JP2022549101A - カプセル化３ｄ細胞共培養における多数の生物学的プロセスを独立して分析する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、多重化及びカプセル化３Ｄ細胞共培養薬物試験又はスクリーニング方法に関する。本発明はまた、１つ以上の標的細胞型における多数の生物学的プロセスに対する１つ以上の目的の薬物の効果を試験するのに適するインビトロ薬物試験キットを開示する。【選択図】なし

Description

本発明は、多重化及びカプセル化３Ｄ細胞共培養における薬物試験又はスクリーニング方法に関する。本発明はまた、１つ以上の標的細胞型における多数の生物学的プロセスに対する１つ以上の目的の薬物の効果を試験するのに適するインビトロ薬物試験キットを開示する。

生体細胞における分子物質のインビトロスクリーニング又は試験は、新規な医薬品の開発に使用される重要な手順を構成し、更に最近では、患者を治療する最良の薬物を規定するための「精密医療」試験中にも使用される。インビトロ分子スクリーニングは、創薬の初期段階で、「ヒット」分子を同定するために使用するか、又はその後の段階で、多数の有利な特性を持つヒット分子として定義されたヒット分子から一連の「リード」物質を規定するために使用することができる。スクリーニングされる化学物質の数が多いため、インビトロ薬物試験は、時間と資源において非常にコストがかかる。これらの大規模な投資にもかかわらず、インビトロ薬物試験は、多くの理由、主に使用される細胞培養の臨床的関連性が低いことから、所望の生物学的効果を持つ優れた候補を規定するのに常に成功するとは限らない。薬物スクリーニングで使用される典型的な単層細胞培養は、３Ｄ組織生理学、細胞サブセットの多様性又はインビボで発生する多臓器の相互作用を反映しない。更に、薬物スクリーニングは通常、試験ごとに単一の実験的読み取り値又は最大２つの読み取り値を使用して実施されている。したがって、全体的な薬物開発プロファイルが最も優れている薬物を同定するには、分子の様々な特性に焦点を当てる多数ラウンドのスクリーニングが必要とされる。例えば、薬物スクリーニングは通常、標的細胞に対する生物学的活性の評価から始まり、その後、肝細胞の存在下でのみ生成される代謝物を含む、肝毒性又は神経毒性を同定するための追加のスクリーニンラウンドが続く。また、重要な生理学的相互作用がインビボで存在し、例えば、タモキシフェンのようなプロドラッグの、別の組織での、タモキシフェンの場合は乳房での活性化のための肝臓によるプロドラッグの代謝が存在する。特に、肝細胞は、多くの場合、元の薬物スクリーニングに存在せず、又は存在する場合には、他の細胞型と直接接触している可能性があり、これは、インビボ細胞生物学を反映しない。細胞型間にこれらの重要な生理学的相互作用を含まないことは、インビボで効率的な治療法を見逃すことにつながる可能性がある。したがって、潜在的な薬物候補の様々な特性及び効果を評価するための多重の試験が必要となるという現在の薬物スクリーニングの状況での問題は、細胞培養薬物試験の上記全ての現象に同時に対処できる方法の欠如である。具体的には、改良された薬物スクリーニング又は試験方法は、評価プロセスを多重化し、より生理学的に関連性のある細胞培養系を利用する能力を有するであろう。

標的ベースの薬物スクリーニングと表現型薬物スクリーニングを区別することができる。標的ベースの薬物スクリーニングアプローチは、目的の細胞に対して所望の生物学的効果を達成するために標的化することができる、特定の、多くの場合、独特な分子経路、受容体又は他の生体分子の事前の同定に依存する。例えば、（腫瘍性）乳房由来細胞のエストロゲン受容体は、内分泌療法のための実行可能な標的であることが実証されている。

実験細胞株は、エストロゲン依存性レポーターを発現するように遺伝子操作されて、この受容体に対する薬物の効果をインビトロで検出又は研究しやすくすることができる。これに対して、表現型スクリーニングは、目的の細胞に所望の生物学的効果を達成するように薬物が作用すべき正確な分子経路や細胞標的に関する事前の知識に依存しない。表現型スクリーニングでは、細胞死、細胞増殖、細胞毒性及び免疫細胞活性化などの一般的な生物学的プロセスは、これらの一般的な表現型変化に対して確立された遺伝子マーカー又はタンパク質マーカーを使用して検出することができる。表現型スクリーニングを使用して同定された薬物によって標的化された正確な分子パートナーは、この特許の範囲を超える追加の試験が実行されるまで依然として不明のままである。

インビトロ薬物スクリーニング及び試験を改良するための以前の試みは、前述の問題に部分的にしか対処しておらず、出願人の知る限りでは、前述の問題の全てに同時に対処したことがない。例えば、欧州特許第１２３５９３５Ｂ１号明細書（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ ＬＬＣ（ロゼッタ・インファーマティクス））には、「多重化」（細胞ごとに多数の）遺伝子レポーター細胞培養系を使用して、細胞の適応度に関連する標的遺伝子の機能を阻害する薬物を同定すること、つまり標的ベースの薬物スクリーニングが記載されている。異なる種類の細胞の共培養後に多数の遺伝子を検出することができるが、その文献の教示は３Ｄスフェロイド細胞培養に拡張されず、様々な種類の共培養細胞を独立して分析する機能は不可能である。

多重化表現型薬物試験も以前に公開されており（ＰＭＩＤ２０１１６８５０を参照）、細胞上清中のタンパク質の大きなパネルの薬物誘発性調節を研究する可能性を示している。再度、この薬物試験の方法論には、系の生理学的関連性を向上させるためのスフェロイドなどの３Ｄ細胞培養の使用が含まれない。更に、アッセイ読み取り値が可溶性タンパク質の値で構成されるため、生物学的プロセスがどの細胞で調節されているかを検出することはできない。

生理学的関連性が改良された細胞培養系、特に３Ｄスフェロイド培養に関連する従来の技術及び学術出版物が増えている。例えば、欧州特許第２４９１３８６Ｂ１号明細書（Ｐｌａｓｔｉｃｅｌｌ Ｌｔｄ（プラスティセル））には、カプセル材料内又はカプセル内部のいずれかで、それぞれが２つ以上のラベルで標識された複数のマイクロカプセルにおける細胞培養が記載されている。この文献には、「スプリットプール細胞」又は「組み合わせ細胞」の培養も含まれ、これらの培養は、主に、種類が同じであるが分化状態が異なる細胞が互いにどのように異なる表現型又は遺伝子型の特性、例えば異なる増殖能力、又は特定の遺伝子若しくはタンパク質の発現を有するかを規定することを目的としている。同様に、韓国特許第１０１７２６０６３Ｂ１号明細書（ＵＮＩＶ ＳＵＮＧＫＹＵＮＫＷＡＮ ＲＥＳ＆ＢＵＳ（成均館大学校リサーチアンドビジネス）［ＫＲ］）には、３Ｄ腫瘍細胞培養をカプセル化するために使用される、様々な蛍光色素によるリポソーム（カプセルのような脂質二重層）の標識が記載されている。これらの文献は、カプセルを標識するために様々な蛍光色素（量子ドット）を使用できるという点で今回の技術に類似するが、いずれも、試験ごとに多数の生物学的プロセスを検出する手段を開示しておらず、またリポソームが主に腫瘍の遺伝子診断に使用されるため、顕微鏡により様々なカプセルを容易に区別できることも開示していない。

欧州特許第１２３５９３５Ｂ１号明細書 欧州特許第２４９１３８６Ｂ１号明細書 韓国特許第１０１７２６０６３Ｂ１号明細書

ＰＭＩＤ２０１１６８５０

本発明は、インビトロ薬物試験、すなわち、新規又は以前に承認された化学的又は生物学的物質のスクリーニングを改良して、少なくとも２種の標的細胞において所望の活性を有し、有害な副作用が最も少ない治療を同定することを目的とする。これらの改良は、（１）多重組織生物をよりよく表す多数の細胞型の共培養を使用することにより翻訳関連性を向上させることと、（２）生物学的プロセス又は読み取り値の数、及び試験において独立して分析できる異なる細胞型の数を増やすことにより、試験から取得できる情報量及び情報質を向上させることと、（３）いずれもより優れた薬物候補の候補リストにおける関連する属性である時間、コスト及びインビボで実行する必要のある試験の量を削減することにより薬物試験の有効性を向上させることとを含む。本発明は、項目（１）及び（２）に記載された特徴の結果として、薬物候補の改良された選択を可能にして、その後のインビボ試験段階へより高い信頼性で進行する。

本発明は、１つ以上の細胞型における多数の生物学的プロセスを分析できる、薬物試験に適するインビトロ方法を提供することを１つの目的とし、この方法は、
同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される前記１つ以上の細胞型のそれぞれにおいて、分析される生物学的プロセスごとに少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子を発現するステップａ）と、
アルギン酸生体高分子を用いて同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される前記１つ以上の細胞型のそれぞれをカプセル化し、複数の細胞型がある場合、カプセルの全て又は１つを除く全てを異なる種類の蛍光体でそれぞれ標識するステップｂ）と、
ステップｂ）の全てのカプセル化された、同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される細胞型を、標識又は非標識アルギン酸生体高分子で任意選択にカプセル化された１つ以上の追加の非標識細胞型と任意選択に共培養するステップｃ）と、
任意選択に前記共培養を１つ以上の薬物に曝露するステップｄ）と、
試験される前記任意選択の１つ以上の薬物への曝露の前及び／又は後に、各蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子の蛍光強度又は生物発光強度を光学イメージングにより個別に分析することにより、ステップｃ）の同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される各細胞型における前記多数の生物学的プロセスの活性を測定するステップｅ）と
を含み、複数の細胞型が共培養される場合、分析される各細胞型は、分析される前記細胞型を含むアルギン酸カプセルに関連する蛍光体標識の種類に基づいて、光学イメージングにより同定される。

