JP2014223061A - 肝細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】酸素透過性の基板上で肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法であって、酸素濃度が4%以上12.5%以下である低酸素濃度中で肝細胞を培養することを特徴とする、方法。
【選択図】図1
Description
また本発明者らは、ガス透過性膜上で肝細胞を培養することにより、薬物輸送機能をもった肝組織を効率よく作製できることを報告している(特許文献1、非特許文献8)。しかしながら、長期間、薬物輸送機能を維持した状態で培養することについては、改善の余地があった。つまり、長期間、薬物の取り込み・排出といった薬物輸送能の解析やそれに対する影響を調べるための高い精度を要求される創薬研究や毒性研究に使用するためには十分ではなかった。
(1)酸素透過性の基板上で肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法であって、培地中の酸素濃度が4.0%以上12.5%以下である低酸素濃度中で肝細胞を培養することを特徴とする、方法。
(2)培地中の酸素濃度が7.5%以上12.5%以下である、(1)に記載の肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法。
(3)肝細胞を低酸素濃度中で2日以上90日以下培養する、(1)または(2)に記載の肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法。
(4)肝細胞を生体マトリックスに埋包して培養する、(1)〜(3)のいずれかに記載の肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法。
(5)(1)〜(4)のいずれかに記載の方法により肝細胞を培養して毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の代謝を評価する、化合物の代謝検定方法。
(6)(1)〜(4)のいずれかに記載の方法により肝細胞を培養して毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の輸送を評価する、化合物の輸送検定方法。
なお、本発明において、肝組織とは毛細胆管を有する複数の肝細胞の集合体を指す。
安定かつ長期的に該細胞を調製することができるため、コラーゲンゲルがより好ましい。
該細胞外マトリクスゲルの作製方法は非特許文献11(LeCluyse et al., Am J Physiol Cell Physiol, 1994, vol.266, pp.1764-1774)に記載の方法で行うことができる。この場合の肝細胞を包埋する細胞外マトリクス層の厚さは栄養分や試験化合物の透過性の観点から、適宜決定することができるが、10〜100マイクロメートルが好適である。
そして、酸素濃度以外は、一般的な細胞培養と同じく、通常37℃、5%CO2の条件で培養を行う。ただし、特殊な肝細胞や条件で培養を行う場合は、公知の方法に従って温度やCO2濃度は適宜変更すればよい。培養条件を調節することによって、毛細胆管の数を調節すること等ができる。
このようにして培養を行うことにより、肝細胞に3次元的位置情報を付与し、容易に肝組織を作製することができる。
気相酸素濃度としては、5%以上14%以下が挙げられ、8.0%以上12.5%以下が好ましく、特に、10%が好ましい。
当業者であれば、この範囲内の低酸素濃度の内の好適な酸素濃度を、適宜選択して使用することができる。
例えば、肝細胞の長期間の培養が必要な場合、培地中酸素濃度として、4.0%以上12.5%以下から適宜選択することで、長期間培養時の毛細胆管の機能を簡便に測定することができる。
本発明の肝細胞の培養方法を利用可能な培養期間は、目的とする試験法に応じて、適宜設定することができるが、2日以上90日以下、好ましくは、4日以上30日以下、より好ましくは7日以上14日以下が挙げられ、特に長期間(約10日以上)でも安定して高い状態で維持できるので利用価値が高い。
低酸素濃度で培養する期間は、肝細胞を播種してから毛細胆管を形成するまですべての期間であってもよいが、全期間である必要はなく、全期間の例えば80%以上、好ましくは90%以上の期間低酸素条件であればよい。また、肝細胞を播種してから通常条件で一定期間培養して肝細胞を接着させたのち、低酸素条件に移行してもよい。
基底膜には化合物を取り込むための有機アニオン輸送体群、およびナトリウム/タウロコール酸共輸送体群が発現している。代表的なものはOATP(Organic anion transportingpolypeptide)1a1, OATP1b2, OATP1b3, OAT2, OATP4, OATP8であり、これらに特異的な抗体を用いた細胞抗体染色によって存在を確認することができる。
