WO2021066196A1 - ３次元肝組織モデル - Google Patents

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WO2021066196A1
WO2021066196A1 PCT/JP2020/037931 JP2020037931W WO2021066196A1 WO 2021066196 A1 WO2021066196 A1 WO 2021066196A1 JP 2020037931 W JP2020037931 W JP 2020037931W WO 2021066196 A1 WO2021066196 A1 WO 2021066196A1
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WO
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cells
liver tissue
blood vessel
liver
dimensional
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PCT/JP2020/037931
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English (en)
French (fr)
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森　宣仁
泰之 木田
祐三 ▲高▼山
祐香 赤木
Original Assignee
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional liver tissue model. More specifically, the present invention relates to a three-dimensional liver tissue model having a perfusable vascular-like structure.
  • liver tissue models such as spheroids and extracellular matrix (ECM) gels in which cells are dispersed are known to have higher functions (protein production and metabolic capacity) than two-dimensional culture systems using culture dishes. It has been developed as a tissue piece for drug testing and liver transplantation. However, such a three-dimensional liver tissue model is still less functional than the actual living liver. This is due to the lack of perfusable main vessels and sinusoids.
  • sinusoids capillaries specific to the liver
  • paracrine paracrine
  • liver tissue model live bud
  • the sinusoidal structure in the three-dimensional liver tissue model prepared as described above is a random network constructed by cell self-formation, and there is a problem that it is difficult to perfuse from the outside. .. Under such circumstances, it has been desired to develop a three-dimensional liver tissue model that can be perfused from the outside.
  • the present invention has been made in consideration of the above situation, and provides the following three-dimensional liver tissue model and the like.
  • a three-dimensional liver tissue model having a main blood vessel-like structure and a sinusoid-like structure (2) The three-dimensional liver tissue model according to (1) above, wherein the main blood vessel-like structure is perfusable. (3) The three-dimensional liver tissue model according to (1) or (2) above, wherein the main blood vessel-like structure is connected or connectable to an external perfusion device.
  • the three-dimensional liver tissue model according to any one of (1) to (3) above, wherein a part of the sinusoidal structure is connected to the main blood vessel-like structure.
  • the three-dimensional liver tissue is prepared by culturing hepatocytes, vascular cells, and mesenchymal cells dispersed in a collagen gel, according to any one of (1) to (4) above.
  • Hepatocytes are HepG2 cells, which are liver cancer-derived cells, vascular cells are human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and mesenchymal cells are mesenchymal stem cells (MSC).
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the three-dimensional liver tissue is a tubular tissue in which a liver tissue containing a sinusoid-like structure is formed around a main blood vessel-like structure penetrating the tissue, as described in (1) to (6) above.
  • the three-dimensional liver tissue model described in either.
  • a method for producing a three-dimensional liver tissue model having a main blood vessel-like structure and a sinusoid-like structure A tubular connector that leads from the outside to the inside of the container is provided on the side surface of the culture container so as to face each other, and a rod-shaped member for forming a main blood vessel-like structure from one connector to the inside of the tube of the other connector is provided. Passing process (A process), (B) A step of filling the culture vessel after the step A with a collagen gel containing hepatocytes, vascular cells, and mesenchymal cells (step B).
  • step C Remove the rod-shaped member from the tubular connector (step C)
  • step D Before or after step C, the medium is added so that the entire collagen gel in the culture vessel is immersed, or the entire collagen gel in the culture vessel is immersed in the medium (step D).
  • Hepatocytes, vascular cells, and mesenchymal cells in the collagen gel were subjected to the steps (E) of perfusing the medium from the tubular connector from which the rod-shaped member was removed (step E), and (F) steps D and E. Culturing step (F step) The production method.
  • Hepatocytes are HepG2 cells, which are liver cancer-derived cells, vascular cells are human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and mesenchymal cells are mesenchymal stem cells (MSC).
  • HAVEC human umbilical vein endothelial cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • a three-dimensional liver tissue model having a main blood vessel-like structure capable of perfusing a medium, a desired drug, or the like and a sinusoid-like structure connected to the main blood vessel-like structure, and a method for producing the same.
  • the three-dimensional liver tissue model of the present invention can have functions such as metabolism and protein production that are closer to those of actual liver tissue. Therefore, for example, it can be used as a drug discovery test tool for screening a substance that improves or enhances liver function, or a substance that prevents or treats liver dysfunction, and can be used for liver regenerative medicine. It is excellent in usefulness and practicality.
  • FIG. 1a is a diagram showing an HE-stained image of a human liver. It is shown that there are large blood vessels (main blood vessels) (marked with * in the figure) and sinusoids lined with endothelial cells and surrounded by hepatocytes.
  • FIG. 1b FIG. 1b shows an example of a perfusion device. The device has a tubular connector with an anchor for anchoring the cultured liver tissue. The device also serves as a culture vessel for liver tissue.
  • FIGS. 1c and 1d Conceptual diagrams of a tubular liver tissue model having a main blood vessel-like structure and a sinusoidal (capillary) -like structure.
  • FIG. 1c shows a liver tissue model made in a perfusion device, and FIG.
  • the liver tissue of the model is made of collagen gel in which HepG2 cells, which are liver cancer-derived cells, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and mesenchymal stem cells (MSC) are dispersed, and has a sinusoidal structure. And it has a main vessel-like structure connected to it.
  • HepG2 cells which are liver cancer-derived cells, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and mesenchymal stem cells (MSC) are dispersed, and has a sinusoidal structure. And it has a main vessel-like structure connected to it.
  • FIG. 2a It is a figure which shows an example (process (i)-(iv)) of the process of making a liver tissue model.
  • (I) Fill the culture vessel (perfusion device) with collagen gel containing hepatocytes and the like (HepG2 cells, HUVEC, and MSC), and (ii) remove the needle (needle), which is a rod-shaped member, to form a main blood vessel-like structure.
  • the cavity channel is formed as a prototype of the above, (iii) the cavity channel is covered with HUVEC, and (iv) the medium is perfused into the cultured hepatocyte.
  • FIG. 2b is a diagram showing an example of a system for perfusing cultured liver tissue.
  • FIG. 2c is a diagram showing a series of photographs (0 sec, 3 sec, 6 sec, 9 sec) of a perfusion test on cultured liver tissue. It has been shown that ink is injected into cultured liver tissue from one tubular connector of a perfusion device and drained from the other tubular connector.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of histological analysis of the prepared liver tissue model.
  • 3a-c show the appearance of liver tissue cultured under different culture conditions.
