JP5196522B2 - 移植用膵島の評価方法 - Google Patents
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Description
従来行なわれてきた機能試験は、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに異なる膵島サンプルを配置し、3ウェルを低濃度グルコース溶液下で、残りの3ウェルを高濃度グルコース溶液下で、2時間インキュベーションし、インキュベーション中に各ウェルに放出されたインスリンの総量を測定し、低濃度グルコース群と高濃度グルコース群とのインスリン産出量の比を刺激指数(stimulation index, SI)として評価していた。
従来行なわれてきた生存性試験は、膵島を構成する細胞の生死を判定するのみであって、これらの細胞が生存していても膵島としての機能を発揮するか否かを判定するものではなかった。
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルのインスリン産生能の変化を測定し、
2) 単離された膵島サンプルの呼吸活性値を測定し、
3) 上記インスリン産生能の変化及び呼吸活性値に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価する。
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルの呼吸活性値の変化を測定し、
2) 上記呼吸活性値の変化に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価する。
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルのインスリン産生能の変化を測定する機構、
2) 単離された膵島サンプルの呼吸活性値を測定する機構、
3) 上記インスリン産生能の変化及び呼吸活性値に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価し、出力するデータ処理機構。
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルの呼吸活性値の変化を測定する機構、
2) 上記呼吸活性値の変化に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価し、出力するデータ処理機構。
膵島
「膵島」とは、別名ランゲルハンス氏島とも呼ばれる、平均約2000個の膵島細胞より構成される細胞塊である。膵島は、グルカゴンを分泌するα細胞、血糖低下作用を有するインスリンを分泌するβ細胞、ソマトスタチンを分泌するδ細胞および膵ポリペプチドを分泌するPP細胞の4種の細胞からなる。膵島移植は、この膵島のみを取り出して、局所麻酔下に肝臓内の血管である門脈に注入することにより、インスリン依存性の一型糖尿病の治療法として、インスリン産生β細胞の移植を目的として行なわれる。
本発明にかかる「移植用膵島」とは、一型糖尿病の治療を目的として、ヒトを含む哺乳動物への移植のために、生体又は死体から単離された膵島をいう。「移植用膵島」は、所定の目的を達成するために、移植した際に一型糖尿病の病的状態を回復するのに十分な生存性(Viability)と機能(Function)を有することが必要である。
本発明で膵島の「移植適応性」とは、膵島移植の成果(成績)であって、移植された膵島の生着が生体内で十分に得られる状態を指している。あくまで目安ではあるが、具体的には、ヒト臨床においては一度目の膵島移植で空腹時血中C-peptideが0.3ng/mL以上、外因性インスリン投与量が移植前の3分の2以下を示し、二度目の移植においては外因性インスリン投与量が移植前の3分の1以下を示し、三度目の移植においては外因性インスリン投与量が一桁、あるいは必要なくなる状態を意味する。なお、動物実験モデルにおいては十分量の膵島グラフトを準備することが可能であるため、糖尿病動物モデルの糖尿病よりの治癒をもって移植適応性を判断し得る。
本発明では、単離された膵島サンプルの「機能=グルコース応答性インスリン産生能」と「生存性=呼吸活性」を統括的に評価することにより、膵島の移植適応性を判断する。ここで、グルコース応答性インスリン産生能と呼吸活性は別々に測定して、その結果を統括的に評価してもよいし、同一の試験で同時に評価してもよい。すなわち、「グルコース応答性インスリン産生能と呼吸活性を統括的に評価する」とは、グルコース応答性インスリン産生能の測定と呼吸活性の測定を別個に行ない、その結果を組み合わせて評価することのほか、グルコース応答性インスリン産生能と呼吸活性を同時に評価できる試験を行い、その結果から評価することの両方を包含する。したがって、発明者らが開発した呼吸活性SIのように、機能(グルコース応答性インスリン産生能)と生存性(呼吸活性)の両方を反映した測定もまた、グルコース応答性インスリン産生能と呼吸活性の統括的評価に含まれる。
