CN103687959A - 用于测定线粒体功能的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了涉及使用胆固醇依赖性细胞溶素(CDC)来测量细胞内线粒体活性的方法、组合物、装置和试剂盒。具体地,CDC(例如,产气荚膜梭菌溶血素O(PFO))用于透化质膜,但不透化细胞内的膜(例如,线粒体膜)。这种选择性透化允许通过测定例如选择性透化之细胞的外部线粒体底物和/或产物的摄入和/或释放来准确评价细胞内线粒体活性。
Description
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求在2011年4月8日提交并且标题为“Methods,Compositions and Kits for Assaying Mitochondrial Function”的美国临时专利申请序列号61/473,730的优先权,其为了所有目的通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于评价细胞内功能以及细胞健康和活力的方法。
发明背景
线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction)是许多脑肌病(encephalomyopathy)、糖尿病和癌症的核心。构成氧化磷酸化(OxPhos)机制的超过100种基因中的遗传突变与人的线粒体脑肌病有关。由缺陷氧化磷酸化造成的疾病也称为线粒体疾病或线粒体紊乱。它们通常是随年龄逐渐发病的多系统致命疾病。还认为受损的线粒体代谢在糖尿病和癌症的病理生理学中起着关键作用。线粒体(mt)DNA的突变分析表明,线粒体功能障碍是普遍现象,其发生在几乎所有类型的癌症中。发现编码对于氧化磷酸化必不可少之蛋白质的mtDNA中的体细胞突变与几乎所有类型的癌症相关。但是,其功能相关性在大多数情况下还有待确定。
COSMIC(癌症中体细胞突变目录,Catalogue Of Somatic MutationsIn Cancer)数据库揭示了与氧化磷酸化功能相关的核基因中的突变是常见的。已鉴定了与呼吸复合物I(NADH-泛醌氧化还原酶)结构/功能相关的超过25种核基因中的体细胞突变。此外,细胞代谢由氧化代谢转换为糖酵解(称为代谢重编程(metabolic reprogramming))是癌症表型的标志之一。其原因可以是mtDNA、nDNA中的体细胞突变或者是由宿主和环境因素引起的氧化磷酸化负调节。线粒体功能障碍还涉及其他年龄相关疾病,例如帕金森病和阿尔茨海默病。因此,需要简单且准确的方法来评估病理生理学环境下的线粒体功能。这样的方法可导致确定线粒体代谢与病理生理学之间的“因果”关系,以及治疗性干预(therapeuticintervention)在恢复正常线粒体代谢中的疗效。因此,用于准确测量线粒体功能的方法不但对于检测和理解这些疾病,而且对于评价影响氧化磷酸化之疗法和其他治疗是非常重要的。
就细胞生物能学(cellular bioenergetic)而言,其可用于确定线粒体制造ATP的备用(空余(spare))能力(氧化磷酸化能力)及其与呼吸链最大氧消耗(呼吸能力)的关系,这确定了在急性/高ATP需求的条件下细胞的命运。
发明内容
本发明的方面涉及可用于在细胞内条件下准确且可重现地测量线粒体功能的方法、组合物和装置。在一些实施方案中,本发明涉及可用于在不从细胞中分离线粒体的情况下以不同条件准确且可重现地测量线粒体功能的方法、组合物和装置。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素(cholesterol-dependent cytolysin,CDC)(例如,产气荚膜梭菌溶血素O(perfringolysin O,PFO))用于透化质膜而不透化细胞内的膜(如线粒体膜)。这种选择性透化允许通过测定例如可在选择性透化细胞的外部测量的线粒体底物和/或产物的摄入和/或释放来准确评价细胞内线粒体活性。
与涉及将线粒体从细胞中移除的方法不同,用经透化的细胞进行分析提供线粒体生物或生理状态的更准确的评估,同时允许直接与包含和经透化细胞中相同线粒体量的全细胞相关联。通常,用于分析细胞内线粒体活性的方法包括使用损害细胞膜和线粒体膜之一或损害两者的去污剂(detergent)或其他透化剂。去污剂通常例如使线粒体膜溶解,并且即使通过低于<0.01%的小心滴定也难以建立维持线粒体功能的去污剂浓度。
基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,基于PFO)的方法提供了细胞膜的有效透化而不破坏线粒体膜。因此,用细胞溶素透化避免了线粒体分子向细胞内和周围细胞环境中的不期望的释放。这也避免了胞浆分子进入线粒体并干扰线粒体功能。而且,胆固醇依赖性细胞溶素在创造适合于在细胞中测量线粒体活性的条件方面出乎意料地有效。在一些实施方案中,在多至50nM或在一些情况下更多(例如,0.1至20nM)的宽动态范围中的浓度下,基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,基于PFO)的方法提供了细胞膜的有效透化而不破坏线粒体膜。另外,由于细胞溶素是蛋白质,所以通常可以不同稀释度非常准确地掌控它们。
因此,基于胆固醇依赖性细胞溶素的透化技术可用于评价一种或更多种线粒体活性而不破坏细胞环境,原因是当线粒体膜暴露于如本文所述的胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)时,其大部分保持完整。可测定底物摄入和/或产物释放以评价一种或更多种线粒体特异性功能(例如,氧化磷酸化)。因此,基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,基于PFO)的测定结果可提供天然细胞环境下线粒体活性的准确评价。在一些实施方案中,基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,基于PFO)的测定结果可提供从疑似患有线粒体疾病之对象得到的细胞中线粒体活性的准确评价。
在一些实施方案中,基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,基于PFO)的细胞透化允许分析外源性试剂(例如,不渗透穿过质膜的分子)对一种或更多种细胞内功能的作用。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)有助于使用外源性试剂(例如,染料、荧光蛋白、标志物或其他试剂)来探测一种或更多种细胞内功能。例如,基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)可有助于使用外源性试剂例如离子敏感性染料(例如,钙敏感染料、pH敏感染料等)或离子敏感性荧光蛋白来探测一种或更多种细胞内功能。在一些实施方案中,可使用基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)以有助于用外源性核酸(例如,表达载体)转染细胞。
在一些实施方案中,提供了基于用产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)选择性透化质膜的方法,所述PFO是来自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的胆固醇依赖性成孔蛋白(pore forming protein)。在一些实施方案中,因为与细胞内的膜相比质膜中浓缩了相对大量的胆固醇,所以细胞内膜仍在很大程度上不受CDC(例如,PFO)影响。在一些实施方案中,与常规的细胞透化技术(例如,采用洋地黄皂苷的那些技术)相比,PFO透化细胞保持了线粒体完整性,并且在宽范围的细胞类型和缓冲液条件中产生了可重现的结果。
在一些实施方案中,提供了利用基于PFO的细胞透化(例如,以微板形式)的方法,所述方法可用于测定空余氧化磷酸化(OxPhos)能力和线粒体生物能学的其他特性。在一些实施方案中,所述方法允许在不从细胞中分离线粒体的情况下评估线粒体功能。在一些实施方案中,所述方法可用于测定(i)空余氧化磷酸化能力和总氧化磷酸化能力,(ii)空余呼吸能力和总呼吸能力,(iii)电子传递/呼吸链(electrontransport/respiratory chain,ETC/RC)能力的特异性缺陷,(iv)TCA循环功能和/或(v)线粒体代谢的细胞特异性特性。在一些实施方案中,基于PFO的测定可用于在单次测定中测量空余氧化磷酸化能力(SOC)和空余呼吸(ETC/RC)能力(SRC)。在一些实施方案中,评价空余氧化磷酸化能力或总氧化磷酸化能力包括将充足量的ADP(例如,对于细胞为1mM,对于成肌细胞≥2mM)和Pi(例如,≥10mM)与期望底物一起用于呼吸介质中。在一些实施方案中,所述方法可用于测定空余氧化磷酸化能力和其他生物能学特性而不需要从细胞中分离线粒体。在一些实施方案中,方法可用于测定:(i)线粒体代谢的细胞特异性特性,(ii)药物对ETC/RC功能和其他线粒体功能的直接和/或间接作用,(iii)缺陷型氧化磷酸化复合物,(iv)化合物的解偶联活性和/或(v)可损害线粒体功能完整性的条件。
在一些实施方案中,本文所公开的方法可用于评估细胞系、原代细胞和组织中的线粒体功能和代谢。在一些实施方案中,所述方法可用于测定氧化磷酸化能力和呼吸链能力。在一些实施方案中,所述方法可用于测定单独的呼吸氧化磷酸化复合物(I-V)的能力。在一些实施方案中,所述方法可用于评价线粒体通透性转换。在一些实施方案中,所述方法可用于诊断受损的线粒体代谢(例如,由于基因突变或药物毒性)。在一些实施方案中,所述方法可用于在维持线粒体功能的条件下评价细胞器(例如,线粒体、溶酶体、细胞核、内质网等)功能。在一些实施方案中,所述方法可用于通过评估基于PFO的透化之后内膜蛋白质的蛋白酶敏感性来评价内膜的蛋白质拓扑学。在一些实施方案中,所述方法可用于使用条件性孔形成(conditional pore-formation)来促进大分子递送至细胞内。
在一些实施方案中,PFO透化细胞用于测定对于在单个添加时不同NADH底物(例如,丙酮酸/丙酮酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α-酮戊二酸/α-酮戊二酸盐和谷氨酸/谷氨酸盐)具有最大呼吸响应的条件。在一些实施方案中,本文公开的方法可用于使用适用于临床研究之小样品来评估线粒体功能。在一些实施方案中,所述方法可用于在不破坏线粒体功能的条件下评估线粒体通透性转换和其他细胞过程以及细胞器。
在一些实施方案中,提供了可以对线粒体功能测定使用低至0.1nM之浓度的PFO衍生物。在一些实施方案中,提供了可在DTT或其他还原剂不存在的情况下使用的PFO衍生物。在这样的实施方案中,避免了由DTT或其他还原剂造成的O2消耗。在一些实施方案中,使用最小量的DTT(例如,≤100nM DTT)。在一些实施方案中,提供了适用于不同细胞(例如,β细胞、成纤维细胞、神经元细胞、原代成肌细胞/管、乳腺上皮细胞、胚胎成纤维细胞、巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞)和不同物种(例如,小鼠、大鼠、仓鼠和人)的细胞的基于PFO的测定。在一些实施方案中,提供了PFO的不同变体(参见,例如,表3和5)。
根据本发明的一些方面,提供了这样的方法,其包括使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触,并且测量细胞的细胞内功能。在一些实施方案中,细胞内功能是细胞的代谢速率、细胞的呼吸速率、有氧呼吸与无氧呼吸之比、分子的消耗速率或分子的产生速率。在一些实施方案中,细胞内功能指示细胞健康或细胞生存力。在一些实施方案中,细胞内功能是线粒体功能。在一些实施方案中,所述方法用作凋亡(细胞死亡机制)测定。
应理解,制备物通常包含多种细胞。这样的制备物可包含任意类型的一种或更多种细胞。在一些实施方案中,细胞可以是动物细胞或植物细胞。在一些实施方案中,细胞是原代细胞。在一些实施方案中,细胞从个体获得。细胞可以是任何的哺乳动物细胞。细胞可以是任何的人细胞。细胞可选自:淋巴细胞、B细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞、髓样细胞(myeloid cell)、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多叶核嗜中性粒细胞(hypersegmented neutrophil)、单核细胞、巨噬细胞、网状细胞(reticulocyte)、血小板、肥大细胞、凝血细胞、巨核细胞、树突细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞(parafollicular cell)、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、松果体细胞(pineal cell)、松果体细胞(pinealocyte)、胶质细胞(glial cell)、成胶质细胞、星形细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞(magnocellular neurosecretory cell)、星状细胞(stellate cell)、伯特歇尔细胞(boettcher cell);垂体细胞、促性腺细胞(gonadotrope)、促皮质激素细胞(corticotrope)、促甲状腺细胞(thyrotrope)、促生长激素细胞(somatotrope)、催乳激素细胞(lactotroph)、肺细胞、I型肺细胞、II型肺细胞、克拉拉细胞(Clara cell);杯状细胞、肺泡巨噬细胞、心肌细胞、周皮细胞(pericyte)、胃细胞、胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、帕内特细胞(paneth cell)、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝细胞(liver cell)、肝细胞(hepatocyte)、枯氏细胞(Kupffer cell)、骨细胞(bone cell)、成骨细胞、骨细胞(osteocyte)、破骨细胞、成牙质细胞、成牙骨质细胞、造釉细胞、软骨细胞(cartilage cell)、成软骨细胞、软骨细胞(chondrocyte)、皮肤细胞、毛发细胞、丝胞(trichocyte)、角质细胞、黑色素细胞、痣细胞、肌肉细胞(muscle cell)、肌细胞(myocyte)、成肌细胞、肌管、脂肪细胞、成纤维细胞、腱细胞(tendon cell)、足细胞、球旁细胞(juxtaglomerular cell)、球内系膜细胞(intraglomerularmesangial cell)、球外系膜细胞、肾脏细胞、肾脏细胞、致密斑细胞(maculadensa cell)、精细胞、塞尔托利细胞(sertoli cell)、莱氏细胞(leydig cell)、卵母细胞及其混合物。因此,细胞可以是间叶细胞、外胚层和内胚层来源的细胞。细胞可选自脐带血细胞、干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、祖细胞、诱导性祖细胞(induced progenitor cell)、自体细胞(autologous cell)、同种移植细胞、同种异体移植细胞、异种移植细胞和遗传工程细胞。
根据本发明的一些方面,提供了这样的方法,其包括使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素(CDC)相接触以及测定制备物中分子的水平,其中所述分子的水平指示细胞的细胞内功能。在一些实施方案中,分子的水平指示线粒体功能。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是选自表1的蛋白质或者其变体或衍生物。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是具有对应于表1所列GenBank登录号的氨基酸序列的蛋白质或者其变体或衍生物。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是表1所列胆固醇依赖性细胞溶素家族中成员的蛋白质或者其变体或衍生物。
