CN105400877A - 一种基于免疫酶联反应的基因组snp位点检测方法 - Google Patents

一种基于免疫酶联反应的基因组snp位点检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，先针对基因组SNP位点设计引物及SNP探针组，将引物与基因组DNA杂交，对杂交产物进行单次短时间延伸，然后将延伸产物分别与SNP探针组中的SNP探针进行变性杂交和退火，使延伸产物与SNP探针结合；再用磁珠捕获与延伸产物结合的SNP探针，通过DNA内切酶处理，切除与延伸产物不完全互补的SNP探针；最后用地高辛标记免疫酶联反应对结果进行检测，基因组SNP即为与出现颜色反应的SNP探针相同的核苷酸。该方法特异性高、仪器依赖性小、实验环境要求小，可在非实验室条件下进行检测，具有检测的准确性和灵敏度，可用于各种环境下的SNP初步筛查。

Description

一种基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种SNP检测方法，具体涉及一种基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)是由基因组单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，是在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象。SNP在人类基因组中可达到300万个，平均约每1250个碱基对就会有一个SNP位点。研究表明SNP与多种疾病的发生相关，而快速、简便的检测这些具有生物学意义的SNP是准确医疗诊断的基础和前提。一方面，SNP检测可参考已有的基因组序列进行，目的相对明确。但另一方面，SNP鉴定需检测基因组DNA序列上特定核苷酸的转换、颠换、插入或缺失情况，对检测灵敏度、通量以及准确性等都有特殊的要求。
截至目前，已报导的SNP检测方法将近百种。其中较常用的方法有以下几大类：首先，是1995年Livak研究小组报导TaqmMan探针SNP分型法，这种通过将荧光发色团和淬灭基团偶联在SNP探针的两端，通过对SNP区域的RT-PCR实现对探针切割，从而通过检测RT-PCR过程中产生的荧光信号种类区分等位基因的SNP类型。这种方法具有分析简单的特点，已被广泛应用于多样本单一SNP位点的检测，但其探针较为昂贵。其次，是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法，如：限制性片段长度多态性法PCR-RFLP、单链构象多态性法PCR-SSCP、变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)。另外，随机扩增多态性(RAPD)和寡核苷酸连接分析(OLA)也是较为常用的方法，这几种方法检测信息准确，但都较为烦琐。再次，是近些年来发展起来的，高通量、自动化程度较高的检测SNP的方法，例如：DNA测序法、DNA芯片检测、飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测、变性高效液相色谱(DHPLC)法等等的高通量分析，其中直接测序是最容易实施的SNP检测方法，而MALDI-TOFMS是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后，在硅芯片上进行引物的退火、延伸，突变位点配对的碱基与正常配对的碱基不同，在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。
这些方法各具优势，具有操作简便、检测特异性高、高通量或高精度等特点，但对实验仪器均有特殊要求和较高的依赖性，局限了其应用的灵活性和范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，该方法能够分析基因SNP信息，并具有特异性高及仪器依赖性小的优点。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，包括以下步骤：
1)依照待检测SNP位点相邻序列，设计带有5’-生物素标记的特异性引物和带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组；
