CN111607632A - 一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法 - Google Patents

一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，具体涉及生物医学技术领域，包括如下步骤：根据标本配制介质；心肌的透化制备，以及心肌细胞的透化制备；利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递；利用呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试；利用呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析；对分析的数据进行采集与分析，得到心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定。本发明提供的测定方法，不需要提取线粒体，只需分离少量的肌肉组织，通过透化操作和底物抑制剂滴定分析即可实现最大程度接近线粒体的生理状态的功能评估。

Description

一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法。
背景技术
目前，线粒体功能与疾病是当前生物医学领域最前沿之一。线粒体普遍存在于真核细胞，是进行能量转化的主要细胞器，也是细胞凋亡调控和活性氧产生的重要部位。线粒体功能障碍特别是氧化磷酸化缺陷将导致一系列临床表现多样性疾病即线粒体疾病。1962年Luft等报道了因线粒体电子传递和ATP合成之间耦联松散导致代谢亢进的病例，第一次将线粒体功能与人类疾病联系在一起。随后，在多种脑肌病患者中发现呼吸链功能缺陷和线粒体形态畸变。1995年Bourgeron等报道了第一例因核基因编码的氧化磷酸化亚单位基因突变导致Leigh综合征(Leigh syndrome，LS)及复合物II缺陷病例。
线粒体呼吸链酶学分析对于诊断线粒体疾病和研究细胞能量代谢、细胞凋亡机制都是至关重要的。但由于需要新鲜足量的标本和复杂的实验室技术支持，国内尚未建立起临床实用的呼吸链复合物酶活性测定方法，以Leigh综合征为例，由于缺乏线粒体呼吸链酶活性分析方法，迄今国内仅30.8％的患者获得生化和基因诊断，多数病因不明。鉴于此，检测线粒体呼吸链功能方法的建立对于诊断线粒体疾病是必要的，其中，线粒体呼吸链酶复合物活性分析是关键技术。
传统的评价线粒体功能的方法是通过提取分离，测定单个呼吸链线粒体酶活性。单个呼吸链线粒体酶的活性测定广泛应用于评价线粒体功能和功能障碍。但由于这种方法不能揭示复合酶如何相互作用，因而不能预测线粒体损伤。氧化磷酸化必须在未受损的线粒体中，通过测量线粒体的耗氧量实现。线粒体分离的过程建立在对组织或细胞的不同离心作用上，这种操作导致了对线粒体功能性质的体外设计。尽管该法有很多优点，如评价线粒体功能的完整性、氧化磷酸化能力和线粒体蛋白的输入等，该法也有一些缺点：
线粒体性质容易受到分离步骤的影响，该效应在病理损伤的线粒体中表现更为显著；容易导致对某一特种线粒体群的优先选择，肿胀的线粒体密度下降，导致离心时可能优选未受损伤的线粒体，而病理线粒体相比最初的标本含量可能会明显下降；需要大量细胞(200×106个)或组织(湿重500mg以上)，以分离出高质量的线粒体；在分离的线粒体中，正常线粒体的相互作用受到破坏，据报道，这些反应对于代谢通道、内部能量转换等至关重要。正因如此，线粒体功能的体内和体外表现才大相径庭；另外会损伤生理线粒体、影响线粒体呼吸系统的装配结果和细胞器内外相互作用等，造成极大的人为误差。
发明内容
本发明针对上述问题，一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，包括如下步骤：
S1，根据标本配制介质；
S2，心肌的透化制备，以及心肌细胞的透化制备；
S3，利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递；
S4，利用呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试；
S5，利用呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析；
S6，对分析的数据进行采集与分析，得到心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定。
其中，所述介质包括：
活检保存液：BIOPS溶液；
透化试剂：皂苷、皂苷透化液；
呼吸介质：MIR06；
底物：ADP、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸、TMPD和抗坏血酸盐；