  • FIG. 3a normal density MSC / non-perfusion condition
  • FIG. 3b low density MSC / perfusion condition
  • FIG. 3c normal density MSC / perfusion condition.
  • An asterisk (*) indicates the main blood vessel.
  • 3d to 3d are HE-stained images of the cross section of the liver tissue of FIGS. 3a to 3c, respectively
  • FIGS. 3g to 3c are fluorescent immunostaining images of the liver tissue of FIGS. 3a to 3c (cyan: nucleus, respectively. Green: CD31, Magenta: EpCAM).
  • FIG. 3a-c show the appearance of liver tissue cultured under different culture conditions.
  • FIG. 3a normal density MSC / non-perfusion condition
  • FIG. 3b low density MSC / perfusion condition
  • FIG. 3c normal density MSC / per
  • FIG. 4 is a diagram showing fluorescent immunostaining of proteins related to liver function in the prepared liver tissue model.
  • Non-perfused liver tissue (Fig. 4a) and perfused liver tissue (Fig. 4b) were stained with albumin (green) and CYP2D6 (magenta), respectively.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of global gene expression in non-perfused and perfused liver tissue.
  • the expression-variable genes are shown in red
  • the liver-related genes are shown in blue
  • the expression-variable genes are shown in red
  • FIG. 5c shows the top 10 enhanced GO terms under perfused conditions
  • FIG. 5d shows the top 10 enhanced GO terms under non-perfused conditions.
  • the GO term is a term defined by Gene ontology.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of functional analysis of the main blood vessel-like structure and the sinusoid-like structure in the prepared liver tissue model.
  • FIG. 6a shows HE staining of liver tissue constructed under perfusion conditions and injected with ink before fixation.
  • FIG. 6b is a bright-field image of the liver tissue injected with ink.
  • FIG. 6c is an image obtained by extracting ink from a bright field image by threshold processing.
  • FIG. 6d is an immunostained image of FIG. 6b (cyan: nucleus, green: CD31, magenta: EpCAM).
  • FIG. 6e is an image in which the image of FIG. 6c and the stained image of FIG. 6d are superimposed.
  • FIG. 6f is a magnified image of FIG. 6e, showing the co-localization of the ink-positive region and the CD-positive sinusoidal structure.
  • FIG. 6j shows the cell density distribution around the main blood vessel under perfused and non-perfused conditions (mean ⁇ standard error, significant difference when not connected by the same alphabet).
  • FIG. 6k shows the cumulative amount of albumin in the medium (mean ⁇ standard error).
  • a three-dimensional liver tissue model and a method for producing the same are provided.
  • the three-dimensional liver tissue has a perfusable main blood vessel-like structure and a sinusoidal (liver-specific capillary) -like structure.
  • the three-dimensional liver tissue is composed of hepatocytes, vascular cells (vascular endothelial cells, etc.), and mesenchymal stem cells, and is produced using a perfusion device. Perfusion from the formed main blood vessel-like structure into the tissue forms sinusoidal structures and high-density cell aggregates around the main blood vessel-like structure, and it is also confirmed that liver-specific gene expression is enhanced. Was done. Based on these results, the three-dimensional liver tissue model and the like according to the present invention were completed.
  • the three-dimensional liver tissue model of the present invention (hereinafter, also simply referred to as the liver tissue model of the present invention) has a main blood vessel-like structure and a sinus-like structure as described above. .. Specifically, for example, as shown in the enlarged view (three-dimensional view) and FIG. 1d (cross-sectional view) of FIG. 1c, a main blood vessel-like structure passes through the center of the inside of the tissue, and the main blood vessel-like structure passes through.
  • a three-dimensional liver tissue in which sinusoid-like structures are connected and extend to the surroundings can be mentioned.
  • the sinusoid-like structure may be entirely connected to the main vessel-like structure or may be partially connected.
  • the liver tissue model of the present invention is preferably a tubular tissue in which a liver tissue including a sinusoidal structure is formed around a main blood vessel-like structure, and the shape, size, etc. of the tissue, etc.
  • the outer shape of is not particularly limited.
  • the main blood vessel-like structure can be perfused, and thus the entire liver tissue can be perfused.
  • the main vessel-like structure is preferably connectable to an external perfusion device, or may be already connected, and is not limited.
  • the main blood vessel-like structure is a blood vessel-like structure having a thickness (diameter) that can be clearly distinguished from sinusoids (capillaries), such as the main blood vessels in actual human liver tissue, that is, portal veins, hepatic arteries, and the like. ..
  • the thickness (caliber) of the main blood vessel-like structure is not limited, but is preferably more than 50 ⁇ m and 1000 ⁇ m or less, and is preferably 100 to 800 ⁇ m, 200 to 700 ⁇ m, 200 to 500 ⁇ m, 200 to 400 ⁇ m, or 200 to 300 ⁇ m. Is also preferable.
  • the sinusoidal structure is also a vascular-like structure having a fineness (caliber) that can be clearly distinguished from the main blood vessels such as the portal vein and the hepatic artery, like the sinusoids in the actual human liver tissue.
  • the fineness (diameter) of the sinusoidal structure is not limited, but is preferably 1 to 50 ⁇ m, preferably 3 to 50 ⁇ m, 4 to 45 ⁇ m, or 5 to 40 ⁇ m.
  • the hepatocyte model of the present invention is preferably prepared by culturing the hepatocytes, vascular cells, and mesenchymal cells dispersed in a collagen gel.
  • the collagen gel in which hepatocytes, vascular cells, and mesenchymal cells are dispersed is cultured in a culture vessel (at this time, it is preferable to culture while perfusing a medium or the like). It is preferable that the main blood vessel-like structure and the sinus-like structure are formed and formed as a hepatocyte-like structure.
  • vascular cells constitute a vascular-like structure of a main blood vessel-like structure or a sinusoid-like structure
  • hepatocytes constitute the entire hepatic tissue mainly around the peripheral portion of the vascular-like structure.
  • the mesenchymal cells constitute the interstitial portion that is the space around the blood vessel-like structure and between the hepatocytes, but it is not strictly limited to these constitutional modes.
  • the thickness of the tissue in the liver tissue model of the present invention is not limited, but for example, the distance from the blood vessel wall surface (outer wall surface of the blood vessel) of the main blood vessel-like structure to the surface of the tissue is 5000 ⁇ m or less.
  • It is preferably 4000 ⁇ m or less, 3000 ⁇ m or less, 2000 ⁇ m or less, 1000 ⁇ m or less, 750 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, or 200 ⁇ m or less.