2)将带有5’-生物素标记的特异性引物与提取出的待检测基因组DNA进行变性杂交，然后去除未与待检测基因组DNA结合的带有5’-生物素标记的特异性引物，得到纯化后的与引物杂交的基因组DNA；
3)在PCR反应体系中对纯化后的与引物杂交的基因组DNA进行单次短时间延伸，然后通过基因组DNA纯化除去PCR反应体系，得到带有生物素标记的延伸产物；
4)将带有生物素标记的延伸产物分别与带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组中的不同SNP探针进行变性杂交，使全部或部分带有生物素标记的延伸产物与SNP探针互补结合，然后通过基因组DNA纯化分离出与延伸产物结合的SNP探针、游离引物、多余SNP探针和其他存在于反应体系中的核酸短序列；
5)用磁珠捕获所有带有生物素标记的与延伸产物结合的SNP探针及其他带有生物素标记的核酸短序列，然后经DNA内切酶处理，除去与延伸产物不完全互补的SNP探针及其他带有生物素标记的核酸短序列，再重新收集磁珠，得到与延伸产物完全互补的SNP探针；
6)用地高辛标记免疫酶联反应对得到的与延伸产物完全互补的SNP探针进行检测，根据是否发生显色判断SNP的分型，其中基因组SNP位点即为与出现颜色反应的SNP探针相同的核苷酸。
所述的带有5’-生物素标记的特异性引物由基因组SNP位点相邻上游区域的基因序列确定，该特异性引物的长度为20～28bp，该特异性引物的基因序列与基因组SNP位点相邻上游区域的基因序列相同，该特异性引物的3’-端核苷酸紧邻但不包含基因组SNP位点，该特异性引物的5’-端带有生物素修饰基团。
所述的带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组由若干SNP探针组成，其中所有SNP探针均为与基因组SNP位点相邻并包含基因组SNP位点的基因序列，该基因序列具体包括四部分：SNP探针5’-端与特异性引物互补的基因序列、与基因组SNP位点核苷酸互补或不互补的核苷酸、与基因组SNP位点3’-端相邻的10bp核苷酸的互补基因序列、以及SNP探针5’-端的地高辛标记；其中含有与基因组SNP位点核苷酸不互补的核苷酸的SNP探针为阴性对照探针。
所述步骤2)中变性杂交的具体操作条件为：先在95℃水浴中热变性5min，再在(Tm–4)℃水浴中杂交5min，其中Tm为带有5’-生物素标记的特异性引物的退火温度，退火温度在60～70℃。
所述步骤2)中在变性杂交后，通过E.Z.N.A.BloodDNAkit基因纯化试剂盒对基因组进行纯化，去除未与待检测基因组DNA结合的带有5’-生物素标记的特异性引物。
所述步骤3)中单次短时间延伸的具体操作条件为：在(Tm–4)℃水浴中反应10～30秒，其中Tm为带有5’-生物素标记的特异性引物的退火温度，退火温度在60～70℃。
所述步骤4)中变性杂交的具体操作条件为：先在95℃水浴中热变性5min，再在(Tm–4)℃水浴中杂交5min，其中Tm为带有5’-生物素标记的特异性引物的退火温度，退火温度在60～70℃。
所述步骤5)中的磁珠为链霉素亲和生物素磁珠，其可与延伸产物上的生物素标记结合，从而达到分离延伸产物的目的；所述的DNA内切酶为T7核酸内切酶I(T7EndonucleaseI)，用于特异性切割不完全配对的dsDNA。
所述步骤6)中的地高辛标记免疫酶联反应，是通过抗地高辛-HRP偶联抗体结合带有5’-地高辛标记的SNP探针，催化HRP底物进行显色反应，其中HRP底物为TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbiphenyl，3,3’5,5’-四甲基联苯双酚二缩水甘油醚)显色底物，终止反应液为2mol/L的H2SO4。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，首先针对基因组SNP位点设计带有5’-生物素标记的特异性引物及带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组，然后将引物与提取的基因组DNA进行杂交，再对与引物杂交的基因组DNA进行单次短时间延伸，然后将延伸产物分别与特异性SNP探针组中的SNP探针进行变性杂交和退火，使全部或部分延伸产物与SNP探针结合；再用磁珠捕获带有生物素标记的与延伸产物结合的SNP探针，通过DNA内切酶处理，切除与延伸产物不完全互补的SNP探针；最后用地高辛标记免疫酶联反应对结果进行检测，根据是否发生显色判断SNP的分型：基因组SNP即为与出现颜色反应的SNP探针相同的核苷酸。