在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。本文使用的术语“产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)”指产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)细菌的能够在胞浆膜中形成孔的细胞溶素或该细胞溶素的变体、衍生物或重组形式。在一些实施方案中,PFO以胆固醇依赖方式在胞浆膜中形成孔。在一些实施方案中,PFO包含如SEQID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列或者其变体或衍生物。在一些实施方案中,PFO包含是如SEQ ID NO:1至12中任一所示氨基酸序列之片段的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述片段包含如SEQ ID NO:1至7中任一种所述并且不包含N端信号序列的氨基酸序列。在一些实施方案中,N端信号序列是所示氨基酸序列的前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸。在一些实施方案中,PFO包含与如SEQ ID NO:1至12中任一所示序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或更高的序列同一性或序列同源性的氨基酸序列。序列同源性可使用NCBI(Bethesda,Maryland)开发的多种公开可得的软件工具(例如,可通过网络得到)来计算。示例性工具包括可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上在线得到的“proteinblast”,其可以以其默认设置使用。在一些实施方案中,PFO包含与如SEQID NO:1至12中任一所示序列相比在多至25个、多至20个、多至15个、多至10个、多至5个或多至2个位置处具有氨基酸替换的氨基酸序列。
在一些实施方案中,PFO包含具有一个或更多个保守氨基酸替换(例如与SEQ ID NO:1至12中任一个相比的一个或更多个保守氨基酸替换)的氨基酸序列。本文使用的“保守氨基酸替换”指不改变其中进行氨基酸替换之蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸替换。可根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体。氨基酸的保守替换包括对以下组中氨基酸进行的替换:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N和(g)E、D。因此,保守氨基酸替换可提供蛋白质的功能等价的变体或同源物。
在一些实施方案中,PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。在所述方法的一些实施方案中,PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其具有氨基酸319位苏氨酸至半胱氨酸的替换和/或氨基酸334位缬氨酸至半胱氨酸的替换。在这样的实施方案中,利用PFO的方法还可包括将还原剂添加到制备物中。在某些实施方案中,还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
在一些实施方案中,PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其具有氨基酸459位半胱氨酸至丙氨酸的替换以及一个或更多个其他氨基酸替换。在所述方法的一些实施方案中,PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其具有氨基酸319位苏氨酸至半胱氨酸的替换和/或氨基酸334位缬氨酸至半胱氨酸的替换以及一个或更多个其他氨基酸替换。
在一些实施方案中,提供了这样的分离的产气荚膜梭菌溶血素O(PFO),其包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其在434位氨基酸处由天冬氨酸替换为丝氨酸。在一些实施方案中,提供了这样的分离的产气荚膜梭菌溶血素O(PFO),其包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其在434位氨基酸处由天冬氨酸替换为丝氨酸以及具有一个或更多个其他氨基酸替换。
在涉及测定制备物中分子水平的方法的一些实施方案中,所述分子是O2。在一些实施方案中,制备物中O2的水平指示细胞耗氧率。在一些实施方案中,所述耗氧率指示线粒体功能。在涉及测定制备物中分子水平的方法的一些实施方案中,所述分子是H+。在一些实施方案中,制备物中H+的水平指示细胞的H+产生速率。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与细胞呼吸效应物(cellular-respiration effector)相接触。在一些实施方案中,细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体(protonphore)。在一些实施方案中,核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。在这样的实施方案中,所述方法还可包括测量细胞的耗氧率,其中ADP刺激的耗氧率指示细胞中的氧化磷酸化。在一些实施方案中,质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone,FCCP)。在这样的实施方案中,所述方法还可包括测量细胞的耗氧率,其中FCCP刺激的耗氧率指示细胞中电子传递和呼吸链功能。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α-酮戊二酸/α-酮戊二酸盐或其组合相接触。在这样的实施方案中,所述方法的结果可以指示细胞中复合物I(NADH-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与琥珀酸/琥珀酸盐相接触。在这样的实施方案中,所述方法的结果可以指示细胞中复合物II(琥珀酸/琥珀酸盐-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与甘油-3-磷酸相接触。在这样的实施方案中,所述方法的结果可以指示细胞中复合物III(泛醇-细胞色素c氧化还原酶)的酶活性。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺(TMPD)和/或抗坏血酸/抗坏血酸盐相接触。在这样的实施方案中,所述方法的结果可以指示细胞中复合物IV(细胞色素c氧化酶)的酶活性。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与琥珀酸/琥珀酸盐和ADP相接触和/或使细胞与甘油-3-磷酸相接触。在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与琥珀酸/琥珀酸盐、甘油-3-磷酸和ADP相接触。在这样的实施方案中,所述方法的结果可以指示细胞中复合物V(ATP合酶)的酶活性。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂(transport inhibitor)、离子载体(ionophore)或krebs循环(krebs cycle)抑制剂相接触。在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与鱼藤酮(rotenone)、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN和寡霉素相接触。
在一些实施方案中,所述方法还包括使细胞与测试剂(test agent)相接触并测定测试剂对细胞内功能(例如,线粒体功能)的作用。在一些实施方案中,测试剂是候选药物。因此,在一些实施方案中,所述方法提供了用于药物筛选的测定。所述方法在一些实施方案中可用于筛选未知或已知化合物(例如,已知的生物活性化合物)的文库,从而鉴定影响细胞内功能(例如,解偶联ATP合成与呼吸链功能)的化合物。在另一些实施方案中,所述方法可用于评价化合物的毒性。因此,在一些实施方案中,所述方法可用于评价先导化合物。
在一些实施方案中,所述方法还包括鉴定细胞中的一个或更多个基因突变。在一些实施方案中,所述方法的结果指示一个或更多个基因突变是否影响细胞的细胞内功能(例如,线粒体功能)。在一些实施方案中,一个或更多个基因突变与线粒体疾病有关。
在一些实施方案中,提供了这样的方法,其包括使包含从对象获得的细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触;以及测定制备物中分子的水平,其中分子的水平指示细胞中呼吸链缺陷存在或不存在。
在一些实施方案中,细胞从患有或疑似患有线粒体疾病的个体获得。在一些实施方案中,所述方法的结果有助于诊断个体患有一种或更多种线粒体疾病。在一些实施方案中,线粒体疾病选自:肌阵挛癫痫伴破碎红纤维(Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fiber,MERRF);线粒体肌病、脑病、高乳酸血症和卒中(Mitochondrial Myopathy,Encephalopathy,Lactacidosis,and Stroke,MELAS);糖尿病和耳聋(Diabetes mellitus anddeafness,DAD)组合,其在早年可由于线粒体疾病;母体遗传糖尿病和耳聋(Maternally Inherited Diabetes and Deafness,MIDD)、莱伯遗传性视神经病(Leber′s Hereditary Optic Neuropathy,LHON);慢性进行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO);利氏病(Leigh Disease);卡恩斯-赛尔综合症(Kearns-Sayre Syndrome,KSS);弗里德赖希共济失调(Friedreich′s Ataxia,FRDA);辅酶QIO(Co-QIO)缺陷;神经病、共济失调、色素性视网膜炎及上睑下垂(Neuropathy,ataxia,retinitis pigmentosa,and ptosis,NARP);肌神经源性胃肠性脑病(Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy,MNGIE);复合物I缺陷;复合物II缺陷;复合物III缺陷;复合物IV缺陷;复合物V缺陷;其他线粒体疾病和影响线粒体功能的其他肌病(myopathy)。在一些实施方案中,线粒体疾病从父母遗传到孩子(即,遗传病)。
在一些实施方案中,具有线粒体疾病的一种或更多种症状的个体可被怀疑患有线粒体疾病。线粒体疾病的症状包括肌无力或运动不耐(exerciseintolerance)、心力衰竭或节律紊乱、痴呆、运动障碍、卒中样发作、耳聋、失明、眼皮下垂、眼运动性受限、呕吐和癫痫。在身体活动期间,肌肉可变得容易疲劳或无力。可发生肌肉痉挛。恶心、头痛和呼吸困难也与这些疾病有关。通常,线粒体疾病在年轻时发生或首次表现(例如,在儿童期时,20岁之前)。因此,在一些实施方案中,所述方法可用于诊断或有助于诊断儿童个体中的线粒体疾病。但是,应理解本文所公开的诊断方法可用于任意年龄的个体。
“对象”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用,其是指脊椎动物,优选哺乳动物,更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠(murine)、猿(simian)、人、家畜(farm animal)、运动动物(sport animal)和宠物。在一些实施方案中,对象、个体或患者是儿童。在一些实施方案中,对象、个体或患者是幼儿。在一些实施方案中,对象、个体或患者是婴儿。如本文所定义的,本文使用的术语“儿童”意指超过3岁且在青春期之前的人。本文使用的术语“幼儿”意指年龄大于12个月至三岁的人。本文使用的术语“婴儿”意指年龄不大于12个月的人。在一些实施方案中,对象、个体或患者处于青春期或在青春期以后。
在一些实施方案中,提供了用外源性核酸转染细胞的方法。在一些实施方案中,所述方法包括使细胞与本文公开的胆固醇依赖性细胞溶素中的任意一种或更多种相接触;以及使细胞与外源性核酸(例如,表达载体、克隆载体等)相接触。在一些实施方案中,所述方法可用于转染难以用常规转染试剂(例如,基于脂质体的试剂)转染的细胞。在一些实施方案中,所述方法可用于转染在悬液中生长的细胞,例如,造血细胞。在一些实施方案中,所述方法可用于转染干细胞或原代细胞。
在所述方法的一些实施方案中,制备物被包含在容器(例如,孔)中。在一些实施方案中,容器是多孔板中的孔。因此,在一些实施方案中,所述方法可以以多重形式(例如,高通量形式)进行。在一些实施方案中,所述方法使用多孔细胞外通量分析仪实施。
根据本发明的一些方面,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器和容纳有用于评价细胞之细胞内功能的试剂的容器。在一些实施方案中,细胞内功能是线粒体功能。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器和容纳有细胞呼吸效应物的容器。
在所述试剂盒的一些实施方案中,细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体。在某些实施方案中,核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。在某些实施方案中,质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α-酮戊二酸/α-酮戊二酸盐或其组合的容器。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有琥珀酸/琥珀酸盐的容器。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有甘油-3-磷酸的容器。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺(TMPD)的容器。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有抗坏血酸/抗坏血酸盐的容器。
在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂、离子载体或krebs循环抑制剂的容器。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有鱼藤酮、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN或寡霉素的容器。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有测定缓冲液的容器。
在所述试剂盒的一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素选自表1或者其变体或衍生物。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。在一些实施方案中,PFO包含如SEQ ID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列或者其变体或衍生物。在一些实施方案中,PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。在一些实施方案中,PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其具有氨基酸319位苏氨酸至半胱氨酸的替换和/或氨基酸334位缬氨酸至半胱氨酸的替换。在一些实施方案中,提供了这样的试剂盒,其包含容纳有还原剂的容器。在一些实施方案中,还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
在所述试剂盒的一些实施方案中,至少一个容器是可重复使用的容器。在所述试剂盒的一些实施方案中,至少一个容器是单次使用的容器。在所述试剂盒的一些实施方案中,至少一个容器是管或瓶。在所述试剂盒的一些实施方案中,管是按扣盖(snap-top)管或螺旋盖(screw-top)管。在所述试剂盒的一些实施方案中,瓶是按扣盖瓶或螺旋盖瓶。在所述试剂盒的一些实施方案中,至少一个容器是玻璃小瓶。在所述试剂盒的一些实施方案中,容器一起被容纳在盒子或包装中。在一些实施方案中,试剂盒还包含用于使细胞透化的说明书。在一些实施方案中,试剂盒还包含用于在特定温度(例如,小于0℃、室温)下储存至少一个容器的说明书。在一些实施方案中,试剂盒还包含用于使用试剂盒中提供之试剂实施本文所公开的方法中之任一种的说明书。