  • each cell that can be used in the present invention cells derived from various mammals such as human, mouse, and rat can be mentioned, and cells derived from human are preferable.
  • hepatocytes include pluripotency such as HepG2 cells, C3A cells, HepaRG cells, and Huh7 cells, which are liver cancer-derived cells, and primary hepatocytes, ES cells, Muse cells, and iPS cells collected from human liver.
  • Intrahepatic embryonic follicle cells, immature hepatocyte-like cells, hepatocyte-like cells and the like derived from stem cells are preferable.
  • vascular cells examples include vascular epithelial cells and vascular endothelial cells, and vascular endothelial cells are preferable.
  • vascular endothelial cells include umbilical vein endothelial cells (HUVEC) collected from humans, hepatic sinus endothelial cells, hepatic vein endothelial cells, cutaneous microvascular endothelial cells, pulmonary artery endothelial cells, aortic endothelial cells, coronary artery endothelial cells, and the like.
  • Preferable examples include vascular endothelial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells such as ES cells, Muse cells, and iPS cells.
  • mesenchymal stem cells for example, mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and the like, hepatic stellate cells, fibroblasts and the like are preferably mentioned.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • hepatic stellate cells fibroblasts and the like are preferably mentioned.
  • hepatocytes endohepatic embryonic follicle cells, immature hepatocyte-like cells, and hepatocytes induced to differentiate from pluripotent stem cells such as primary hepatocytes, ES cells, Muse cells, and iPS cells collected from human liver as described above.
  • hepatocytes and sinus vessels are differentiated into hepatocytes and sinus vessels by perfusion culture using only these cells (that is, without using vascular cells or mesenchymal cells), and the hepatocytes of the present invention. You may build a model.
  • collagen gel that can be used in the present invention
  • various collagen gels such as type I, type II, type III, type IV, type V, and type XI can be preferably adopted as appropriate.
  • various matrix components such as matrigel (registered trademark), gelatin, agar, agarose, fibrin, glycosaminoglycan, hyaluronic acid, proteoglycan, and laminin are required.
  • Alginic acid and the like can also be used. It is also possible to use a gel extracted from the matrix components of the liver and other organs.
  • the liver tissue model of the present invention is highly useful, for example, in the field of drug discovery or regenerative medicine.
  • tools for screening new drugs such as substances that improve or enhance liver function, or substances that prevent or treat liver dysfunction
  • tools for evaluating the dynamics of various existing or developing drugs in the liver and further.
  • the manufacturing method of the present invention of 3.3-dimensional liver tissue model the main vessel-like structures and a manufacturing method of three-dimensional liver tissue model having a sinusoidal-like structure (hereinafter, simply sometimes referred to as the manufacturing method of the present invention. ) Is not particularly limited as long as it is a method capable of constructing the liver tissue model of the present invention described above, but for example, a method including the following steps A to F is preferable.
  • a tubular connector that leads from the outside to the inside of the container is provided on the side surface of the culture container so as to face each other, and a rod-shaped member for forming a main blood vessel-like structure from one connector to the inside of the tube of the other connector is provided.
  • Passing process A process
  • B A step of filling the culture vessel after the step A with a collagen gel containing hepatocytes, vascular endothelial cells, and mesenchymal cells
  • step B A step of filling the culture vessel after the step A with a collagen gel containing hepatocytes, vascular endothelial cells, and mesenchymal cells
  • step C The rod-shaped member is removed from the tubular connector (step C).
  • step D Before or after step C, the medium is added so that the entire collagen gel in the culture vessel is immersed, or the entire collagen gel in the culture vessel is immersed in the medium (step D).
  • step E A step of perfusing the medium from a tubular connector from which the rod-shaped member has been removed (step E).
  • step F A step of culturing hepatocytes, vascular cells, and mesenchymal cells in the collagen gel by steps D and E (step F).
  • the culture vessel is not particularly limited in shape, size, etc., and can be appropriately designed so that a three-dimensional liver tissue having a desired shape and size can be constructed (for example, 3D printer technology). It can also be manufactured by.).
  • the material of the culture container is also not particularly limited, but a material known to be usable in animal cell culture, such as acrylic resin, is preferably used. It is preferable that the culture vessel can be used as it is as a perfusion device in a later step. Examples of such a culture vessel include a culture vessel as shown in FIG. 1b (a rectangular hollow portion in the central portion of FIG. 1b corresponds to a culture vessel) and the like.
  • a tubular connector leading from the outside to the inside of the container is provided on the side surface of the culture container, specifically, the opposite side surface.
  • the tubular connector may be paired (that is, two) or two or more pairs may be appropriately provided, and is not limited.
  • the tubular connector preferably has an anchor structure at the inner end of the culture vessel.
  • the specific structure of the anchor is not particularly limited.
  • the anchor structure can suppress the contraction of the cultured tissue as much as possible and facilitate the construction of the liver tissue having a desired shape.
  • the surface of the culture vessel provided with the tubular connector is subjected to atmospheric plasma treatment and / or coating treatment with fibronectin. By this treatment, the detachment of the cultured liver tissue can be suppressed.
  • the thickness of the rod-shaped member passing from one connector into the tube of the other connector is appropriately designed so that the inner diameter of the main blood vessel-like structure in the liver tissue has a desired size (for example, more than 50 ⁇ m and 1000 ⁇ m or less as described above).
  • -It may be selected and is not particularly limited, but is preferably about 500 ⁇ m, for example.
  • the material of the rod-shaped member is not particularly limited, but for example, a material made of metal, particularly stainless steel is preferable.
  • the shape of the rod-shaped member is not particularly limited as long as it can construct a main blood vessel-like structure having a desired inner diameter and length, such as a needle-shaped member (for example, a syringe needle or the like) or a wire-shaped member.
  • the method for filling the collagen gel containing hepatocytes and the like into the culture vessel after step A is not particularly limited, but the filling amount is appropriately adjusted in consideration of contraction due to culture of hepatocytes (particularly, contraction of collagen gel). You can adjust it.
  • the cell density of hepatocytes and the like suspended in the packed collagen gel is not limited, but the hepatocytes (HepG2 cells and the like) are, for example, 3 ⁇ 10 5 to 3 ⁇ 10 8 cells / mL. Is preferable, and 3 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 7 cells / mL, or 3 ⁇ 10 7 cells / mL is also preferable.
  • the HUVEC is preferably, for example, 3 ⁇ 10 8 cells / mL or less, 3 ⁇ 10 5 to 3 ⁇ 10 8 cells / mL, 3 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 7 cells / mL, or 3 ⁇ . it is also preferred that 10 7 cells / mL.
