CN105866265B - 仿生拮抗血管内皮细胞与白细胞粘附毛细管及其电泳方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种仿生拮抗血管内皮细胞与白细胞粘附毛细管及其电泳方法及用途，包括将细胞贴附培养于毛细管内壁作为固定相，在流动相中加入拮抗受体‑配体相互作用的化合物，并利用该毛细管进样分析细胞的方法，利用此法可以筛选得到具有某种特定活性的化合物。本研究建立的以贴壁培养细胞层作为固定相的毛细管进样分析细胞的全新毛细管电泳方法可以推广并应用于模拟生理环境条件下利用细胞间粘附机制快速筛选抗粘附药物。

Description

仿生拮抗血管内皮细胞与白细胞粘附毛细管及其电泳方法及 用途

技术领域

本发明涉及毛细管及其制备方法和应用，尤其涉及仿生拮抗血管内皮细胞与白细胞粘附毛细管及其电泳方法及用途。

背景技术

大多数生物分子在发挥其生理功能时，都与其目标分子发生特异性相互作用，例如配体和受体、凝集素和多糖蛋白、酶和底物、抗原和抗体等。对生物分子及其功能配体相互作用的表征已成为生物化学研究的重点之一，有助于深入认识并了解生物大分子间各种功能的结构基础以及作用机制，有利于新药研发。

炎症反应发生时，受炎症部位释放趋化因子的刺激，吞噬细胞脱颗粒，β2整合素表达增加，与血管内皮细胞上配体粘附增加，并跨内皮运动至炎症部位，使局部白细胞增多并释放反应性氧化代谢物和水解酶，发挥防御功能同时造成局部组织和微血管的损伤。嗜中性粒细胞与内皮细胞的粘附结合是溢出至外周损伤的先决步骤。在白细胞与内皮细胞粘附过程中，Mac-1与ICAM-1发生较强的特异性结合。Mac-1即CD11b/CD18,α_Mβ₂整合素，是白细胞游走、趋化、吞噬的基础，参与机体防御作用及免疫应答。它分子结构中有两个重要区域：识别蛋白配体的I域和识别多糖的凝集素部位。细胞间粘附分子ICAM-1是内皮细胞表面主要的粘附分子，是Mac-1的配体，在介导白细胞与内皮细胞粘附、跨越内皮细胞及向血管外迁移中起着重要的作用。ICAM-1在静息的内皮细胞、白细胞上呈低水平表达。在IL-1β、IFN-γ和TNF-α等细胞因子作用下，ICAM-1可以在多种细胞上的表达明显上调。

细胞粘附分子与肿瘤转移机制也密切相关。β₂-整合素-ICAM-1相互作用在调控白细胞-肿瘤细胞聚集动力学中起到重要作用，不仅可以诱导白细胞自身行为，还可以促进白细胞-肿瘤细胞间在血流中的聚集、趋边，以及与血管内皮层的碰撞。转移性肿瘤在异位器官穿过血管壁首先是与内皮细胞的特异性粘附，这与不同器官的血管床选择表达粘附分子相关。对于经过初步筛选得到的这类机制、结构全新的化合物进行初步药效学评估十分重要，研究其在炎症模型和肿瘤转移模型上的药效水平迫切且关键。

在对于Gu-4的抗粘附作用研究过程中，已明确Gu-4是通过作用于白细胞整合素Mac-1的α亚基CD11b而拮抗粘附的。以荧光素标记Gu-4为探针，初步证实Gu-4可以与CD11b的Lectin结构域结合从而发挥作用。对于Gu-4这样一类机制、结构全新的化合物进行更为广泛的药效学、药代动力学研究十分必要和迫切。因此，针对以Gu-4为代表的经毛细管电泳初步筛选得到的对CD11b具有靶向性活性的化合物开展进一步的体内体外活性水平研究十分重要。

将细胞固定于色谱柱内进行受体配体相互作用研究并应用于药物筛选是近年来发展的新技术。该技术突出的优势在于对不可分离的细胞膜受体进行固定化，从而克服传统生物学方法中存在的准确率低、毒性大、成本高等问题。细胞固定化技术利用物理或化学方法将细胞固定在合适的载体上，使其发挥生物活性，比酶固定化更简便、快捷、经济。