复合物抑制剂：鱼藤酮、抗霉素A、苍术苷复合物抑制剂；
测试介质：细胞色素C。
其中，心肌透化制备,包括：
S21，获取心肌并去除所有脂肪和结缔组织，将所述心肌分离成肌条，浸泡在BIOPS溶液中；
S22，对浸在BIOPS溶液的肌条进行分离，获取肌纤维束；
S23，将肌纤维束转移到含有BIOPS溶液的透化试剂中，在0℃至4℃条件下温和混匀10-30分钟；
S24,将混匀后的肌纤维转移到含有线粒体呼吸介质中，温和震荡5分钟，洗去皂苷和ATP，洗掉皂苷和其他代谢物后称量肌纤维束的湿重；
S25，在高分辨率呼吸测定仪反应仓中加入呼吸介质2.1ml，在37℃条件下与空气平衡；
S26，将透化并称重后的肌纤维束加到所述反应仓中。
其中，心肌细胞的透化制备，包括：
获取心肌细胞；
用胰蛋白酶清洗所述细胞，离心；
计算细胞密度，测试细胞活性；
利用MIR06清洗所述心肌细胞，离心，将细胞在呼吸介质中再混悬；
在高分辨率呼吸测定仪反应仓加入呼吸介质1ml至3ml，在36℃至38℃条件下与空气平衡；
将所述细胞混悬液加入到所述反应仓中进行稀释，系统平衡4至6分钟；
对稀释后的细胞混悬液加入洋地黄皂苷digitonin，进行培养，使呼吸速率降低5-7分钟。
其中，对线粒体复合物的逐步分析，包括：
分别加入10mM谷氨酸和5mM苹果酸各5μL，记录静止的复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ支持的呼吸；
加入10μM细胞色素C1μL，保证线粒体的呼吸强度；
加入0.5M的ADP 10μL，获得复合物Ⅰ最大呼吸速率；
加入10mM琥珀酸20μL，获得复合物Ⅰ+Ⅱ的呼吸速率；
加入0.5μM鱼藤酮复合物Ⅰ的抑制剂1μL，获得复合物Ⅱ的呼吸速率；
加入2.5μM抗霉素A复合物Ⅲ的抑制剂1μL；
分别加入0.5mM的TMPD和2mM抗坏血酸盐各5μL，激活复合物Ⅳ。
其中，所述心肌分离出的肌条长2mm-5mm，直径1mm，湿重2mg-5mg。
其中，所述获取的心肌细胞为(5-10)×106个。
其中，所述胰蛋白酶清洗在36℃-38℃下进行，时间为4-6分钟，所述胰蛋白酶的浓度为0.5％。
本发明的优点：
本发明提供了一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，与传统线粒体呼吸链复合物活性对比，传统线粒体呼吸链复合物活性常在体外分离线粒体后再检测其功能，然而，线粒体的重要性质在体内和体外的表现是不同的。近年来随着高分辨率呼吸仪的出现，国外体外线粒体检测方法有了很大的改进，但仍停留在实验室水平。
本发明应用高分辨率呼吸测定仪通过原位法检测心肌、培养心肌、心肌细胞的线粒体呼吸功能，本发明不需要分离细胞器、只需应用洋地黄毒苷或皂苷等透化剂对标本进行选择性的透化后，再运行设计的底物-抑制剂滴定方法便可实现对几种线粒体复合物的逐步分析。本发明可保留在细胞内原位置和装配条件下的线粒体功能特征，保留与其他细胞器的交互作用。
由于仅需少量组织，且所有透化过程和特别的滴定分析可在2小时内完成，该方案可期待用于人类活检样品的氧化磷酸化研究和临床病理诊断，为人类线粒体病理和生理学临床诊断和研究提供科学依据。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明的数据采集与分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
Skulachev将线粒体呼吸分为5种状态，评价线粒体呼吸功能更多地注重于呼吸态V3和V4，由此可以计算出RCR，RCR是指ADP控制下的氧消耗速率与不受ADP控制的氧消耗速率的比值，它是反映线粒体结构完整性及氧化磷酸化耦联程度的灵敏指标，它的下降表示线粒体氧化磷酸化能量生成耦联松弛，是代表线粒体呼吸功能较好的指标。磷氧比(P/O)指当一对电子通过呼吸链传至氧所产生的ATP分子数，它反映了线粒体利用氧化释放的能量来合成ATP的效率，是衡量氧化磷酸化效率的指标。
本方法应用于课题组的实验研究《不同运动预适应方案对力竭大鼠心肌线粒体生物发生、融合分裂及呼吸功能的影响》，将SD大鼠左心室心肌标本取材处理后，应用高分辨呼吸仪(Oxygraph-2k)测定线粒体呼吸链复合物I、II、IV的呼吸速率，线粒体呼吸系统复合物I为NADH-辅酶Q还原酶，线粒体呼吸系统复合物II为琥珀酸琥珀酸-辅酶Q还原酶,线粒体呼吸系统复合物IV为细胞色素氧化酶。
本发明只需分离1mg-3mg肌肉组织，通过透化操作和底物抑制剂滴定分析即可实现最大程度接近线粒体的生理状态的功能评估。
参考图1，一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，包括如下步骤：