  • the MSC is preferably, for example, 0.5 ⁇ 10 8 cells / mL or less, 0.5 ⁇ 10 5 to 0.5 ⁇ 10 8 cells / mL, 0.5 ⁇ 10 6 to 0.5. It is also preferable that it is ⁇ 10 7 cells / mL, 0.5 ⁇ 10 6 cells / mL, or 0.5 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the density of the collagen gel is not limited, but is preferably 0.1 to 20 mg / mL, preferably 1 to 10 mg / mL, 1 to 5 mg / mL, or 3 mg / mL. ..
  • the rod-shaped member is removed from the tubular connector.
  • the space (hollow channel) after the rod-shaped member is removed is the basis of the main blood vessel-like structure in the liver tissue model of the present invention.
  • the medium is poured so that the entire collagen gel is immersed, or the entire collagen gel is immersed in the medium.
  • the state as shown in (ii) of FIG. 2a is set. This is because the entire collagen gel is placed under culture conditions.
  • the above-mentioned addition of the medium and immersion in the medium may be performed before the removal of the rod-shaped member described above, or may be performed after the removal, and are not limited.
  • the medium is then perfused through the tubular connector from which the rod-shaped member has been removed.
  • the medium By allowing the medium to flow into the tubular connector while the liver tissue to be cultured (collagen gel, etc.) has not been detached from the tubular connector, the medium can be perfused into the space (hollow channel) after the rod-shaped member has been removed. it can.
  • nutrients are also provided from inside the cultivated hepatocytes, and as shown in FIGS. 2a (ii) to (iv), hepatocytes, vascular cells, and mesenchymal cells in the collagen gel are cultured. ..
  • the entire liver tissue as a three-dimensional tissue such as a main blood vessel-like structure and a sinusoid-like structure is effectively constructed.
  • the entire culture vessel is immersed in the medium and perfused into the culture tissue from the tubular connector using an external pump or the like.
  • the conditions for perfusion of the medium described above are not limited, but for example, it is preferable to adjust the flow rate of the medium so that the shear stress is 1 ⁇ 10-8 to 10 Pa, and 1 ⁇ 10-6. It is also preferable to adjust so as to be ⁇ 5 Pa, 1 ⁇ 10 -4 to 3 Pa, or 1 ⁇ 10 -3 to 1 Pa.
  • liver tissue As for other culture conditions related to liver tissue, well-known conditions can be appropriately adopted when culturing living tissue.
  • the type of medium Dulbecco-modified Eagle's medium, Ham F-12 medium, Iskov-modified Dulbecco's medium, M199 medium, vascular endothelial cell growth medium, hepatocyte culture medium and the like are preferably mentioned, and a mixture thereof can also be used. it can. Further, those supplemented with growth factors such as fetal bovine serum, endothelial cell growth factor, and hepatocyte growth factor can also be used.
  • the temperature condition of the culture is, for example, preferably 35 to 40 ° C., more preferably 37 ° C., and the culture period is preferably, for example, about 2 to 20 days, but is not particularly limited.
  • ⁇ Material / Method> Cell culture HepG2 cells, which are liver cancer-derived cells, were cultured in Dalveco-modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% 100-fold concentration penicillin streptomycin solution.
  • DMEM Dalveco-modified Eagle's medium
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • EMM-2 endothelial cell growth medium
  • Immortalized MSCs (mesenchymal stem cells) were cultured by DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% 100-fold non-essential amino acid solution and 1% 100-fold penicillin streptomycin solution. All cells were cultured in a 5% CO 2 environment at 37 ° C.
  • the perfusion device which is also used as a culture container, was molded by a 3D printer (made of acrylic resin). The device was washed with an ultrasonic cleaner and then sterilized with 70% ethanol. After drying in a clean bench, the device was treated with atmospheric plasma for 5 minutes to improve cell and collagen gel adhesion, immersed in 10 ⁇ g / mL bovine fibronectin and coated at 37 ° C. for 2 hours. went. The device was placed in phosphate buffered saline (PBS) free of Mg 2+ and Ca 2+ and stored at 4 ° C. for up to 1 week. Immediately before the tissue construction, a needle (Terumo Corporation: syringe needle 25G (diameter: 0.50 mm, material: stainless steel)) was passed through the connector.
  • PBS phosphate buffered saline
  • DMEM fetal bovine serum
  • EGM2 fetal bovine serum
  • a 1: 1 mixture was used.
  • DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin streptomycin was used.
  • a 100 ⁇ L HUVEC suspension (4 ⁇ 10 6 cells / mL) was injected into the cavity flow path using a syringe and a syringe pump.
  • the device After 20 minutes of incubation, the device was turned over and incubated for an additional 20 minutes to allow the cells to adhere to the top surface of the flow path. The perfusion device was then returned to its original position, and after 80 minutes, the medium was perfused with a peristaltic pump at a flow rate of 1 mL / hour. The flow within the tissue was visualized by injecting a 2: 1 mixture of ink and PBS with a syringe pump.
  • HE staining sliced sections were deparaffinized and rehydrated and stained with Meyer's hematoxylin and eosin Y ethanol solution.
  • immunostaining the sliced sections after rehydration were treated with an autoclave device at 121 ° C. for 15 minutes to activate the antigen. The sections were washed with ultrapure water and then blocked with 4% block ace for 20 minutes. It was then incubated overnight with a primary antibody diluted with 1% block ace.
  • the primary antibodies are CD31 (1: 200, BBA7, R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA), EpCAM (1: 200, ab71916, Abcam PLC, Cambridge, UK), albumin (1: 200). 100, MAB1455, R & D Systems), CYP2D6 (1: 100, AV41675, Sigma-Aldrich) were used. Sections were washed with PBS and then incubated with secondary antibody for 1 hour. Furthermore, counterstaining was performed using Hoechst.
  • the fixed tissue was embedded in an OCT compound and sliced into 7um. Images of Hoechst-stained sections were analyzed by ImageJ. The image was binarized by threshold processing and watershed processing. The number of cells in the upper and lower regions of the main vessel was then counted by the analysis particle plugin.
  • albumin quantification contained in quantitative culture supernatant of albumin, it was collected media after 4 days and after 7 days, and stored in -80 ° C. until measurement. Samples were thawed and quantified with a human albumin ELISA kit.
  • liver cancer-derived cells HepG2 liver cancer-derived cells
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the device also improved cell and collagen adhesion by coating with atmospheric plasma and fibronectin.
  • a tubular liver tissue having a morphology similar to that of human liver was designed.