毛细管电泳是离子或荷电离子以电场为驱动力，基于电泳淌度不同而实现分离的一种新兴分离技术。大多数胶体颗粒由于表面的离子化分子而带有表面电荷，可以在带有直流电的电场中运动。细菌、病毒及真菌等微生物的毛细管电泳行为与胶体颗粒物质类似。它们具有富含蛋白、脂多糖、脂分子及磷壁酸等物质的膜分子和细胞壁，因而具有特异性电荷。细胞可以看做一个表面带负电荷的球形粒子，其电泳淌度是表征细胞表面电荷的参数之一。在介质特性一定的情况下，细胞电泳淌度主要与细胞的大小、形状和有效电荷相关，而主要由细胞的电荷密度决定。毛细管电泳可将细胞当做“离子”进行分析，具有高灵敏度、高效率、高分辨率、进样量少、成本低等优点。

发明内容

本发明提供了一种仿生拮抗血管内皮细胞与白细胞粘附毛细管及其电泳方法及用途。

本发明通过利用整合素Mac-1受体超表达的细胞固定毛细管柱，使用细胞固定化毛细管电泳方法(imobilized cells cpillary electrophoresis,ICCE)筛选得到活性化合物Gu-4。通过开发在毛细管内壁培养活细胞以及进一步将活细胞贴附于毛细管内壁并进行固定处理的方法，提供一种新型的毛细管柱，制备这种具有经过固定处理的细胞层作为固定相而该细胞层表面的受体保持天然构象和生物活性的毛细管方法，并且开发了将这种新型的毛细管通过毛细管电泳在生物技术领域比如药物筛选方面的应用。

本发明提供了一种毛细管，其中在所述毛细管的内壁形成有固定相，所述固定相包括牢固贴附于所述内壁的细胞层，所述细胞层的细胞是表面超表达配体ICAM-1细胞，并且所述细胞层表面的配体保持天然构象和生物活性；所述毛细管能够用来通过观察受体-配体间相互作用和细胞-细胞间相互作用，从而模拟生理环境条件下利用细胞间粘附机制快速筛选抗粘附药物。

本发明首次将超表达ICAM-1配体的细胞贴壁培养在毛细管柱内壁形成固定相，并将超表达整合素Mac-1的细胞进行电泳分析，通过观察其电泳色谱行为研究受体-配体间相互作用和细胞-细胞间相互作用，在接近生理条件下模拟炎症反应中游走的白细胞与内皮细胞之间的粘附作用，在缓冲体系中加入不同浓度拮抗剂Gu-4，模拟血药浓度，定性和定量分析其对超表达整合素Mac-1的细胞色谱峰型的影响评价其拮抗能力。

本发明还提供了所述毛细管的制备方法，包括以下步骤：

对毛细管进行前处理；

对细胞进行培养，然后注入所述毛细管；

对所述细胞在所述毛细管内进行进一步的培养；

使所述细胞在所述毛细管内贴壁生长；以及

对贴壁生长的所述细胞进行固定处理，使所述细胞牢固地贴附于所述毛细管的内壁，并且使所述细胞表面表达的受体保持天然构象和生物活性。

本发明还提供了一种细胞分析方法，包括：提供权利要求1-4所述的毛细管，其内壁贴附有经过固定处理并作为固定相的细胞层；提供电泳装置；采取进样前处理并确定电泳条件，其中进样分析的细胞层表面的受体保持天然构象和生物活性；将细胞样品进入所述毛细管；在流动相中加入化合物作为拮抗剂，其为拮抗受体-配体相互作用的化合物；对所述细胞样品进行电泳分析；以及对所述细胞样品进行检测分析。

本发明进一步对于筛选得到的活性化合物Gu-4进行白细胞-内皮细胞粘附活性实验和肿瘤转移模型——细胞划痕实验药效学评价，最后以环磷酰胺为阳性对照，进行了动物水平——抗肿瘤转移模实验研究，其结果表明静脉给药Gu-4(5、10、20mg/kg)具有很好的抑制B16黑色素瘤转移能力,且具有良好的量效关系。