本発明において、膵島の「グルコース応答性インスリン産生能」とは、グルコース濃度変化に応答した膵島細胞からのインスリン分泌であって、従来公知の糖負荷試験や、発明者らが開発した新型糖負荷試験などによって評価できる。特に、サンプルの均一性と測定値の正確性が担保されている新型糖負荷試験によって測定した刺激指数を用いて評価することが好ましい。
本発明で用いられる「刺激指数(SI=Stimulation Index)は、単離された移植膵島の機能(Function)を評価する指標であって、刺激=糖負荷(グルコース濃度変化)に対する膵島の応答(インスリン分泌)として評価される。
本発明にかかる「呼吸活性値」は、膵島サンプルの酸素消費量を示す値であって、移植膵島の生存性(Viability)を評価する指標である。次項では、呼吸活性値を膵島細胞表面の局所酸素濃度変化量として測定する方法について詳述する。
本発明にかかる「呼吸活性の刺激指数(呼吸活性SI)」は、糖負荷に応答した呼吸活性値の変化であって、そのSIは次式のように定義される:
本発明では、膵島の「機能=グルコース応答性インスリン産生能」と「生存性=呼吸活性」を統括的に評価することで、より正確に膵島の移植適応性を判断する。
(1)新型糖負荷試験(New SGS test)と呼吸活性測定を組み合わせて膵島の移植適応性を評価する方法
(2)呼吸活性SIにより膵島の移植適応性を評価する方法
について、具体的に説明する。
新型糖負荷試験(New SGS test)
「新型糖負荷試験」は、発明者らが開発した、移植用膵島の機能試験である。本試験では、従来法で問題となっていたサンプルの不均一性の問題を改善するため、同一の膵島サンプルについて、異なるグルコース濃度に対するインスリン産生能の変化を測定する。また、膵島が試験チューブに移動する過程における様々な環境変化によるインスリンベースライン値上昇の影響を排除するため、膵島機能に影響を与えない範囲での十分な洗浄の後に測定を行う。
「呼吸活性値」は、膵島の酸素消費量であり細胞の生存性の指標となる。たとえば、発明者らが開発した走査型電気化学顕微鏡を用いる方法により、膵島細胞表面に形成される局所的酸素濃度勾配から膵島の酸素消費量を測定することができる。この方法は、測定に要する時間が非常に短く、1サンプルあたり1〜2分程度で測定することができる。さらに、感度が非常に高く、無侵襲的計測であるため、膵島細胞生存性を正確に判定できるという利点もある。
上記のようにして求めたインスリン産生の刺激指数(SI)と呼吸活性値から、膵島の移植適応性を判断する。
呼吸活性SI
「呼吸活性SI(呼吸活性の刺激指数)」の測定は、発明者らが開発した手法であって、呼吸状態を通して細胞の生存性をみるとともに、糖負荷に応答した細胞の代謝上昇(呼吸活性も上昇)を評価することにより、膵島の機能と生存性の両方を評価する手法である。
上記のようにして求めた呼吸活性SIから、膵島の移植適応性を判断する。
本発明はまた、上記の評価方法を実施するためのシステムも提供する。前記システムは、単離された膵島について、そのインスリン産生能と呼吸活性を評価するための測定機構と、得られたインスリン産生能と呼吸活性値から前記膵島の移植適応性を判断する機構を有する。
新型糖負荷試験と呼吸活性測定により膵島の移植適応性を評価するためのシステムは、
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルのインスリン産生能の変化を測定する機構と、2) 単離された膵島サンプルの呼吸活性値を測定する機構と、3) 上記インスリン産生能の変化及び呼吸活性値に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価し、出力するデータ処理機構を有する。
呼吸活性SIにより膵島の移植適応性を評価するためのシステムは、1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルの呼吸活性値の変化を測定する機構、2) 上記呼吸活性値の変化に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価し、出力するデータ処理機構を有する。
本発明の評価方法を用いることにより、移植適応性に優れた膵島を選択し、膵島移植の成功率を向上させることができる。本発明の方法で移植適応性ありと判断された膵島は、その機能と生存性の両面において優れ、移植後の高い生着率と機能性が期待される。
1.新型糖負荷試験
試験方法