  • the sinusoidal structure is self-assembled by cells and further connected to the main vessel-like structure. Since this main vessel-like structure is connected to the perfusion device, the prepared liver tissue can be perfused.
  • Tubular liver tissue was prepared as shown in FIG. 2a.
  • a collagen solution in which HepG2, HUVEC, and MSC were suspended was injected into a perfusion device coated with atmospheric plasma and fibronectin (FIG. 2a (i)).
  • a hollow flow path was constructed by removing the rod-shaped member (needle) that had passed through the connector (FIG. 2a (ii)).
  • HUVEC was injected into the hollow flow path to cover the wall surface of the flow path (FIG. 2a (iii)).
  • the medium was perfused into the main blood vessels constructed using a peristaltic pump (Fig. 2a (iv), Fig. 2b).
  • ink was injected after perfusion for 4 days (Fig. 2c).
  • the injected ink was discharged from the discharge side connector, which flowed into the main blood vessel from the injection side connector of the perfusion device.
  • no leakage from the liver tissue and the junction of the perfusion device was observed.
  • CD31 and EpCAM are markers for HUVEC and HepG2, respectively.
  • Fig. 3g-i are markers for HUVEC and HepG2, respectively.
  • CD31-positive cells and EpCAM-positive cells were sparsely distributed, but no sinusoidal structure was observed (Fig. 3g).
  • Fig. 3h Under low-density MSC / perfusion conditions, most aggregate cells were stained with EpCAM and few CD31-positive cells were observed (Fig. 3h).
  • the CD31-positive region under normal density MSC / perfusion conditions was clearly larger than the non-perfused region (Fig. 3i).
  • the CD31-positive region formed a luminal structure and was observed to be connected to the main blood vessel in the same manner as the sinusoid.
  • the density of sinusoidal structures was high around the main vessels and tended to decrease with increasing distance.
  • the sinusoidal structure is flanked by EpCAM-positive HepG2 cells, a form similar to that in the human liver, where the sinusoids are surrounded by hepatocytes.
  • albumin and CYP2D6 which are the major proteins and metabolic enzymes produced in the liver, respectively.
  • CYP2D6 were detected relatively strongly under perfusion conditions. This suggests that perfusion maintained normal tissue function.
  • the decay rate of albumin with distance from the main vessel was slightly greater than that of CYP2D6. This suggests that zonation in the human liver (a term indicating that protein production such as albumin is high in the oxygen-rich region and foreign substance metabolism activity is high in the oxygen-poor region) has been partially reproduced. ..
  • RNA-seq was performed on samples 7 days after culture (7 days after culture). 5ad).
  • 954 expression-variable genes were detected (FIG. 5a).
  • 520 were non-perfused and 434 were enhanced under perfusion conditions.
  • VEGFC vascular endothelial growth factor
  • HGF a type of hepatocyte growth factor
  • FGF5 a type of fibroblast growth factor
  • CD34 a membrane expressed by endothelial cells undergoing angiogenesis.
  • An increase in the penetrating protein, COL8A1 extracellular matrix expressed at the angiogenic site
  • liver-related genes a total of 261 genes involved in drug metabolism in Phases 1 to 3 and genes of nuclear receptors known to control liver function were selected based on the preceding humanities. As a result, it was found that the expression level of most of the genes (246 genes) was maintained (Fig. 5b). Considering that the amount of total RNA extracted from tissues cultured under perfusion conditions was 4.6 times higher than that of non-perfused tissue, it is suggested that perfusion maintains not only cell viability but also metabolic function. .. In order to further investigate the effect of perfusion, Gene ontology (GO) enrichment analysis was then performed (Fig. 5c, d).
  • GO Gene ontology
  • ink was first injected into the main blood vessel and its penetration into tissues was verified (Fig. 6a-). f). As shown in FIG. 6a, the injected ink was confirmed not only in the main blood vessel but also in the surrounding area.
  • the area positive for ink was extracted from the bright-field image by thresholding (FIGS. 6b and 6c) and superposed on the immunostained image (FIG. 6df). .. As a result, according to the superposed image obtained, the ink-positive region reached a distance of 160 ⁇ m from the end of the main blood vessel.
  • the ink-positive region was co-localized with the CD31-positive sinusoidal structure, suggesting that the sinusoidal structure is connected to the main blood vessel.
  • the cell density distribution around the main blood vessel was analyzed (Fig. 6j). The number of cells in the analysis target area was 22.9 under the perfusion condition, which was 2.3 times that under the non-perfusion condition. In particular, the cell density was significantly higher in the region within 200 ⁇ m from the main vessel as compared with the non-perfused one. This difference in cell density distribution suggests that perfusion supplied oxygen and nutrients and formed a gradient thereof.
  • the concentration and cumulative amount of albumin secreted into the culture broth were measured and calculated using the ELISA method. As shown in FIG.
  • the amount of albumin under the perfusion condition was 5.5 times that of the non-perfused case. From the above, it is judged that the substance exchange (material inflow to the tissue and substance outflow from the tissue) was achieved by perfusion through the main blood vessel and the sinusoidal structure.
  • a tubular liver tissue having a perfusable main blood vessel-like structure and a sinusoid-like structure can be produced by combining a perfusion device and a collagen gel in which a cell line is dispersed. Histological analysis and gene expression analysis showed that perfusion through the main vessel-like structure promotes sinusoidal angiogenesis and maintains liver tissue viability and function. Most of the liver-related genes were not significantly enhanced, but the amount of total RNA extracted from the perfused tissue was higher than that of the non-perfused tissue. The tissue was found to have higher function than the non-perfused one. Gene expression analysis revealed that non-perfused conditions enhance the GO term (biological process) for inflammation.
  • the method of this example can be applied to the construction of a three-dimensional tissue model of various organs / tissues having a general main blood vessel-like structure and a capillary-like structure. Further, by using cells derived from primary cells or iPS cells in addition to the established cells as the cells to be used, there is a possibility that a tissue closer to the living body can be constructed. Furthermore, it is considered that setting parameters related to culture such as cell density and ratio, ECM gel concentration, perfusion flow rate, and medium composition as appropriate according to various target organs / tissues is also a factor for increasing the above possibility.
  • a method of producing a similar structure For capillary (sinusoidal) -like structures, various methods have been proposed that utilize spontaneous angiogenesis of cells. Examples include skin tissue angiogenic by adipose tissue-derived cells, liver buds constructed by utilizing self-assembly of iPS cell-derived intrahepatic germ layer cells, MSC, and HUVEC.