本发明包括将超表达ICAM-1配体的细胞贴壁培养在毛细管柱内壁形成固定相，在流动相中加入拮抗受体-配体相互作用的化合物，并将超表达受体Mac-1的细胞进行电泳分析，通过观察其电泳色谱行为研究受体-配体间相互作用和细胞-细胞间相互作用，在接近生理条件下模拟炎症反应中游走的白细胞与内皮细胞之间的粘附作用，在缓冲体系中加入不同浓度拮抗剂Gu-4，模拟血药浓度，定性和定量分析其对超表达整合素Mac-1的细胞色谱峰型的影响评价其拮抗能力。

本发明建立的全新毛细管电泳方法可以推广并用于在模拟生理环境条件下利用细胞间粘附机制快速筛选抗粘附药物，提供了在生物技术领域的应用。所述生物领域包括药物筛选、生物活性大分子与活性配体相互作用或与化合物相互作用、药物成分分析、药物活性成分纯化及鉴定等方面。

附图说明

图1显示根据本发明的一种实施方式通过共聚焦显微镜采集的Mac-1-FP转染HEK293细胞的图像(A至D)。其中：A为共转染pEGFP-CD11b和pEYFP-CD18质粒且PMA刺激2h后培养皿贴壁生长表达Mac-1-FP的HEK 293细胞的图像；B为细胞核；C为生长表达CD11b-EGFP的HEK 293细胞的图像，CD11b-EGFP定位于细胞膜；D为生长表达CD18-EYFP的HEK 293细胞的图像，CD18-EYFP定位于细胞膜。

图2显示根据本发明的一种实施方式通过共聚焦显微镜采集的Mac-1-FP转染HEK293细胞贴壁生长于毛细管内壁的图像(A至D)。其中：A为共转染pEGFP-CD11b和pEYFP-CD18质粒且PMA刺激2h的表达Mac-1-FP的HEK 293细胞的图像；B为细胞核；C为生长表达CD11b-EGFP的HEK 293细胞的图像，CD11b-EGFP定位于细胞膜；D为生长表达CD18-EYFP的HEK 293细胞的图像，CD18-EYFP定位于细胞膜。

图3显示根据本发明的一种实施方式通过共聚焦显微镜采集的培养皿贴壁生长ICAM-1-EGFP转染HEK 293细胞的图像(A至F)。其中：A为HEK 293细胞核；B为表达ICAM-1-EGFP的HEK 293细胞的图像，ICAM-1-EGFP定位于细胞膜；C为A和B图像的重叠；D，E，F分别为A，B，C的局部放大。

图4显示根据本发明的一种实施方式通过共聚焦显微镜采集的ICAM-1-EGFP转染HEK 293细胞贴壁生长于毛细管内壁的图像(A至F)。其中：A为转染pEGFP-ICAM-1质粒且的表达ICAM-1-EGFP的HEK 293细胞的图像；B为细胞核；C为生长表达ICAM-1-EGFP的HEK 293细胞的图像，ICAM-1-EGFP定位于细胞膜；D，E，F分别为A，B，C的局部放大。

图5为本发明具体实施的毛细管电泳图(A，B，C，D和E)，其中：A为DMSO在未涂层管、正常HEK 293细胞贴壁管、CD18-EYFP超表达HEK 293细胞贴壁管、CD11b-EGFP超表达HEK293细胞贴壁管和Mac-1-FP超表达HEK 293细胞贴壁管中的色谱行为；B为乳糖在未涂层管、正常HEK 293细胞贴壁管、CD18-EYFP超表达HEK 293细胞贴壁管、CD11b-EGFP超表达HEK293细胞贴壁管和Mac-1-FP超表达HEK 293细胞贴壁管中的色谱行为；C为Gu-4在未涂层管、正常HEK 293细胞贴壁管、CD18-EYFP超表达HEK 293细胞贴壁管、CD11b-EGFP超表达HEK293细胞贴壁管和Mac-1-FP超表达HEK 293细胞贴壁管中的色谱行为；D为将CD11b超表达细胞贴壁毛细管保存在4℃冰箱，10天后取出与正常细胞管贴壁对比的色谱行为；E为Gu-4在CD11b超表达HEK 293细胞贴壁毛细管中的色谱峰的日内、日间、批间重现性。