S1，根据标本配制介质，包括①活检保存液BIOPS溶液②透化试剂皂苷、皂苷(saponin)溶液③呼吸介质MIR06④底物ADP、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸、TMPD和抗坏血酸盐⑤鱼藤酮、抗霉素A、苍术苷等复合物抑制剂⑦细胞色素C测试介质。
S2，心肌的透化制备、心肌细胞的透化制备；
心肌的透化制备包括以下步骤：
S21，杀死大鼠，迅速取出心肌，放在含有0℃的分离介质的培养皿中；
S22，去除所有脂肪和结缔组织，用手术剪和手术镊将心肌分离成长2mm-5mm，直径1mm，湿重2mg-5mg的肌条，浸泡在分离介质BIOPS溶液中；
S23，在解剖镜下，用手术镊分离浸在BIOPS溶液的肌条，以形成薄的肌纤维束，在分离过程中，避免机械损伤肌纤维；
S24，将肌纤维束转移到含有2ml的BIOPS溶液的小试管，在4℃条件下用涡旋振荡器温和混匀20分钟；
S25，将透化后的纤维转移到含有线粒体呼吸介质MIR06中，温和震荡5分钟，洗去皂苷和ATP；
S26，重复S25操作2-3次，彻底清洗掉皂苷和其他代谢物后称量肌纤维的湿重；
S27,在高分辨率呼吸测定仪反应仓中加入MIR06呼吸介质2.1ml，在37℃条件下与空气平衡；
S28,用镊子将透化并称重后的纤维束2mg-5mg加到高分辨率呼吸测定仪反应仓中。
心肌细胞的透化制备包括以下步骤：
实验前2-3天，在37℃、7％CO2标准生长介质(添加了10％胎牛血清)中种植心肌细胞系H9C2，以得到(5-10)×106个心肌细胞；
在37℃，用0.5％胰蛋白酶清洗细胞5分钟，24℃-25℃,200g离心5分钟；
用细胞计数计算细胞密度，应用苔盼兰测试细胞活性；
用呼吸介质MIR06清洗，然后24℃-25℃,200g离心5分钟，将细胞在5ml呼吸介质MIR06中再混悬；
在反应仓加入2ml呼吸介质MIR06，在37℃条件下与空气平衡；
加入浓度为(10-20)×106个/ml的细胞混悬液到反应仓，使细胞浓度最终达到(1-4)×106个/ml，系统平衡5分钟；
用25μL注射器，加入洋地黄皂苷(digitonion)培养5分钟，加入后，呼吸速率降低5-7分钟，可以打开细胞膜，表明细胞膜的透化，使底物进入细胞液和细胞器；
现在细胞可用于底物抑制剂滴定分析和细胞色素C实验。
S3，利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递，细胞色素C是线粒体内膜的结合松弛的膜周边蛋白；当线粒体外膜完整时，内源性细胞色素C处于细胞内膜，外源性的细胞色素C对呼吸没有影响，而当线粒体外膜损伤时，内源性细胞色素C在生理离子强度的影响下从内膜流失，使呼吸受到抑制，当加入饱和浓度的细胞色素C后，其导致的ADP激发的最大呼吸会得到重塑。
S4，以呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试，用于对照组的质量控制，一般根据组织的不同，RCR可在6-10，当这一重要的功能参数在此范围内时表明呼吸和磷酸化耦合，能够用于对照组的质量控制。
S5，呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析，包括以下步骤；
分别加入10mM谷氨酸和5mM苹果酸各5μL，记录静止的复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ支持的呼吸，不加入ADP；
加入10μM细胞色素C1μL，保证线粒体的呼吸强度；
加入0.5M的ADP 10μL，为复合物Ⅰ最大呼吸速率；
加入10mM琥珀酸20μL，为复合物Ⅰ+Ⅱ的呼吸速率；
加入0.5μM鱼藤酮1μL，(复合物1的特别抑制剂)，为复合物Ⅱ的呼吸速率(注意：鱼藤酮剧毒！)；
加入2.5μM抗霉素A1μL(复合物Ⅲ的特别抑制剂)；
分别加入0.5mM的TMPD和2mM抗坏血酸盐各5μL，激活复合物Ⅳ，呼吸速率应该明显高于加入谷氨酸苹果酸或琥珀酸。
S6，应用Datlab软件对数据进行采集与分析，呼吸速率以每毫克肌纤维干重、每毫克组织湿重或每106个细胞计算，大鼠心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定(湿重2.8mg，37℃；底物解偶联抑制剂滴定方案中的氧流量(pmolO2·s-1·mg-1湿重)和底物控制状态顺序)。
本发明提供了一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，与传统线粒体呼吸链复合物活性相比，传统线粒体呼吸链复合物活性常在体外分离线粒体后再检测其功能，然而，线粒体的重要性质在体内和体外的表现是不同的。
本发明拟应用高分辨率呼吸测定仪通过原位法检测大鼠心肌、培养心肌细胞的线粒体呼吸功能，本发明不需要分离细胞器、只需应用洋地黄毒苷或皂苷等透化剂对标本进行选择性的透化后，再运行设计的底物-抑制剂滴定方法便可实现对几种线粒体复合物的逐步分析。本发明可保留在细胞内原位置和装配条件下的线粒体功能特征，保留与其他细胞器的交互作用。