虽然在一些实施方案中,本文所公开的试剂盒可用于研究目的,但是在另一些实施方案中,本文所公开的试剂盒可用于诊断目的。因此,在一些实施方案中,试剂盒包含可用于诊断或有助于诊断个体患有线粒体疾病(例如,包括本文所公开的线粒体疾病中的任一种)的方法的一种或更多种试剂或组分。
附图说明
图1提供了典型哺乳动物细胞中葡萄糖代谢的非限制性概览。示出了糖酵解、TCA循环与氧化磷酸化系统的关系。示出了产生并氧化NADH和FADH2的反应。CC:细胞色素c;Q:泛醌;CI-V:氧化磷酸化复合物I至V;MAS:苹果酸-天冬氨酸穿梭;GPS:甘油-3-磷酸穿梭。期望细胞周边环境中乳酸、O2和CO2水平的测量给出糖酵解、呼吸和TCA循环的速率。
图2阐明了基于洋地黄皂苷(DIG)的细胞透化。使用XF分析仪在包含琥珀酸作为底物的不含Ca2+的缓冲液中测量INS1E的呼吸。测量基础呼吸速率之后,用DIG(第一个箭头)、然后用ADP透化细胞,添加或不添加细胞色素c(CC)(第二个箭头)。对于组DIG、DIG+ADP和DIG+ADP+CC,第二次添加的分别是缓冲液、ADP和ADP+CC。
图3阐明了与洋地黄皂苷性能相比的PFO性能。图3A示出了原代胰岛β细胞。图3B示出了中国仓鼠肺成纤维细胞。如下进行注射:“a”是在作为呼吸底物的琥珀酸存在下的具有nPFO(25nM)或洋地黄皂苷(DIG,图3A中为0.010%,图3B中为0.005%)的1mM ADP+10μM细胞色素c(Cyt C或CC);“b”是1μg/ml寡霉素。OCR速率以绝对值(图3A)示出或相对于第三速率归一化(图3B)。
图4示出了基于PFO的测定不需要外源性细胞色素c。示出了由琥珀酸支持的ADP刺激的INS1E细胞呼吸。如下进行注射:“a”是nPFO,“b”是具有或不具有细胞色素c的ADP。
图5阐明了氧化磷酸化能力和呼吸(ETC/RC)能力。ADP和FCCP刺激的呼吸分别提供氧化磷酸化能力和呼吸能力。图5A示出了中国仓鼠肺成纤维细胞V79-G3中ADP和FCCP刺激的呼吸的相对水平。如下进行注射:“a”是1mM ADP;“b”是2μM FCCP。图5B示出了与完整细胞中基础呼吸的敏感性相比,经透化的V79-G3细胞中ADP刺激的呼吸的寡霉素敏感性(偶联测试)。如下进行注射:“a”是1mM ADP或ADP+nPFO;“b”是2μg/ml寡霉素。图5C示出了nPFO透化后的呼吸衰退,其是因为由胞浆稀释造成的ADP限制。如下进行注射:“a”是5nMnPFO;“b”是缓冲液(nPFO)或1mM ADP(nPFO+ADP)或1mMADP+104M细胞色素c(nPFO+ADP+CC)。
图6示出了大鼠胰岛β细胞中ADP刺激的和FCCP刺激的呼吸的比较水平。图6A示出了大鼠胰岛瘤INS1E细胞。如下进行注射:“a”是nPFO+ADP;“b”是FCCP。图6B示出原代大鼠β/胰岛细胞。如下进行注射:“a”是nPFO;“b”是琥珀酸+ADP;“c”是FCCP。原代细胞中基础呼吸的较低速率是因为在注射之前(箭头“b”)进行了预饥饿并且不存在任何外源性底物。
图7示出了使用基于PFO之方法的用于复合物I缺陷的功能性测定。图7A示出了对复合物I底物显示出呼吸缺乏的复合物I突变体的结果。图7B示出了对复合物I底物显示出恢复呼吸的补充对照细胞。图7C示出了来自B组的将箭头“a”之前之基础速率设定为“0”的数据。如下进行注射:“a”是nPFO,“b”是琥珀酸(Suc)或谷氨酸+苹果酸(Glu+Mal)。
图8阐明了寡霉素处理后底物供应至β细胞ETC/RC中的限制以及对Ca2+介导之线粒体通透性转换的敏感性。用寡霉素(2μg/ml)处理所有的组,然后在>60分钟之后,在存在或不存在nPFO的情况下用琥珀酸和/或FCCP处理。组如下。“寡霉素_缓冲液”指示仅用寡霉素处理;“寡霉素_SF”指示仅寡霉素+琥珀酸+FCCP;“寡霉素_PF”指示寡霉素+nPFO+FCCP处理,稍后添加琥珀酸;“寡霉素_PSF”指示寡霉素+nPFO+琥珀酸+FCCP;“寡霉素_PSFCa”指示在添加nPFO+琥珀酸+FCCP之后添加寡霉素和1.3mM CaCl2。
图9提供了PFO纯化方案的概览。
图10提供了运作模型的略图,所述运作模型示出β细胞呼吸在细胞完整时主要由氧化还原穿梭来支持。如果β细胞主要由氧化还原穿梭支持,则当使其透化时,复合物I依赖性呼吸应显著降低。
图11示出了β细胞表现出低水平的复合物I依赖性呼吸。图11A是与对照(Con)相比,通过分别用增加浓度的鱼藤酮(Rot)、噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)、抗霉素A(Ant A)测量呼吸抑制来确定复合物I、II&III依赖性呼吸。图11B示出了INS1E细胞中鱼藤酮、TTFA和抗霉素A的最大呼吸抑制百分比。
图12示出了经透化的β细胞不表现出复合物I依赖性呼吸:图12A示出来自原代β细胞的结果。图12B示出来自原代星形细胞的结果。图12C示出来自CCL16肺成纤维细胞的结果。图12D示出了在谷氨酸+苹果酸和鱼藤酮存在下分离的线粒体中的NAD(P)H水平。箭头指示以下内容:“a”指示细胞透化;“b”指示底物+ADP(对于图12A、12B)或ADP(对于图12C)。在图12C中,在透化之前在呼吸缓冲液中添加所有底物。丙酮酸、谷氨酸、苹果酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸和鱼藤酮分别用单字母符号P、G、M、I、K和R指示。
图13示出了β细胞的相对呼吸(ETC/RC)和氧化磷酸化(OxPhos)能力在细胞类型之间是相当的。图13A示出了INS1E细胞。图13B示出了V79中国仓鼠肺成纤维细胞。图13C示出了原代β细胞。箭头指示以下内容:“a”指示用ADP(对于图13A、13B)或不用ADP(对于图13C)进行透化;“b”指示FCCP(对于图13A、13B)或ADP(对于图13C);“c”指示FCCP。用ADP和FCCP的最大呼吸刺激分别被当作氧化磷酸化能力和呼吸能力的指标。
图14示出了当抑制氧化磷酸化时β细胞呼吸逐渐衰退。测试了相对于呼吸链功能障碍的底物限制。图14A示出了葡萄糖(Glu)和丙酮酸(Pyr)刺激INS1E细胞中的呼吸,其在寡霉素存在下逐渐衰退。Lo&Hi指示2mM和16.7mM葡萄糖。图14B示出了寡霉素存在下的呼吸衰退是因为底物供应至呼吸链受限。字母P、S、F分别指示透化、琥珀酸和FCCP。
图15示出了糖酵解、TCA循环与氧化磷酸化之间的内在关系。重点是如所指示地产生电子供体(例如NADH和FADH2)以支持氧化磷酸化的反应。虚线示出了产生NADH和FADH2的反应,而实线示出了消耗它们的那些反应。在两端具有箭头的线示出了可逆反应。F-1,6-BP:果糖-1,6-二磷酸;G-3-P:甘油醛-3-磷酸;GPS:甘油-3-磷酸穿梭;MAS:苹果酸天冬氨酸穿梭;CI-V:氧化磷酸化复合物I-V;p:质子动力;线粒体膜电位;pH:跨越线粒体内膜的pH差;Pi:无机磷酸-磷酸盐:Q:泛醌。
图16示出了用洋地黄皂苷透化细胞测定线粒体功能的结果。β细胞如实施例8所述生长。在2mM(图16A至16C)或15mM葡萄糖(图16D至16F)存在下使用包含10mM琥珀酸的不含Ca2+的LKB缓冲液。图16A示出了对于最大呼吸的外源性Cyt C。β细胞首先用0.01%洋地黄皂苷(DIG)透化,然后单独添加1mM ADP(ADP)或将其与10μM CytC(ADP+CC)一起添加(右边箭头)。对照组不接受ADP或Cyt C。图16B示出了在图16A中使用的测定条件下与ATP合成偶联的呼吸。细胞首先在2μg/ml寡霉素存在(寡霉素-FCCP)或不存在(对照,寡霉素,FCCP)下用0.01%DIG透化,然后进行以下添加:“对照”,是ADP+CC;“寡霉素”,是对照加寡霉素;“FCCP”,是对照加2μM FCCP;“寡霉素-FCCP”,是寡霉素加2μM FCCP。图16C示出了来自图16B并且将基础速率设定为100%用以比较ADP和FCCP刺激之呼吸速率的数据。图16D至16F示出了来自原代大鼠星形细胞(图16D)、仓鼠B2-MWFE细胞(图16E)和人H1080细胞(图16F)的结果,所述细胞首先用指定浓度的洋地黄皂苷(DIG)透化,然后添加1mM ADP和10μM Cyt C(ADP+CC)。
图17示出了用nPFO透化细胞测定线粒体功能的结果。如实施例8所述制备细胞,并在包含2mM葡萄糖(图17A至17D)或15mM葡萄糖(图17E至17F)的不含Ca2+的LKB缓冲液中进行测定。相对于基础呼吸速率(basal respiration rate,BRR)的ADP和FCCP刺激的呼吸分别指示空余氧化磷酸化能力(Spare OxPhos capacity,SOC)和空余呼吸能力(spare respiratory capacity,SRC)。图17A示出了用25nM nPFO或0.01%洋地黄皂苷(DIG)透化的原代胰岛β细胞的呼吸响应。在10μMCyt C存在下在透化时添加琥珀酸和ADP(Succ+ADP)。添加1μg/ml寡霉素(寡霉素)以测定偶联效率。图17B示出了使用INS1E细胞进行nPFO滴定的结果。测定条件除不添加Cyt C之外与图17A相同。添加ADP以及不同浓度的nPFO(ADP)和2μM FCCP(FCCP)。图17C示出了INS1E细胞中与SRC相比的SOC。图17D示出了INS1E细胞中与SOC相比的nPFO浓度。图17E示出了V79-G3细胞中与SRC相比的SOC。图17F示出了V79-G3细胞中与SOC和SRC相比的nPFO浓度。
图18A至18H示出了在nPFO透化细胞中线粒体完整性和呼吸偶联的评估。在如实施例8所述使细胞生长之后,在包含具有2mM葡萄糖(图18A至18C)或15mM葡萄糖(图18D至18H)的10mM琥珀酸的不合Ca2+的LKB缓冲液中测量呼吸。β细胞首先用至少1nM nPFO透化,然后在添加指定化合物之后测量呼吸速率的变化。图18A示出了nPFO透化INS1E细胞中的线粒体完整性(“ADP”指示单独的1mM ADP;“ADP+CC”指示1mM ADP+10μM Cyt C)。图18B示出了nPFO透化INS1E细胞中的呼吸偶联(“ADP”指示单独的1mM ADP;“寡霉素”指示1mMADP和1μg/ml寡霉素;“ADP+FCCP”指示1mM ADP+1μg/ml寡霉素+2μM FCCP)。图18C示出了来自图18B的用设定为100%的基础速率归一化以比较ADP和FCCP刺激的呼吸速率的数据。图18D示出了nPFO透化V79-G3细胞的完整性(“对照“指示仅缓冲液;“ADP”指示1mM ADP;“ADP+CC”指示1mM ADP和10μM Cyt C)。图18E示出了与寡霉素处理的完整(寡霉素)V79-G3细胞相比,nPFO透化(nPFO)V79-G3细胞中的呼吸衰退。图18F示出了与经透化的V79-G3细胞相比,完整V79-G3细胞中的寡霉素不敏感性呼吸(“寡霉素”指示1mM ADP后添加寡霉素;“nPFO+ADP_寡霉素”指示nPFO和1mM ADP后添加寡霉素)。图18G和18H分别示出了nPFO透化HEK293和SHSY-5Y细胞中的线粒体完整性(“ADP”指示1mM ADP;“ADP+CC”指示1mMADP+10μM Cyt C)。
图19A至19F示出了氧化磷酸化和ETC/RC的空余(备用)能力和总能力的估计。如实施例8所示使β细胞生长,并且在包含15mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB(图19A和图19D至19F)或LPBT(图19B和19C)缓冲液中测量测定。与1mM ADP一起添加10mM琥珀酸以测量空余氧化磷酸化能力(SOC)。在测量ADP刺激的呼吸之后,添加FCCP以测量空余ETC/RC能力(SRC)。在图19A至19C中,与nPFO一起添加琥珀酸和ADP,而在图19D至19F中,在用nPFO透化之后添加它们。图19A示出了完整(SRCi)和透化(SRCp)HEK293细胞中的SOC和SRC。在“对照”中,向未透化细胞添加2μM FCCP;在“nPFO”中,在测量经琥珀酸+ADP刺激的呼吸之后向透化细胞中添加3μM FCCP。图19B示出了通过将SOC添加到基础呼吸速率的寡霉素敏感性部分中来估计HEK293细胞中的总氧化磷酸化(TOC)能力。总呼吸能力通过nPFO透化细胞中的最大呼吸速率来估计(“PSA_F”指示nPFO+琥珀酸+ADP后添加FCCP);“O_PSAF”指示寡霉素后添加nPFO+琥珀酸+ADP+FCCP)。图19C示出了通过监测ADP刺激的呼吸中寡霉素敏感部分来测定HEK293细胞的偶联效率(“PSA_O”指示nPFO+琥珀酸+ADP后添加寡霉素;“O_PSAF”指示寡霉素后添加nPFO+琥珀酸+ADP+FCCP)。图19D至19F示出了用于在不同细胞中通过系列添加nPFO、ADP和FCCP确定TOC的策略,所述不同细胞例如HEK293(图19D)、SHSY-5Y(图19E)和β细胞(图19F)。
图20A至20I示出了不同因素对氧化磷酸化能力的作用。实验条件如实施例8所述并参照图19。与nPFO(图20A、20B、20C、20G、20H)同时或在其之后(图20E、20F)添加呼吸底物(每个10mM)和ADP(1mM)。图20A描绘了在包含2mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB缓冲液中原代β细胞氧化磷酸化能力的底物依赖性改变(“succ”指示琥珀酸;“G+M”指示谷氨酸+苹果酸;“G3-P”指示甘油-3-磷酸)。图20B示出了在与图20A相关的实验中使用的测定条件下,β细胞中不含Ca2+对由琥珀酸支持的氧化磷酸化的作用(“对照”指示琥珀酸+ADP;“CaCl2”指示与琥珀酸+ADP一起添加700μM CaCl2)。图20C示出了不同呼吸缓冲液对HEK293细胞之氧化磷酸化能力的作用。在不同缓冲液(参见表6)中孵育细胞,然后测量ADP刺激的呼吸。添加2μg/ml寡霉素以测试偶联效率。图20D示出了不同缓冲液中的偶联效率(CE)。对来自图20C的数据绘图。图20E示出了磷酸盐(KH2PO4)对氧化磷酸化能力和呼吸能力的作用。对于LKB、HKB和MAS缓冲液参见表6。KH2PO4是用10mMKH2PO4代替0.4mM KH2PO4的LKB。图20F示出了来自图20E的将基础呼吸速率设定为100%之后重新绘图的数据。图20G示出了对于INS1E细胞的不同缓冲液中的空余氧化磷酸化能力,将LKB与LPBT进行比较,将HKB与HPBT进行比较。透化之前的基础呼吸速率设定为100%。图20H示出了在高Na+和高K+缓冲液中INS1E细胞的基础呼吸速率和ADP刺激的呼吸速率的差异。示出了对于图20G的LPBT和HPBT缓冲液中的实际呼吸速率。图20I示出了INS1E细胞中不同缓冲液对复合物I和复合物II依赖性呼吸的作用。
图21A至21F示出了关于线粒体功能障碍和线粒体代谢具体特征的数据。在图21A至21C中,示出了依赖于由谷氨酸+苹果酸(Glu+Mal)支持的呼吸的复合物I。在包含15mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB缓冲液中进行测定。用1nM nPFO透化β细胞并使用指定底物测量ADP刺激的呼吸。在图21A中,示出了由Glu+Mal支持的呼吸的鱼藤酮敏感性测试。使用2μM鱼藤酮(Rot)抑制复合物I。在图21B中,示出了复合物I缺陷型CCL16-B2细胞中由Glu+Mal支持的呼吸的缺乏。图21C示出了B2-MWFE细胞(其是补充有野生型中国仓鼠Ndufal cDNA的CCL16-B2细胞)中挽救的复合物I活性。图21D提供了示出苹果酸影响有效利用NADH生成底物的数据,所述底物例如丙酮酸(P)、异柠檬酸(I)、谷氨酸(G)和α-酮戊二酸(K)(“PF”、“IF”、“GF”和“KF”分别指示与FCCP分开添加P、I、G和K;“PGMIKF”指示与FCCP一起添加P、I、G和K)。在所有组中最后添加苹果酸(从左边起第三个箭头),除了添加PGMIKF的组之外,该组接受苹果酸和其他底物。图21E示出了原代β细胞中对于单个底物(P、G、M、I、K)的复合物I依赖性呼吸的缺乏(“PA”、“GA”、“MA”、“IA”和“KA”分别指示与1mM ADP分开添加P、G、I、M和K)。琥珀酸支持的呼吸(SA)用作阳性对照。SA组在第三次注射时接受2μM FCCP,而其他组接受10mM琥珀酸。图21F示出了与INS1E细胞相比的大鼠星形细胞中的复合物I依赖性呼吸。在2μM鱼藤酮存在(星形细胞_GM+ROT、INS1E_GM+ROT)和不存在(星形细胞_GM、INS1E_GM)下监测星形细胞和IS1E细胞中的Glu+Mal支持的呼吸。