图6为不同浓度下的化合物Gu-4研究浓度与峰形之间的相互作用的关系，其中：A为化合物Gu-4浓度低于50μM时的结合常数趋于常数；B为峰形随着浓度变化；C为各个浓度下的化合物Gu-4与CD11b超表达细胞相互作用的动力学参数；D为20μM浓度下Gu-4在CD11b超表达细胞管中各个动力学参数的RSD值；E为20μM浓度下Gu-4在α_Mβ₂超表达细胞管中各个动力学参数的RSD值。

图7为细胞在200μm I.D.毛细管中的电泳行为，其中：A，B，C分别为1.5kV、1.2kV和1.0kV三种条件下细胞在200μm I.D.毛细管中的色谱行为；D为选用反向进样法，即选用10.2cm为有效长度时，细胞在200μm I.D.细胞贴壁毛细管中的色谱行为；E为不同细胞悬液密度进样分析的色谱行为。

图8为细胞在毛细管电泳中相互作用的色谱行为，其中：A为HEK 293和Mac-1-HEK293两种细胞在超表达ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的色谱行为；B为在缓冲介质中加入不同浓度的Gu-4(40μM,4μM,40nM)后的Mac-1-HEK 293在ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的色谱行为；C为在缓冲介质中加入乳糖后的Mac-1-HEK 293在ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的色谱行为。

图9为白细胞-内皮细胞粘附实验结果，其中：A为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在皿中的生长状态；B为人急性白血病单核细胞(THP-1)在皿中的生长状态；C为经TNF-α或者PMA刺激后的已标记绿色荧光标签的THP-1细胞粘附在HUVEC细胞上的形态；D为加入Gu-4浓度为0，0.04μM，0.4μM，4μM，40μM五个数值时的荧光读数；E为在40μM Gu-4的作用下，白细胞的粘附数据统计。

图10为划痕实验结果，其中：A为在0h和24h时加入不同浓度的Gu-4对划痕愈合能力的影响；B为与对照组(0μM)相比，加入0.04μM,0.4μM,4μM和40μM的Gu-4分别可以使24h时NCI-H520细胞的划痕愈合面积减少的数据统计。

图11为肿瘤转移模型的实验结果，其中：A，B，C，D，E分别为生理盐水组、CTX组、Gu-4低(5mg/kg/d)组、Gu-4中(10mg/kg/d)组以及Gu-4高(20mg/kg/d)组小鼠肺部情况；F为生理盐水组、CTX组、Gu-4低(5mg/kg/d)组、Gu-4中(10mg/kg/d)组以及Gu-4高(20mg/kg/d)组小鼠肺部转移集落数据统计。

具体实施方式

在下文中结合一些具体的实施方式对本发明作进一步的、示例性的描述，包括在毛细管内培养细胞并将其贴附于毛细管内表面进而制备以活细胞层作为固定相的毛细管的方法，以及这种新型的毛细管通过毛细管电泳在生物技术领域比如药物筛选方面的用途。

在一种实施方式中，将一种细胞，例如生物活性大分子超表达的细胞，培养在毛细管内并使得细胞贴壁生长，从而获得其内壁贴附有活细胞的毛细管。

在一种实施方式中，对毛细管进行前处理，在无菌条件下对所述毛细管进行涂层、冲洗及冲干的处理。在一种实施方式中，还进一步包括在毛细管内注入浓度为例如0.1-1.0mg/L的多聚赖氨酸(PLL)溶液，然后孵化1.5-4.0小时。