  • the three-dimensional liver tissue model of the present invention has a main blood vessel-like structure capable of perfusing a medium, a desired drug, etc., and a sinusoidal structure connected to the main blood vessel-like structure, and has a metabolism closer to that of actual liver tissue. And can have functions such as protein production. Therefore, the three-dimensional liver tissue model of the present invention is used in, for example, a drug discovery test tool for screening a substance that improves or enhances liver function, or a substance that prevents or treats liver dysfunction, or in drug discovery. It can be used as a test tool for predicting and evaluating the metabolic rate of a candidate compound in the liver, the composition of the metabolite produced, or the effect of the candidate compound or metabolite on the liver, and further, liver regeneration. It has excellent usefulness and practicality, such as being able to be used for medical purposes.

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Abstract

外部から灌流を行うことが可能な３次元肝組織モデル等を提供する。本発明にかかる３次元肝組織モデルは、主血管様構造及び類洞様構造を有することを特徴とする。

Description

３次元肝組織モデル
　本発明は、３次元肝組織モデルに関する。詳しくは、灌流可能な血管様構造を有する３次元肝組織モデルに関する。
　スフェロイドや細胞を分散させた細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ゲルといった３次元肝組織モデルは、培養皿を用いた２次元の培養系と比べて機能（タンパク質産生、代謝能）が高いことが知られており、薬剤試験や肝移植用の組織片として開発されてきた。しかしながら、そのような３次元肝組織モデルは、実際の生体の肝臓と比べて依然機能は低い。この要因として、灌流可能な主血管及び類洞が欠如していることが挙げられる。生体の肝臓において、類洞（肝臓に特異的な毛細血管）は酸素・栄養の供給路として機能するだけでなく、灌流による機械的刺激をパラクライン・シグナル（傍分泌）に変換することで肝細胞の増殖や生存に関与することから、肝臓の恒常性を維持するために必須の構造であると考えられている。さらに、薬剤等の生体異物が類洞を通じて肝細胞に効率よく輸送されていることから、類洞は代謝やタンパク質産生といった肝機能にとっても重要である。
　近年、肝細胞、血管内皮細胞、間葉系幹細胞を、マトリゲル（登録商標）上で共培養し、間葉系幹細胞による組織の収縮を誘引することで、類洞様構造の形成を促進して、３次元肝組織モデル（ｌｉｖｅｒ　ｂｕｄ）が作製することが提案されている（例えば、非特許文献１参照。）
Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｈｕｍａｎ　ｌｉｖｅｒ　ｆｒｏｍ　ａｎ　ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｏｒｇａｎ　ｂｕｄ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，ｖｏｌ．９，ｐ．３９６−４０９（２０１４）．
　しかしながら、上記のように作製される３次元肝組織モデルにおける類洞様構造は、細胞の自己形成によって構築されたランダムなネットワークであり、外部から灌流を行うことは困難であるという問題があった。
　このような状況下において、外部から灌流を行うことが可能な３次元肝組織モデル等の開発が望まれていた。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、３次元肝組織モデル等を提供するものである。
（１）主血管様構造及び類洞様構造を有する３次元肝組織モデル。
（２）主血管様構造は灌流可能なものである、前記（１）に記載の３次元肝組織モデル。
（３）主血管様構造は、外部の灌流デバイスに接続されている又は接続可能なものである、前記（１）又は（２）に記載の３次元肝組織モデル。
（４）類洞様構造の一部は、主血管様構造に接続されている、前記（１）~（３）のいずれかに記載の３次元肝組織モデル。
（５）３次元肝組織は、コラーゲンゲル中に分散した肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を培養して作製されたものである、前記（１）~（４）のいずれかに記載の３次元肝組織モデル。
（６）肝細胞が、肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞であり、血管系細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であり、間葉系細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、前記（１）~（５）のいずれかに記載の３次元肝組織モデル。
（７）３次元肝組織は、該組織を貫通する主血管様構造の周囲に、類洞様構造を含む肝組織が形成された、管状の組織である、前記（１）~（６）のいずれかに記載の３次元肝組織モデル。
（８）肝機能を改善する若しくは亢進させる物質、又は肝機能障害を予防若しくは治療する物質をスクリーニングするためのものである、前記（１）~（７）のいずれかに記載の３次元肝組織モデル。
（９）肝臓の再生医療に用いられるものである、前記（１）~（７）のいずれかに記載の３次元肝組織モデル。
（１０）主血管様構造及び類洞様構造を有する３次元肝組織モデルの作製方法であって、
　（Ａ）培養容器の側面に、対向するように、該容器の外部から内部に通じる管状コネクタを設け、一方のコネクタから他方のコネクタの管内に、主血管様構造を形成するための棒状部材を通す工程（Ａ工程）、
　（Ｂ）Ａ工程後の培養容器内に、肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を含むコラーゲンゲルを充填する工程（Ｂ工程）、
　（Ｃ）棒状部材を管状コネクタから抜去する（Ｃ工程）、
　（Ｄ）Ｃ工程の前又は後に、培養容器中の前記コラーゲンゲル全体が浸漬するように培地を投入する、又は培養容器中の前記コラーゲンゲル全体を培地中に浸漬させる工程（Ｄ工程）、
　（Ｅ）棒状部材を抜去した管状コネクタから培地を灌流させる工程（Ｅ工程）、並びに