ルビンや抱合(間接)ビリルビンが挙げられ、更に抱合ビリルビンとしては、グルクロン酸抱合体や硫酸抱合体などが挙げられる。また、他の肝細胞で代謝され、毛細胆管中に排泄される生体成分や化合物についても同様に利用可能なことは容易に理解できる。生体成分としては、Taurocholic acid、glycocholic acid、taurochenodeoxycholic acid、glycochenodeoxycolic acid、a- and b-tauromuricholic acidなどの胆汁酸などが挙げられ、化合物としては、Cephradine、d8-taurocholic acid、Digoxin、enkepharine hydrate、iodocyanine green、Indomethacine、Ouabain、Pravastatin、Rosuvastatin、Methotrexate、Vincristine、Doxorubicinなどが挙げられる。
薬物輸送検定としては、薬物がどのくらいの量と速度で肝細胞に取り込まれ、胆汁に排出されるかどうかの検定が例示される。または、ある化合物Aが化合物Bの輸送を阻害・促進するかどうかの検定が例示される。
薬物輸送検定の方法としては、例えば、非特許文献10の方法が挙げられる。また、上述した代謝検定の方法を適宜改変して行うこともできる。
ハイスループットなスクリーニングのためには、毛細胆管を形成した肝細胞が培養されている培養部分それぞれに、試験化合物暴露させる注入口と、それぞれの区画の肝細胞で代謝され毛細胆管に排出される代謝物を回収するための口が設けられたマイクロ流路デバイスを構築することで可能となる。
上記マイクロ流路デバイスの注入口には化合物ライブラリから化合物溶液を分取し送液するポンプ、出口には代謝物を高速液体クロマトグラフィ(HPLC)や質量分析装置(LC/MSやLC/MS/MS等)や蛍光光度計等に送って代謝物の定量や組成分析結果を導く流路が接続され、これらの動作をコンピューターなどで操作するようなものが例示される。
<実施例1−1:ガス透過性膜細胞培養プレートの作製と前処理>
ガス透過性膜細胞培養プレートは、底面の空いた直径1センチの円形のウェルが24個並んでいるポリカーボネート製培養プレートに、厚さ1mm程度のポリジメチルシロキサン(PDMS)薄膜を底面に張ることで作製した。この表面を70%エタノール溶液で処理することで滅菌した。細胞培養開始日にプラズマエッチングを行いPDMS薄膜を親水化した後、酸性10%コラーゲンI(ベクトン・ディッキンソン社製)溶液で処理し、約5分後、溶液を吸い取って、室温で約30分間放置し乾燥することで、膜表面のコラーゲンコート処理とした。酸性を中和させるため、播種直前に培地で1回表面を洗浄した。
一般的なコラゲナーゼ灌流方法を用いてラットの肝臓から調製した肝細胞を、密度1.5×105 cells/cm2で実施例1−1に従い作製したガス透過性膜プレート表面全体に均一に播いた。比較(従来法)として、直径1センチの円形のウェルが24個並んでいるコラーゲンコートされたポリスチレン製培養プレート(ベクトン・ディッキンソン社製)に同様に肝細胞を播いたものを用意した。培養は37℃、5%CO2/95%空気のCO2インキュベーターを用いて行った。空気は20%O2に相当する。播種約4時間後に250μg/mlマトリゲルを含んだ播種培地を交換し、非接着肝細胞を除き、培養を継続した。播種約24時間後にマトリゲル含有培養培地に交換し、それぞれ次のような気相条件のインキュベーターに移して培養を継続した。
(条件1)20%O2:5%CO2/ 20%O2(95%空気)
(条件2)10%O2:5%CO2/ 10%O2
(条件3)5%O2:5%CO2/ 5%O2
その後24時間ごとにマトリゲル含有培養培地を交換した。
(1)5 (and 6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (CDFDA)による毛細胆管染色
実施例1−2に従って培養された肝細胞をHBSSバッファ(0.35 g/L KCl, 0.25g/L MgSO4, 0.18 g/L CaCl2, 0.16 g/L KH2PO4, 4.8 g/L HEPES, 7.9 g/L NaCl, and 0.9 g/L glucose, pH 7.4)で2回洗浄したのち、10 μmol/L CDFDAを含むHBSSで15分間、37℃でインキュベートした。4℃で冷却したHBSSバッファで2回洗浄して反応停止後、蛍光顕微鏡(励起波長:495nm、蛍光波長:530nm)で蛍光画像を取得した。
培養4日目に、(1)と同様に、培養肝細胞をCDFDAにより処理をした。非特許文献8に従って薬物排出指数として、胆汁排出指数を測定した。
培養開始4日後(ゲル重層3日後)の培養肝細胞を二つ用意した。続いて、それぞれの培養肝細胞を別々に温Ca/Mg(+) HBSS または 温Ca/Mg(-) HBSSバッファ0.5mLで2回洗浄した。続いて、それぞれの培養肝細胞を別々に温Ca/Mg(+) HBSS または 温Ca/Mg(-) HBSSバッファ0.5mL中で37℃に10分間放置したのち、液を除いた。続いて、両培養肝細胞に10 μM CDCFを含んだ温Ca/Mg(+) HBSSバッファ0.5mLを加え、10分間インキュベートののち、溶液を除去した。続いて、両培養肝細胞を0.5mLの冷Ca/Mg(+) HBSSバッファで3回洗浄し、反応を速やかに停止し、非特異的に細胞表面や基板表面に吸着したCDFを除いた。続いて、0.5% Triton X-100を含むPBS を500μL加えて、室温で30分間振とうしたのち、液を回収した。これを13000 x g, 15分、4℃で遠心して、上澄みとし、その100μLを取って、蛍光マイクロプレートリーダー(励起492nm、蛍光530nm)で計測して、CDF量を定量した。また、原液25μLをBCAプロテインアッセイキット(Thermo社製)によりタンパク量を計測した。胆汁排出インデックス(Bile Excretion Index: BEI)はタンパク量当たりの蛍光