本发明属于PCR非依赖性方法，虽然只包括单次延伸反应，但通过3次特异性筛选和1次信号放大过程，保证了结果的特异性和灵敏度。其中，3次特异性筛选过程为：①通过特异性引物与模板的结合与单次延伸合成出被检测序列和非特异延伸的杂片断；②通过磁珠捕获去除基因组、基因组降解短片断及未与延伸产物结合的多余SNP探针，此时捕获产物中仅为与SNP探针结合的被检序列和非特异序列；③通过T7内切酶I对不完全互补的序列(包括所有杂序列和非同型SNP探针序列)进行切割，剩余序列中只有可以与延伸产物SNP性质相同的地高辛标记得以保留，保证了反应的特异性。1次信号放大过程为：通过地高辛免疫酶联反应放大信号，提高反应的灵敏度。另外，本发明提供的方法中包含的试剂及操作工具均较轻便，可由发明试剂盒提供，依赖的外在设备仅为加热装置，即：具有实验仪器及环境要求低的优点，可在不具备专业仪器的实验环境或野外操作环境下进行检测。可能在未来疾病的初步筛查、刑侦初步判断等领域得以应用。
附图说明
图1为本发明提供的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法的流程示意图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步详细说明。
本发明公开了一种SNP检测方法，该方法基于生物素标记引物的Taq酶单向延伸、DNA限制性酶切、地高辛偶联核酸探针的免疫酶联反应实施。该方法包括:针对基因组SNP位点设计带有5’-生物素标记的特异性引物及带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组，引物依照SNP位点5’-端相邻序列设计，引物序列不包含SNP位点。特异性SNP探针为与包含引物序列、SNP位点及其下游10bp的序列互补的核酸序列，并带有5’-端的地高辛标记，依SNP位点变异碱基的A/T/C/G情况，设计针对不同碱基变异的一组探针，其中与SNP位点核苷酸互补的核苷酸，为此位点多态性核苷酸的互补核苷酸，阴性对照探针中此位点核苷酸为与此为点多态性都不互补的核苷酸。如图1所示，该方法的具体流程为：先将引物与提取基因组进行杂交，在Taq介导的引物延伸体系中对引物杂交DNA进行单次短时间延伸，然后将延伸产物分别与特异性SNP探针组进行变性和退火，使全部或部分延伸产物与SNP探针结合；用磁珠捕获带有生物素标记的延伸产物(无论其是否与SNP探针或其他相似序列的结合情况)，然后通过DNA内切酶处理磁珠，切除与延伸产物不完全互补的SNP探针；最后用地高辛标记免疫酶联反应对结果进行检测，根据是否发生显色判断SNP的分型：基因组的SNP即为与出现颜色反应的SNP特异性探针相同的核苷酸。该方法的优点是：方法的仪器依赖性小，适用于各种不具备专业仪器的实验环境，应用互补筛选、DNA内切酶筛选及免疫酶联放大系统，具有检测的准确性和灵敏度，可用于各种环境下的SNP初步筛查。
实施例1
对免疫活化基因SEMA4D基因SNP位点rs11526468的单位点检测。
1.针对SNP位点rs11526468，设计对应的检测引物和探针，合成公司为生工生物科技有限公司(SangonBiotech，上海)。
rs11526468位点的周边序列为：
……GGTGTGGGACTGCTCCACTGTGGTGCTCTGCATGTACTTCCCGTGGGAGAAGACCTCCTCGGCTGTGGACAGGTTGTAGGYGCACACTGCCGACAGCCCCACGTTGTTCCTGGGGAGGGGAAAGAGGTGACGGGACCACCTGGCGGCATCAAGGGAGCAAGGAGGGGGACTCCACCCAGGGCACTTACAGCTGTGGGGTGA……
以Y点5’端临近序列设计引物，引物长度23bp；引物Tm值为65.7℃；
引物序列：biotin-CTCGGCTGTGGACAGGTTGTAGG。
以Y点5’端临近序列的互补序列，Y点的SNP情况，Y点3’端临近10bp序列的互补序列设计探针，探针长度为23+1+10＝34bp；由于此SNP位点为C/T，则探针组包含两个序列：
探针1：digoxin-GGCAGTGTGCGCCTACAACCTGTCCACAGCCGAG；