本発明は、１つ以上の標的細胞型における多数の生物学的プロセスに対する１つ以上の目的の薬物の効果を試験するのに適するインビトロ薬物試験キットを提供することを別の目的とし、このキットは、
前記１つ以上の標的細胞型において分析される生物学的プロセスごとに蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子を発現する１つ以上のアルギン酸カプセル化された標的細胞型を含む少なくとも１つの使用準備済のマイクロウェルプレートを含み、複数の細胞型がある場合、カプセルの全て又は１つを除く全てが異なる種類の蛍光体でそれぞれ標識される。

本発明の他の目的及び利点は、以下の例示的な図面及び添付の特許請求の範囲を参照して進められる以下の詳細な説明のレビューから当業者に明らかになるであろう。

肝癌（ＬＣ）細胞（肝細胞）と共培養された乳癌（ＢＣ）細胞におけるタモキシフェン（Ｔａｍ）対タモキシフェン代謝物（４－ヒドロキシタモキシフェン、４ＯＨＴ）によるエストロゲン受容体α（ＥＲα）の薬理学的阻害を示す。エストロゲン受容体α（ＥＲα）の制御下でルシフェラーゼを安定して発現するＢＣ細胞は、ＬＣ細胞の有無のもとで培養され、Ｔａｍ又はその代謝物の１つである４－ＯＨＴの濃度を増加させながら４８時間処理された。ＢＣ細胞は溶解され、生物発光が測定されて、ＢＣ細胞の前癌活性の読み取り値と見なすことができるＥＲα活性が測定された。グラフは、Ｌｏｇ［阻害剤濃度］の関数として、阻害剤なしのＥＲαの活性を１００％と見なしたＥＲαの活性の百分率を示す。データは、３つの独立した繰り返しを表す。 共培養における２つの異なる細胞型（ＢＣ及びＬＣ）の２つの細胞増殖状態（活発な増殖及び潜伏）の定量化を示す。二重蛍光レポーター遺伝子ＦＵＣＣＩを発現するように遺伝子操作された３Ｄカプセル化ＢＣ細胞とＬＣ細胞の共培養の増殖を示す。ＦＵＣＣＩレポーターを安定して発現するＢＣ細胞及びＬＣ細胞（増殖細胞は、緑色であり、増殖していない細胞は赤色である）は、遠赤色標識アルギン酸カプセル（ＢＣ）又は非標識アルギン酸カプセル（ＬＣ）にカプセル化された。ＢＣカプセルとＬＣカプセルは、混合されて共培養を調製し、異なる濃度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）とともに９６時間インキュベートされた。そして、細胞及びカプセルの蛍光強度は、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（モレキュラーデバイス））で測定され、ソフトウェアＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で処理されて分析された。グラフは、ＢＣ細胞又はＬＣ細胞のいずれかに対応するレポーター遺伝子の蛍光強度（任意単位）を示す。データは、３つの独立した反復を表す。 二重レポーター遺伝子ＦＵＣＣＩを発現するカプセル化ＢＣ細胞、レポーター遺伝子ｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３を発現するカプセル化ＢＣ細胞及びカプセル化ＬＣ細胞の多重培養を示す。ＬＣ細胞は、緑色標識アルギン酸カプセルにカプセル化され、二重レポーター遺伝子ＦＵＣＣＩを安定して発現するＢＣ細胞（活発な増殖細胞は緑色であり、増殖していない細胞（潜伏）は赤色である）は、非標識アルギン酸カプセルにカプセル化され、レポーター遺伝子ｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３を安定して発現するＢＣ細胞（全ての細胞は、赤色（レポーター発現対照）であり、かつアポトーシス誘導時に緑色になる）は、遠赤色標識アルギン酸カプセルにカプセル化された。カプセル化された細胞は、カバーガラス底部を備えた９６ウェルプレートで一緒に混合され、３７℃で９６時間インキュベートされた。画像取得は自動共焦点顕微鏡で実行され、画像に直接注釈が付けられた。 単一培養又はＬＣ細胞との多重培養のいずれかにおいてタモキシフェンの濃度を増加させながら処理されたＢＣ細胞アポトーシスの定量化を示す。ＬＣ細胞は、緑色標識アルギン酸カプセルにカプセル化され、二重レポーター遺伝子ＦＵＣＣＩを安定して発現するＢＣ細胞（活発な増殖細胞は緑色であり、増殖していない細胞（潜伏）は赤色である）は、非標識アルギン酸カプセルにカプセル化され、レポーター遺伝子ｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３を安定して発現するＢＣ細胞（全ての細胞は、赤色（レポーター発現対照）であり、かつアポトーシス誘導時に緑色になる）は、遠赤色標識アルギン酸カプセルにカプセル化された。カプセル化された細胞は、カバーガラス底部を備えた９６ウェルプレートでＬＣ細胞あり（多重培養）又はなし（単一培養）で一緒に混合され、マイクロモル範囲のタモキシフェン濃度を増加させながら処理されるか又は処理されず、３７℃で９６時間インキュベートされた。画像取得は自動共焦点顕微鏡で実行された。細胞セグメンテーションと細胞蛍光強度の定量化は、ソフトウェアＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で実行された。アポトーシスの定量化のために、遠赤色標識カプセルからの細胞蛍光強度が測定され、緑色蛍光は赤色蛍光で正規化された。グラフは、タモキシフェンの濃度を増加させながら処理したときのｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３レポーター遺伝子の正規化された蛍光強度を示す。データは、３つの独立した反復を表す。 単一培養又はＬＣ細胞との多重培養のいずれかの中にタモキシフェンの濃度を増加させながら処理されたＢＣ細胞増殖の定量化を示す。ＬＣ細胞は、緑色標識アルギン酸カプセルにカプセル化され、二重レポーター遺伝子ＦＵＣＣＩを安定して発現するＢＣ細胞（活発な増殖細胞は緑色であり、増殖していない細胞（潜伏）は赤色である）は、非標識アルギン酸カプセルにカプセル化され、レポーター遺伝子ｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３を安定して発現するＢＣ細胞（全ての細胞は、赤色（レポータ発現対照）であり、かつアポトーシス誘導時に緑色になる）は、遠赤色標識アルギン酸カプセルにカプセル化された。カプセル化された細胞は、カバーガラス底部を備えた９６ウェルプレートでＬＣ細胞あり（多重培養）又はなし（単一培養）で一緒に混合され、マイクロモル範囲のタモキシフェンの濃度を増加させながら処理されるか又は処理されず、３７℃で９６時間インキュベートされた。画像取得は自動共焦点顕微鏡で実行された。細胞セグメンテーションと細胞蛍光強度の定量化は、ソフトウェアＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で実行された。増殖の定量化のために、非標識カプセルからの細胞蛍光強度が測定された。グラフは、タモキシフェンの濃度を増加させながら処理されたときのＦＵＣＣＩ二重レポーター遺伝子の蛍光強度（任意単位）を示す。データは、３つの独立した反復を表す。

出願人の知る限りでは、多重化薬物試験方法は、固体インビボ組織構造をシミュレートする３Ｄスフェロイド培養と組み合わされておらず、人体などの生体系の多臓器性を再現することを目的とした共培養モデルとも組み合わされていない。予期せぬことに、様々な細胞培養薬物試験方法を組み合わせることにより、以下に詳述する現在の細胞培養薬物試験の主な制限の１つ又は２つにしか対処しない方法のいずれにも存在しない独特な利点を得る。

生物学的プロセスの多重化検出と異なる細胞型の物理的分離とを組み合わせた薬物試験方法の利点には、試験費、労力及び時間の自明で単純な経済的対策が含まれる。更に、現在の技術に固有の非自明な科学的概念の進歩も含まれる。これには、別個のヒトの器官の細胞に潜在的に異なる効果を有する薬物を同定する能力が含まれる。例えば、肝細胞代謝薬物は、非常に強力な抗腫瘍増殖効果を持ちながら、非常に低い濃度で肺細胞に対して高い毒性を示し、免疫細胞から予期しない炎症反応を誘導する。したがって、異なる細胞型における多数の生物学的プロセスの調節を同時に検出する能力により、薬物活性の比類のないハイコンテントスクリーニングが可能になる。したがって、本発明は、生物学的プロセスの同時評価がなかったら開発プロセスの次のラウンドに進んでいたであろう薬物候補の選択範囲を狭めることができるため、従来の技術に勝る独特な利点を提供する。今回の技術の追加の有利な特徴は、目的の標的細胞における強力な生物学的活性及び重要な器官からの細胞の低い毒性又は炎症などの多数の所望の特徴を有する薬物をより効果的に同定することができることである。

細菌又は肝細胞と大部分の他の細胞型との直接接触を防止するための細胞のカプセル化も、それらの細胞は通常インビボで他のほとんどの細胞型と直接接触しないため、有利である。例えば、肝細胞は、多くの場合、循環する薬物を代謝するが、ニューロンや肺細胞などと直接接触しない。前述したように、他のほとんどの細胞培養系には、別個の細胞型における多数の生物学的プロセスを個別に分析する手段が含まれないため、今回の技術は、生体系全体をよりよく再現することを目的とする様々な組織からの細胞に対する、薬物スクリーニングで試験された化学物質の影響を検出するために独特に位置付けられる。

本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書で論じられる刊行物及び出願は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいずれも、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物に先行する権利がないことを容認するとは解釈されない。また、材料、方法及び実施例は、例示的なものにすぎず、限定的なことを意図しない。

矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、本発明の理解を容易にするために、以下の定義が提供される。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に異なると指示しない限り、複数形の参照を含む。

「含む」という用語は、一般に、包含する意味で、つまり、１つ以上の特徴又は構成要素の存在を許容する意味で使用される。

本明細書で使用される場合、「被験体」又は「患者」という用語は、当技術分野でよく知られており、かつ本明細書で相互交換可能に使用され、イヌ、ネコ、ラット、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、そして最も好ましくはヒトを含む哺乳動物を指す。いくつかの実施形態において、被験体は、治療を必要とする被験体、又は疾患又は障害を有する被験体である。しかしながら、他の実施形態において、被験体は、正常な被験体であってもよい。この用語は、特定の年齢又は性別を示さない。したがって、成人及び新生児の被験体は、男性でも女性でも、対象となることが意図される。