輝度値(Accumulation)からの以下の計算式より求めた。
<実施例2−1:ガス透過性膜細胞培養プレートの作製と前処理>
ガス透過性膜細胞培養プレートは、底面の空いた直径1センチの円形のウェルが24個並んでいるポリカーボネート製培養プレートに、厚さ1mm程度のポリジメチルシロキサン(PDMS)薄膜を底面に張ることで作製した。この表面を70%エタノール溶液で処理することで滅菌した。細胞培養開始日にプラズマエッチングを行いPDMS薄膜を親水化した後、酸性10%コラーゲンI(ベクトン・ディッキンソン社製)溶液で処理し、約5分後、溶液を吸い取って、室温で約30分間放置し乾燥することで、膜表面のコラーゲンコート処理とした。酸性を中和させるため、播種直前に培地で表面を洗浄した。
一般的なコラゲナーゼ灌流方法を用いてラットの肝臓から調製した肝細胞を、密度1.5×105 cells/cm2で実施例2−1に従い作製したガス透過性膜プレート表面全体に均一に播いた。播種直後は、培養は37℃、5%CO2/95%空気のCO2インキュベーターを用いて行った。空気は20%O2に相当する。播種約4時間後に250μg/mlマトリゲルを含んだ播種培地を交換し、非接着肝細胞を除き、培養を継続した。播種約24時間後にマトリゲル含有培養培地に交換し、それぞれ次のような気相条件のインキュベーターに移して培養を継続した。(条件1)20%O2:5%CO2/ 20%O2(95%空気)
(条件2)14%O2:5%CO2/ 14%O2
(条件3)10%O2:5%CO2/ 10%O2
(条件4)8%O2:5%CO2/ 8%O2
(条件5)5%O2:5%CO2/ 5%O2
その後24時間ごとにマトリゲル含有培養培地を交換した。
従来法との比較として、組織培養プラスチック(TCPS)プレート(ベクトン・ディッキンソン社製)上に肝細胞を同数(密度1.5×105 cells/cm2)播種し、20%気相酸素濃度条件下で培養した。
ニードル型酸素濃度計(PreSens, Microx TX-3)を用いて、各気相酸素濃度条件下において、培地中の酸素濃度を60分間測定した(図4)。測定開始約60分後に平衡となった酸素濃度から、気相酸素濃度が20%, 14%, 10%, 8%, 5%の時、培地中酸素濃度はそれぞれ19%, 12.5%, 8%, 7%, 4%であることがわかった。
5 (and 6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (CDFDA)による毛細胆管染色
培養された肝細胞を、培養2日目、4日目、10日目に、HBSSバッファ(0.35 g/L KCl, 0.25g/L MgSO4, 0.18 g/L CaCl2, 0.16 g/L KH2PO4, 4.8 g/L HEPES, 7.9 g/L NaCl, and 0.9 g/L glucose, pH 7.4)で2回洗浄したのち、10 μmol/L CDFDAを含むHBSSで15分間、37℃でインキュベートした。4℃で冷却したHBSSバッファで2回洗浄して反応停止後、蛍光顕微鏡(励起波長:495nm、蛍光波長:530nm)で蛍光画像を取得した(図5)。
特に、10日目(長期間)でも、従来よりも低い酸素濃度で培養するだけで、測定可能な胆汁排出領域を維持できる意義は大きい。
Claims (6)
- 酸素透過性の基板上で肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法であって、培地中の酸素濃度が4.0%以上12.5%以下である低酸素濃度中で肝細胞を培養することを特徴とする、方法。
- 培地中の酸素濃度が7.5%以上12.5%以下である、請求項1に記載の肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法。
- 肝細胞を低酸素濃度中で2日以上90日以下培養する、請求項1または2に記載の肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法。
- 肝細胞を生体マトリックスに埋包して培養する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の肝細胞を培養して毛細胆管を形成させる方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法により肝細胞を培養して毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の代謝を評価する、化合物の代謝検定方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法により肝細胞を培養して毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の輸送を評価する、化合物の輸送検定方法。
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