图22A至22B示出了寡霉素处理对底物供应至β细胞ETC/RC的作用。如实施例中所述使INS1E细胞生长并饥饿。图22A示出了在寡霉素存在下INS1E细胞中的进行性呼吸衰退。在1.3mM CaCl2存在下将包含2mM葡萄糖的LKB缓冲液用于测定;不添加EGTA。在2mM葡萄糖中测量基础呼吸速率之后,添加14.7mM葡萄糖或10mM丙酮酸(左侧箭头)以测量呼吸刺激。随后,在约90分钟后,添加2ug/ml寡霉素(寡霉素)。对照组仅接受缓冲液。图22B示出了寡霉素对INS1E细胞的ETC/RC功能的作用。具有16.7mM葡萄糖并且不添加EGTA的不含Ca2+的LKB缓冲液用于测定。在进行测定之前,将β细胞在16.7mM葡萄糖中孵育约60分钟。在指示时间点用2μg/ml寡霉素(寡霉素)处理所有的组,然后在±nPFO下接受10mM琥珀酸和/或2μM FCCP。“对照”指示仅缓冲液;“Succ+FCCP”指示仅琥珀酸+FCCP(无PFO);“nPFO+FCCP_Succ”指示nPFO+FCCP之后添加琥珀酸;“nPFO+Succ+FCCP”指示一起添加nPFO+琥珀酸+FCCP。
图23A至23B示出了使用完整细胞进行FCCP滴定的结果。以指定细胞密度接种HEK293细胞,然后使用含有1.3M CaCl2和15mM葡萄糖而不添加EGTA的LKB缓冲液如实施例8所述地进行呼吸测定。图23A示出了得自于XF24分析仪的实际图。使用部分A、B、C和D进行1μMFCCP的连续添加,分别导致1、2、3和4μM FCCP的累积浓度。图23B示出了基础呼吸速率和最大呼吸速率与细胞密度的线性关系。使用来自图23A中速率3(无FCCP)和6(含有2μM FCCP)的数据。
图24A至24B示出了与洋地黄皂苷相比的某些细胞透化剂的相对性能。如实施例8所述使INS1E细胞生长并进行测定。用指定试剂透化β细胞并在琥珀酸(10mM)、ADP(1mM)和Cyt c(10μM)存在下监测呼吸。图23A示出了与皂苷(5至25μg/ml SAP)透化细胞相比的洋地黄皂苷(0.01%DIG)的相对线粒体功能。图23B示出了与丙甲甘肽(3至30μg/ml ALA)透化细胞相比的洋地黄皂苷(0.01%DIG)的相对线粒体功能。
图25A至25F示出了不同PFO变体的相对性能和DTT对呼吸的作用。在不含Ca2+的LKB(图25A)和HKB(图25B)缓冲液中测定nPFO透化HEK293细胞和rPFO透化HEK293细胞中的呼吸速率。图25C中示出了在将基础呼吸速率设定为100%之后来自图25A和25B组的rPFO数据。图25D示出了使用INS1E细胞的nPFO与dbPFO的比较。在含有2mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB中进行测定并用1nM nPFO或1nMdbPFO+1mM DTT透化细胞。图25E示出了1mM DTT对透化INS1E细胞之呼吸的作用。图25F示出了1mM DTT对完整INS1E细胞之呼吸的作用。
图26A示出了rPFO透化INS1E细胞。在V7培养板中的实验结束时在显微镜下观察用1nM rPFO透化的细胞。碘化丙啶(PI)染色用于确认完全透化(下图),其由细胞质肿胀(上图)可明显看出。图26B示出了B2-MWFE细胞的经dbPFO介导的透化。使用100nM DTT在1nMdbPFO处理的细胞中诱导孔的形成。
图27示出了不含半胱氨酸的PFO衍生物对于膜结合的胆固醇依赖性。使用如实验过程中所述的固有Trp荧光来测定结合的PFO衍生物(0.1μM终浓度)与具有变化的胆固醇含量以及比例恒定为1∶1∶1的POPC、POPE和SM的脂质体(0.2mM总脂质终浓度)的分数。示出了对于多种衍生物的胆固醇依赖结合等温线:nPFO(PFO)(方形)、rPFO(圆形)、rPFOD434s(向上三角形)和dbPFOD434s-C459A(向下三角形)。数据点是至少两次测量的平均值±标准偏差。
图28示出了不含半胱氨酸的PFO衍生物在线粒体功能测定中的相对性能。使用两种不同浓度(0.1nM、1.0nM)的nPFO、rPFO和rPFOD434S(参见表5)透化HEK293细胞。随后一起添加琥珀酸(Succ:10mM)和FCCP(3mM)以测量最大呼吸活性。图28A示出了0.1nM下的相对性能。图28B示出了1.0nM下的相对性能。图28C示出了在0.1和1.0nM两种浓度下nPFO活性的比较。图28D示出了在两种浓度(0.1和1.0nM)下PFO变体之中活性的比较。在LPBT缓冲液中进行测定(参见表6)。
图29示出了洋地黄皂苷介导的细胞透化不得到稳定呼吸。在不同浓度的洋地黄皂苷(%DIG)存在下透化细胞并使用琥珀酸作为底物监测ADP刺激的呼吸。在LKB或LPBT缓冲液中进行测定(参见表6)。图29A和29B示出了LKB缓冲液中洋地黄皂苷浓度与呼吸活性之间的反比关系。图29A中,在透化之前琥珀酸存在于介质中并且在图29B中将其与ADP一起添加。比较两组中的箭头ADP和Succ+ADP。对饥饿的INS1E细胞进行测定。图29C和29D示出了用于非饥饿INS1E细胞的呼吸缓冲液的作用。在所测试的所有洋地黄皂苷浓度下,LKB缓冲液(图29C)中的呼吸衰退比LPBT(图29D)中的呼吸衰退快。图29E和29F示出了通过洋地黄皂苷的细胞色素c丢失与呼吸衰退有关。即使在用于LKB&LPBT缓冲液二者的最高洋地黄皂苷浓度(0.01%)下,与琥珀酸+ADP一起添加外源性细胞色素c(CC)也抑制呼吸衰退。
图30示出了与高K+(HPBT)缓冲液相比低K+(LPBT缓冲液)对INS1E细胞生物能学的作用。图30A示出了添加寡霉素(寡霉素;1μg/ml)之后的呼吸衰退和对解偶联剂FCCP(2μM)的响应。图30B示出了在速率4下将基线设定为100%而重新绘制的图30A的数据。在高K+缓冲液(HPBT)中描绘了更快速的衰退并且对FCCP无响应。
图31示出了鱼藤酮对完整细胞中总细胞呼吸和对PFO透化细胞中复合物I活性的剂量依赖性作用。图31A和31D示出了LKB(图31A)和LPBT(图31D)缓冲液中经鱼藤酮处理之HEK293人细胞的基线归一化呼吸速率(“Rot”指示在箭头处添加0、10、20、50&1000mM鱼藤酮;“P/GM/A”指示1nM rPFO、谷氨酸+苹果酸(每个10mM)、1mM ADP&3μM FCCP;“succ”指示10mM琥珀酸)。图31B和31E示出了分别由图31A和31D的数据绘制的呼吸速率和鱼藤酮浓度(“基础”指示完整细胞呼吸的衰退;“Glu+Mal”指示FCCP存在下的复合物I依赖性呼吸;“succ”指示FCCP存在下的复合物II依赖性呼吸)。图31C示出了不同鱼藤酮剂量下复合物I和II依赖性呼吸的抑制百分比(“LKB-CI,CII”指示LKB缓冲液中复合物I和II的功能;“LPBT-CI,II”指示LPBT缓冲液中复合物I和II的功能)。图31F示出了在LKB缓冲液(虚线)和LPBT缓冲液(实线)中基础复合物I抑制(完整细胞中)与最大复合物I抑制(透化细胞中)之间的关系。在最大鱼藤酮剂量(1μM)下,在基础和最大之间以及在缓冲液之间没有观察到显著差异(参见图31B和31E)。
图32示出了Ndufa1S55A来源的MEF中降低的呼吸活性。图32A至32B示出了WT和S55A MEF的基础呼吸速率与最大呼吸速率之间的差异。通过使用增加剂量的FCCP(2至4μM)测定了最大呼吸。图32C至32D示出了通过重组产气荚膜梭菌溶血素O(rPFO)透化的细胞中的呼吸活性。通过在ADP+FCCP存在下使用特定底物测量复合物I和II的活性(“Glu+Mal”指示谷氨酸+苹果酸并且“succ”指示琥珀酸)。在V7板中使100,000个细胞/孔旋转减慢(spin down)并在培养4小时后进行测量。
发明的某些实施方案的详述
在一些实施方案中,本发明的方面涉及用于线粒体功能的简单且可重现的测定。在一些实施方案中,可以以试剂盒提供一种或更多种测定组分。本发明的方面涉及这样的出乎意料的发现:基于细胞溶素(例如,基于产气荚膜梭菌溶血素O(PFO))的细胞透化消除了对分离线粒体的需要,并且维持了线粒体周围的细胞微环境。这允许在接近生理条件下进行功能测定。
根据一些方面,本发明涉及胆固醇依赖性细胞溶素。本文使用的“胆固醇依赖性细胞溶素”是以胆固醇敏感方式在基于脂质的膜中形成孔的蛋白质的家族成员。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是由革兰氏阳性菌分泌的成孔毒素(pore-forming toxin)。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素具有特征性的β桶形结构。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是在靶细胞膜表面上寡聚化的单体蛋白质。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素在靶细胞膜表面处形成环形孔前(pre-pore)复合物,并且将大的β桶插入膜中。在一些实施方案中,孔形成需要靶膜中存在胆固醇。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素选择性透化胞浆膜而不损害线粒体膜。表1中提供了胆固醇依赖性细胞溶素的非限制性实例。其他实例对于本领域技术人员来说是显而易见的。在一些具体实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
根据本发明的一些方面,通过胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)选择性透化细胞膜而不损害线粒体膜,这可用于测量线粒体代谢物的测定。许多线粒体代谢物容易穿过线粒体膜进入胞浆和从胞浆穿过线粒体膜。但是,这些代谢物不容易穿过细胞膜。这使得在不破坏细胞的情况下和在破坏线粒体天然生理环境的过程中难以测定这些代谢物。出乎意料地,已发现胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)透化细胞膜足以使得线粒体代谢物能够进入和离开细胞。在一些实施方案中,这允许通过测量一种或更多种线粒体代谢物的细胞外水平来评价线粒体活性。根据本发明的一些方面,由于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)使得细胞膜对于线粒体代谢物能够透化并且不破坏线粒体膜,所以其选择性是有用的。在一些实施方案中,这允许在其自然细胞环境中评价线粒体的活性。
根据本发明的一些方面,提供了基于PFO的细胞透化方法用于线粒体功能测定。所述方法通常可用于不同的细胞类型(例如,建立的细胞系和原代细胞)。本文中还提供了提供用于所述方法之试剂的试剂盒。在一些实施方案中,这些试剂盒可用于测定复合物I、II、III、IV和/或V、氧化磷酸化(OxPhos)能力和/或呼吸(ETC/RC)能力。因此,在一些实施方案中,提供了用于线粒体功能的简单且可重现的测定。在一些方面中,所述测定和试剂盒提供了用于线粒体功能障碍的诊断工具。在一些实施方案中,本发明的方面可用于理解线粒体代谢在病理生理学中的作用。在一些实施方案中,本发明的方面提供了用于线粒体疾病的诊断工具。
在一些实施方案中,基于胆固醇依赖性细胞溶素(例如,基于PFO)的细胞透化消除了对分离线粒体的需要,并且维持了线粒体周围的细胞微环境。这允许在接近生理条件下使用测定技术(例如使用基于微板的呼吸计量法)进行线粒体功能测定,所述测定技术包括测量细胞代谢物(例如,线粒体代谢物)的摄入、释放、消耗和/或产生。这还允许检查不透膜试剂(membrane impermeable agent)对线粒体功能的作用。
表1:胆固醇依赖性细胞溶素的非限制性实例
产气荚膜梭菌溶血素O[产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)菌株13]gi|18309145|ref|NP_561079.1|
MIRFKKTKLIASIAMALCLFSQPVISFSKDITDKNQSIDSGISSLSYNRNEVLASNGDKIESFVPKEGKKTGNKFIVVERQKRSLTTSPVDISIIDSVNDRTYPGALQLADKAFVENRPTILMVKRKPININIDLPGLKGENSIKVDDPTYGKVSGAIDELVSKWNEKYSSTHTLPARTQYSESMVYSKSQISSALNVNAKVLENSLGVDFNAVANNEKKVMILAYKQIFYTVSADLPKNPSDLFDDSVTFNDLKQKGVSNEAPPLMVSNVAYGRTIYVKLETTSSSKDVQAAFKALIKNTDIKNSQQYKDIYENSSFTAVVLGGDAQEHNKVVTKDFDEIRKVIKDNATFSTKNPAYPISYTSVFLKDNSVAAVHNKTDYIETTSTEYSKGKINLDHSGAYVAQFEVAWDEVSYDKEGNEVLTHKTWDGNYQDKTAHYSTVIPLEANARNIRIKARECTGLAWEWWRDVISEYDVPLTNNINVSIWGTTLYPGSSITYN(SEQ ID NO:1)
氧化磷酸化(OxPhos)
氧化磷酸化(线粒体的关键功能之一)通过五种多聚体酶复合物(I至V,见下文)在电子供体(NADH&FADH2)和电子载体(泛醌、细胞色素c)的帮助下进行。NADH和FADH2向电子传递/呼吸链(ETC/RC)供应电子,建立了跨越线粒体内膜的电化学梯度(Δp=ΔΨm+ΔpH),称为质子动力(Δp)。Δp是使用ADP和Pi合成ATP的驱动力。四种酶复合物构成了ETC/RC。复合物I是NADH-泛醌氧化还原酶;复合物II是琥珀酸/琥珀酸盐-泛醌氧化还原酶;复合物III是泛醇-细胞色素c氧化还原酶;复合物IV是细胞色素c-泛醌氧化还原酶。与通过复合物I、III和IV穿过线粒体膜的质子迁移偶联的电子转移建立了Δp,其驱动使用ATP合酶(复合物V)的ATP合成(参见图1和15)。主要地,ETC/RC功能由线粒体产生的NADH和FADH2支持,所述NADH和FADH2来自通过三羧酸(TCA)循环的丙酮酸/丙酮酸盐氧化代谢。在某些情况下,脂肪酸的13-氧化和氨基酸代谢也有助于线粒体NADH/FADH2合并物。通常,丙酮酸/丙酮酸盐氧化代谢占优势。因此,基于给定细胞的生理环境严格调节其他底物的氧化。在胞浆中由甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的反应也生成了NADH。通过GAPDH的代谢通量取决于连续NADH氧化以再生成支持GAPDH功能的NAD+。在胞浆中,NADH使用苹果酸-天冬氨酸(MAS)和甘油-3-磷酸(GPS)穿梭通过乳酸脱氢酶(LDH)并且通过NADH氧化还原穿梭来再生(参见图1)。LDH和氧化还原穿梭在再生NAD+中在正常和病理生理条件下的不同细胞类型和组织中的相对贡献很大。
线粒体功能障碍和疾病:
氧化磷酸化损伤也称为线粒体功能障碍(且与线粒体疾病有关),并且可由遗传和核基因或mtDNA中的体细胞突变,或者药物或毒素的功能性破坏造成。在构成氧化磷酸化机制的超过100种基因中的突变与人的线粒体脑病有关,所述线粒体脑病是最常见的代谢疾病,发生率在活产(livebirth)中超过~1/5000。呼吸链复合物I缺陷在许多情况下是线粒体疾病的原因。发现与复合物I生物起源相关联的至少五十种已知基因中的二十五种与线粒体疾病有关。已鉴定了结构亚基(例如,NDUFA1、2、11;NDUFS1-4、6-8;NDUFV1、2)和装配因子(例如,NDUFAF1-6)的致病性突变。神经退行性疾病例如帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病(Huntington′s disease)也与线粒体功能障碍有关。此外,发现mtDNA突变与几乎所有类型的癌症有关。2型糖尿病也与相关组织(例如β细胞和肌肉)中的线粒体功能下降有关系。2型糖尿病由于肥胖诱导疾病的激增而成为主要的临床挑战。因此,在一些实施方案中,提供了用于在病理生理学环境下准确评估线粒体功能的方法。
线粒体功能测定:
质膜透化移除了细胞的渗透屏障并且允许在完整细胞中准确估计线粒体功能。通过利用膜中差异性分布的胆固醇实现了质膜的选择性透化。因为大多数胆固醇存在于质膜中,所以预计细胞内的膜大部分仍然不接触胆固醇依赖性成孔剂。因此,可在胆固醇依赖性成孔剂存在下选择性透化质膜。本文公开的是基于使用胆固醇依赖性成孔蛋白(例如,来自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringen)的产气荚膜梭菌溶血素O(PFO))的细胞透化方法的线粒体功能测定方法。已表征了通过PFO形成孔的机制。应用:
在一些实施方案中,本文公开的方法和试剂盒可用于分析细胞外通量(XF)的系统(例如,可商购的细胞外通量(XF)分析仪,例如,可得自Seahorse Bioscience),以评估细胞中的线粒体功能。在一些实施方案中,研究生物能学途径的这种分析仪的使用者分离细胞或组织,将其粘附于培养板,并进行生物能学评估。这些技术可用于在允许实验控制底物供应和需求的条件下提供关于线粒体生物学的有价值的信息和见解。根据本发明的一些方面,全细胞可在板(例如,XF板)中被直接选择性透化,允许控制底物供应和需求,接近氧化磷酸化和呼吸链二者的组分,以及消除对通过复杂且可能损害线粒体的分离技术的需要。