「多重化」という用語は、関連する化学的タグ又は生物学的タグを介して多数の生物学的プロセスを同時に検出できる薬物試験を指す。

「スフェロイド」という用語は、略球形状の３Ｄ細胞凝集体を指す。

「肝細胞」という用語は、任意の初代培養肝細胞又は健康な肝細胞又は形質転換された肝細胞に由来する任意の細胞株を指し、肝癌（ＬＣ）細胞株などを含む。

「カプセル」は、マイクロフルイディクスデバイスによって生成される高分子シート又は高分子層を指し、典型的には、細胞をカプセル化又は包むために使用される本発明のアルギン酸を含む。カプセルは、細胞単位を取り囲む保護バリアであることが当技術分野で知られている。この用語は、半透過性又は不透過性の構造を指すために当技術分野で一般的に使用されており、本発明の文脈において、マイクロカプセルは、半透過性であり、培地及び他の試薬の成分の通過を可能にするが、細胞単位の同定を可能にするためにラベル及びタグを保持する。

マイクロカプセル化又はカプセル化は、マイクロカプセル内に細胞単位を取り囲むことである。

本明細書で使用される場合、「培養条件」という用語は、細胞の成長又は分化を促進するためにその細胞が配置されるか又は曝露される環境を指す。したがって、この用語は、細胞の成長及び／又は分化に影響を及ぼしうる培地、温度、大気条件、基質、撹拌条件などを指す。より具体的には、この用語は、培養培地に組み込まれ、細胞の成長及び／又は分化に影響を及ぼす可能性がある特定の薬剤を指す。これには、初代細胞、細胞株若しくは微生物の培養後の上清若しくは溶解物、又は生体に由来する生体液若しくは抽出物が含まれる。

本明細書で言及される場合、「細胞」は、独立して機能することができる生物の最小構造単位、又は全部が半透過性細胞膜若しくは細胞壁によって取り囲まれている１つ以上の核、細胞質及び様々な細胞小器官からなる単細胞生物であると規定される。細胞は、原核生物、真核生物、動物若しくは植物、又は古細菌であってもよい。例えば、細胞は、真核生物細胞であってもよい。細胞は、天然であってよく、所望の特性を達成するために遺伝子操作又は継代培養などによって修飾されてもよい。幹細胞は、以下でより詳細に規定され、複数の分化された細胞型を生じさせることができる分化全能性、多能性又は多分化能性細胞である。幹細胞は、インビトロで分化されて、それら自体が多分化能性であるか又は最終的に分化することができる分化細胞を生じさせることができる。インビトロで分化された細胞は、細胞分化を促進する１つ以上の薬剤（作用物質）へ幹細胞を曝露させることによって人工的に作製された細胞である。

「細胞」という用語は、その一般的かつ広い文脈で使用され、細胞を、細胞株、生物若しくはヒトからの初代細胞、又は細菌、真菌、又は植物細胞のいずれかであると規定する。カプセル化された細胞に印加される特定の圧力又は３Ｄ組織のような構造の形成など、カプセル化された細胞培養の特性は、他の方法でインビトロで達成するのが困難である細胞の分化又は成長に有利に働きうる。例えば、カプセル化により、多能性神経幹細胞又は軟骨細胞の増殖が促進され、肝細胞の長期維持が容易になるため、提案された薬物試験方法に追加の翻訳関連性が提供される。

細胞単位（又は細胞）の「群」は、相互に連結していない複数のそのような細胞単位である。例えば、細胞単位は細胞群ではなく、１つの単一単位に一緒に集団化した１つ以上の細胞である。単一細胞、及び個別細胞単位は、細胞又は細胞単位の群を形成するためにプーリングされてもよい。群は、該群を２つ以上の細胞又は細胞単位の群に分けることにより分割することができる。

「薬物試験」という用語は、薬物スクリーニングを含む一般的な用語である。本発明によれば、薬物試験は、所望の生物学的効果を有する新規な化学物質を同定するために分子ライブラリーをスクリーニングすることを含むことができ、またどの薬物若しくは薬物の組み合わせが患者に最も適切であるかを同定するか、又は新規な薬物若しくは以前に特定された薬物のメカニズム又は非特異的な効果を特徴づけるために既知の薬物又は以前に承認された薬物をインビトロで試験することを含むことができる。

本発明の１つの目的は、薬物試験用の試験化合物の添加の有無にかかわらず、３Ｄ細胞共培養で増殖した１種以上の細胞における異なる生物学的プロセス、例えば細胞増殖、細胞毒性、腫瘍性成長又は阻止、免疫細胞活性化、炎症反応、抗生物質耐性、薬物相乗効果を検出するための方法に関する。この方法では、前述の異なる生物学的プロセスに対応する蛍光レポーター遺伝子を含むように遺伝子操作されたカプセル化された細胞株が使用され、レポーター遺伝子ごとに異なる蛍光色が使用されるため、これらの生物学的プロセスの大きさの読み取り値を個別に分析することができる。生物学的活性はまた、異なる蛍光化合物に結合されたアルギン酸に異なる細胞型をカプセル化することにより、異なる細胞型間に区別することができる。この方法は、（１）異なる細胞株、例えば、細胞薬物標的として使用される乳癌細胞と一緒に薬物を代謝できる肝細胞を組み込むことと、（２）単一の試験で多数の生物学的読み取り値に関する同期情報、特に肝臓若しくは他の細胞に対する毒性及び／又は抗腫瘍活性若しくは他の薬効の測定基準を提供することと、（３）標的細胞の３Ｄ細胞培養を使用して、薬物の有効性を試験するときに追加の生理学的関連性を提供することとにより、薬物スクリーニングアッセイを改善することを目的とする。

本明細書で使用される場合、「ラベル」又は「タグ」は、細胞単位を同定し、及び／又は細胞単位が曝露された培養条件又は一連の培養条件を決定するための手段である。したがって、ラベル（標識）は、それぞれが特定の培養ステップで追加される１群のラベル、又は開始時、又は細胞単位が曝露される培養ステップに従って修飾されるか又は培養ステップ中に追跡される実験で追加されたラベル、又は単純に、使用された培養ステップを推測することができる位置参照であってもよい。ラベル又はタグは、更にいずれかの１つの時点に細胞単位の場所又は同一性を報告若しくは記録するか、又は該細胞単位に一意の識別子を割り当てる素子であってもよい。ラベル又はタグの例としては、固有の配列、構造若しくは質量の分子、又はビーズなどの蛍光分子若しくは物体、又は高周波及びその他のトランスポンダー、又は固有のマーキング若しくは形状を有する物体が挙げられる。異なる蛍光色素は発光スペクトルが重複している可能性があるため、異なるタグの選択は、異なる蛍光色素間の蛍光の重複が最小限になるか又はまったくないように実行される必要があり、或いは測定値が染色対照サンプルを使用して補正されるため、イメージング結果の解釈が損なわれないように実行される必要がある。

「同定用ラベル」は、それに付着している細胞単位の性質を決定することを可能にするラベルである。これは、様々な培養条件への細胞単位の曝露を記録することを、各曝露時に同定用ラベルを追加し、その後に該ラベルの分析によってデコンボリューションすることによって可能にする。

細胞は、細胞が培地と接触して配置される場合に、又は細胞の成長、分化又は代謝状態などの１つ以上の細胞プロセスに影響を与える条件下で成長させられる場合に「培養条件に曝露される」。

したがって、培養条件が細胞を培地中において培養することを含む場合、該細胞は、効果を発揮するために十分な期間にわたって、培地に配置される。同様に、条件が温度条件である場合、細胞は所望の温度で培養される。細胞単位の１つ以上の群の「プーリング」は、複数の背景、つまり複数の異なるセットの培養条件に曝露された細胞単位を含む単一群又はプールを作製するために群の混合物を含む。プールは、ランダム又は非ランダムのいずれかで更に群に分割されてもよく、このような群は、それ自体が本発明の目的の「プール」ではないが、それら自体は、例えば異なるセットの培養条件に曝露された後に、組み合わせによってプールされてもよい。

「細胞成長」及び「細胞増殖」は、本明細書で相互交換可能に使用されて、異なる細胞型又は系統に分化することのない細胞数の増加を示す。換言すれば、これらの用語は、生存細胞数の増加を示す。好ましくは、増殖は、表現型又は遺伝子型における感知可能な変化を伴わない。

「細胞分化」は、１つの細胞型から異なる細胞型への発生である。例えば、両能性、多能性又は分化全能性細胞は、神経細胞に分化することができる。分化は、増殖を伴ってもよく、増殖とは独立しててもよい。「分化」という用語は、一般に、発生的にはまだ規定されていない細胞型、例えばニューロン、又はリンパ球からの成熟細胞型の表現型の獲得を指すが、分化転換を排除しないので、１つの成熟細胞型はまた別の成熟細胞型へ、例えばニューロンからリンパ球へ、又は単球からマクロファージへ転換することができる。

「複数」という用語は、１つを超えることを意味する。ラベルの文脈において、複数は、複数のカプセル化された細胞単位を１回のカプセル化あたり少なくとも１つのラベルで標識できるように、各カプセル化が少なくとももう１つのラベルが追加される事実を記載している。マイクロカプセル内の細胞単位の文脈において、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の細胞単位を単一マイクロカプセル内に含むことができる。

「表現型スクリーニング」という用語は、細胞又は生物の表現型を所望の方法で変化させる小分子、ペプチド、抗体又はＲＮＡｉなどの物質を同定するために生物学的研究及び創薬で使用される１種のスクリーニングを指す。