在一种实施方式中，将经过适当培养的细胞注入毛细管中进行进一步的培养，例如，将经电转后的细胞被置于培养基中悬浮细胞至密度例如为1.0×10⁵-1.0×10⁸个/mL，随后注入经前处理的毛细管内，再将该毛细管浸入培养基(例如含有10-20％FBS的RPMI 1640培养基)，在37℃，5％CO₂孵箱内培养，其培养时间为例如10-48小时。

在一种实施方式中，当生物活性大分子超表达的细胞在毛细管内贴壁生长后，对其进行固定处理，使得所述细胞表面表达的受体保持天然构象和生物活性，牢固地贴附于所述毛细管的内表面。该固定处理步骤包括，对活细胞层采用例如4％的多聚甲醛进行处理，其处理时间可为例如10-40分钟。

本发明所提供的一种实施方式还包括采用合适的细胞贴附方法。针对Mac-1从细胞膜分离纯化时其天然构象会发生改变的情况，在一个非限制性的实施方式中，选择了对细胞活性影响小、操作条件温和、效果持久的离子吸附法作为Mac-1超表达细胞的促贴附手段，将细胞培养在毛细管内。

在提供上述将细胞贴附于毛细管色谱柱内壁的方法的同时，本发明的实施方式还包括将所述毛细管色谱柱用于生物技术例如包括药物筛选的操作方法。在本发明的一种实施方式中，根据特定的操作条件，以化合物Gu-4为阳性对照以及二甲基亚砜(DMSO)和乳糖为阴性对照进行了方法验证。结果表明，阳性化合物Gu-4与阴性对照DMSO和乳糖与在超表达Mac-1细胞贴附的毛细管色谱柱内的色谱行为完全不同，据此可以定性判断化合物与受体之间是否存在相互作用。

本发明所提供的一种实施方式还包括将所述毛细管用于毛细管电泳的毛细管电泳系统及其方法。所述毛细管电泳方法包括：提供本发明所述的毛细管，其内壁贴附有经过固定处理并作为固定相的细胞层；提供电泳装置；将样品导入所述毛细管；对所述样品进行电泳分析；以及对所述样品进行检测分析。

在本发明的一些实施方式中，将本发明的毛细管用于毛细管电泳分析并通过采用不同浓度的化合物Gu-4来验证峰型是否符合非线性色谱理论(Non-linearChromatography,NLC)的特征峰型，以此定量计算具有相互作用化合物的动力学参数。

本发明所提供的一种实施方式还包括采用合适的细胞贴附方法。针对ICAM-1从细胞膜分离纯化时其天然构象会发生改变的情况，在一个非限制性的实施方式中，选择了对细胞活性影响小、操作条件温和、效果持久的离子吸附法作为ICAM-1超表达细胞的促贴附手段，将细胞培养在毛细管内。

在提供上述将细胞贴附于毛细管色谱柱内壁的方法的同时，本发明的实施方式还包括将所述毛细管色谱柱用于生物技术例如包括药物筛选的操作方法。在本发明的一种实施方式中，根据特定的操作条件，以化合物Gu-4为阳性对照以及乳糖为阴性对照进行了方法验证。结果表明，阳性化合物Gu-4与阴性对照乳糖与在超表达ICAM-1细胞贴附的毛细管色谱柱内的色谱行为完全不同，据此可以定性判断受体与配体之间、化合物与受体之间是否存在相互作用。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于示例说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1、Mac-1超表达细胞的培养

HEK 293细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS，Canada GIBCO)的RPMI 1640培养基中，其中含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。将400μl HEK 293细胞(4×10⁶)通过电脉冲发生器(Electro Square PoratorECM830,BTX,San Diego,CA)，在电压123V，脉冲时间20ms条件下，瞬时转染pEGFP-CD11b和pEYFP-CD18质粒各10μg。36h后加入终浓度为1-5μg/mL的PMA刺激不同时间后，将细胞培养于盖玻片上，利用激光共聚焦显微镜观察，细胞表面Mac-1-FP蛋白的表达情况可见图1(A～D)，证明大多数细胞表面都表达了配体Mac-1。