试剂盒:
在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素和测定特异性试剂被包装成试剂盒形式。在一些实施方案中,试剂盒设计可根据具体测定而不是细胞类型而改变。在一些实施方案中,这些试剂盒被设计成解决线粒体代谢的具体方面,例如氧化磷酸化、TCA循环和细胞特异性氧化磷酸化/TCA循环特征。提供了用于复合物I至IV测定、氧化磷酸化能力和ETC/RC能力测定的试剂盒。
本文公开了用于复合物I、II以及氧化磷酸化和ETC/RC能力的测定并且在一些实施方案中提供相应的试剂盒。在一些实施方案中,ADP刺激的呼吸是复合物V活性的度量,例如,当底物未起限制作用时。在一些实施方案中,琥珀酸/琥珀酸盐与甘油-3-磷酸一起使用确保了ETC/RC活性是非限制性因素,并且因此ADP刺激的寡霉素敏感性呼吸是复合物V功能的输出。相似地,在一些实施方案中,羧基苍术苷(carboxyatractiloside)敏感性呼吸给出了ATP/ADP核苷酸转运蛋白(ANT)的功能输出。在一些实施方案中,使用由甘油-3-磷酸+琥珀酸/琥珀酸盐支持的抗霉素A敏感性呼吸测定复合物III的活性。同样地,在一些实施方案中如所述地使用抗坏血酸/抗坏血酸盐+TMPD支持的KCN敏感性呼吸测定复合物IV的活性。在一些实施方案中,试剂盒具有选自PFO、ADP、FCCP和测定缓冲液的组分。
试剂的实际浓度通常随实验设计(例如,24孔与96孔测定形式)和测定数目而改变。PFO通常可使用的范围是1至100nM。ADP通常可使用的范围是1至2mM。FCCP通常可使用的范围是2至4μM。组分通常以100至1000倍浓缩原液提供,其可在建议范围内的期望浓度下被使用者使用,以得到测定中的最大线粒体性能。
应理解,试剂盒可包含与胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)一起用于特定复合物测定(例如,复合物I至V之一)的一种或更多种组分(例如,一种或更多种底物或抑制剂),并且任选地包含一种或更多种还原剂(例如,DTT或其他合适的还原剂)。可在试剂盒中分开的容器中提供不同组分。但是,在一些实施方案中,可在单个容器(例如,样品管、孔等)中组合两种或更多种不同组分。表2提供了用于线粒体复合物之试剂盒的组分的非限制性实例。
表2:用于线粒体复合物之试剂盒的组分的非限制性实例
基于微板的呼吸计量法:
在一些实施方案中,功能测定将以基于微板的系统或装置为基础,例如使用来自Seahorse Biosciences的细胞外通量(XF)分析仪。在一些实施方案中,野生型PFO和/或其变体将用于选择性质膜透化以消除底物运输屏障,并且可测定线粒体性能的特征(例如,最大线粒体性能)。可实施用于测定在不同细胞类型中运作的具体线粒体功能的方法。在一些实施方案中,一个或更多个微板可预加载(和/或提供)一种或更多种测定组分(例如,底物、抑制剂等)和一种或更多种胆固醇依赖性细胞溶素(例如,PFO)以及任选地预加载(和/或提供)一种或更多种还原剂(例如,DTT或其他合适的还原剂)。
除非另有说明或除非由上下文明显看出的,否则本文使用的关于数字的术语“约”一般认为是包括落在数字任一方向上(大于或小于)的1%、5%、10%、15%或20%范围内的数字(除非其中这些数字小于可能值的0%或超过100%)。
为了本文所述的目的,本文描述的所有参考文献通过引入并入本文。
通过以下实施例将更详细地描述本发明的示例性实施方案。这些实施方案是本发明的示例,本领域技术人员应认识到本发明不限于示例性实施方案。
实施例
实施例1:实验设计和方法学:
用于线粒体功能测定的基于PFO的细胞透化方法:
使用本文公开的方法测试野生型PFO和变体的最大线粒体性能(参见表1PFO的实例)。基于本文描述的细胞透化方法开发了广泛适用的不同氧化磷酸化组分的具体测定。已建立的细胞和原代细胞均用于测试基于PFO之测定的一般适用性。
已认识到,可使用还原剂以增加野生型PFO的保存期。PFO仅在459位包含一个Cys残基。为了避免透化反应中对还原剂的需要,使用了不合Cys的衍生物PFOC459A。该变体具有与野生型PFO相当的活性。突变体rPFOT319C-V334C提供了条件性细胞透化,这是因为其插入后直到添加还原剂例如DTT才在膜中形成孔。在用rPFOT319C-V334C处理之后,可在实验之前清洗细胞以移除蛋白质。
表3:PFO变体及其性质:为了简化突变符号,包含C459A突变的所有衍生物称为rPFO。
a)制备功能性PFO:
图9中阐明了已用于得到重组PFO(例如,野生型或变体)的非限制性纯化方案。简言之,所述方案涉及过表达含有His-标记的PFO蛋白质和/或其变体用于亲和纯化。在一些实施方案中,使表达PFO和rPFO的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞条件性地在37℃在2L培养物中生长并持续搅拌。当培养物在600nm下的浊度达到0.5至0.6时,通过添加异丙基-α-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG,Gold Biochemicals,St.Louis,MO)至最终浓度1mM来诱导PFO/rPFO的表达。诱导3小时之后,通过离心(4,400g,15分钟,4℃)收获细胞。在蛋白酶抑制剂PMSF和苯甲脒存在下将细胞沉淀以50mg/mL的浓度悬浮于总计25mL的缓冲液B[10mM MES(2-(N-吗啉代)-乙磺酸)(pH6.5)、150mM NaCl]中。通过在15,000psi下一次通过弗氏细胞压碎器(French pressure cell)(活塞直径1英寸,Aminco,Silverspring,MD)来使细胞裂解。
通过在4℃下以31,000g离心15分钟清除细胞裂解物之后,在室温下将上清液加载到已预加载Ca2+并且用缓冲液B平衡的包含螯合Sepharose Fast Flow(GE Healthcare,Piscataway,NJ)的柱子上。用115mL缓冲液B(2mL/分钟)和线性梯度0至50mM的咪唑(pH6.5)清洗柱子以移除另外的污染蛋白质。结合的PFO/rPFO用包含300mM咪唑的55mL缓冲液B洗脱。
在4℃下将包含大部分蛋白质的合并级分用4L缓冲液C(10mMMES(pH6.5)、1mM EDTA)透析过夜,并直接加载到用缓冲液C平衡的SP Sepharose HP(GE Healthcare,Piscataway,NJ)阳离子交换柱(1.5cm I.D.×10cm)上。用60mL缓冲液B(3mU分钟)和30mL缓冲液C中的0.1M NaCl清洗柱子,然后用100mL缓冲液C中的线性梯度(3mU分钟)0.1至0.9M NaCl洗脱PFO/rPFO。在~0.5M NaCl下洗脱PFO并且用由甘油制成10%(v/v)的缓冲液A进行透析包含PFO的合并级分,将其等分到冷冻小瓶(cryovial)中,在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。当纯化包含Cys残基的PFO衍生物时,包含二硫苏糖醇(5mM)作为还原剂。缺少Cys的衍生物(rPFO)不需要添加DTT。
b)用于不同线粒体功能测定的条件优化:
开发了用于复合物I、II、V、氧化磷酸化能力和ETC/RC能力的一般方法。可用多种细胞类型实施这些测定,所述细胞类型例如外周血单核细胞、成肌细胞、神经元、星形细胞和突触小体。在一些实施方案中,细胞特异性修饰可用于某些蛋白质。修饰可取决于使用的缓冲液条件和补充物。在一些实施方案中,发现包含低K+的缓冲液对于线粒体功能测定是有利的,例如,在使用INS1E细胞的测定中。在某些环境下相似的缓冲液可适用于其他细胞类型。但是,在一些情况下可优化对于不同细胞类型的不同离子(包括K+)的相对水平。
为了在病理生理学环境中评价用于原代细胞的条件,可使用部分复合物I缺陷(~50%)的小鼠模型(NdufalS55A)。如实施例11所公开的,原代细胞(神经元、小鼠胚胎成纤维细胞、血单核细胞、胸腺细胞和脾细胞)和突触小体可来源于NdufalK1小鼠,从而测定部分复合物I组装物的生理作用。部分复合物I缺陷是人线粒体疾病的最常见原因。但是,也可使用这些方法研究其他缺陷。
实施例2:使用不同细胞类型的实验评价:
相似的实验条件可用于在不同细胞(参见表4,细胞的非限制性列表)中复合物I至V以及氧化磷酸化和ETC/RC能力的测定。
表4:用于基于PFO之线粒体功能测定的细胞。
用乳腺上皮细胞和成体干细胞评价了用于基于XF的呼吸计量法的条件。可用其他细胞进行相似的实验。例如,可使用不同的原代细胞,例如,乳腺上皮细胞、小鼠胚胎成纤维细胞。在一些实施方案中,基于原代神经元和星形细胞的实验,这些原代细胞可来源于Ndufa1S55A小鼠。在一些实施方案中,优化用于不同细胞类型的不同测定组分的浓度可以是有利的。例如,在不同量的K+、Ca2+和/或肉毒碱存在下使可兴奋细胞(例如肌细胞和神经元)而不是其他细胞生长可以是有利的。但是,使用同样是可兴奋细胞的β细胞的测定表明,这样的细胞可在宽范围的测定条件下进行有效评价。当使用ADP刺激且由琥珀酸支持的呼吸作为线粒体性能的输出响应时,可测定给定细胞类型的这些参数。
实施例3:使用洋地黄皂苷作为透化试剂的测定:
在细胞色素c存在和不存在下,使用琥珀酸作为底物来优化洋地黄皂苷浓度和呼吸缓冲液以达到最大ADP刺激的呼吸。图2示出了用于INS1E细胞的条件的代表性数据,其包括添加外源性细胞色素c。除非另有具体说明,否则使用不含Ca2+的低K+呼吸缓冲液[20mM TES pH7.4、3.5mMKCL、120mM NaCl、0.4mM KH2PO4、1.2mM Na2SO4、2mM MgSO4、1mM EGTA,含有0.4%脂肪酸,不合BSA]。因为细胞内K+离子浓度较高(~120mM),所以测试不含Ca2+的高K+缓冲液[用25至120mM NaCl代替缓冲液中等摩尔的KCL]以确定线粒体是否表现得更好。发现在某些情况下,使用INS1E细胞,与低K+缓冲液相比,高K+缓冲液表现不佳。在相同的条件下,评价了两种其他常用的透化剂(皂苷和丙甲甘肽)的性能;将性能结果与洋地黄皂苷进行比较。虽然使用皂苷和丙甲甘肽实现了与洋地黄皂苷相当的性能水平,但是测定不是可重现的。这些研究表明,对于每种细胞类型,必须优化洋地黄皂苷浓度,并且这在不同物种中而非一个特定物种中更加易变。与其他去污剂一样,用洋地黄皂苷也存在可重现性问题,认为这是由于孔形成的不均匀性,其不能用去污剂有效控制。基于外源性细胞色素c与去污剂的测定的要求表明,损失线粒体完整性导致了细胞色素c丢失。
实施例4:基于PFO的测定:
进行了基于PFO的测定,并且发现其克服了与基于洋地黄皂苷的测定有关的问题。首先,将野生型PFO用于选择性透化质膜。在使用INS1E细胞和中国仓鼠肺成纤维细胞(V79-G3)的测定中对PFO与洋地黄皂苷的性能进行比较。出乎意料地,在两种细胞类型中,PFO均胜过洋地黄皂苷(参见图3)。评价了基于PFO的测定中对外源性细胞色素c的需要。这通过在细胞色素c存在与不存在下的ADP刺激的呼吸来完成。测试表明,可使用甚至更低浓度的PFO而无需添加细胞色素c(图4)。
在使用PFO的测定中缺少外源性细胞色素c需求表明,相对于洋地黄皂苷,使用PFO更好地保留了线粒体完整性。因此,在细胞色素c不存在下进行了使用PFO的另外的研究。虽然本文所示数据仅是对于INS1E细胞的,但是所述条件适用于不同类型的细胞。
实施例5:测定空余氧化磷酸化(OxPhos)和呼吸(ETC/RC)能力:
为了比较细胞的氧化磷酸化能力与ETC/RC能力,将细胞与底物(例如,15mM葡萄糖和10mM琥珀酸)一起在不含Ca2+的呼吸缓冲液中预孵育,然后测量呼吸速率。在测量基础呼吸速率之后,用PFO使细胞透化,然后相继测量ADP和FCCP刺激的呼吸速率。通过这种方式,测定了氧化磷酸化和ETC/RC的空余能力(图5A)。在不向PFO透化细胞中添加ADP的情况下,呼吸衰退至稳态,并且剩余的呼吸仅通过穿过线粒体内膜的质子(H+)渗漏支持(图5B&C)。ADP刺激的呼吸添加至接近基础呼吸水平,并且细胞色素c的存在或不存在似乎不产生大的差异(图5C)。氧化磷酸化能力和ETC/RC能力分别通过ADP刺激的和质子载体FCCP刺激的呼吸来测量。通过FCCP使ADP刺激的呼吸进一步增加表明氧化磷酸化能力比ETC/RC能力低(图5A)。这可以是某些细胞(例如成纤维细胞)的常见特征,所述细胞不可面临需要更大空余氧化磷酸化能力的急性ATP短缺(图5A和6A)。但是,在对于其生物能学需求主要依赖于线粒体氧化磷酸化的其他细胞(例如,β细胞)中,氧化磷酸化和ETC/RC能力二者必须相等。显示出其氧化磷酸化和ETC/RC能力几乎相等的胰岛β细胞中通过ADP和FCCP的呼吸刺激的相似水平强调了这一点(图6)。这些数据合起来强调了基于PFO的测定用于在单一实验中评估氧化磷酸化和ETC/RC的相对能力的有用性。由于得到的信息是生理相关的并且是可重现的,所以这是非常有力的方法。此外,如本文所述,该实验系统还允许在会损害细胞生物能学的药物处理之后测定给定细胞中的呼吸衰退的基础。
实施例6:评估ETC/RC和底物供应:
通过基于PFO的细胞透化的可重现性,可进行在ETC/RC复合物中具有缺陷的突变体的功能性筛选。图7的数据阐明了复合物I突变体的实施例。复合物I突变体缺少基于生成NADH之底物(例如,谷氨酸+苹果酸)的呼吸,而它们表现出与基于生成FADH2的琥珀酸的对照细胞相当的呼吸。如本文所述,NADH&FADH2将电子分别供应至复合物I&II。也可使用特定底物和抑制剂测定其他复合物的活性(参见本文提供的复合物III&IV测定的描述)。
除了测定ETC/RC的功能缺损之外,基于PFO的测定可适合于测定底物供应至ETC/RC的限制,这可在某些条件下造成呼吸衰退。为了解决这个问题,评价了β细胞中由寡霉素造成的呼吸衰退。图8中的数据表明,β细胞中的这种寡霉素诱导呼吸衰退是由于底物供应的限制。在琥珀酸和FCCP二者存在下,仅可在PFO透化细胞中恢复呼吸。此外,添加Ca2+使呼吸显著下降,认为至少一部分是因为打开了通透性转换孔。
总之,所呈现的数据证实了线粒体功能的基于PFO的功能测定的可行性。这些测定可使用任意合适的技术进行。在一些实施方案中,可使用基于微板的呼吸计量法,其使用来自Seahorse Biosciences的XF分析仪。除基于XF分析仪的研究之外,PFO可用于在一系列环境中透化细胞以研究线粒体代谢。
实施例7:在胰岛β细胞中评价线粒体NADH代谢
图10至14示出了以下描述的涉及基于PFO之透化的测定结果。关于葡糖激酶,广泛认识了线粒体代谢在葡萄糖传感(glucose sensing)中的作用。认为对ATP的反馈抑制不敏感的低亲和性葡糖激酶增加了通过糖酵解的通量并且增强了丙酮酸的产生。认为丙酮酸通过TCA循环代谢以生成用于ATP产生的电子供体(对于呼吸复合物I&II分别为NADH&FADH2),并且为胰岛素持久释放提供另外的信号。虽然基于成像的研究表明,线粒体中的丙酮酸代谢可能在生成NADH方面无效,但是其对线粒体功能的影响在其他地方似乎没有被详细研究。
使用透化的INS1E和分散的胰岛细胞的原位呼吸计量法测定来研究β细胞基于不同底物生成NADH的能力。数据示出,β细胞线粒体不表现出可检测的基于NADH生成底物的呼吸水平,而来自肺成纤维细胞、星形细胞和神经元的线粒体在相同实验条件下表现出强力的呼吸。此外,基于琥珀酸和α-甘油磷酸/磷酸盐(分别是复合物II&III的底物)的呼吸速率是非常强力的。这些数据表明了β细胞线粒体中NADH代谢的特有调节,这可与通过酶而不是复合物I的有限NADH产生和/或消耗有关。NADH水平比在成纤维细胞和星形细胞线粒体中发现的NADH水平低。提议β细胞经线粒体中的葡萄糖通过负调节关键步骤以有助于对氧化还原穿梭的依赖来调节NADH输出,并且因葡萄糖代谢与胰岛素分泌的紧密偶联而有助于苹果酸和柠檬酸输出至胞浆。
β细胞生物能学取决于氧化磷酸化。其在通过β细胞的胰岛素分泌中发挥作用。胰岛素分泌对通过氧化还原穿梭的胞浆NADH氧化的依赖性表明β细胞中的呼吸链功能主要取决于胞浆电子供体。因此,测试了与非葡萄糖敏感的其他细胞(例如星形细胞和成纤维细胞)相比β细胞线粒体中的NADH的产生是否更低。使用多种NADH生成底物来监测复合物I依赖性呼吸的差异。此外,为了探测氧化磷酸化在丙酮酸循环中的作用,监测了在阻断ATP合酶(复合物V)活性的寡霉素存在下的呼吸衰退。
实施例7中基于PFO的测定的结果表明,经透化的β细胞由于线粒体中的NADH产生受限而不显示出复合物I依赖性呼吸。在完整的β细胞中,呼吸可仅通过氧化还原穿梭支持。β细胞中的呼吸能力和氧化磷酸化能力是相当的。在这些实验中,无论所使用的底物如何,β细胞中的氧化磷酸化对于维持呼吸活性都是重要的。在该实施例中观察到的在寡霉素存在下的呼吸衰退与底物限制有关,其发生是由于β细胞中丙酮酸循环的阻断。