蛍光試薬は、一般的に、生物学的プロセスの活性を測定するためにライフサイエンス研究所で使用される。例えば、蛍光試薬ＤｉＯＣ６とヨウ化プロピジウムの組み合わせにより、細胞集団内の生細胞（緑色蛍光）と死細胞（赤色蛍光）の検出及び定量化が可能になる。ジヒドロエチジウムは、細胞ストレスの指標である細胞内の活性酸素種の生成を、酸化された後に細胞内で赤くなることにより測定するための蛍光プローブである。クマリンボロネート又はフルオレセインボロネートは、炎症を含む多くの生理学的プロセスに関与する一酸化窒素の細胞への生成を、それぞれ青色又は緑色の蛍光を発することにより測定するために使用できる。Ｆｕｒａ－２は、シグナル伝達経路の刺激により変動するカルシウムの細胞内濃度を測定するための蛍光プローブである。

本発明においてこのような試薬を組み込むことは、分析できる生物学的活性のスペクトルの拡大に役立つ。しかしながら、レポーター遺伝子の代わりに、蛍光試薬は、細胞集団の全ての細胞における生物学的活性を無差別に報告する。確かに、蛍光試薬は、細胞培養培地に添加された後に自由に拡散する可溶性分子であるため、全ての細胞を染色する。蛍光試薬は、蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子と組み合わせて使用されて、レポーター遺伝子が存在しない場合のある追加の生物学的活性を測定することができる。そのためには、蛍光レポーター遺伝子の活性は、それらが発現されている細胞型における生物学的活性を特異的に報告するため、最初に測定する必要がある。そして、蛍光試薬の添加を実行して、全ての細胞を染色することができる。試薬の蛍光を個別に測定するために依然としてカプセルの色を使用することができるため、細胞共培養における特定のカプセル化された細胞型の関連する生物学的活性を測定することができる。また、いくつかの蛍光試薬は、それらの蛍光スペクトルが重複しない範囲で同時に使用することができる。

特に、本発明は、１つ以上の細胞型における多数の生物学的プロセスを分析できるインビトロ薬物試験方法を提供することを１つの目的とし、この方法は、
同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される上記１つ以上の細胞型のそれぞれにおいて、分析される生物学的プロセスごとに少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子を発現するステップａ）と、
アルギン酸生体高分子を用いて同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される上記１つ以上の細胞型のそれぞれをカプセル化し、複数の細胞がある場合、カプセルの全て又は１つを除く全てを異なる種類の蛍光体でそれぞれ標識するステップｂ）と、
ステップｂ）の全てのカプセル化された、同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される細胞型を、標識又は非標識アルギン酸生体高分子で任意選択にカプセル化された１つ以上の追加の非標識細胞型と任意選択に共培養するステップｃ）と、
任意選択に上記共培養（共培養物）を１つ以上の薬物に曝露するステップｄ）と、
試験される上記任意選択の１つ以上の薬物への曝露の前及び／又は後に、各蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子の蛍光強度又は生物発光強度を光学イメージングにより個別に分析することにより、ステップｃ）の同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される各細胞型における上記多数の生物学的プロセスの活性を測定するステップｅ）と
を含み、複数の細胞型が共培養される場合、分析される各細胞型は、分析される上記細胞型を含むアルギン酸カプセルに関連する蛍光体標識の種類に基づいて、光学イメージングにより同定される。

薬物の試験に加えて、本発明のインビトロ方法は、細胞若しくは組織からの上清、又は細胞若しくは微生物培養液からの溶解物を含む生体液の試験にも適する。

有利には、本発明は、薬物試験を意図しているが、ヒトの健康に対する予想又は確認された効果を有する他の分子ファミリーを試験することができる。例えば、本発明は、ヒトの健康に対する未知の化合物の影響を予測し、並びに／又は関連する生物学的活性及び試験される細胞型を選択することによって既知の化合物の知識を拡大するために使用することができる。栄養素、化粧品、汚染物質、及び外因性活性物質などの他の化学物質は、細胞培養培地に可溶な形態で添加することができる範囲で試験することができる。本発明はまた、汚染された液体（例えば、化学工場若しくは病院などの下流の水）又は生理学的流体（例えば、尿、血清など）など、組成が未決定並びに／又は複雑な流体に対して、それらが含み、測定された効果の原因となる１つ以上の分子を同定する必要なしに、特定の生物学的活性及び細胞型に対するそれらの効果を決定するために使用することができる。このような用途により、本発明は、ヒトの健康に対する化合物並びに／又は流体の潜在的な有害及び／若しくは有益な効果を予想するための予測ツールとして包括的に使用することができる。

多数の生物学的プロセスとしても規定される生物学的活性は、蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子の両方によって報告することができる。ルシフェラーゼと呼ばれるいくつかの生物発光タンパク質は、レポーター遺伝子として使用することができる。例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼは、一般的に生物発光レポーター遺伝子として使用される。生物発光は、生物発光計で測定され、多くの場合、蛍光より感度が高い。いくつかのレポーター遺伝子は、蛍光レポーター遺伝子によって不良に検出される弱い生物学的活性を報告するため、生物発光レポーター遺伝子でのみ利用できる。したがって、生物発光レポーター遺伝子は、検出が不良な生物学的活性を測定するための蛍光レポーター遺伝子の優れた代替手段となる。利用可能な生物発光色のセットに制限があるため、いくつかの生物発光レポーター遺伝子との多重化は困難であり、蛍光レポーター遺伝子は、多くの場合、好ましい。

しかしながら、二重レポーター系は、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼを使用して設計することができ、両方の生物発光レポータタンパク質の生物発光を同じサンプルで連続して測定することができる。蛍光レポーター遺伝子を生物発光レポーター遺伝子と組み合わせる可能性があるが、生物発光を測定する前にまず蛍光を測定する必要がある。確かに、生物発光シグナルは非常に強く、蛍光の検出を損なう。基質が必要であり、蛍光取得直後に細胞共培養に添加することができるため、生物発光を簡単に制御することができる。報告された特定の生物学的活性に影響を与える可能性のある細胞型間の可能な生物学的コミュニケーションを考慮しながら、特定の生物学的活性を測定するために、他の細胞型との共培養における１種の細胞型に単一の生物発光レポーター遺伝子を使用するという別の可能性がある（実施例１を参照）。

本発明は、カプセルごとにいくつかの細胞型をカプセル化する可能性を含む。例えば、肝臓に通常見られる他の細胞と一緒に肝細胞を使用して肝臓カプセルを準備して、インビトロで肝臓機能をよりよく再現することができるため、インビボ生物学をより反映する方法で薬物を代謝するか、肝毒性を研究することができる。

或いは、単一のカプセル内に免疫系又は間質細胞（例えば、単球、Ｔリンパ球若しくは内皮細胞の細胞株、又は患者由来の初代細胞）と一緒に癌細胞（腫瘍細胞株又は患者由来の腫瘍細胞）を含むスフェロイドを生成して、非癌性腫瘍関連細胞を（再）プログラムできる薬物が腫瘍退縮を促進するか、例えば、腫瘍関連免疫細胞がより炎症性になるか又は腫瘍に対する細胞傷害性免疫応答を開始するか、又は腫瘍内皮細胞が血管新生因子の分泌を減少させるかを試験することができる。

したがって、カプセルごとにいくつかの種類の細胞を使用する可能性は、異なる細胞が認識できる（つまり、同じカプセル内の１つの細胞型が緑色であり、別の細胞型が赤色であるか、又は１つの生物学的活性が緑色で読み取られ、第２の生物学的活性が赤色で読み取られる）場合に特に興味深い。

好ましくは、蛍光体はアミン－アルギン酸生体高分子に結合されるが、単純な共有結合化学を有する幅広い種類の蛍光色素が知られており、これらの蛍光色素は、それらがより所望の物理化学的若しくはアッセイ依存性の特性、又は同じ試験でより多くの蛍光体（例えば、４つの異なる蛍光カプセルラベル、１つの非標識カプセル、及び４つの異なるレポーター遺伝子蛍光ラベル）を組み合わせる場合の他の蛍光ラベルとのより優れた相互互換性を有する場合、アミン系色素を置き換えることができ、これらの蛍光体はいずれもイメージング顕微鏡の特定のフィルター及びレーザー構造を介して相互に正確に区別することができる。

本発明において、上記多数の生物学的プロセスは、細胞増殖、炎症、腫瘍成長又は阻止、薬物毒性、血管新生、免疫刺激、解毒反応、ホルモン反応、生体異物応答、遺伝毒性ストレス応答及びアポトーシスを含むリストから選択される。

本発明の一実施形態において、上記１つ以上の細胞型は、上記細胞型間の予想若しくは確認された生理学的相互作用に基づいて、及び／又は上記試験される１つ以上の薬物に対する上記１つ以上の細胞型の予想若しくは確認された効果に基づいて、共培養のために選択される。

例えば、１つ以上の細胞型間の予想又は以前に記載された生理学的相互作用は、薬物が肝細胞によって代謝され、標的となる癌細胞型に対する薬物の反応性を変化させることができるという予想に基づく、肝細胞と癌細胞型との共培養、又は卵巣癌細胞が乳癌細胞の増殖を誘導するエストロゲンを生成するという知識に基づく、卵巣癌細胞と乳癌細胞との共培養、或いは乳癌細胞における抗エストロゲン薬である薬物が子宮内膜で、抗エストロゲン薬の予想される有害な副作用であるプロエストロゲン作用を示すという知識に基づく、抗エストロゲン薬を試験するための、肝細胞と子宮内膜癌細胞と乳癌細胞との共培養を含んでもよい。