　（Ｆ）Ｄ工程及びＥ工程により、前記コラーゲンゲル中の肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を培養する工程（Ｆ工程）
を含む、前記作製方法。
（１１）Ａ工程において、管状コネクタを設けた培養容器の表面に、大気プラズマ処理、及び／又はフィブロネクチンによるコーティング処理を行う、前記（１０）に記載の作製方法。
（１２）管状コネクタは、培養容器の内部側の端にアンカー構造が設けられている、前記（１０）又は（１１）に記載の作製方法。
（１３）肝細胞が、肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞であり、血管系細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であり、間葉系細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、前記（１０）~（１２）のいずれかに記載の作製方法。
（１４）前記（１）~（８）のいずれかに記載の３次元肝組織モデルの作製方法である、前記（１０）~（１３）のいずれかに記載の作製方法。
　発明の効果
　本発明によれば、培地や所望の薬剤等を灌流させることができる主血管様構造と、それに接続された類洞様構造とを併せ持つ、３次元肝組織モデル、及びその作製方法等を提供することができる。
　本発明の３次元肝組織モデルは、実際の肝組織により近い代謝及びタンパク質産生等の機能を有するものとなり得る。そのため、例えば、肝機能を改善する若しくは亢進させる物質、又は肝機能障害を予防若しくは治療する物質をスクリーニングするための創薬試験ツールとして用い得ることや、さらには、肝臓の再生医療用に用い得るといった、有用性・実用性に優れたものである。
　図１ａ：ヒト肝臓のＨＥ染色像を示す図である。大血管（主血管）（図中の＊印）と、内皮細胞に裏打ちされ肝細胞によって取り囲まれた類洞とが存在することが示されている。
　図１ｂ：灌流デバイスの一例を示す図である。該デバイスには培養した肝組織を固定するためのアンカーを有する管状コネクタがある。該デバイスは、肝組織の培養容器にもなるものである。
　図１ｃ及び１ｄ：主血管様構造及び類洞（毛細血管）様構造を有する管状肝組織モデルの概念図である。図１ｃは、灌流デバイス内に作製した肝組織モデルを示し、図１ｄは、該肝組織モデルの長手方向の断面図を示す。該モデルの肝組織は、肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を分散させたコラーゲンゲルによって作製されており、類洞様構造とそれが接続した主血管様構造を有する。
　図２ａ：肝組織モデルの作製プロセスの一例（プロセス（ｉ）~（ｉｖ））を示す図である。（ｉ）肝細胞等（ＨｅｐＧ２細胞、ＨＵＶＥＣ、及びＭＳＣ）を含むコラーゲンゲルを培養容器（灌流デバイス）に充填すること、（ｉｉ）棒状部材である針（ｎｅｅｄｌｅ）を抜去して主血管様構造の原型となる空洞流路を形成すること、（ｉｉｉ）ＨＵＶＥＣで空洞流路を被覆すること、（ｉｖ）培地を培養肝組織に灌流することを示す。
　図２ｂ：培養肝組織に灌流するためのシステムの一例を示す図である。該システムでは、ペリスタルティックポンプによって灌流を行い、培養中に発生した気泡を除去するためバブルトラップが設けられている。
　図２ｃ：培養肝組織への灌流試験の連続写真（０ｓｅｃ，３ｓｅｃ，６ｓｅｃ，９ｓｅｃ）を示す図である。灌流デバイスの一方の管状コネクタから、培養肝組織内に墨汁が注入され、他方の管状コネクタから排出される様子が示されている。
　図３：作製した肝組織モデルの組織学的解析の結果を示す図である。図３ａ~ｃは、異なる培養条件下で培養した肝組織の外観を示す。図３ａ：通常密度ＭＳＣ・非灌流条件、図３ｂ：低密度ＭＳＣ・灌流条件、図３ｃ：通常密度ＭＳＣ・灌流条件。アスタリスク（＊）は主血管を示す。図３ｄ~ｆは、それぞれ、図３ａ~ｃの肝組織の横断面のＨＥ染色像であり、図３ｇ~ｉは、それぞれ、図３ａ~ｃの肝組織の蛍光免疫染色像（シアン：核、緑：ＣＤ３１、マゼンタ：ＥｐＣＡＭ）である。
　図４：作製した肝組織モデルにおける、肝臓機能に関連するタンパク質の蛍光免疫染色を示す図である。非灌流の肝組織（図４ａ）、及び灌流した肝組織（図４ｂ）を、それぞれ、アルブミン（緑）及びＣＹＰ２Ｄ６（マゼンタ）で染色した。
　図５：非灌流及び灌流した肝組織におけるグローバルな遺伝子発現の解析結果を示す図である。図５ａのＭＡプロットでは、発現変動遺伝子が赤色で示されており、図５ｂのＭＡプロットでは、肝臓関連遺伝子が青色で、そのうち発現変動したものが赤色で示されている。図５ｃは、灌流条件において亢進されたＧＯターム（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ）上位１０を示し、図５ｄは、非灌流条件において亢進されたＧＯターム（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ）上位１０を示す。なお、ＧＯタームは、遺伝子オントロジー（ｇｅｎｅ　ｏｎｔｏｌｏｇｙ）で定義される用語である。
　図６：作製した肝組織モデルにおける、主血管様構造及び類洞様構造の機能解析の結果を示す図である。図６ａは、灌流条件で構築し、固定前に墨汁を注入された肝組織のＨＥ染色。図６ｂは、墨汁を注入した肝組織の明視野像。図６ｃは、明視野像から閾値処理によって墨汁を抽出した画像。図６ｄは、図６ｂの免疫染色像（シアン：核、緑：ＣＤ３１、マゼンタ：ＥｐＣＡＭ）。図６ｅは、図６ｃの画像と図６ｄの染色像を重ね合わせた像。図６ｆは、図６ｅの拡大像であり、墨汁陽性の領域とＣＤ陽性の類洞様構造の共局在を示す。図６ｊは、灌流条件及び非灌流条件における主血管周辺の細胞密度分布（平均±標準誤差、同一のアルファベットで接続されていない場合、有意差あり）。図６ｋは、培地中のアルブミン累積量（平均±標準誤差）。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１９−１８４０２７号明細書（令和１年（２０１９年）１０月４日付け出願）の全体を包含する。本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
　本発明においては、３次元肝組織モデル及びその作製方法等を提供する。該３次元肝組織は、灌流可能な主血管様構造及び類洞（肝臓に特異的な毛細血管）様構造を有する。該３次元肝組織は、肝細胞、血管系細胞（血管内皮細胞等）、及び間葉系幹細胞によって構成され、灌流デバイスを用いて作製されている。形成した主血管様構造から組織内への灌流により、主血管様構造の周囲に、類洞様構造及び高密度な細胞凝集体が形成されるとともに、肝特異的な遺伝子の発現の亢進も確認された。これらの結果に基づき、本発明に係る３次元肝組織モデル等は完成された。
２．３次元肝組織モデル
　本発明の３次元肝組織モデル（以下、単に、本発明の肝組織モデルとも言う。）は、前述のとおり、主血管様構造及び類洞様構造を有するものである。具体的には、例えば、図１ｃの拡大図（立体図）や図１ｄ（断面図）にあるように、組織内部の中心に主血管（ｍａｉｎ　ｃｈａｎｎｅｌ）様構造が通っており、主血管様構造に類洞（ｓｉｎｕｓｏｉｄ）様構造がつながって周囲に伸びている、３次元肝組織が挙げられる。類洞様構造は、その全部が主血管様構造に接続されていてもよいし、一部が接続されていてもよい。本発明の肝組織モデルは、主血管様構造の周囲に、類洞様構造を含む肝組織が形成された、管状の組織であるものが好ましく挙げられるが、組織の形状、さらには大きさ等の外形については、特に限定はされない。