实施例8:使用产气荚膜梭菌溶血素O及其变体测定线粒体代谢的空余氧
化磷酸化能力和细胞特异性特征
概述:
在该实施例中,在线粒体功能测定中,将使用去污剂用于细胞透化的有效性与胆固醇依赖性细胞溶素(CDC)产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)和其某些变体进行比较。CDC作为50至70kDa的水溶性单体分泌,其在包含胆固醇的膜中形成大的环形和弧形同源寡聚孔(homooligomericpore)(35至50个单体/寡聚体)。所形成的孔的直径为约并且允许大分子(例如,抗体、β-淀粉酶和甲状腺球蛋白)通过。以下所述结果表明,与去污剂相比,当细胞用PFO透化时,线粒体完整性保留得更好。
此外,已开发了基于PFO的方法,其允许使用基于微板的呼吸计量法在小样品中测定空余氧化磷酸化能力和其他生物能学特征。使用这些方法,发现在需要生物能的细胞(例如β细胞)中,空余氧化磷酸化能力与空余呼吸能力相当,而在其他细胞(例如成纤维细胞)中,其低于呼吸能力。这些数据表明在足够的呼吸底物(例如琥珀酸和ADP)存在下,无机磷酸/磷酸盐(Pi)的水平对氧化磷酸化能力具有显著作用。
材料和方法:
试剂:
鱼藤酮来自于Calbiochem。除非另有说明,否则其他试剂来自于Sigma。
制备功能性PFO:
使用已知方法纯化天然(nPFO)、不含半胱氨酸的rPFO(包含C459A突变的nPFO)和改造的包含二硫键的突变体dbPFO(包含双T319C-V334C突变的rPFO)。这些衍生物包含来自pRSET-B载体(Invitrogen)的多组氨酸标签。在具有或缺乏多组氨酸标签的PFO衍生物中没有检测到显著的功能差异或结构差异。
nPFO和rPFO均是细胞活性的,但是rPFO在使用模型膜进行测试时采用更高的胆固醇浓度。相比之下,dbPFO与膜结合但不形成孔,其原因是跨膜β发夹之一与结构域2通过二硫键共价连接。通过添加(2S,3S)-1,4-双(巯基)丁烷-2,3-二醇(DTT)还原二硫键释放了锁定的跨膜β发夹,导致了大的跨膜桶的插入。
在纯化之后,将不含半胱氨酸的rPFO和dbPFO储存在缓冲液A[50mM HEPES pH7.5、100mM NaCl和10%(v/v)甘油]中,而将nPFO储存在补加有5mM DTT的缓冲液A中以维持其细胞活性。蛋白质保持在-80℃直至使用。使用摩尔吸光系数(ε280)计算蛋白质浓度为74260cm-1M-1。
细胞和培养条件:
大鼠胰岛瘤INS1E细胞在补加有11.1mM葡萄糖、10%胎牛血清(FBS)、1mM HEPES(Invitrogen)和50μMβ-巯基乙醇(2-巯基乙-1-醇)的RPMI1640培养基(Mediatech Inc,Manassas,VA)中生长。饥饿培养基在1mM丙酮酸钠存在下包含4mM葡萄糖而非11.1mM葡萄糖。另一些细胞例如中国仓鼠肺成纤维细胞(V79-G3、CCL16-B2、CCL16-B2-MWFE)、人胚胎肾(HEK293)细胞和小鼠C2C12成肌细胞在补加有10%FBS(Invitrogen)、1%非必需氨基酸(Mediatech,Inc,Manassas,VA)和1%抗生素混合物(PenStrep,Invitrogen)的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium,DMEM,Invitrogen,Grand Island,NY)中在37℃、5%CO2/95%空气的湿润气氛下生长。人成神经细胞瘤SHSY5Y细胞在含有10%FBS和1%抗生素混合物的DMEM/F12培养基中培养。在用不含Ca2+和Mg2+的磷酸/磷酸盐缓冲盐水(PBS:pH7.4)清洗一次之后使用0.05%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)收获细胞。
分离大鼠原代胰岛β细胞:
使用本领域已知的方法从Wistar大鼠中分离胰岛。将胶原酶P酶溶液(1.2至1.4mg/ml;Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)注射到供体胰腺的远端。消化之后,对胰岛进行梯度纯化,然后手动挑选并在5%CO2培养箱中在补加有10%热灭活FBS和1%PenStrep(Mediatech,Manassas,VA)的RPMI-1640培养基中进行培养。使用本领域已知的方法由胰岛制备单个细胞。培养24至48小时之后,在4℃下以1100rpm维持5分钟收集胰岛,然后用PBS清洗两次。收集的胰岛用补加有EDTA的0.05%胰蛋白酶(Invitrogen)处理3分钟,然后轻轻研磨以分离细胞。在研磨之前通过添加包含血清的RPMI培养基终止胰蛋白酶活性。在来自Seahorse Bioscience(Billerica,MA)的聚乙烯亚胺(PEI)包被的V7PS XF24培养板中每孔接种100,000个细胞。除非另有注释,否则细胞在接种72小时后用于实验。在大鼠胰岛中,β细胞是主要的细胞类型(~80%)。除非另有说明,否则分散的大鼠胰岛细胞在本文中称为原代β细胞。
呼吸计量法和细胞透化:
在V7组织培养板中生长至~80%细胞覆盖(confluence)的细胞原位用于使用XF24通量分析仪(Seahorse Biosciences)的基于微板的呼吸计量法。除非另有说明,否则所有测定都使用V7PS板进行。以以下密度接种细胞:10-20,000个/孔(肺成纤维细胞V79-G3、B2-MWFE;HT1080);25,000个/孔(原代星形细胞);30,000个/孔(HEK293);50,000个/孔(INS1E)和100,000个/孔(原代β细胞)。除非另有说明,否则细胞在接种后生长24至72小时,用500μl指定的呼吸缓冲液(参见表6)清洗两次,然后在37℃下在非CO2培养箱中孵育~30至60分钟。在向注射口加载指定化合物之后,根据制造商说明书对预水化24小时的XF24盒体(cartridge)进行校准。根据制造商说明书校准传感器盒体之后,将含有细胞的V7培养板装载到XF24分析仪中。根据所使用的细胞类型,分别在0.5至2分钟、1.5至2分钟和3至5分钟使用混合、等待和测量的循环来测量细胞的呼吸活性。在3至4次呼吸速率测量之后,用指定试剂(例如,洋地黄皂苷、皂苷、PFO、rPFO或dbPFO)透化细胞。指定的呼吸底物(例如,琥珀酸、或谷氨酸+苹果酸)在透化细胞之前存在于呼吸缓冲液中或者与透化剂一起或在其之后添加。通过所使用的不同类型细胞的滴定测定来确定ADP(1至2mM)和羰基氰对三氟甲氧基苯腙(FCCP)的最佳浓度。图23A至23B示出了使用HEK293细胞的典型FCCP滴定测定。在FCCP滴定测定中不使用寡霉素。在完整细胞中给出的最大呼吸之相同FCCP浓度适用于透化细胞。分别使用注射口a、b&c相继(第1次、第2次、第3次)添加化合物。除非另有注释,否则所有的呼吸底物(琥珀酸、苹果酸、谷氨酸、丙酮酸等)的使用浓度为10mM。Cyt C使用浓度为10μM。实际耗氧率或归一化(基础呼吸设定为100%或0%)耗氧率(ORC)表示为呼吸的度量。基于通过ADP和FCCP的基础呼吸速率的呼吸活性增加被认为是空余(备用)氧化磷酸化能力和空余呼吸能力。
NAD(P)H测定:
使用本领域已知方法从INS1E和B2-MWFE细胞中分离线粒体。使用基于微板的BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher)测量线粒体含量。在37℃下,在2μM鱼藤酮存在下,将250μl不含Ca2+的LKB(不含葡萄糖)中的20g线粒体与谷氨酸+苹果酸(每种10mM)一起孵育115分钟。使用FLUOstar Omega荧光计(BMG Labtech)来测量在355nm激发和460nm发射波长下NAD(P)H的相对水平。NADH标准曲线用于确定NAD(P)H的浓度。
结果:
在去污剂透化细胞中线粒体完整性受到损害:
大鼠胰岛瘤细胞系INS1E用于评估用于线粒体功能测定的透化条件。INSIE细胞是对于大鼠胰岛β细胞的实验模型。洋地黄皂苷已用于选择性质膜透化以评估线粒体功能。评价了基于洋地黄皂苷的测定以确定其是否适合于采用有限数目细胞(例如,5000至100,000个细胞)的基于微板的呼吸计量法。
首先,使用琥珀酸作为底物测定了对于最大ADP刺激之呼吸的合适洋地黄皂苷浓度。在10μM Cyt C存在下用0.01%洋地黄皂苷观察到了最大呼吸和持久呼吸(图16A)。在Cyt C不存在下,即使在较低的洋地黄皂苷浓度下也没有实现最大呼吸。这些数据表明,洋地黄皂苷损伤了线粒体外膜完整性,导致Cyt C释放。通过得自于相同来源的不同批次的洋地黄皂苷,随着在0.0025%至0.01%范围中的浓度增加,观察到呼吸速率降低。当细胞用洋地黄皂苷透化时,所使用的呼吸缓冲液的类型对线粒体功能具有显著作用(图29)。因此,即使小心滴定,也鉴定不出对于给定细胞类型的不同测定条件下实现可重现性的洋地黄皂苷浓度。
为了测试呼吸活性与ATP合成的偶联,评价了经ADP刺激的呼吸对寡霉素的敏感程度。寡霉素是使用Ap由ADP和Pi合成ATP的ATP合酶(复合物V)抑制剂(参见图15)。当将寡霉素与ADP一起添加时,大部分ADP刺激的呼吸(~75%)是寡霉素敏感的。预计剩余的呼吸由穿过线粒体内膜的H+渗漏来支持。
为了测定呼吸能力,使用FCCP。质子载体FCCP通过驱散穿过线粒体内膜的H+梯度来诱导最大呼吸。因此,使用如通过滴定确定的合适FCCP浓度来测定INS1E细胞的呼吸能力(最大呼吸)。ADP和FCCP二者给出相当的呼吸刺激,表明在INS1E细胞中的空余氧化磷酸化能力和呼吸能力分别相当(图16B、16C)。使用琥珀酸作为呼吸底物在空余氧化磷酸化与呼吸能力之间没有观察到显著差异。此外,在寡霉素存在下FCCP刺激的呼吸与无寡霉素时观察到的呼吸没有显著差异,这表明呼吸能力主要通过ETC/RC的功能能力来确定。
为了评估相同实验条件可应用于测定其他细胞中线粒体功能的程度,在多种细胞类型中评价了ADP刺激的由琥珀酸支持的呼吸,所述细胞类型包括原代大鼠星形细胞、中国仓鼠成纤维细胞和人细胞。相似的条件适用于大鼠星形细胞(图16D),并且对于仓鼠(B2-MWFE)和人(HT1080)细胞使用洋地黄皂苷滴定(图16E、F)。
将其他试剂例如皂苷(另一种去污剂)和丙甲甘肽(成孔肽)的相对性能与洋地黄皂苷进行比较。皂苷和丙甲甘肽二者用于不同实验设定中的线粒体功能的测定。在INS1E细胞中,皂苷而非丙甲甘肽的结果与洋地黄皂苷相当(图24A、24B)。与洋地黄皂苷相比,皂苷的结果可重现性较低。
在PFO透化细胞中线粒体完整性保持完整:
胆固醇依赖性细胞溶素(CDC)用于保留细胞透化后的线粒体完整性。CDC(例如,产气荚膜梭菌溶血素O(PFO))与包含相对高的量之胆固醇的膜相结合。发现通过CDC跨膜β桶的插入形成的孔比通过去污剂得到的那些孔更容易控制并且更均匀。因此,在CDC存在下,细胞内细胞器保持结构和功能完整。
开发了几种产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)衍生物用于透化测定。发现与洋地黄皂苷相比,用nPFO透化的β细胞中的呼吸响应更强力(图17A)。同样也在中国仓鼠肺成纤维细胞(V79-G3)中观察到了通过nPFO的线粒体功能的这种改善。进行nPFO剂量响应分析以确定最大线粒体功能所需的最小浓度。在不同剂量下测量的INS1E和V79-G3细胞的空余氧化磷酸化能力和呼吸能力。发现在一些实施方案中,1nM PFO对于最大线粒体性能是足够的(图17B至D)。在所测试的所有nPFO剂量下,未观察到超过ADP刺激的通过添加FCCP的呼吸之进一步增加(图17B)。
使用基于nPFO的测定发现,INS1E细胞的氧化磷酸化能力与呼吸能力相当(图16B、C和图17B、C)。与INS1E细胞不同,V79-G3细胞中的空余氧化磷酸化能力与呼吸能力相比较低(图17E、F)。在V79-G3细胞中,针对宽范围的nPFO浓度,空余氧化磷酸化能力与呼吸能力没有变化。即使对于中国仓鼠V79-G3细胞,低至1nM nPFO对于最大线粒体性能也是足够的(图17F)。
与基于洋地黄皂苷的测定相反,当在nPFO透化细胞中测定线粒体功能时不需要外源性Cyt C。在不存在或存在添加的Cyt C的情况下,观察到不同细胞类型中的线粒体性能没有差异(图18A、D、G、H)。在β细胞中,呼吸活性一般与外部葡萄糖浓度成比例,而在其他细胞类型中则不是。当葡萄糖不受限制时,β细胞透化也造成呼吸衰退(图19F)。在琥珀酸单独存在下,透化V79-G3细胞中的呼吸衰退至稳态水平(图18D)。剩余的呼吸由H+渗漏支持,原因是其与完整细胞中的寡霉素不敏感呼吸相当(图18E)。单独添加ADP使得呼吸恢复至接近基础水平(透化前状态,图18D)。当将ADP与nPFO同时添加时,没有呼吸衰退,相反地呼吸相对基础水平增加了~20%(图17E、18F)。
ADP刺激的呼吸对寡霉素是敏感的,表明呼吸与ATP合成相偶联(图18F)。单独的ADP导致了呼吸刺激,表明质膜对于ADP是不渗透的。寡霉素存在下的呼吸衰退与nPFO透化细胞中的呼吸衰退重叠(图18E)。这些数据表明在INS1E和V79-G3两种细胞中ETC/RC功能与ATP合成相偶联并且保留了线粒体完整性。
使用基于PFO的测定确定空余氧化磷酸化能力:
在透化时在饱和底物浓度存在下通过适当量ADP进行的呼吸刺激允许测量空余氧化磷酸化能力。图19A中的数据示出了用于测定空余氧化磷酸化能力和呼吸能力的典型实验。人HEK293细胞用于这些测定。在包含15mM葡萄糖的不含Ca2+的呼吸缓冲液中孵育β细胞,然后与nPFO同时添加琥珀酸和ADP。相对于基础呼吸,ADP刺激的呼吸给出了空余氧化磷酸化能力的估计。为了测定空余氧化磷酸化能力(SOC)是否与空余呼吸能力(SRC)相匹配,向所述细胞中添加FCCP。通过监测所述细胞中的ADP和FCCP刺激的呼吸,测定了支持ATP合成的空余呼吸能力的分数(SOC/SRC)。完整细胞与PFO透化细胞(SRCi相对于SRCp)的空余呼吸能力的比较表明,在一些情况下,在使用葡萄糖作为呼吸底物的完整细胞中SRC可被低估~60%(图19A)。
图19B示出了可由其估计总氧化磷酸化能力的数据。所述数据示出了通过将空余氧化磷酸化能力(SOC)加到寡霉素敏感性呼吸(OSR)中可在给定实验条件下测定给定细胞类型的总氧化磷酸化能力(TOC)。由于寡霉素作用是相对瞬时的,所以完整细胞中空余氧化磷酸化能力(SOC)和寡霉素敏感性呼吸(OSR)的总和提供了总氧化磷酸化能力的准确估计(TOC=SOC+OSR)。可通过监测ADP刺激的呼吸的寡霉素敏感性来测定进一步的偶联效率(CE)(图19C)。寡霉素的存在似乎不影响空余呼吸能力和总呼吸能力(图19B)。
在底物存在下,PFO透化细胞中的呼吸衰退与来自细胞质的ADP渗漏有关(图18D、G、H)。使用替代的测定设计来测定总氧化磷酸化能力(图19D)。其允许分析基于给定底物的氧化磷酸化能力与呼吸能力之间的关系。对于给定细胞类型可优化实验条件,例如在PFO透化之后实现稳态呼吸速率所花费的时间。
使用基于PFO的测定评估氧化磷酸化能力:
一些因素(包括例如底物和实验条件)可影响氧化磷酸化能力。确定了基于PFO的测定是强力且可重现的,评价了可影响氧化磷酸化能力的因素。发现空余氧化磷酸化能力随不同底物而改变,所述不同底物例如谷氨酸+苹果酸、琥珀酸和甘油-3-磷酸,其分别在复合物I、II和III的情况下支持ETC/RC功能(图20A)。氧化磷酸化在即使含有琥珀酸的游离Ca2+(~220nM)存在下也显著增加,其氧化认为是对Ca2+不敏感(图20B)。使用LKB缓冲液进行实验以促进比较相同条件下完整细胞与透化细胞中的线粒体生物能学。
考虑到细胞的细胞质中细胞内K+浓度较高,并且基于PFO的方法是强力且一致的,评价了通过选择呼吸介质影响氧化磷酸化能力的程度。表6示出了基于对HEK293细胞氧化磷酸化能力的作用而比较的呼吸缓冲液的列表。使用HEK293细胞的原因是它们显示出比呼吸能力低的氧化磷酸化能力(图19A、B)。ADP刺激的呼吸在LKB缓冲液中最小。在MAS缓冲液中观察到最大呼吸(图20C)。与LKB和HKB缓冲液相比,在MAS缓冲液中的偶联效率显著较高(p<0.05,图20D)。
进一步的分析表明KH2PO4浓度是影响氧化磷酸化能力的因素(图20E)。呼吸介质的另一些组分例如BSA(0.2%和0.4%)和缓冲剂的浓度(例如,TES或HEPES)对FCCP刺激的呼吸具有很小的作用并且对ADP刺激的呼吸不产生显著作用。当KH2PO4浓度由0.4mM增加至10mM时,空余氧化磷酸化能力与在MAS缓冲液中观察到的氧化磷酸化能力相当(图20E)。在这些条件下,氧化磷酸化能力低于呼吸能力。这些数据表明,除底物和ADP之外,Pi利用度可限制氧化磷酸化能力。