本発明の好ましい実施形態において、上記インビトロ薬物試験方法は、上記共培養を１つ以上の薬物に曝露するステップｄ）を含む。

特に、１つ以上の細胞型における多数の生物学的プロセスを分析できるインビトロ薬物試験方法は、
同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される上記１つ以上の細胞型のそれぞれにおいて、分析される生物学的プロセスごとに少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子を発現するステップａ）と、
アルギン酸生体高分子を用いて同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される上記１つ以上の細胞型のそれぞれをカプセル化し、複数の細胞型がある場合、カプセルの全て又は１つを除く全てを異なる種類の蛍光体でそれぞれ標識するステップｂ）と、
ステップｂ）の全てのカプセル化された、同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される細胞型を、標識又は非標識アルギン酸生体高分子で任意選択にカプセル化された１つ以上の追加の非標識細胞型と任意選択に共培養するステップｃ）と、
上記共培養を１つ以上の薬物に曝露するステップｄ）と、
試験される上記１つ以上の薬物への曝露の前及び／又は後に、各蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子の蛍光強度又は生物発光強度を光学イメージングにより個別に分析することにより、ステップｃ）の同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される各細胞型における上記多数の生物学的プロセスの活性を測定するステップｅ）と
を含み、複数の細胞型が共培養される場合、分析される各細胞型は、分析される上記細胞型を含むアルギン酸カプセルに関連する蛍光体標識の種類に基づいて、光学イメージングにより同定される。

好ましい実施形態において、上記インビトロ薬物試験方法は、上記共培養を１つ以上の蛍光試薬に曝露して、１つ以上の追加の生物学的プロセスを測定する追加のステップｆ）を更に含む。

好ましくは、光学イメージングは、顕微鏡及び／又はルミノメータによって実行される。適切な機器ノズルが使用され、細胞カプセルのサイズが十分に小さい場合、光学イメージングは、フローサイトメトリーによって実行されてもよい。フローサイトメトリーを使用すると、標準的なイメージング顕微鏡と比較してより多くの蛍光パラメータを容易に分析することができるため、アッセイの多重化を向上させることができ、画像分析ソフトウェアを使用せずに分析することもできるが、プレートウェルあたりのカプセル数が少ないほど、画像ベースの顕微鏡に適する。

本発明の別の実施形態において、上記少なくとも１つ以上の細胞型は、肝細胞、腫瘍細胞、脳細胞、上皮細胞、内皮細胞、免疫系細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、肺細胞、腎臓細胞、動脈細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、膵臓細胞、腸細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、真菌細胞又は細菌の細胞株又は初代組織細胞サブセットを含む群から選択される。

好ましくは、インビトロ薬物試験アッセイで分析される上記１つ以上の細胞型の少なくとも１つ、又はステップｃ）の任意選択に追加された非標識細胞の少なくとも１つは、肝細胞である。

本発明の一実施形態において、カプセル化された上記１つ以上の細胞型の少なくとも１つは、患者の癌サンプルに由来する。

本発明の一実施形態において、上記１つ以上の細胞型の少なくとも１つは、細菌又は真菌細胞である。後者の場合、上記試験される薬物は、抗生物質又は殺菌剤である。この実施形態において、上記分析される多数の生物学的プロセスは、抗微生物薬耐性又は抗微生物薬感受性、細菌増殖、殺菌活性又は静菌活性を含むリストから選択される。

別の実施形態において、本発明のインビトロ方法は、薬物スクリーニング又は試験のために設計され、上記多数の蛍光レポーター遺伝子は、表現型創薬プロセス中に研究される生物学的プロセスのために選択される。

例えば、遺伝子レポーターは、機構論的生物学的研究を介して以前に同定された特定の標的、つまり特定の癌又は他の特定の疾患の病因において重要な役割を果たす受容体であるため、選択される。

好ましくは、遺伝子レポーター及び調節エレメントは、ＣＴＣＦインスレーター配列に隣接している。

蛍光色素は、アルギン酸蛍光体と蛍光レポーター遺伝子構造との間のスペクトルの重複が最小化されるか又は検出装置（顕微鏡若しくはサイトメータ）を構成するときに適切な制御を使用してなくすように選択される。

換言すれば、本発明の１つの対象物は、蛍光標識されたアルギン酸カプセルにカプセル化された、蛍光レポーター遺伝子を発現する真核生物（例えば、哺乳動物細胞）又は原核生物細胞（例えば、細菌）からなる。これら２つの異なる種類の蛍光標識（細胞内レポーター遺伝子とアルギン酸カプセル標識）の組み合わせにより、１つ以上の細胞型における多数の生物学的プロセスを同時に監視することができる。

具体的には、細胞は、アルギン酸生体高分子でカプセル化される。カプセルは、通常の生理学的圧力のように細胞に物理的な制約を加える。この圧力により、カプセル内の多細胞凝集体は、細胞を介した酸素及び栄養素の拡散と適合性がある３００μｍ未満のサイズにとどまり、この細胞培養モデルの生理学的関連性を向上させる（向上した生物学的関連性の例は上記に記載され、神経幹細胞及び軟骨細胞を含む）。

各細胞型は、１つの特定の蛍光体で化学的に修飾されたアルギン酸シェルにカプセル化される。したがって、各蛍光体により、インビトロ薬物試験の分析中に１つの特定の細胞型を含むカプセルを同定することができる。

カプセル化された細胞は、典型的には、異なる蛍光レポーター分子又は他のレポーター分子を発現するように遺伝子操作された細胞株で構成され、試験される「生物学的プロセス」に関与する主要な活性を監視することができる。

同時に監視できる遺伝子のパネルは、薬物試験で検出できる、一般的に研究されている特徴、つまり生物学的プロセスの主要な調節因子又はバイオマーカーを含む。これらの特徴は、細胞毒性、細胞増殖、炎症、ホルモン反応、生体異物応答、遺伝毒性ストレス応答及び抗生物質耐性を含む。

特に、本発明は、同じ試験内で同時に、多数の細胞型における多数の細胞プロセスに対する薬物の効果を特徴づける方法を含む。これを達成するために、この方法は、蛍光活性が生物学的プロセス活性を示す蛍光レポーター遺伝子に融合された調節エレメントを介して１つ以上の細胞プロセスを監視することができるように遺伝子操作されたカプセル化細胞を使用する。共培養で使用される細胞株は、細胞増殖、生体異物ストレス応答、炎症、腫瘍成長又は阻止、及び薬物毒性又は解毒反応を含むがこれらに限定されない生物学的プロセスに関与する１つ以上のレポーター遺伝子を発現するように操作することができる。

同じ細胞型は、異なる生物学的プロセスに対してレポーター遺伝子を発現するように遺伝子操作することができる。多数のレポーター遺伝子の分析を多重化するために、細胞は、必要な数の別々の細胞バッチに分割され、各バッチは、単一の生物学的プロセスに対応する単一のレポーター遺伝子を含むように操作される。別々の細胞バッチは、同じカプセルにカプセル化されるために一緒にプールされるか、又は混合共培養又は物理的に分離された共培養のいずれか中の多数の生物学的プロセスの活性を測定するために、それぞれ別々にカプセル化される。異なる細胞プロセスに対応する遺伝子の多重化分析は、最良の薬物候補を予測する能力の向上と、薬物候補の詳細な特性評価を実行するために必要な試薬、消耗品及び時間の節約とを含む多くの利点を提供することを目的とする。

各種類のカプセルは、通常、単一のヒトの器官、又は腫瘍などの別個の生理学的部位に見られる１つ以上の細胞型を含む。細胞のカプセル化は、異なる細胞型の別々の単一細胞懸濁液の調製を含む。次いで、その懸濁液は、顕微鏡によるカプセルの内容物の同定を可能にする多くの蛍光マーカーの１つで事前に標識されたアルギン酸の薄層にカプセル化される。

次に、スフェロイドと呼ばれる３Ｄ組織様構造の形成を促進ために、カプセル化された細胞はインキュベートされる。異なるカプセル化された細胞スフェロイドは、混合されて異なる細胞亜型の共培養が作成され、この細胞亜型は、腫瘍細胞株、患者由来の原発性腫瘍細胞、及び細胞株、特に薬物を代謝できる肝細胞を含んでもよいが、これらに限定されない。

カプセル化３Ｄ細胞培養の使用は、（ｉ）同じヒト器官に通常見られない異なる細胞型の細胞間接触を防止し、そして（２）同じウェル内の異なる細胞型の同時分析を可能にし、例えば、薬物の毒性は、同じ共培養における肝細胞と癌細胞で別々に評価することができる。

同じウェル内の多数の細胞型の共培養の目的は、この薬物試験アプローチの臨床的関連性を向上させるために、人体で発生する多細胞微小環境、組織又は器官間システムを再現することである。例えば、別々のカプセルにおける腫瘍細胞と肝細胞との共培養の目的は、インビボで薬物を投与した後の一般的なプロセスをシミュレートすることであり、該一般的なプロセスにおいて、肝臓が最初に薬物を代謝し、その後、薬物代謝物が遠位の解剖学的部位における抗腫瘍反応の主なエフェクターとなる。

また、本発明は、多数の効果、例えば、抗腫瘍効果及び肝毒性が同時に研究できるため、時間及び資源を節約する。これは、薬物性肝障害（ＤＩＬＩ）が多くの薬物候補が開発プロセスを進めない主な理由の１つであるため、重要である。

本発明の１つの独特な利点は、混合細胞型の共培養において多数の生物学的プロセスを測定することができることであり、これは、薬物試験の効率及び正確さ（インビボモデルへのより多くの翻訳関連性）を向上させる。

本発明と他の３Ｄ共培養、又はカプセル化された細胞ベースの薬物試験方法論との共通の利点は、既存の技術に共通する以下の特徴を介して薬物試験の臨床的関連性を向上させることである：
アルギン酸カプセルは、通常インビボで相互に接触しない異なる細胞型の物理的分離として機能し、
３Ｄスフェロイド細胞培養は、細胞培養単層と比較して、よりインビボ組織のように挙動する。

更に、本発明は、同時に研究できる生物学的プロセスの数を増加させることと、生物学的プロセスのレパートリーを増加させ、すなわち、一般的に製薬会社によって研究される生物学的プロセスの大部分を定量化するためのレポーター遺伝子のライブラリーを作製することとを可能にする。