「新型糖負荷試験」は、発明者らが開発した、移植用膵島の機能試験である。本試験では、従来法で問題となっていたサンプルの不均一性の問題を改善するため、同一の膵島サンプルについて、異なるグルコース濃度に対するインスリン産生能の変化を測定する。また、膵島が試験チューブに移動する過程における様々な環境変化によるインスリンベースライン値上昇の影響を排除するため、膵島機能に影響を与えない範囲での十分な洗浄の後に測定を行う。具体的には、測定容器として、従来のマイクロプレートではなく、膵島を透見できるポリスチレン性の至適サイズを有するプラスチックチューブを用いる。プラスチックチューブは、溶液の交換が容易であり、かつ、最小溶液量での検出が可能となり、さらに可視的に膵島の存在を確認することができることから、膵島の吸い込みを確実に阻止することが可能であり、同一膵島のグルコース濃度に対する反応性の変化を容易かつ迅速に検出することができる。測定対象である膵島サンプルは、その大きさが統一されていることが望ましいが、本試験は同一膵島がグルコース応答性に産生するインスリン量の比を検出しているために、各試験において大きく異なることがなければ、他の機能試験のように膵島の大きさを厳密に同一化する必要はない。試験手順の詳細は以下の通りである。
2) ポリスチレン性プラスチックチューブに2mlのラインをつける。
3) チューブに1.5mlの低濃度グルコース溶液を入れ、37℃のウォーターバスの中で10分間インキュベートする。使用する低濃度グルコース溶液、高濃度グルコース溶液も一緒に温めておく。
4) 20個の膵島をピックアップし、プラスチックチューブ入れ、37℃で5分間、22rpmで動かしながらインキュベートする。その後37℃で5分間静置する。
5) 各チューブから1.2mlずつ低濃度グルコース溶液を吸引し、新しい低濃度グルコース溶液を1.2ml追加する(膵島を吸引しないよう注意)。その後37℃で5分間、22rpmでインキュベート、37℃で5分間静置させる。
6) 上記5)をもう1度繰り返す。
7) 各チューブから1.3ml廃液し、低濃度グルコース溶液を1.8ml追加する。
8) 37℃で30分間、22rpmでインキュベートする。その後37℃で5分間、静置させる。
9) プラスチックチューブから膵島を吸わないよう気をつけながら1.5mlのサンプルを採取し、エッペンドルフチューブに移す。採取したサンプルはすぐに氷上に配置する。
10) 1本のチューブには引き続き低濃度グルコース溶液、3本のチューブには高濃度グルコース溶液を1.5mlずつ追加する。
11) 37℃で30分間、22rpmでインキュベートする。その後、37℃で5分間静置させる。
12) 各プラスチックチューブから1.5mlのサンプルを採取する。
13) 採取したサンプルは3800rpmで5分間遠心する。遠心後、各チューブから1mlずつサンプルを採取する。
14) サンプルは−80℃の冷凍庫で保存し、後日ELISAを行い、低濃度グルコース溶液と高濃度グルコース溶液におけるインスリン含有量の値の比を算出する。
移植成績と上記膵島機能試験の相関はr=0.57、p=0.0006であり、有意な相関を認めた。治癒群におけるグルコース応答性インスリンS.IのMean±SEMは7.05±1.86であり、非治癒群におけるグルコース応答性インスリンS.IのMean±SEMは1.31±0.17であった。グルコース応答性インスリンS.Iが1.7以上のケースにおいては、14例中11例(78.6%)で治癒を認めた。
試験方法
8週齢の雄性Lewis ratよりType V collagenase (1mg/1mL:SIGMA)を使用し膵島を分離した。分離後、10%ウシ血清入りRPMI溶液で12時間培養し、その後、膵島に各々0(n=7)、40(n=6)、50(n=6)、60(n=7)、80(n=7)秒のheat shockを加え、様々なアポトーシス状態を引き起こした。その上で、各群より無作為に直径約200umの膵島を10個サンプリングし、 走査型電気化学顕微鏡により各々の呼吸活性値を測定した。多検体測定プレート内にマウス胚用HTF培地の一部組成を改変した測定溶液を5 ml入れ、プレート底部に施したマイクロウェル内に膵島を導入した後、それぞれウェル底部の中心に静置した。マイクロ電極は酸素が還元可能な-0.6V vs. Ag/AgClに電位を保持し、微小電極を膵島直近に手動で移動した後、移動速度30 μm/sec、走査距離160 μmの条件で膵島近傍を鉛直方向にコンピューター制御により走査した。1回の測定につき3回微小電極を走査した後、膵島の酸素消費量は球面拡散理論式に基づき専用の解析ソフトで算出した。様々なアポトーシス状態を引き起こした各群の膵島は、それぞれ同種同系の雄性Lewis ratへ7 IEQs/g(レシピエント体重)で経門脈的に移植され、移植成績と上記膵島生存性試験の相関を検討した。
移植成績と上記膵島生存性試験の相関はr=0.72、p<0.0001であり、有意な相関を認めた。治癒群における膵島グラフトの呼吸活性値のMean±SEMは5.44±0.24であり、非治癒群における膵島グラフトの呼吸活性値のMean±SEMは2.08±0.44であった。膵島グラフトの呼吸活性値が4.5以上のケースにおいては、14例中12例(85.7%)で治癒を認めた。
8週齢の雄性Lewis ratを使用した同種同系膵島移植実験における移植成績の評価は、移植2週間後に糖尿病が治癒しているかどうかをもって判定した。糖尿病の治癒の判定は、随時血糖値が200mg/dL以下となっていることをもって治癒と判定した。
試験方法