探针2：digoxin-GGCAGTGTGCACCTACAACCTGTCCACAGCCGAG；
阴性对照探针：digoxin-GGCAGTGTGCCCCTACAACCTGTCCACAGCCGAG。
2.收集10份待检测血液样本，通过E.Z.N.A.BloodDNAkit基因纯化试剂盒分离血液中的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)250μL样本中加入25μLOBProtease和BLBuffer，混合均匀，65℃10min；
(2)加入260μL100％酒精，混合均匀。将混合液加入HibindDNAMinicolumn，用橡胶押杆将混合液推出纯化柱，弃去滤过液；
(3)将500μLHB缓冲液加入纯化柱，橡胶押杆将混合液推出纯化柱，弃去滤过液；
(4)将700μLWashBuffer加入纯化柱，橡胶押杆将混合液推出纯化柱，弃去滤过液；
(5)室温干燥5min，加入200μL纯水，将1.5mLEP管套入纯化柱出液口，橡胶押杆将混合液推出纯化柱，收集滤出液即为基因组DNA。
3.在1.5mLEP管中依次加入200μL提取的基因组DNA，1μL10μmol/L的引物，Taq酶缓冲液，2μLtaq酶，5μLdNTP。混合后进行链延伸，条件为：95℃水浴中热变性5分钟；在60℃水浴30秒，缓慢冷却至室温。
4.通过miroEluteDNACleanupkit除去PCR反应缓冲体系，具体步骤为：
(1)向样品中加入600μLDPBuffer，混合均匀，转入miroEluteDNAMiniColumn纯化柱，抽吸纯化柱，弃去滤过液；
(2)向纯化柱加入700μLSPWBuffer，抽吸纯化柱，并重复冲洗过程，抽吸纯化柱至干燥；
(3)加入50μLElutionBuffer，室温放置1min，抽吸纯化柱并收集滤过液。
5.向SNP探针1和SNP探针2的探针缓冲液中分别加入上述延伸产物，充分混合，于95℃水浴中热变性5分钟；在60℃水浴中杂交2分钟(探针缓冲液：100μLPBS+4μL10μmol/L的特异性SNP探针)。
6.DynabeadsMyOnestreptavidinT1磁珠捕获带有生物素标记的延伸产物，并通过T7EndonucleaseI除去杂交后不完全与探针配对的延伸产物，用地高辛标记免疫酶联反应对结果进行检测，根据是否发生显色判断SNP的分型：样品SNP即为与出现颜色反应的SNP特异性探针相同的核苷酸。
具体步骤为：
(1)在2mLEP管中加入150μL重悬的Dynabeads，加入50μL纯化后的延伸产物。
(2)依次加入100μLPBS/BSA和1μLanti-Digoxigeninantibody[HRP.21H8]，混合完全并室温孵育10min(PBS/BSABuffer:1*PBS+0.2％BSA)。
(3)将试管放入magnet槽中，用1mLPBS/BSAbuffer清洗。
(4)取下试管并加入40U(4μL)T7EndonucleaseI混合，37℃孵育30min。
(6)将试管放入magnet槽中，用1mLPBS/BSAbuffer清洗。
(7)加入50μLTMB显色缓冲液混合并孵育30min，加入终止反应液，观察颜色反应。
7.实验结果见表1。
实施例2
对HBV治疗预后相关基因IL28B多态性位点的多点检测。人IL28B基因包含的SNP位点：rs12979860，rs8099917。
1.针对rs12979860的SNP位点，设计对应的检测引物和探针，合成公司为生工生物科技有限公司(SangonBiotech，上海)。
rs12979860位点的周边序列为：
……GGATTCCTGGACGTGGATGGGTACTGGCAGCGCACGGTCGTGCCTGTCGTGTACTGAACCAGGGAGCTCCCCGAAGGCGYGAACCAGGGTTGAATTGCACTCCGCGCTCCCCCAGCAAAGCCCCTCGCCCCGACCTGGAGCCGAGTCCTCCCGGCAGGGCTCCCTTCTGTGATTGACCCTGAGCCTGCGTTCGCGCTGACGAC……
以Y点5’端临近序列设计引物，引物长度21bp；引物Tm值为70.5℃；
rs12979860引物序列：biotin-CCAGGGAGCTCCCCGAAGGCG；