本発明は、細胞生物学及び応用創薬の分野で現在知られている多くの既存の個々の要素又はプロセス、並びに完全に新規である要素を組み合わせる。これらの技術的要素又はプロセスを以下のａ～ｄに説明する。
ａ、組織様特性を持つ３Ｄ細胞スフェロイドを形成するための細胞のカプセル化。
好ましくは、細胞のアルギン酸ベースのカプセル化の方法は、マイクロフルイディクスデバイスを用いて実行される。マイクロフルイディクスデバイスは、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ Ｋ、Ｆｅｙｅｕｘ Ｍ、Ｇｕｒｃｈｅｎｋｏｖ Ｂ、Ｄｅｌｇａｄｏ Ｃ、Ｔｒｕｓｈｋｏ Ａ、Ｋｒａｕｓｅ ＫＨ、Ｖｉｇｎｊｅｖｉｃ Ｄ、Ｎａｓｓｏｙ Ｐ、Ｒｏｕｘ Ａ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２０１６年４月２６日、１６（９）：１５９３－１６０４、ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ６１ｃ００１３３ｅに記載されている。
ｂ、薬物スクリーニングにおけるより臨床的に関連性のある結果の達成に役立つ、インビボのような細胞相互作用を発生させるための異なる細胞型の共培養。好ましくは、本発明は、肝細胞を使用して細胞共培養におい薬物を代謝する。
ｃ、蛍光プローブによる細胞カプセルの標識。一般的な蛍光分子でアルギン酸を標識するための技術は、当技術分野で広く知られている。
ｄ、遺伝子操作と主要な細胞プロセスに関連する多数の調節活性の検出。本発明は、同じ細胞内の異なる蛍光レポーター遺伝子の蛍光強度の多数同時（多重化）分析に関する。本発明の方法は、特定の分子薬物標的の同一性を知ることに依存しない「表現型薬物スクリーニング」、或いは特定のタンパク質の調節活性が細胞において測定される「標的ベース」の薬物スクリーニングを実行することを目的とする。この要素は、本発明の独特な特徴を表す。

本発明は、１つ以上の標的細胞型における多数の生物学的プロセスに対する１つ以上の目的の薬物の効果を試験するのに適するインビトロ薬物試験キットを提供することを別の目的とし、このキットは、
上記１つ以上の標的細胞型において分析される生物学的プロセスごとに蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子を発現する１つ以上のアルギン酸カプセル化された標的細胞型を含む少なくとも１つの使用準備済のマイクロウェルプレートを含み、複数の細胞型がある場合、カプセルの全て又は１つを除く全てが異なる種類の蛍光体でそれぞれ標識される。

好ましくは、上記１つ以上の標的細胞型の少なくとも１つは、肝細胞である。

本発明の一実施形態において、上記蛍光体で標識された、アルギン酸カプセル化された１つ以上の標的細胞型は、１つ以上の患者由来細胞型と共培養される。好ましくは、上記１つ以上の患者由来細胞型は、分析される多数の生物学的プロセスごとに少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子を含むように遺伝子操作される。

より好ましくは、上記１つ以上の患者由来細胞型は、それぞれ、蛍光体で標識されたアルギン酸生体高分子でカプセル化される。

上記インビトロ薬物試験キットは、表現型（ほぼ全ての細胞に共通のレポーターで一般的な生物学的プロセスに影響を与える）又は標的ベース（一部の細胞、例えばエストロゲン受容体にのみ存在する可能性のある、以前に理想的な治療標的として同定された特定の経路の調節）の創薬のために使用できるという１つの利点を有する。

本発明の別の実施形態において、分析される上記多数の生物学的プロセスは、細胞増殖、炎症、腫瘍成長又は阻止、薬物毒性、血管新生、免疫刺激、解毒反応、ホルモン反応、生体異物応答、遺伝毒性ストレス応答及びアポトーシスを含むリストから選択される。

本発明の更なる実施形態において、１つ以上の患者由来細胞型は、肝細胞、腫瘍細胞、脳細胞、上皮細胞、内皮細胞、免疫系細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、肺細胞、腎臓細胞、動脈細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、膵臓細胞、腸細胞、線維芽細胞又は皮膚細胞を含むリストから選択される。

本発明の一実施形態において、上記カプセル化された標的細胞型における生物学的プロセスに対する上記１つ以上の薬物の効果を同定するために、１つ以上の薬物は、上記少なくとも１つの使用準備済のマイクロウェルプレートのウェルごとに試験される。

本発明の別の実施形態において、上記薬物間の相互作用を同定するために、複数の薬物は、上記少なくとも１つの使用準備済のマイクロウェルプレートのウェルごとに試験される。

特に、目的のカプセル化された細胞内の生物学的プロセスに対する薬物の効果、又は多数の薬物間の相互作用、例えば細胞毒性又は細胞増殖を含むがこれらに限定されない生物学的プロセスの調節の相乗効果又は非相乗効果を同定するために、１つ以上の薬物が、ウェルごとに試験される。

当業者は、本明細書に記載した本発明は、具体的に記載されたもの以外の変更及び修正がなされてもよいことを理解するであろう。本発明は、その精神又はその本質的な特徴から逸脱することなく、このような変更及び修正を全て含むと理解されるべきである。本発明はまた、本明細書で個別に又は集合的に言及されるか又は示されるステップ、特徴、組成物及び化合物の全てを、そして当該ステップ又は特徴の任意の２つ又はそれ以上のいかなる及び全ての組み合わせも含む。したがって、本開示は、全ての態様において例示するものであって限定するものではないと考えられ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示されると見なされるべきであり、均等の意味及び範囲内に入る全ての変化は、本発明の範囲に含まれることが意図される。

様々な参考文献が、本明細書全体を通して引用されており、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

前述の説明は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。このような実施例は、本発明を実施する方法の例示的なものであるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１
説明
エストロゲン応答エレメントの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現する単層乳癌（ＢＣ）細胞（ＭＥＬＮ細胞、表１及び２）を、カプセル化された肝癌（ＬＣ）細胞と共培養するか又は共培養せずに、タモキシフェン又は４－ヒドロキシタモキシフェンの濃度を増加させながら４８時間処理する。ルシフェラーゼの活性（生物発光強度）を測定することにより、ＢＣ細胞におけるエストロゲン受容体αの活性を決定する。

材料及び方法
ＢＣ細胞の細胞播種
培地をＭＥＬＮ細胞上に吸引する（表１を参照）。
ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳを吸引する。
細胞にトリプシンを添加し、過剰なトリプシンを吸引する。
３７℃で５分間インキュベートする。

細胞に白色の細胞培養培地（１０％チャコール処理済みウシ胎児血清を補った、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ）を繰り返しピペッティングして分離し、管に収集し、細胞を９６ウェルプレートに白色の細胞培養培地で１００００細胞／ウェルで播種する。
細胞を３７℃でインキュベートする。

ＬＣ細胞のカプセル化のプロトコル
－カプセル化のための細胞の準備
コンフルエント皿からのＬＣ細胞（表１を参照）をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により分離し、細胞培養培地を使用して収集する
細胞を数え、１ｍｌあたり５００万個の細胞を含む細胞懸濁液を調製する。
細胞懸濁液を４０μｍ Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング）フィルターを通して５０ｍｌのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管に注ぐ。
１ｍｌの細胞懸濁液（すなわち５００万個の細胞）を１．５ｍＬの遠心分離管に入れる。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレット化し、３００μＭのソルビトール（９０μｌ）に再懸濁する。細胞を氷上に置く。

－カプセル化
カプセル化は、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ Ｋ、Ｆｅｙｅｕｘ Ｍ、Ｇｕｒｃｈｅｎｋｏｖ Ｂ、Ｄｅｌｇａｄｏ Ｃ、Ｔｒｕｓｈｋｏ Ａ、Ｋｒａｕｓｅ ＫＨ、Ｖｉｇｎｊｅｖｉｃ Ｄ、Ｎａｓｓｏｙ Ｐ、Ｒｏｕｘ Ａ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２０１６年４月２６日、１６（９）：１５９３－１６０４、ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ６１ｃ００１３３ｅに記載されている特許取得済みのデバイス（国際公開第２０１３／１１３８５５号パンフレット）で実行する。カルシウム溶液を含む１０ｃｍのペトリ皿にカプセルを収集し、３０分間インキュベートする。カルシウム溶液を細胞培養培地と交換する。
カプセルが皿の底部に沈降するのを待つ。
皿の底部にあるカプセルを吸引しないように１８ゲージ針を使用してカルシウム溶液の９０％を吸引する。
細胞培養培地で１０ｃｍのカプセル皿を完全に（４０ｍＬ）満たす。
カプセルを沈降させ、培養培地を吸引し、補充する。２回繰り返し、最後の繰り返しで１５ｍｌの細胞培養培地を残す。
インキュベーションカプセルを３７℃でインキュベートする。

プレートへのＬＣカプセルの装填と処理
カプセルの培地を吸引し、約５ｍｌの培地を残す。
カプセルが通過できるチップを備えた１ｍｌのピペットで、残りの培地で皿の表面を洗浄する。
１５ｍｌの管にできるだけ多くのカプセルを収集する。
５ｍｌの培地を添加して１ｍｌのピペットで残りのカプセルを収集する。

・カプセルを３００ｒｐｍで１分間遠心分離し、培地を吸引し、フェノールレッドを含まない１０ｍｌの細胞培養培地（１０％チャコール処理済みウシ胎児血清を補った、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ）でカプセルを再懸濁する。もう一度繰り返す。
・カプセルを３００ｒｐｍで１分間遠心分離し、培地を吸引し、カプセルの上部に約２００μｌの培地を残す。
カプセルを適切な量でウェルに移す前に懸濁状態に維持するために連続的に上下にピペッティングすることにより、９６ウェルプレート内のＢＣ細胞単層の上部にカプセルを分注する。
ウェルの半分はカプセルで満たされない（ＢＣ細胞のみの状態）。
全てのウェルを１０ｐＭの１７β－エストラジオール（Ｅ２）で処理し、その後に３０ｐＭ～１μＭの範囲の濃度が異なるタモキシフェン又は４－ヒドロキシタモキシフェンを添加する。
プレートを３７℃で４８時間インキュベートする。