与可兴奋细胞例如INS1E(图20G、H)相比,对Na+与K+缓冲液的选择可对测定不可兴奋细胞如HEK293(图20C、E、F)中的空余磷酸化/呼吸能力具有相对小的作用。在INS1E细胞中,虽然使用琥珀酸(复合物II底物)的空余氧化磷酸化能力显著更高,但是对于复合物I底物谷氨酸+苹果酸未观察到显著差异(图20I)。
使用基于PFO的测定来评估ETC/RC:
为了证实基于PFO的测定可鉴定ETC/RC组装物中的具体缺陷,使用复合物I缺陷型CCL16-B2细胞。由于不存在由Ndufal基因编码的MWFE亚基,所以CCL16-B2细胞在复合物I组装物中损伤。首先,如图21A所示,在能够呼吸的V79-G3细胞中测试由谷氨酸+苹果酸支持之呼吸的鱼藤酮敏感性。由谷氨酸+苹果酸支持的呼吸对复合物I的特异性抑制剂鱼藤酮是敏感的。在CCL16-B2细胞中没有检测到谷氨酸+苹果酸支持的呼吸,而使用琥珀酸时观察到强力的呼吸(图21B)。相比之下,B2-MWFE细胞(补充有野生型MWFE蛋白质的CCL16-B2细胞)在相同条件下表现出由谷氨酸+苹果酸和琥珀酸二者支持的呼吸(图21C)。这些数据表明,使用本文公开的基于PFO的测定,可使用来自有限量样品的特定底物和抑制剂组合而不分离线粒体,以鉴定ETC/RC功能的特定缺陷,。
使用基于PFO的测定通过呼吸计量法来评估TCA循环代谢:
由于TCA循环是线粒体中NADH的主要来源,所以复合物I依赖性呼吸也可提供关于单个NADH生成步骤的功能状态的信息以及影响代谢物运输进入线粒体的因素。苹果酸是调节柠檬酸/异柠檬酸、α-酮戊二酸和Pi穿过线粒体内膜之运输的TCA循环代谢物。
为了确定苹果酸是否影响利用丙酮酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸来支持呼吸活性以及其影响程度,首先在苹果酸不存在的情况下然后在其存在的情况下在相同测定中测量呼吸速率。这可在显示出复合物I依赖性呼吸的B2-MWFE细胞中完成(图21C)。在添加苹果酸后实现了异柠檬酸和α-酮戊二酸的最大呼吸响应(图21D)。对于丙酮酸和谷氨酸也观察到了相似的响应,这二者在苹果酸不存在的情况下均示出甚至更低的呼吸响应。由于不期望丙酮酸和谷氨酸的运输直接受苹果酸的存在所影响,所以这是出乎意料的。
在原代β细胞中没有观察到丙酮酸、谷氨酸、苹果酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸各自支持呼吸,而在相同细胞中由琥珀酸支持的呼吸是正常的(图21E)。这些数据表明苹果酸支持使用生成NADH之底物(例如丙酮酸、谷氨酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸)的最大呼吸响应。
在原代大鼠星形细胞中显示出复合物I依赖性呼吸的条件下,观察到INS1E中没有显著的呼吸(图21F)。这可能至少部分是因为线粒体内NADH代谢的β细胞特异性负调节。这样的调节允许β细胞在胰岛素分泌中的生物能学需求主要依赖于胞浆NADH。
当在2μM鱼藤酮存在下在37℃用谷氨酸+苹果酸处理线粒体15分钟以抑制NADH氧化时,与B2-MWFE线粒体相比,INS1E线粒体中的NAD(P)H水平降低了~40%(与6.83+0.11μM相比为4.05±0.65μM,t检验为p<0.002)。B2-MWFE细胞(其线粒体用作阳性对照)显示出复合物I依赖性呼吸(图21C)。
评估氧化磷酸化系统:
基于PFO的测定用于区分对氧化磷酸化系统的底物限制作用与直接作用。β细胞模型INS1E细胞显示出强力的葡萄糖刺激呼吸(图22A),并且当用寡霉素处理时,显示出进行性呼吸衰退(图22A)。在低和高葡萄糖二者处理的细胞中观察到寡霉素存在下的呼吸衰退(图22A)。这些数据表明,在低葡萄糖中,呼吸由穿过线粒体内膜的H+渗漏支持;而在高葡萄糖中,基本上所有的葡萄糖诱导呼吸均支持ATP合成(图22A)。在这两种情况下,寡霉素不敏感呼吸随时间进行性衰退。在低葡萄糖介质中更快速的衰退表明对ETC/RC的底物供应随时间变得有限。在丙酮酸存在下观察到相似的作用,表明作用主要在糖酵解的下游并且与丙酮酸代谢有关(图22A)。
为了评估对ETC/RC的底物供应的限制,在用nPFO透化之后在相同细胞中进行了呼吸挽救实验(respiration rescue experiment)。首先,在LKB呼吸介质(不含CaCl2,不添加EGTA)中用寡霉素处理INS1E细胞。添加寡霉素约30分钟后,呼吸开始逐渐衰退(图22B)。当用FCCP处理完整细胞时,未观察到呼吸增加。当添加底物(琥珀酸)时,FCCP仅可在透化细胞中使呼吸恢复。这些数据表明当氧化磷酸化被完全阻断时,底物限制影响INS1E细胞中的呼吸衰退。这与以下见解相一致:线粒体与影响β细胞生理学的细胞质代谢物之间的穿梭在不存在连续ATP合成的情况下停止。这可导致对ETC/RC的底物限制,其中通过代谢循环生成甘油-3-磷酸对β细胞生物能学可能非常重要。这些实验阐明了本文公开的基于PFO的测定可用于评价ETC/RC功能的直接和间接作用。
实施例9:分析PFO的变体
如图27所示,使用人工膜(脂质体)测试不同PFO变体的胆固醇依赖性结合。rPFO结合比天然PFO(nPFO)多使用~4mo1%的胆固醇。将D434S突变引入到rPFO衍生物中改变了突变蛋白的膜结合性质,使得其可用于如nPFO的类似胆固醇水平的环境中。类似地,当将同一突变引入到包含二硫键的PFO衍生物(即,rPFOT319C-V334C)中时,所得蛋白质dbPFOD434S-C459A的结合性质与天然PFO相似。因此,我们恢复了rPFO及其包含二硫键的衍生物rPFOT319C-V334C中天然毒素的胆固醇结合性质。这些突变体可在结合测定中不存在还原剂(例如DTT)的情况下使用,以避免Cys氧化或蛋白质之间二硫键的形成。当使用rPFOT319C-V334C或dbPFOD434S-C459A突变体时,可在蛋白质与靶膜结合之后添加还原剂以诱导孔形成。此外,可在使用rPFOT319C-V334C或dbPFOD434S-C459A突变体引发孔形成之前移除未结合的蛋白质。如实验过程所述,使用固有Trp荧光测定结合的PFO衍生物(0.1μM终浓度)与具有变化的胆固醇含量以及比例恒定为1∶1∶1的POPC、POPE和SM的脂质体(0.2mM总脂质终浓度)的分数。图27示出了用于多种衍生物的胆固醇依赖性结合等温线:天然PFO(方形)、PFOC459A(圆形)、PFOD434S-C459A(向上三角形)和PFOT319C-V334C-D434S-C459A(或dbPFOD434S-C459A,向下三角形)。在图27中,数据点是至少两次测量的平均值和标准偏差。
表5:PFO变体及其性质:
注意:表3和5中所述替换的氨基酸编号以SEQ ID NO:1或2所述序列为基础。在具有不同序列长度的PFO中可进行类似的替换。例如,在一些实施方案中,PFO可具有截短的N端(例如,不含N端信号序列的PFO,例如不合SEQ ID NO:1或2的前28个氨基酸)或延长的N端(例如,具有N端肽标签的PFO)。在这样的实施方案中,可替换相同氨基酸,但是那些氨基酸自N端的相对位置可与SEQ ID NO:1或2所述序列的环境不同。
制备PFO衍生物。使用蛋白质表达和纯化领域中已知的适当方法来表达和纯化PFO衍生物。包含天然PFO序列(SEQ ID NO:2的氨基酸29至500)加上来自载体(Invitrogen)之多组氨酸标签的PFO衍生物称为nPFO。缺少Cys的PFO衍生物(nPFOC459A,其中半胱氨酸459替换为丙氨酸)称为rPFO。使用如前所述的QuickChange(Stratagene)过程进行PFO诱变。表5提供了关于PFO衍生物的另外的信息。
对于结合的测定。如前所述,使用通过PFO与包含胆固醇的膜结合产生之Trp发射强度的变化进行与脂质体的结合。简言之,在固定在295nm(2nm带通)的激发波长下在348nm(4nm带通)处记录Trp荧光的发射。使用4mm×4mm石英比色杯用在缓冲液A(HEPES50mM,NaCl100mM,DTT 1mM,EDTA0.5mM,pH7.5)中包含200nM蛋白质的样品得到单体PFO衍生物的信号。对于单体的净发射强度(F0)在减去添加蛋白质之前的样品信号后获得。添加脂质体(~200μM总脂质)并将样品在37℃下孵育20分钟。在25℃下重新平衡样品之后测量膜孵育后的Trp发射,并减去来自缺少蛋白质的平衡样品的信号(F)。结合蛋白质的分数确定为(F-Fo)/(Ff-F0),其中Ff是所有蛋白质被结合时的发射强度。如前所述,在水溶液中进行PFO衍生物与胆固醇分散体的结合。
制备脂质和脂质体。非甾醇脂质得自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL),胆固醇来自Steraloids(Newport,RI)。如前所述,生成了大的单层囊泡。简言之,将1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(POPE)和鞘磷脂(SM,猪脑)的等摩尔混合物与指定量的胆固醇(5-胆甾烯-3β-醇)在氯仿中组合。将氯仿蒸发后形成的脂质薄膜重悬于缓冲液A中并通过配备有0.1μm过滤器的挤出机21次。将脂质体储存在冰中并在三周之后丢弃。
实施例10:PFO衍生物在线粒体功能测定中显示出与天然PFO相当的或
更好的性能:
产生并评价了几种不含半胱氨酸的PFO衍生物。与天然PFO一样,这些衍生物可透化哺乳动物细胞。在一些实施方案中,发现衍生物可与天然PFO一样有效地透化细胞。使用作为人工膜的脂质体评估这些衍生物的胆固醇敏感性。不含半胱氨酸的PFO衍生物的并排比较显示出与天然PFO相当的或相对更好的性能。
图28示出了在使用人HEK293细胞的线粒体功能测定中nPFO、rPFO和rPFOD434S的相对性能。rPFO和rPFOD434S是相当的,并且在不添加还原剂时维持其活性。在显微镜下目检表明,与在测试条件下的其他衍生物相比,用rPFOD434S透化之后的总细胞形态学保留得较好。用rPFOD434S透化之后,细胞质/细胞空胞(cell ghost)的膨胀相对较低。因此,在一些实施方案中,rPFOD434S对于一般用途是有利的。
在一些实施方案中,由于rPFO具有比其他PFO衍生物相对更低的胆固醇敏感性,所以其对于透化细胞是有利的。例如,某些哺乳动物细胞中的胆固醇含量可在某些病理生理学条件(例如,代谢综合征)下增加,在这样的情况下,胆固醇可在线粒体中累积,如果PFO留在测定介质中,则所述累积可危害线粒体功能。因为rPFO具有相对低的胆固醇敏感性,所以其对于这种细胞的细胞透化可以是有利的。已开发了有条件性活性的PFO衍生物。在一些实施方案中,通过≤50nM DTT引发PFO的衍生物(dbPFOD434S-C459A和rPFOT319C-V334C)以在质膜中形成孔。与这些衍生物一起使用时,使用浓度约50nM或更低的DTT不显著干扰细胞功能。这些衍生物可用于具有高水平胆固醇的细胞。在这样的情况下,在透化之前移除过量的PFO可在透化之后保留线粒体功能。在一些实施方案中,因为可在用≤50nM DTT诱导孔形成之前移除rPFOT319C-V334C和dbPFOD434S-C459,所以它们可用于细胞透化。这些是不期望显著影响线粒体功能的DTT浓度。在一些实施方案中,dbPFOD434S-C459A与rPFOT319C-V334C是功能相当的。
实施例11:PFO衍生物与洋地黄皂苷的比较
在一些实施方案中,利用洋地黄皂苷进行细胞透化以评估线粒体功能的测定受到限制,原因是(i)所观察到的洋地黄皂苷对细胞透化的作用是浓度依赖性的,(ii)使观察到的洋地黄皂苷的作用受缓冲液组成影响,(iii)即使在小心滴定洋地黄皂苷之后通常也得不到稳定的呼吸,以及(iv)所观察到的洋地黄皂苷的作用由于洋地黄皂苷浓度的有限动态范围而具有低可重现性(参见图29)。在一些实施方案中,相对高浓度的洋地黄皂苷可损害线粒体膜并释放对呼吸链功能重要的细胞色素c。
如本文所公开的,PFO衍生物克服了洋地黄皂苷的这些限制。PFO可用作透化剂,部分原因是其可高精度地被掌控,有助于可靠且可重现的测定。与洋地黄皂苷相比,PFO衍生物在0.1至20nM的浓度范围内产生可重现的结果,而在实验输出方面没有显著差异(比较图28与图29)。此外,在所测试的所有缓冲液中,用PFO透化的细胞的呼吸活性(与洋地黄皂苷相比)是稳定的(参见实施例8)。
对缓冲液的选择影响完整细胞和透化细胞中线粒体生物能学的方面:K+与无机磷酸/磷酸盐含量(Pi)不同的呼吸缓冲液(参见表6)用于评价其对线粒体功能的影响。图20示出缓冲液选择可影响细胞的氧化磷酸化(OxPhos)能力,其在MAS缓冲液中最大。通过改变LKB的磷酸/磷酸盐(Pi)(0.4mM至10mM),LKB中的氧化磷酸化能力可增加至在MAS缓冲液中观察到的水平(图20E、F)。考虑到不同细胞(INS1E和其他细胞)在低K+缓冲液(LKB、LPBT;参见表6)中看起来是形态学健康的,将这些缓冲液用于许多测定。图30中示出了数据的一个实例,其示出在HPBT(高K+缓冲液)中寡霉素(ATP合酶抑制剂)存在下INS1E细胞中相对较快的呼吸衰退。
在完整细胞和透化细胞中同对评估呼吸抑制:为了测定完整细胞中的药物诱导呼吸抑制如何转变为呼吸链复合物的最大抑制,将鱼藤酮用作用于抑制复合物I的实例。图31A示出细胞呼吸的剂量依赖性抑制。虽然在低磷酸/磷酸盐LKB缓冲液(0.4mM Pi)中ADP刺激的呼吸不明显(图31A),但是在高磷酸/磷酸盐LBPT缓冲液(10mM Pi)中观察到了ADP刺激的呼吸。鱼藤酮剂量依赖地抑制ADP刺激的呼吸(图31D)。使用由谷氨酸+苹果酸支持的呼吸在3μM FCCP存在下测量复合物I抑制(图31A、D)。认识到,随着鱼藤酮对复合物I抑制的增加,在LBPT缓冲液中复合物II依赖性呼吸也被显著抑制(图31D、E)并且在LKB缓冲液中最小(图31A、B)。
该观察结果的原因可以是草酰乙酸(复合物II的生理抑制剂)的堆积(build-up)。在鱼藤酮对复合物I显著抑制的存在下,由于NADH堆积,所以草酰乙酸不能转化为柠檬酸。当在不存在谷氨酸+苹果酸的情况下在鱼藤酮处理的细胞中测量复合物II依赖性呼吸时,没有检测到显著的复合物II抑制。因此,当复合物I被显著抑制时,可在不存在谷氨酸+苹果酸的情况下测量复合物II功能。较高水平的磷酸/磷酸盐也可导致琥珀酸从线粒体中出来(以磷酸/磷酸盐进入为交换)。因此,对于复合物II测定,在复合物I抑制存在下,可期望维持琥珀酸/磷酸/磷酸盐配给>1以避免对复合物II的琥珀酸供应受限。
来源于复合物I缺陷型小鼠模型(NdufalS55A)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用于评估可使用基于PFO的测定检测遗传编码部分呼吸链缺陷的程度。来自突变小鼠的完整MEF示出基于葡萄糖+丙酮酸或单独的丙酮酸的细胞呼吸减少(图32A、B)。在包含丙酮酸的呼吸缓冲液中观察到的差异确认了氧化代谢的缺陷,并且表明了受损糖酵解的缺乏。
在rPFO透化MEF中,复合物I功能降低~50%,而复合物II功能正常。为了使在复合物I缺陷存在下谷氨酸+苹果酸的混杂作用最小化,单独平行地测量了复合物II功能。总之,这些测定提供了可用于在患有不同病症(包括线粒体疾病)的人患者中检测部分呼吸链缺陷的框架。
表6:呼吸缓冲液的组成。不含Ca2+的缓冲液不添加CaCl2,而常规的LKB包含1.3mM CaCl2并且不添加EGTA。如对于具体测定的正文和/或附图图例所述的,在呼吸缓冲液中添加指定浓度的葡萄糖。
aNa-N-三-(羟甲基)-甲基-2-氨基-乙烷磺酸;b4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸;c牛血清白蛋白(不含脂肪酸)
1低K+缓冲液;2高K+缓冲液;3K+-HEPES-EGTA缓冲液;4甘露醇和蔗糖缓冲液;5,6磷酸/磷酸盐、BSA和TES浓度分别在LKB和HKB中改变。
由此已描述了本发明的至少一个实施方案的几个方面,应理解,对于本领域技术人员将容易进行多种改变、修饰和改进。这样的改变、修饰和改进旨在属于本公开内容的一部分,并且旨在在本发明的精神和范围中。因此,以上描述和附图仅是举例说明的,并且在所附的权利要求中详细描述了本发明。
在权利要求中使用序数词例如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求要素,其本身不意味着一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先、居先或顺序或者进行方法运作的时间顺序,而仅用作标记以区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但是使用序数词),从而区分权利要求要素。
Claims (104)
1.方法,其包括:
(a)使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触;以及