「呼吸活性SI(呼吸活性の刺激指数)」の測定は、呼吸状態を通して細胞の生存性をみるとともに、糖負荷に応答した細胞の代謝上昇(呼吸活性も上昇)を評価することにより、膵島の機能と生存性の両方を評価する手法である。この方法では、新型糖負荷試験に従い、同一膵島サンプル低濃度グルコース含有溶液中での呼吸活性値と高濃度グルコース含有溶液中での呼吸活性値を求める。次いでその比より呼吸活性SIを求める。呼吸活性値は、走査型電気化学顕微鏡を用いて膵島近傍に形成される酸素濃度勾配を電気化学的に測定し、球面拡散理論式に基づき算出した。この方法は、測定に要するサンプルが少なく、高精度な結果が得られるという利点に加えて、1つの試験で機能と生存性の2つのファクターを同時評価できるという利点も有する。
移植成績と上記膵島呼吸活性SIの相関はr=0.75、p<0.0001であり、有意な相関を認めた。治癒群における膵島グラフトの呼吸活性SIのMean±SEMは1.92±0.19であり、非治癒群における膵島グラフトの呼吸活性SIのMean±SEMは0.65±0.10であった。膵島グラフトの呼吸活性SIが1.5以上のケースにおいては、11例中10例(90.9%)で治癒を認めた。
Claims (8)
- 単離された膵島サンプルについて、そのグルコース応答性インスリン産生能と呼吸活性値を統括的に評価することにより、前記膵島の移植適応性を評価することを特徴とする、移植用膵島の評価方法であって、
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルのインスリン産生能の変化を測定する工程、
2) 単離された膵島サンプルの呼吸活性値を測定する工程、
3) 上記インスリン産生能の変化及び呼吸活性値に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価する工程
を含み、
前記グルコース応答性インスリン産生能の変化が、次式で示されるインスリン産生の刺激指数(Stimulation Index:SI)によって評価されるものであり、
(式中、低濃度グルコース含有溶液は1〜5.5mMの濃度であり、高濃度グルコース含有溶液は16.7〜25mMの濃度である)
前記グルコース応答性インスリン産生のSIが1.7以上、かつ、呼吸活性値が4.5×1014/mol・s-1以上の場合に上記膵島は移植適応性ありと判断する、前記評価方法。 - 下記工程を含む、請求項1に記載の方法:
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルの呼吸活性値の変化を測定し、
2) 上記呼吸活性値の変化に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価する。 - 上記呼吸活性値の変化が、次式で示される呼吸活性の刺激指数(SI)である、請求項2に記載の評価方法:
(式中、低濃度グルコース含有溶液は1〜5.5mMの濃度であり、高濃度グルコース含有溶液は16.7〜25mMの濃度である)。 - 上記呼吸活性SIが1.5以上の場合に、上記膵島は移植適応性ありと判断する、請求項3に記載の評価方法。
- 上記呼吸活性値が、膵島細胞表面の局所酸素濃度変化量である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の移植用膵島の評価方法。
- 単離された膵島について、そのグルコース応答性インスリン産生能と呼吸活性値を評価するための測定機構と、得られたグルコース応答性インスリン産生能と呼吸活性値から前記膵島の移植適応性を判断する機構を有する、移植用膵島の評価用システムであって、
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルのインスリン産生能の変化を測定する機構、
2) 単離された膵島サンプルの呼吸活性値を測定する機構、
3) 上記インスリン産生能の変化及び呼吸活性値に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価し、出力するデータ処理機構
を有し、
前記データ処理機構は、前記グルコース応答性インスリン産生能の変化を、次式で示されるインスリン産生の刺激指数(Stimulation Index:SI)によって評価し、
(式中、低濃度グルコース含有溶液は1〜5.5mMの濃度であり、高濃度グルコース含有溶液は16.7〜25mMの濃度である)
前記グルコース応答性インスリン産生のSIが1.7以上、かつ、呼吸活性値が4.5×1014/mol・s-1以上の場合に上記膵島は移植適応性ありと判断する、前記システム。 - 下記の機構を有する請求項6に記載のシステム:
1) 単離された膵島サンプルについて、グルコース濃度変化に対する同一膵島サンプルの呼吸活性値の変化を測定する機構、
2) 上記呼吸活性値の変化に基づき、単離された膵島の移植適応性を評価し、出力するデータ処理機構。 - 上記呼吸活性値を測定する機構が、走査型電気化学顕微鏡を有する局所酸素濃度変化量の測定機構である、請求項6または7に記載のシステム。
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