ルシフェラーゼ活性の測定
カプセルを吸引し、ＰＢＳで１回洗浄し、吸引してカプセルを完全に除去する。ＢＣ細胞に２０μｌのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ））を添加し、プレートシェーカーで室温、１００ｒｐｍで１５分間インキュベートする。
１０μｌの溶解物をルミノメータに適合した白色９６ウェルプレートに移し、１０μｌのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加する。
ルミノメータで生物発光強度を読み取る。

結果
図１から分かるように、単層で増殖するＢＣ細胞とのインビトロ共培養にカプセル化ＬＣ細胞を含めると、タモキシフェンの抗癌活性が増加した（ＥＲα活性が阻害され、ＬＣ細胞を含むとＩＣ５０が低くなる）。これは、ＢＣ細胞とカプセル化ＬＣ細胞の共培養が、プロドラッグ（タモキシフェン）とＢＣ標的細胞株のみを含む単一培養系では見落とされていた、ＬＣ細胞による二次活性薬物代謝物（エンドキシフェン）の生理学的産生を再現できることを示唆している。詳細については、図１を参照。

実施例２
説明
遠赤色標識カプセル中の二重レポーターＦＵＣＣＩ（表２を参照）を安定して発現するカプセル化ＢＣ細胞と、非標識カプセル中の二重レポーターＦＵＣＣＩを安定して発現するカプセル化ＬＣ細胞との共培養を異なる血清濃度でインキュベートした。活発な増殖細胞と増殖していない細胞（潜伏）の量は、同じ共培養ウェル内のＬＣ細胞とＢＣ細胞の両方で同時に赤（Ｇ１期）と緑（Ｇ２／Ｓ期）の核の割合を定量化することによって決定される。

材料及び方法
安定したレポーター細胞株を樹立するプロトコル
ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍの皿に４００万個の細胞／皿で播種する。
３７℃で２４時間インキュベートする。
プラスミドｐＭＤ２Ｇ、ｐｓＰＡＸ２及び目的のレンチウイルスレポータープラスミド（ｐＢＯＢ－ＥＦｌ－ｆａｓｔＦＵＣＣＩ－ｐｕｒｏ）の混合物で、ポリエチレンイミントランスフェクション法を使用して細胞をトランスフェクトする。
トランスフェクション溶液を細胞に添加し、３７℃で一晩インキュベートする。
完全培地変更を行う。
細胞を３７℃で８時間インキュベートする。
レンチウイルスを含む培地を管に収集する。
完全培地を細胞に添加し、細胞を３７℃で１６時間インキュベートする。
培地を使用して、８～１６時間間隔で更に２回収集を繰り返す。
安定したレポーター細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ１３４及びＨｅｐＧ２、表１）を生成するために使用する細胞を、通常の細胞培養と同じ密度で、レンチウイルス含有培地に３７℃で９６時間直接播種する。
レンチウイルス含有培地を吸引し、完全細胞培養培地と交換する。ピューロマイシンを最終濃度２μｇ／ｍＬで直接培地に２４時間添加することにより、抗生物質耐性（レポーター＋）細胞を選択する。
死細胞を含むピューロマイシン培地を除去し、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む完全細胞培養培地と交換する。
安定したレポーター細胞株を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む培地で維持する。

アミン基を有する蛍光体によるアルギン酸の染色（表３を参照）
ｐＨ６．０の０．１ＭのＭＥＳ中で２５ｍＬの１％（ｗ／ｖ）アルギン酸溶液を調製し、室温（ＲＴ）でローテータで一晩混合する。
２００μｌのＤＭＳＯに溶解した染料１ｍｇを添加し、ローテータでＲＴで１０～３０分間アルギン酸と混合する。
アルギン酸溶液中に最終濃度が２ｍＭになるようにｐＨ６．０の２００μｌの０．１ＭのＭＥＳに溶解したスルホＮＨＳを添加し、ローテータでＲＴで３０分間混合する。
アルギン酸溶液中に最終濃度が５ｍＭになるようにｐＨ６．０の２００μｌの０．１ＭのＭＥＳに溶解したＥＤＣを添加し、ローテータで室温で１～２時間混合して反応させる。
Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｓｅｒカセット（１０Ｋ）で１Ｌの蒸留水で３０分間透析する。次に、水を交換し、カセットを５Ｌの蒸留水に入れ、４℃で穏やかに撹拌しながら一晩放置する。
染色されたアルギン酸をカセットから収集してプラスチック管に移し、４℃で保存する。カプセル化の前に、染色されたアルギン酸と、（ステップ１のみを実行して調製した）染色されていないアルギン酸とを、染色されたアルギン酸：染色されていないアルギン酸の比率１：１０で混合する。

安定したレポーター細胞のカプセル化のプロトコル
－カプセル化のための細胞の準備
実施例１の「カプセル化のための細胞の準備」と同じプロトコルである。
－カプセル化
出願人が遠赤色標識アルギン酸を使用してＢＣ細胞をカプセル化し、非標識アルギン酸を使用してＬＣ細胞をカプセル化することを除いて、実施例１の「カプセル化」と同じプロトコルである。

共培養を行うためのプレートへのＢＣカプセル及びＬＣカプセルの装填
カプセルの培地を吸引し、約５ｍｌの培地を残す。
カプセルが通過できるチップを備えた１ｍｌのピペットで、残りの培地で皿の表面を洗浄する。
１５ｍｌの管にできるだけ多くのカプセルを収集する。
５ｍｌの培地を添加して１ｍｌのピペットで残りのカプセルを収集する。
カプセルを３００ｒｐｍで１分間遠心分離し、培地を吸引し、カプセルを１０ｍｌの細胞培養培地で再懸濁する。
・カプセルを３００ｒｐｍで１分間遠心分離し、培地を吸引し、カプセルの上部に約２００μｌの培地を残す。
・カプセルを適切な量でウェルに移す前に懸濁状態に維持するために連続的に上下にピペッティングすることにより、９６ウェルのイメージング用プレートのウェル内にカプセルを分注する。
ウシ胎児血清をウェルに添加するか又は添加せずに、共培養を３７℃で９６時間インキュベートする。

共培養におけるＢＣ細胞とＬＣ細胞の蛍光強度の測定
カプセル化３Ｄ細胞共培養を含む９６ウェルプレートの画像取得は、自動共焦点顕微鏡（ＩＸＭ－Ｃ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（商標））で実行する。４倍対物レンズを使用し、各蛍光チャネルについてウェルごとに１２個の異なる領域で１０個のｚステップを実行する。

また、本明細書で使用する方法は、典型的なハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）手順であり、これは、現在、医薬品産業で創薬に選択されている方法である。画像取得後、関連するオブジェクトマスクを生成する一連のセグメンテーションプロセスを適用することにより、画像内の異なる細胞レポーター及びカプセルを同定する第１のステップと、マスクが適用された元の画像からいくつかのパラメータ（蛍光強度、サイズ、形状など）を抽出する第２のステップとの２つのステップで画像分析を行う。この画像解析プロセスにより、両方の共培養細胞型の（ＦＵＣＣＩレポーターによって報告される）各増殖状態を同時に正確に定量化することができる。

結果
図２は、２つの異なる蛍光レポーター（増殖細胞に用いられる緑色蛍光レポーター遺伝子、増殖していない細胞に用いられる赤色蛍光レポーター遺伝子の両方がＦＵＣＣＩレポーターに含まれる）によって報告された２つの異なる細胞状態が、２つの異なるアルギン酸カプセル（ＢＣ細胞に対して遠赤色標識アルギン酸カプセル、ＬＣ細胞に対して非標識アルギン酸カプセル）にカプセル化された２つの異なる細胞型の３Ｄ共培養において同時に定量化することができることを示す。図２の結果は、自動顕微鏡取得とそれに続くソフトウェアＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）による画像処理、分析というＨＣＳ手順によってレポーターの蛍光をそれらどうしで、及び標識アルギン酸カプセルの蛍光と区別することができることも示す。

実施例３
説明
非標識カプセル中の二重レポーターＦＵＣＣＩ（表２）を安定して発現するカプセル化ＢＣ細胞と、遠赤色標識カプセル中のレポーターｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３（表２）を安定して発現するカプセル化ＢＣ細胞との共培養を、緑色標識したカプセル中のカプセル化ＬＣ細胞と共培養するか又は培養せずに、タモキシフェンの濃度を増加させながら９６時間処理する。アポトーシスの誘導は、レポーターｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３を安定して発現するＢＣ細胞で自動共焦点顕微鏡（ＨＣＳ）によって測定し、増殖は、二重レポーターＦＵＣＣＩを安定して発現するＢＣ細胞で同時に測定する。

材料及び方法
２つのＢＣの安定したレポーター細胞株を樹立するプロトコル
二重レポーターＦＵＣＣＩを安定して発現するＢＣ細胞株を作製することに加えて、出願人が、ｐＨＡＧＥレンチウイルスベクター（ｐＨＡＧＥ－ｆＥＦ１－ｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３）に組み込まれたレポーターを含む自家製のレンチウイルスコンストラクトを用いて、レポーターｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３（表２）を安定して発現するＢＣ細胞株も作製したことを除いて、実施例２の「安定したレポーター細胞株を樹立するプロトコル」と同じプロトコルである。