(b)测定所述制备物中分子的水平,其中所述分子的水平指示所述细胞的细胞内功能。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述分子的水平指示线粒体功能。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述胆固醇依赖性细胞溶素包含选自表1的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述PFO包含如SEQ ID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的方法,其中所述PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。
7.根据权利要求4所述的方法,其中所述PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其319位氨基酸处由苏氨酸替换为半胱氨酸,并且334位氨基酸处由缬氨酸替换为半胱氨酸。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法,其中所述氨基酸序列还在434位氨基酸处包含天冬氨酸至丝氨酸的替换。
9.根据权利要求7所述的方法,其还包括向所述制备物中添加还原剂。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述分子是O2。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述制备物中O2的水平指示所述细胞的耗氧率。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述耗氧率指示线粒体功能。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述分子是H+。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述制备物中H+的水平指示所述细胞的H+产生速率。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与细胞呼吸效应物相接触。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。
19.根据权利要求18所述的方法,其还包括测量所述细胞的耗氧率,其中ADP刺激的耗氧率指示所述细胞中的氧化磷酸化。
20.根据权利要求17所述的方法,其中所述质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
21.根据权利要求20所述的方法,其还包括测量所述细胞的耗氧率,其中FCCP刺激的耗氧率指示所述细胞中的电子传递和呼吸链功能。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α-酮戊二酸/α-酮戊二酸盐或其组合相接触。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述方法的结果指示所述细胞中复合物I(NADH-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与琥珀酸/琥珀酸盐相接触。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述方法的结果指示所述细胞中复合物II(琥珀酸-泛醌氧化还原酶)的酶活性。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与甘油-3-磷酸相接触。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述方法的结果指示所述细胞中复合物III(泛醇-细胞色素c氧化还原酶)的酶活性。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺(TMPD)和/或抗坏血酸/抗坏血酸盐相接触。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述方法的结果还指示所述细胞中复合物IV(细胞色素c氧化酶)的酶活性。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与琥珀酸/琥珀酸盐和ADP相接触。
31.根据权利要求30所述的方法,其还包括使所述细胞与甘油-3-磷酸相接触。
32.根据权利要求30或31所述的方法,其中所述方法的结果还指示所述细胞中复合物V(ATP合酶)的酶活性。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂、离子载体或krebs循环抑制剂相接触。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述抑制剂是鱼藤酮、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN和寡霉素。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与测试剂相接触以及测定所述测试剂对所述细胞内功能的作用。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述测试剂是候选药物。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其还包括鉴定所述细胞中的一个或更多个基因突变,其中所述方法的结果指示所述一个或更多个基因突变是否影响所述细胞的所述细胞内功能。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞从患有或疑似患有线粒体疾病的个体获得。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述方法的结果有助于将所述个体诊断为患有所述线粒体疾病。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述制备物被包含在孔中。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述孔位于多孔板中。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞是动物细胞或植物细胞。
43.方法,其包括:
(a)使包含细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触;以及
(b)测量所述细胞的细胞内功能。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述细胞内功能是所述细胞的代谢速率、所述细胞的呼吸速率、有氧呼吸与无氧呼吸的比例、分子的消耗速率或分子的产生速率。
45.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述细胞内功能指示细胞健康或细胞生存力。
46.根据前述权利要求43至45中任一项所述的方法,其中所述细胞内功能是线粒体功能。
47.根据前述权利要求43至46中任一项所述的方法,其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
48.根据前述权利要求43至47中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与细胞呼吸效应物相接触。
49.根据前述权利要求43至48中任一项所述的方法,其还包括使所述细胞与测试剂相接触以及测定所述测试剂对所述细胞内功能的作用。
50.根据权利要求49所述的方法,其中所述测试剂是候选药物。
51.根据前述权利要求43至50中任一项所述的方法,其还包括鉴定所述细胞中的一个或更多个基因突变,其中所述方法的结果指示所述一个或更多个基因突变是否影响所述细胞的所述细胞内功能。
52.根据前述权利要求43至51中任一项所述的方法,其中所述细胞得自于患有或疑似患有线粒体疾病的个体。
53.根据权利要求51所述的方法,其中所述方法的结果有助于将所述个体诊断为患有所述线粒体疾病。
54.根据前述权利要求43至53中任一项所述的方法,其中包含所述细胞的所述制备物处于多孔板的孔中。
55.试剂盒,其包含:
容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器;和
容纳有用于评价细胞之细胞内功能的试剂的容器。
56.根据权利要求55所述的试剂盒,其中所述细胞内功能是线粒体功能。
57.试剂盒,其包含:
容纳有胆固醇依赖性细胞溶素的容器;和
容纳有细胞呼吸效应物的容器。
58.根据权利要求57所述的试剂盒,其中所述细胞呼吸效应物是核苷酸或质子载体。
59.根据权利要求58所述的试剂盒,其中所述核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。
60.根据权利要求59所述的试剂盒,其中所述质子载体是对三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
61.根据前述权利要求55至60中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有谷氨酸/谷氨酸盐、丙酮酸/丙酮酸盐、苹果酸/苹果酸盐、异柠檬酸/异柠檬酸盐、α-酮戊二酸/α-酮戊二酸盐或其组合的容器。
62.根据前述权利要求55至61中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有琥珀酸/琥珀酸盐的容器。
63.根据前述权利要求55至62中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有甘油-3-磷酸的容器。
64.根据前述权利要求55至63中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺(TMPD)的容器。
65.根据前述权利要求55至64中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有抗坏血酸/抗坏血酸盐的容器。
66.根据前述权利要求55至65中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有呼吸链抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、解偶联剂、转运抑制剂、离子载体或krebs循环抑制剂的容器。
67.根据前述权利要求55至66中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有鱼藤酮、丙二酸/丙二酸盐、抗霉素A、KCN或寡霉素的容器。
68.根据前述权利要求55至67中任一项所述的试剂盒,其还包含容纳有测定缓冲剂的容器。
69.根据前述权利要求55至68中任一项所述的试剂盒,其中所述胆固醇依赖性细胞溶素选自表1。
70.根据前述权利要求55至69中任一项所述的试剂盒,其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
71.根据权利要求70所述的试剂盒,其中所述PFO包含如SEQ IDNO:1或2所示的氨基酸序列。
72.根据权利要求70所述的试剂盒,其中所述PFO包含如SEQ IDNO:1或2所示的氨基酸序列,其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。
73.根据权利要求70所述的试剂盒,其中所述PFO包含如SEQ IDNO:1或2所示的氨基酸序列,其319位氨基酸处由苏氨酸替换为半胱氨酸,并且334位氨基酸处由缬氨酸替换为半胱氨酸。
74.根据权利要求71至73中任一项所述的试剂盒,其中所述PFO还在434位氨基酸处包含天冬氨酸至丝氨酸的替换。
75.根据权利要求73所述的试剂盒,其还包含容纳有还原剂的容器。
76.根据权利要求75所述的试剂盒,其中所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
77.根据前述权利要求55至76中任一项所述的试剂盒,其中至少一个容器是可重复使用的容器。
78.根据前述权利要求55至77中任一项所述的试剂盒,其中至少一个容器是单次使用的容器。
79.根据前述权利要求55至78中任一项所述的试剂盒,其中至少一个容器是管或瓶。
80.根据权利要求79所述的试剂盒,其中所述管或瓶是按扣盖的管或瓶或者螺旋盖的管或瓶。
81.根据前述权利要求55至80中任一项所述的试剂盒,其中至少一个容器是玻璃小瓶。
82.根据前述权利要求55至81中任一项所述的试剂盒,其中所述容器一起被容纳在盒子或包装中。
83.根据前述权利要求55至82中任一项所述的试剂盒,其还包含用于使细胞透化的说明书。
84.根据前述权利要求55至83中任一项所述的试剂盒,其还包含用于在使用前将至少一个容器保存在低于0℃的温度的说明书。
85.根据前述权利要求55至84中任一项所述的试剂盒,其还包含用于诊断用途的说明书。
86.根据前述权利要求55至85中任一项所述的试剂盒,其还包含用于进行根据权利要求1至42中任一项所述之方法的说明书。
87.分离的产气荚膜梭菌溶血素O(PFO),其包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其434位氨基酸处由天冬氨酸替换为丝氨酸。
88.根据权利要求87所述的分离的PFO,其还在319位氨基酸处包含苏氨酸至半胱氨酸的替换。
89.根据权利要求87或88所述的分离的PFO,其还在334位氨基酸处包含缬氨酸至半胱氨酸的替换。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的分离的PFO,其还在459位氨基酸处包含半胱氨酸至丙氨酸的替换。
91.分离的PFO,其包含如SEQ ID NO:8至12中任一所示的氨基酸序列。
92.组合物,其包含根据权利要求87至91中任一项所述的分离的PFO以及载体。
93.试剂盒,其包含容纳有根据权利要求87至91中任一项所述的分离的PFO或容纳有根据权利要求92所述之组合物的容器。
94.用外源性核酸转染细胞的方法,所述方法包括:
(a)使所述细胞与胆固醇依赖性细胞溶素相接触;以及
(b)使所述细胞与所述外源性核酸相接触。
95.根据权利要求94所述的方法,其中步骤(a)在步骤(b)之前进行。
96.根据权利要求94所述的方法,其中步骤(a)和(b)同时进行。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的方法,其中所述胆固醇依赖性细胞溶素是产气荚膜梭菌溶血素O(PFO)。
98.根据权利要求97所述的方法,其中所述PFO包含如SEQ ID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列。
99.根据权利要求97所述的方法,其中所述PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其459位氨基酸处由半胱氨酸替换为丙氨酸。
100.根据权利要求97所述的方法,其中所述PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列,其319位氨基酸处由苏氨酸替换为半胱氨酸,并且334位氨基酸处由缬氨酸替换为半胱氨酸。
101.根据权利要求99或100所述的方法,其中所述氨基酸序列还在434位氨基酸处包含天冬氨酸至丝氨酸的替换。
102.方法,其包括:
使包含从对象得到之细胞的制备物与胆固醇依赖性细胞溶素相接触;以及
测定所述制备物中分子的水平,其中所述分子的水平指示所述细胞中呼吸链缺陷的存在与否。
103.根据权利要求102所述的方法,其中所述细胞中所述呼吸链缺陷的存在指示所述对象患有线粒体疾病。
104.根据权利要求103所述的方法,其中所述线粒体疾病选自:肌阵挛癫痫伴破碎红纤维(MERRF);线粒体肌病、脑病、高乳酸血症和卒中(MELAS);糖尿病和耳聋(DAD);母体遗传糖尿病和耳聋(MIDD);莱伯遗传性视神经病(LHON);慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO);利氏病;卡恩斯-赛尔综合症(KSS);弗里德赖希共济失调(FRDA);辅酶QIO(Co-QIO)缺陷;神经病、共济失调、色素性视网膜炎及上睑下垂(NARP);肌神经源性胃肠性脑病(MNGIE);复合物I缺陷;复合物II缺陷;复合物III缺陷;复合物IV缺陷;复合物V缺陷;其他线粒体疾病;以及影响线粒体功能的其他肌病。
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