实施例2、贴附超表达Mac-1活细胞的石英毛细管色谱柱的制备

石英毛细管色谱柱依次用甲醇、0.1M NaOH和去离子水冲洗和消毒。在无菌操作条件下冲干毛细管后，注入0.1-1.0mg/mL的多聚赖氨酸(PLL)并孵化1.5-4.0小时待用。经电转后的细胞回到培养基悬浮细胞至密度为1.0×10⁵-1.0×10⁸个/mL，并注入经前处理的毛细管色谱柱内，毛细管色谱柱浸入含有10-20％FBS的RPMI 1640培养基中，在37℃，5％CO₂孵箱内培养12小时。加入终浓度为1-5μg/mL的PMA刺激2小时。为了保持细胞的结构，贴附细胞的毛细管色谱柱需要用4％的多聚甲醛固定10-40min，再用PBS冲洗后待用。这些Mac-1超表达细胞贴壁生长于毛细管色谱柱的内壁效果见图2(A～D)。结果表明Mac-1超表达细胞在毛细管色谱柱内贴壁生长良好，细胞固定涂层均匀。此方法制备的毛细管色谱柱在数月内未见细胞脱落，制备后4℃于PBS浸泡保存30天仍保持着药物筛选活性。

实施例3、ICAM-1超表达细胞的培养

HEK 293细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS,Canada，GIBCO)的RPMI 1640培养基中，其中含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。将400μl HEK 293细胞(4×10⁶)通过电脉冲发生器(Electro Square PoratorECM830,BTX,San Diego,CA)，在电压123V，脉冲时间20ms条件下，瞬时转染pEGFP-ICAM-1质粒20μg，将细胞培养于盖玻片上。37℃，5％CO₂孵箱内培养36h后，PBS洗涤两遍，使用4％多聚甲醛固定20min，PBS洗涤两遍，再使用工作浓度为1μg/ml的核染料Hochsst染核15min，PBS洗涤两遍后利用激光共聚焦荧光显微镜观察，细胞表面ICAM-1-EGFP蛋白的表达情况可见图3(A～F)，证明大多数细胞表面都表达了配体ICAM-1。

实施例4、贴附超表达ICAM-1活细胞的石英毛细管色谱柱的制备

石英毛细管色谱柱依次用甲醇、0.1M NaOH和去离子水冲洗和消毒。在无菌操作条件下冲干毛细管后，注入0.1-1.0mg/mL的多聚赖氨酸(PLL)并孵化1.5-4.0小时待用。经电转后的细胞回到培养基悬浮细胞至密度为1.0×10⁵-1.0×10⁸个/mL，并注入经前处理的毛细管色谱柱内，毛细管色谱柱浸入含有10-20％FBS的RPMI 1640培养基中，在37℃，5％CO₂孵箱内培养12小时。为了保持细胞的结构，贴附细胞的毛细管色谱柱需要用4％的多聚甲醛固定10-40min，再用PBS冲洗后待用。这些ICAM-1超表达细胞贴壁生长于毛细管色谱柱的内壁效果见图4(A～F)。结果表明ICAM-1超表达细胞在毛细管色谱柱内贴壁生长良好，细胞固定涂层均匀。此方法制备的毛细管色谱柱在数月内未见细胞脱落。

实施例5、贴附超表达Mac-1活细胞的石英毛细管色谱柱用于化合物筛选方法的验证

乳糖衍生物Gu-4作为新型的Mac-1拮抗剂，具有对Mac-1的强亲和力以及良好的粘附抑制活性。因此，在本实验中将化合物Gu-4作为阳性化合物，DMSO和乳糖为阴性化合物，分别研究了其在未涂层管、正常HEK 293细胞贴壁管、CD18-EYFP超表达HEK 293细胞贴壁管、CD11b-EGFP超表达HEK 293细胞贴壁管和Mac-1-FP超表达HEK 293细胞贴壁管中的色谱行为，实验结果如图5所示。比较DMSO在不同色谱柱上的电泳图发现，峰高不变，峰形稍有展宽。化合物Gu-4在细胞包被毛细管色谱柱中电泳峰的峰高明显降低，峰展宽并拖尾，表明阳性化合物Gu-4与固定相发生了很强的亲和作用且其作用靶点是CD11b。