アミン基を有する蛍光体によるアルギン酸の染色（表３を参照）
実施例２の「アミン基を有する蛍光体によるアルギン酸の染色（表３を参照）」と同じプロトコルである。

安定したレポーター細胞のカプセル化のプロトコル
－カプセル化のための細胞の準備
実施例１の「カプセル化のための細胞の準備」と同じプロトコルである。
－カプセル化
非標識アルギン酸を使用して二重レポーターＦＵＣＣＩを安定して発現するＢＣ細胞をカプセル化し、遠赤色標識アルギン酸を使用してレポーターｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３を安定して発現するＢＣ細胞をカプセル化し、緑色標識アルギン酸を使用してＬＣ細胞をカプセル化することを除いて、実施例１の「カプセル化」と同じプロトコルである。

共培養を行うためのプレートへのカプセルの装填と処理
以下のことを除いて、実施例１の「プレートへのＬＣカプセルの装填と処理」と同じプロトコルである。
カプセルを適切な量でウェルに移す前に懸濁状態に維持するために連続的に上下にピペッティングすることにより、９６ウェルのイメージング用プレートのウェル内にカプセルを分注する。
ウェルの半分はＬＣカプセルで満たされない（ＢＣ細胞のみの状態）。
全てのウェルを１０ｐＭの１７β－エストラジオール（Ｅ２）で処理し、その後に１μＭ～１０μＭの範囲の濃度が異なるタモキシフェン又は４－ヒドロキシタモキシフェンを添加する。
プレートを３７℃で９６時間インキュベートする。

共培養におけるＢＣ細胞の蛍光強度の測定
画像解析プロセスにより、ＦＵＣＣＩレポーターを発現するＢＣ細胞及びｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３レポーターを発現するＢＣ細胞における（ＦＵＣＣＩレポーターによって報告される）各増殖状態及び（ｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３レポーターによって報告される）アポトーシスの誘導をそれぞれ同時に正確に定量化することができることを除いて、実施例２の「共培養におけるＢＣ細胞とＬＣ細胞の蛍光強度の測定」と同じプロトコルである。

結果
図３は、ＬＣ細胞、レポーター遺伝子ｚｉｐＧＦＰ－Ｃａｓｐ３を安定して発現するＢＣ細胞及び二重レポーター遺伝子ＦＵＣＣＩを安定して発現するＢＣ細胞の３種類のカプセル化された細胞の多重培養を示す。カプセルの色により各種類の細胞を同定することができ、細胞の蛍光強度を測定して各種類のカプセルにおける特定の生物学的活性（ここでは、非標識カプセル中のＢＣ細胞の増殖又は遠赤色カプセル中のＢＣ細胞のアポトーシス）を定量化することができる。この特定の実験では、出願人は、異なる色のカプセルを使用して、同じ蛍光色を持つ２つの異なるレポーターを区別し、追加のカプセル色を使用して第２の細胞型（ＬＣ細胞）を同定した。

図４及び図５は、出願人が２つの異なる生物学的活性（細胞増殖及びアポトーシス）のレポーターを使用して、多重培養（共培養）ウェルにおける２つの異なる生物学的活性を同時に測定できることを示す。この実験では、出願人は、マイクロモル範囲の濃度のタモキシフェンを使用した。タモキシフェンのこれらの濃度では、細胞増殖の阻害は飽和するが、アポトーシスは用量依存的に誘導される。出願人は、図４において、ＢＣ細胞におけるアポトーシスの誘導が、ＬＣ細胞との共培養においてのみ用量依存的にタモキシフェンによって増加することを観察することができる。図５において、細胞増殖阻害は１μＭですでに最大であり、タモキシフェンの濃度を高くしても更に増加することができない。この実験は、本発明の方法を使用すると、出願人が多重培養中に２つの異なる生物学的活性を独立して同時に測定することができることを示す。出願人は、ＬＣ細胞の存在がＢＣ細胞に対するタモキシフェンの効率を向上させることを再び示した。重要なことに、この実験により、同じ培養ウェル内の同じ分子の２つの異なる薬理学的効果（細胞増殖の阻害及びアポトーシスの誘導）を確実に区別することができる。

Claims (21)

1. １つ以上の細胞型における多数の生物学的プロセスを分析できるインビトロ薬物試験方法であって、
   同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される前記１つ以上の細胞型のそれぞれにおいて、分析される生物学的プロセスごとに少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子を発現するステップａ）と、
   アルギン酸生体高分子を用いて同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される前記１つ以上の細胞型のそれぞれをカプセル化し、複数の細胞型がある場合、カプセルの全て又は１つを除く全てを異なる種類の蛍光体でそれぞれ標識するステップｂ）と、
   ステップｂ）の全てのカプセル化された、同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される細胞型を、標識又は非標識アルギン酸生体高分子で任意選択にカプセル化された１つ以上の追加の非標識細胞型と任意選択に共培養するステップｃ）と、
   任意選択に前記共培養を１つ以上の薬物に曝露するステップｄ）と、
   試験される前記任意選択の１つ以上の薬物への曝露の前及び／又は後に、各蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子の蛍光強度又は生物発光強度を光学イメージングにより個別に分析することにより、ステップｃ）の同じインビトロ薬物試験アッセイで分析される各細胞型における前記多数の生物学的プロセスの活性を測定するステップｅ）と
   を含み、複数の細胞型が共培養される場合、分析される各細胞型は、分析される前記細胞型を含むアルギン酸カプセルに関連する蛍光体標識の種類に基づいて、光学イメージングにより同定される、インビトロ薬物試験方法。
2. 前記多数の生物学的プロセスは、細胞増殖、炎症、腫瘍成長又は阻止、薬物毒性、血管新生、免疫刺激、解毒反応、ホルモン反応、生体異物応答、遺伝毒性ストレス応答及びアポトーシスを含むリストから選択される、請求項１に記載のインビトロ薬物試験方法。
3. 前記１つ以上の細胞型は、前記細胞型間の予想若しくは確認された生理学的相互作用に基づいて、及び／又は前記試験される１つ以上の薬物に対する前記１つ以上の細胞型の予想若しくは確認された効果に基づいて、共培養のために選択される、請求項１又は２に記載のインビトロ薬物試験方法。
4. 前記共培養を１つ以上の薬物に曝露するステップｄ）を含む、請求項１に記載のインビトロ薬物試験方法。
5. 前記共培養を１つ以上の蛍光試薬に曝露して、１つ以上の追加の生物学的プロセスを測定するステップｆ）を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験方法。
6. 光学イメージングは、顕微鏡及び／又はルミノメータによって実行されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験方法。
7. 前記１つ以上の細胞型は、肝細胞、腫瘍細胞、脳細胞、上皮細胞、内皮細胞、免疫系細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、肺細胞、腎臓細胞、動脈細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、膵臓細胞、腸細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、真菌細胞又は細菌の細胞株又は初代組織細胞サブセットを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験方法。
8. インビトロ薬物試験アッセイで分析される前記１つ以上の細胞型の少なくとも１つ、又はステップｃ）の任意選択に追加された非標識細胞型の少なくとも１つは、肝細胞であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験方法。
9. カプセル化された前記１つ以上の細胞型の少なくとも１つは、患者の癌サンプルに由来することを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験方法。
10. 前記１つ以上の細胞型の少なくとも１つは、細菌又は真菌細胞であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験方法。
11. 前記試験される薬物は、抗生物質又は殺菌剤である、請求項１０に記載のインビトロ薬物試験方法。
12. 前記分析される多数の生物学的プロセスの少なくとも１つは、抗微生物薬耐性又は抗微生物薬感受性、細菌増殖、殺菌活性又は静菌活性を含むリストから選択される、請求項１０に記載のインビトロ薬物試験方法。
13. １つ以上の標的細胞型における多数の生物学的プロセスに対する１つ以上の目的の薬物の効果を試験するのに適するインビトロ薬物試験キットであって、
    前記１つ以上の標的細胞型において分析される生物学的プロセスごとに蛍光レポーター遺伝子又は生物発光レポーター遺伝子を発現する１つ以上のアルギン酸カプセル化された標的細胞型を含む少なくとも１つの使用準備済のマイクロウェルプレートを含み、複数の細胞型がある場合、カプセルの全て又は１つを除く全ては異なる種類の蛍光体でそれぞれ標識される、インビトロ薬物試験キット。
14. 前記１つ以上の標的細胞型の少なくとも１つは肝細胞である、請求項１３に記載のインビトロ薬物試験キット。
15. 蛍光体で標識された、アルギン酸カプセル化された前記１つ以上の標的細胞型は、１つ以上の患者由来細胞型と共培養される、請求項１３又は１４に記載のインビトロ薬物試験キット。
16. 前記１つ以上の患者由来細胞型は、分析される多数の生物学的プロセスごとに少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子を含むように遺伝子操作される、請求項１５に記載のインビトロ薬物試験キット。
17. 前記１つ以上の患者由来細胞型は、それぞれ、蛍光体で標識されたアルギン酸生体高分子でカプセル化される、請求項１５又は１６に記載のインビトロ薬物試験キット。
18. 分析される前記多数の生物学的プロセスは、細胞増殖、炎症、腫瘍成長又は阻止、薬物毒性、血管新生、免疫刺激、解毒反応、ホルモン反応、生体異物応答、遺伝毒性ストレス応答及びアポトーシスを含むリストから選択される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験キット。
19. 前記１つ以上の標的細胞型は、肝細胞、腫瘍細胞、脳細胞、上皮細胞、内皮細胞、免疫系細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、肺細胞、腎臓細胞、動脈細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、膵臓細胞、腸細胞、線維芽細胞又は皮膚細胞を含むリストから選択される、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験キット。
20. 前記カプセル化された標的細胞型における生物学的プロセスに対する前記１つ以上の薬物の効果を同定するために、前記１つ以上の薬物は、前記少なくとも１つの使用準備済のマイクロウェルプレートのウェルごとに試験される、請求項１３～１９のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験キット。
21. 前記薬物間の相互作用を同定するために、複数の薬物が、前記少なくとも１つの使用準備済のマイクロウェルプレートのウェルごとに試験される、請求項１３～１９のいずれか一項に記載のインビトロ薬物試験キット。

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