以Y点5’端临近序列的互补序列，Y点的SNP情况，Y点3’端临近10bp序列的互补序列设计探针，探针长度为21+1+10＝32bp；由于此SNP位点为C/T，则探针组包含2个序列：
rs12979860探针1：digoxin-ACCCTGGTTCGCGCCTTCGGGGAGCTCCCTGG；
rs12979860探针2：digoxin-ACCCTGGTTCACGCCTTCGGGGAGCTCCCTGG；
2.收集10份待检测血液样本，通过E.Z.N.A.BloodDNAkit分离血液中的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)250μL样本中加入25μLOBProtease和BLBuffer，混合均匀，65℃10min；
(2)加入260μL100％酒精，混合均匀。将混合液加入HibindDNAMinicolumn，用橡胶押杆将混合液推出纯化柱，弃去滤过液；
(3)将500μLHB缓冲液加入纯化柱，橡胶押杆将混合液推出纯化柱，弃去滤过液；
(4)将700μLWashBuffer加入纯化柱，橡胶押杆将混合液推出纯化柱，弃去滤过液；
(5)室温干燥5min，加入200μL纯水，将1.5mLEP管套入纯化柱出液口，橡胶押杆将混合液推出纯化柱，收集滤出液为基因组DNA。
3.在1.5mLEP管中依次加入200μL提取的基因组DNA，1μL10μmol/L的引物，Taq酶缓冲液，2μLtaq酶，5μLdNTP。混合后进行链延伸，条件为：95℃水浴中热变性5分钟；在60℃水浴30秒，缓慢冷却至室温。
4.通过miroEluteDNACleanupkit除去PCR反应缓冲体系，具体步骤为：
(1)向样品中加入600μLDPBuffer，混合均匀，转入miroEluteDNAMiniColumn纯化柱，抽吸纯化柱，弃去滤过液；
(2)向纯化柱加入700μLSPWBuffer，抽吸纯化柱，并重复冲洗过程，抽吸纯化柱至干燥；
(3)加入50μLElutionBuffer，室温放置1min，抽吸纯化柱并收集滤过液。
5.向SNP探针1和SNP探针2的探针缓冲液中分别加入上述延伸产物，充分混合，于95℃水浴中热变性5分钟；在60℃水浴中杂交2分钟(探针缓冲液：100μLPBS+4μL10μmol/L的特异性SNP探针)。
6.DynabeadsMyOnestreptavidinT1磁珠捕获带有生物素标记的延伸产物，并通过T7EndonucleaseI除去杂交后不完全与探针配对的延伸产物，用地高辛标记免疫酶联反应对结果进行检测，根据是否发生显色判断SNP的分型：样品SNP即为与出现颜色反应的SNP特异性探针相同的核苷酸。
具体步骤为：
(1)在2mLEP管中加入150μL重悬的Dynabeads，加入50μL纯化后的延伸产物。
(2)依次加入100μLPBS/BSA和1μLanti-Digoxigeninantibody[HRP.21H8]，混合完全并室温孵育10min(PBS/BSABuffer:1*PBS+0.2％BSA)。
(3)将试管放入magnet槽中，用1mLPBS/BSAbuffer清洗。
(4)取下试管并加入40U(4μL)T7EndonucleaseI混合，37℃孵育30min。
(6)将试管放入magnet槽中，用1mLPBS/BSAbuffer清洗。
(7)加入50μLTMB显色缓冲液混合并孵育30min，加入H2SO4终止反应，观察颜色反应。
7.实验结果见表1。
表1是rs11526468(C/T)和rs12979860(C/T)的测序结果和使用本方法的检测结果。从汉族无关个体DNA样本中随机挑选出的10个样本的测序及检测结果如表1所示。从上到下依次为样本1～10和阴性对照组。
表1rs11526468(C/T)和rs12979860(C/T)的测序结果和本方法的检测结果
从表1可以看出，在对rs11526468(C/T)和rs12979860(C/T)两SNP位点的测序中，本发明的方法可靠有效，检测结果与测序结果完全相同。

Claims (9)

1.一种基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)依照待检测SNP位点相邻序列，设计带有5’-生物素标记的特异性引物和带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组；