以Leigh综合征为例，由于缺乏线粒体呼吸链酶活性分析方法，迄今国内仅30.8％的患者获得生化和基因诊断，多数病因不明，本发明由于仅需少量组织，且所有透化过程和特别的滴定分析可在2小时内完成，该方案可期待用于人类活检样品的氧化磷酸化研究和临床病理诊断，为人类线粒体病理和生理学临床诊断和研究提供科学依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，根据标本配制介质；
S2，心肌的透化制备，以及心肌细胞的透化制备；
S3，利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递；
S4，利用呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试；
S5，利用呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析；
S6，对分析的数据进行采集与分析，得到心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定。
2.根据权利要求1所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法,其特征在于，所述介质包括：
活检保存液：BIOPS溶液；
透化试剂：皂苷、皂苷透化液；
呼吸介质：MIR06；
底物：ADP、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸、TMPD和抗坏血酸盐；
复合物抑制剂：鱼藤酮、抗霉素A、苍术苷复合物抑制剂；
测试介质：细胞色素C。
3.根据权利要求2所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，心肌透化制备,包括：
S21，获取心肌并去除所有脂肪和结缔组织，将所述心肌分离成肌条，浸泡在BIOPS溶液中；
S22，对浸在BIOPS溶液的肌条进行分离，获取肌纤维束；
S23，将肌纤维束转移到含有BIOPS溶液的透化试剂中，在0℃至4℃条件下温和混匀10-30分钟；
S24,将混匀后的肌纤维转移到含有线粒体呼吸介质中，温和震荡5分钟，洗去皂苷和ATP，洗掉皂苷和其他代谢物后称量肌纤维束的湿重；
S25，在高分辨率呼吸测定仪反应仓中加入呼吸介质2.1ml，在37℃条件下与空气平衡；
S26，将透化并称重后的肌纤维束加到所述反应仓中。
4.根据权利要求2所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，心肌细胞的透化制备，包括：
获取心肌细胞；
用胰蛋白酶清洗所述细胞，离心；
计算细胞密度，测试细胞活性；
利用MIR06清洗所述心肌细胞，离心，将细胞在呼吸介质中再混悬；
在高分辨率呼吸测定仪反应仓加入呼吸介质1ml至3ml，在36℃至38℃条件下与空气平衡；
将所述细胞混悬液加入到所述反应仓中进行稀释，系统平衡4至6分钟；
对稀释后的细胞混悬液加入洋地黄皂苷digitonin，进行培养，使呼吸速率降低5-7分钟。
5.根据权利要求2所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，对线粒体复合物的逐步分析，包括：
分别加入10mM谷氨酸和5mM苹果酸各5μL，记录静止的复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ支持的呼吸；
加入10μM细胞色素C1μL，保证线粒体的呼吸强度；
加入0.5M的ADP 10μL，获得复合物Ⅰ最大呼吸速率；
加入10mM琥珀酸20μL，获得复合物Ⅰ+Ⅱ的呼吸速率；
加入0.5μM鱼藤酮复合物Ⅰ的抑制剂1μL，获得复合物Ⅱ的呼吸速率；
加入2.5μM抗霉素A复合物Ⅲ的抑制剂1μL；
分别加入0.5mM的TMPD和2mM抗坏血酸盐各5μL，激活复合物Ⅳ。
6.根据权利要求3所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，所述心肌分离出的肌条长2mm-5mm，直径1mm，湿重2mg-5mg。
7.根据权利要求4所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，所述获取的心肌细胞为(5-10)×106个。
8.根据权利要求4所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，所述胰蛋白酶清洗在36℃-38℃下进行，时间为4-6分钟，所述胰蛋白酶的浓度为0.5％。
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