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag 600
gtggctctgt actgtgcgat ctgatcggtc atagctgttt cctgaacccc tatagtgtca 660
cctaaatact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 720
ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 780
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aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 1200
gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 1260
aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 1320
caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 1380
tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 1440
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gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 1560
agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 1620
gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 1680
ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 1740
taatctcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga 1800
gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 1860
atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 1920
gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 1980
ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 2040
cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 2100
ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg 2160
atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 2220
acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 2280
atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 2340
tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 2400
ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 2460
tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 2520
cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 2580
agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgaccaa aatcccttaa 2640
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 2700
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 2760
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 2820
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 2880
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 2940
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 3000
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 3060
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 3120
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 3180
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 3240
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 3300
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 3360
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 3420
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaaga 3467
<210>7
<211>3467bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60
cgacaggttt cccgactgga aagctaatac gactcactat agggcagtgt aaaacgacgg 120
ccagtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 180
atgttgtgtg gaattgtgag attacgccaa gctgacctta ggggtttcgt ttttttttag 240
cgtattttcg ttttttttta gcgtattttc gtttcgcgtt aggtttattc gtagggtttt 300
ttttagtacg ttcgcggtcg tagtagttag tttagtattt attttcgaag ttcgaaatga 360
ttttatttag ttgcgcgttg atcgcggggt tcgatatgat ggttggtggg tagcgggtcg 420
cgcggagggt agcggcgagg aagcgttttc ggcggggttc gggttttgcg cgttggttgg 480
ggcgtcgcgt tcgcgttttt gtagtgtaga gctgaggctg tcaagtgtaa agtgtagcgg 540
tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag 600
gtggctctgt actgtgcgat ctgatcggtc atagctgttt cctgaacccc tatagtgtca 660
cctaaatact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 720
ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 780
aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 840
ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 900
gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 960
ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 1020
ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 1080
gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 1140
aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 1200
gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 1260
aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 1320
caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 1380
tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 1440
acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 1500
gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 1560
agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 1620
gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 1680
ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 1740
taatctcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga 1800
gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 1860
atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 1920
gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 1980
ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 2040
cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 2100
ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg 2160
atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 2220
acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 2280
atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 2340
tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 2400
ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 2460
tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 2520
cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 2580
agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgaccaa aatcccttaa 2640
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 2700
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 2760
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 2820
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 2880
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 2940
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 3000
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 3060
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 3120
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 3180
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 3240
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 3300
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 3360
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 3420
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaaga 3467

Claims (10)

1.一种用于检测septin9基因启动子甲基化的引物对，其由引物1和引物2组成；
所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物1和所述引物2的摩尔量比为1:1。
3.一种用于检测septin9基因启动子甲基化的PCR试剂，其包括权利要求1或2所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物1和所述引物2在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。
5.一种用于检测septin9基因启动子甲基化的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物对或权利要求3或4所述的PCR试剂。
6.权利要求1或2所述的引物对或权利要求3或4所述的PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在如下1)-8)中任一种中的应用：
1)检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化；
2)制备检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化的产品；
3)检测或辅助检测septin9基因启动子中每个甲基化位点的甲基化状态；
4)制备检测或辅助检测septin9基因启动子中每个甲基化位点的甲基化状态的产品；
5)检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化率；
6)制备检测或辅助检测septin9基因启动子甲基化率的产品；
7)诊断或辅助诊断结直肠癌；
8)制备诊断或辅助诊断结直肠癌的产品。
7.一种检测septin9基因启动子甲基化的方法，包括如下步骤：
(1)重硫酸盐处理待测样品基因组DNA，得到重硫酸盐处理后基因组DNA；
(2)采用权利要求1所述的引物对对所述重硫酸盐处理后基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)PCR富集DNA片段，构建DNA测序文库；
(4)将所述文库进行高通量测序并进行甲基化分析，得到待测样品基因组DNA的septin9基因启动子中的每一个甲基化位点的甲基化状态。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)和(3)之间还包括纯化的步骤；
所述步骤(3)和(4)之间还包括纯化的步骤；
所述纯化的方法均为磁珠纯化。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)中，所述PCR扩增为Touch-down PCR；
或，所述待测样品基因组DNA为受试者组织中的基因组DNA或血浆中游离的基因组DNA。
10.权利要求7-9中任一所述的方法在诊断或辅助诊断结直肠癌中的应用。
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