2)将带有5’-生物素标记的特异性引物与提取出的待检测基因组DNA进行变性杂交，然后去除未与待检测基因组DNA结合的带有5’-生物素标记的特异性引物，得到纯化后的与引物杂交的基因组DNA；
3)在PCR反应体系中对纯化后的与引物杂交的基因组DNA进行单次短时间延伸，然后通过基因组DNA纯化除去PCR反应体系，得到带有生物素标记的延伸产物；
4)将带有生物素标记的延伸产物分别与带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组中的不同SNP探针进行变性杂交，使全部或部分带有生物素标记的延伸产物与SNP探针互补结合，然后通过基因组DNA纯化分离出与延伸产物结合的SNP探针、游离引物、多余SNP探针和其他存在于反应体系中的核酸短序列；
5)用磁珠捕获所有带有生物素标记的与延伸产物结合的SNP探针及其他带有生物素标记的核酸短序列，然后经DNA内切酶处理，除去与延伸产物不完全互补的SNP探针及其他带有生物素标记的核酸短序列，再重新收集磁珠，得到与延伸产物完全互补的SNP探针；
6)用地高辛标记免疫酶联反应对得到的与延伸产物完全互补的SNP探针进行检测，根据是否发生显色判断SNP的分型，其中基因组SNP位点即为与出现颜色反应的SNP探针相同的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述的带有5’-生物素标记的特异性引物由基因组SNP位点相邻上游区域的基因序列确定，该特异性引物的长度为20～28bp，该特异性引物的基因序列与基因组SNP位点相邻上游区域的基因序列相同，该特异性引物的3’-端核苷酸紧邻但不包含基因组SNP位点，该特异性引物的5’-端带有生物素修饰基团。
3.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述的带有5’-地高辛标记的特异性SNP探针组由若干SNP探针组成，其中所有SNP探针均为与基因组SNP位点相邻并包含基因组SNP位点的基因序列，该基因序列具体包括四部分：SNP探针5’-端与特异性引物互补的基因序列、与基因组SNP位点核苷酸互补或不互补的核苷酸、与基因组SNP位点3’-端相邻的10bp核苷酸的互补基因序列、以及SNP探针5’-端的地高辛标记；其中含有与基因组SNP位点核苷酸不互补的核苷酸的SNP探针为阴性对照探针。
4.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述步骤2)中变性杂交的具体操作条件为：先在95℃水浴中热变性5min，再在(Tm–4)℃水浴中杂交5min，其中Tm为带有5’-生物素标记的特异性引物的退火温度，退火温度在60～70℃。
5.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述步骤2)中在变性杂交后，通过E.Z.N.A.BloodDNAkit基因纯化试剂盒对基因组进行纯化，去除未与待检测基因组DNA结合的带有5’-生物素标记的特异性引物。
6.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述步骤3)中单次短时间延伸的具体操作条件为：在(Tm–4)℃水浴中反应10～30秒，其中Tm为带有5’-生物素标记的特异性引物的退火温度，退火温度在60～70℃。
7.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述步骤4)中变性杂交的具体操作条件为：先在95℃水浴中热变性5min，再在(Tm–4)℃水浴中杂交5min，其中Tm为带有5’-生物素标记的特异性引物的退火温度，退火温度在60～70℃。
8.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述步骤5)中的磁珠为链霉素亲和生物素磁珠，DNA内切酶为T7核酸内切酶I。
9.根据权利要求1所述的基于免疫酶联反应的基因组SNP位点检测方法，其特征在于：所述步骤6)中的地高辛标记免疫酶联反应，是通过抗地高辛-HRP偶联抗体结合带有5’-地高辛标记的SNP探针，催化HRP底物进行显色反应，其中HRP底物为TMB显色底物，终止反应液为2mol/L的H2SO4。
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