亲和色谱中的色谱峰形的变化是化合物与固定相之间的特异性和非特性相互作用的结果。通常，由于化合物与固定相的解离速率高于结合速率，使得色谱峰表现为展宽，拖尾的非高斯峰形。在色谱容量一定的情况下，化合物峰形偏离高斯峰的程度与化合物的浓度相关。而NLC理论正好解释了浓度与峰形变化的关系以及各种动力学参数的计算方法。本发明用CD11b超表达细胞贴壁的毛细管色谱柱对不同浓度(20μM,50μM,100μM,200μM，500μM)的化合物Gu-4进行电泳分析。所得的不对称峰型如图6中的谱图所示，可用非线性色谱模型进行解释，并用软件拟合峰型，计算结合常数(K)、结合速率常数(k_a)、解离速率常数以及容量因子(k’)。

实施例6、贴附活细胞的毛细管色谱柱中用于细胞间相互作用研究方法的建立

为了模拟生理条件选用磷酸盐缓冲体系，同时考察了细胞悬液密度、操作电压、缓冲溶液和毛细管长度等因素的影响，实验结果如图7所示。综合电渗流、热效应、细胞出峰时间和响应灵敏度等因素，本实验最终选择pH值为7.40的40mM PB作为缓冲液，操作电压为3～1.0kV，200μm I.D.毛细管(10.2/30.2cm)，细胞悬液密度为1.0×10⁵-1.0×10⁸个/mL。

实施例7、贴附超表达ICAM-1活细胞的石英毛细管色谱柱用于化合物筛选方法的验证

以乳糖类衍生物Gu-4作为考察拮抗Mac-1与ICAM-1之间的受体-配体相互作用的阳性化合物，乳糖作为阴性对照化合物，分别研究将其加入缓冲溶液中后对Mac-1-HEK 293在ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的色谱行为的影响，实验结果如图8所示。比较HEK293和Mac-1-HEK 293两种细胞在超表达ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的色谱行为，可以观察到Mac-1-HEK 293在ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的峰高低于HEK 293在ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的峰高，色谱峰降低展宽，表明Mac-1与ICAM-1之间发生了受体-配体相互作用。在缓冲介质中加入不同浓度的Gu-4(40μM,4μM,40nM)，可以观察到40μM的Gu-4可以有效拮抗Mac-1与ICAM-1之间的受体-配体相互作用，使得细胞色谱峰基本恢复至与空白对照水平一致，4μM和40nM的Gu-4无法明显抑制Mac-1与ICAM-1之间的受体-配体相互作用，其细胞色谱行为与不加入拮抗剂的Mac-1-HEK 293在ICAM-1配体蛋白的细胞贴壁毛细管中的色谱行为接近。在介质中加入乳糖后，观察到细胞色谱行为接近Mac-1与ICAM-1发生粘附作用时的色谱行为，说明乳糖无法有效阻断粘附作用。

实施例8、白细胞-内皮细胞粘附实验

经TNF-α或者PMA刺激后，白细胞可以与内皮细胞发生较强的粘附作用。这种相互作用经由Wash Buffer洗涤后依旧存在，于是可以利用荧光显微镜观察到粘附在内皮细胞表面的、标记了绿色荧光标签的白细胞发出绿色荧光并且通过荧光仪可以测出相应荧光读数。荧光响应值的大小与粘附的白细胞数目正相关。粘附能力越强，白细胞数目越多，荧光响应值越大。同理，药物拮抗粘附活性越强，白细胞数目越少，荧光响应值越小。

针对毛细管电泳初步筛选得到的活性的阳性化合物Gu-4，本实验做了浓度梯度以研究其抗粘附活性，考察了0，0.04μM，0.4μM，4μM，40μM这五个浓度数值时的荧光读数，实验结果如图9所示。当浓度大于等于40μM时，荧光读数趋于平稳，细胞粘附数目出现平台期，即Gu-4抗粘附能力趋于饱和。选择40μM作为Gu-4的实验浓度，进行了白细胞-内皮细胞粘附实验活性筛选。在40μM Gu-4的作用下，白细胞的粘附数目显著性降低，与空白对照组存在显著性差异，证明Gu-4可以有效拮抗炎症条件下白细胞与内皮细胞间的粘附作用。本实验结果是通过平行操作三次以上实验情况下统计得到。

实施例9、划痕实验

针对探究毛细管电泳初步筛选得到的活性的阳性化合物Gu-4对肿瘤细胞的迁移是否具有影响，选用人肺癌细胞细胞(NCI-H520)进行划痕实验考察，实验结果如图10所示。加入Gu-4后，肺癌细胞的划痕愈合能力受到显著抑制。随着Gu-4浓度的增高，抑制作用显著增强。与对照组(0μM)相比，0.04μM,0.4μM,4μM和40μM的Gu-4分别可以使24h时NCI-H520细胞的划痕愈合面积减少为对照组的91.4％、80.7％、68.4％和47.1％。本实验结果是通过平行操作三次以上实验情况下统计得到的。

实施例10、肿瘤转移模型

选用处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞(B16)和6～8周龄的C57/BL小鼠构建肿瘤转移模型，包括生理盐水组作为空白对照组，给药环磷酰胺(CTX)作为阳性对照组，研究了Gu-4高(20mg/kg/d)、中(10mg/kg/d)、低(5mg/kg/d)三个剂量组对于肿瘤转移模型的药效学评价。于实验第1天称重C57/BL小鼠并且尾静脉注射B16细胞，注入细胞24h后开始给药，每组腹腔给药14天，于实验第16天称重并且颈椎脱臼法处死小鼠，剖取肺，称肺重，用解剖显微镜计数各肺叶的转移集落数，实验结果如图11所示。在实验进行的16天中，CTX组小鼠死亡2只。从小鼠日常生活状态观察，发现生理盐水组和Gu-4高、中、低剂量组小鼠均状态较好。通过统计小鼠体重可以发现，Gu-4在中、低剂量下表现出较好的抗肿瘤转移能力，在高剂量下其抗肿瘤转移能力与CTX接近，而其毒性远远小于CTX，具有发展为毒性较小的抗肿瘤转移药物的潜质。

本文对一些具体的实施例进行了详细的描述，然而这只是作为对发明目的实例说明，而不限制下述权利要求书的范围。应当理解，对本文所述具体方案的不同取代、改变和修饰都不偏离本发明权利要求所定义的内涵和外延，从而应当属于本申请所要求保护的发明范围。

Claims (8)

1.一种细胞分析方法，包括：

提供毛细管，其内壁贴附有经过固定处理并作为固定相的细胞层；提供电泳装置；采取进样前处理并确定电泳条件，其中进样分析的细胞层表面的受体保持天然构象和生物活性；将细胞样品进入所述毛细管；在流动相中加入化合物作为拮抗剂，其为拮抗受体-配体相互作用的化合物；对所述细胞样品进行电泳分析；以及对所述细胞样品进行检测分析；

其中，所述细胞层的细胞为表面超表达配体ICAM-1细胞，所述细胞样品为超表达受体Mac-1细胞。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其中流动相中加入不同浓度的化合物Gu-4作为拮抗剂，模拟血药浓度，验证超表达整合素Mac-1的细胞色谱峰型是否符合非线性色谱理论的特征峰型，以此定量计算具有相互作用化合物的动力学参数。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其中通过细胞样品的电泳色谱行为观察受体-配体间相互作用和细胞-细胞间相互作用，能够在模拟生理环境条件下利用细胞间粘附机制快速筛选抗粘附药物。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述细胞样品采用多聚甲醛进行处理。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述细胞层是通过涂层贴附于所述毛细管的内壁。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述毛细管为石英毛细管。

7.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述毛细管为熔融石英毛细管。

8.根据权利要求1所述的分析方法，其能够用于药物筛选、生物活性大分子与活性配体相互作用、细胞与细胞之间相互作用、药物成分分析、药物活性成分纯化及鉴定。