　本発明の肝組織モデルにおいて、主血管様構造は、灌流可能なものであり、ひいては、該肝組織全体への灌流を可能とするものである。当該主血管様構造は、外部の灌流デバイスに接続可能なものであることが好ましく、又は、すでに接続されている状態のものであってもよく、限定はされない。主血管様構造は、実際のヒト肝臓組織における主血管、すなわち門脈や肝動脈等のように、類洞（毛細血管）とは明確に区別できる太さ（口径）を有する血管様構造である。主血管様構造の太さ（口径）は、限定はされないが、例えば、５０μｍ超かつ１０００μｍ以下であることが好ましく、１００~８００μｍ、２００~７００μｍ、２００~５００μｍ、２００~４００μｍ、又は２００~３００μｍであることも好ましい。類洞様構造も、実際のヒト肝臓組織における類洞と同様に、門脈や肝動脈等の主血管とは明確に区別できる細さ（口径）を有する血管様構造である。類洞様構造の細さ（口径）は、限定はされないが、例えば、１~５０μｍであることが好ましく、３~５０μｍ、４~４５μｍ、又は５~４０μｍであることも好ましい。
　本発明の肝組織モデルは、当該組織が、コラーゲンゲル中に分散した肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を培養して作製されたものであることが好ましい。詳しくは、肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を分散したコラーゲンゲルを、培養容器内で培養することにより（この際、培地等の灌流を行いながら培養することが好ましい。）、前述した主血管様構造と類洞様構造とを形成し、肝組織様の構造体として形成されたものが好ましい。本発明の肝組織モデルにおいては、血管系細胞が、主血管様構造や類洞様構造の血管様構造を構成し、肝細胞が、血管様構造の周辺部分を主とする肝組織全域を構成し、間葉系細胞が、血管様構造の周囲や肝細胞間の空隙である間質部分を構成するが、厳密にこれらの構成態様に限定されなくてもよい。
　本発明の肝組織モデルにおける当該組織の厚みは、限定はされないが、例えば、主血管様構造の血管壁面（血管の外側壁面）から、当該組織の表面までの距離が、５０００μｍ以下であることが好ましく、４０００μｍ以下、３０００μｍ以下、２０００μｍ以下、１０００μｍ以下、７５０μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、又は２００μｍ以下であることも好ましい。
　ここで、本発明に用い得る各細胞については、ヒト、マウス、ラット等の各種哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来の細胞が好ましい。用い得る肝細胞としては、例えば、肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞、Ｃ３Ａ細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞、Ｈｕｈ７細胞や、ヒト肝から採取した初代肝細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、ｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞から分化誘導した肝内胚葉細胞、未熟肝細胞様細胞、肝細胞様細胞等が好ましく挙げられる。また、用い得る血管系細胞としては、例えば、血管上皮細胞や血管内皮細胞が挙げられ、好ましくは血管内皮細胞である。血管内皮細胞としては、例えば、ヒトから採取した臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、肝類洞内皮細胞、肝静脈内皮細胞、皮膚微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞や、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、ｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞から分化誘導した血管内皮細胞等が好ましく挙げられる。さらに、間葉系細胞としては、例えば、骨髄、脂肪組織、臍帯等に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）や、肝星細胞、線維芽細胞等が好ましく挙げられる。なお、肝細胞として、上述したような、ヒト肝から採取した初代肝細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、ｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞から分化誘導した肝内胚葉細胞、未熟肝細胞様細胞、肝細胞様細胞等を用いる場合は、これらのみを用いて（すなわち、血管系細胞や間葉系細胞を用いずに）、灌流培養により、肝細胞と類洞血管とに分化させ、本発明の肝組織モデルを構築してもよい。
　また、本発明に用い得るコラーゲンゲルについては、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＸＩ型等の各種コラーゲンのゲルを適宜好ましく採用することができる。なお、当該コラーゲンゲルに替えて、又はコラーゲンゲルと共に、必要に応じて、各種マトリックス成分、例えば、マトリゲル（商標登録）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ラミニン、アルギン酸等を用いることもできる。また、肝臓や他の臓器のマトリックス成分を抽出したゲルを用いることもできる。
　本発明の肝組織モデルは、例えば、創薬分野あるいは再生医療の分野において、有用性が高いものである。例えば、肝機能を改善する若しくは亢進させる物質、又は肝機能障害を予防若しくは治療する物質といった新薬をスクリーニングするためのツールや、既存の又は開発中の各種医薬の肝臓における動態評価としてのツール、さらには、肝組織の再生医療における各種条件の最適化等のためのツールなどとして、適宜利用することができる。
３．３次元肝組織モデルの作製方法
　本発明にかかる、主血管様構造及び類洞様構造を有する３次元肝組織モデルの作製方法（以下、単に、本発明の作製方法と言うことがある。）は、前述した本発明の肝組織モデルを構築できる方法であれば、特に限定はされないが、例えば、以下のＡ~Ｆ工程を含む方法等が好ましく挙げられる。
　（Ａ）培養容器の側面に、対向するように、該容器の外部から内部に通じる管状コネクタを設け、一方のコネクタから他方のコネクタの管内に、主血管様構造を形成するための棒状部材を通す工程（Ａ工程）
　（Ｂ）Ａ工程後の培養容器内に、肝細胞、血管内皮細胞、及び間葉系細胞を含むコラーゲンゲルを充填する工程（Ｂ工程）
　（Ｃ）棒状部材を管状コネクタから抜去する（Ｃ工程）
　（Ｄ）Ｃ工程の前又は後に、培養容器中の前記コラーゲンゲル全体が浸漬するように培地を投入する、又は培養容器中の前記コラーゲンゲル全体を培地中に浸漬させる工程（Ｄ工程）
　（Ｅ）棒状部材を抜去した管状コネクタから培地を灌流させる工程（Ｅ工程）
　（Ｆ）Ｄ工程及びＥ工程により、前記コラーゲンゲル中の肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を培養する工程（Ｆ工程）
・Ａ~Ｃ工程について
　培養容器は、形状、大きさ等は特に限定はされず、所望の形状、大きさの３次元肝組織を構築できるように適宜設計することができる（例えば、３Ｄプリンタ技術により製造することもできる。）。培養容器の材質についても、特に限定はされないが、例えば、アクリル樹脂等のように、動物細胞培養において使用可能であることが周知の材質が好ましく挙げられる。培養容器は、後の工程において、そのまま灌流デバイスとしても用いることができるものであることが好ましい。このような培養容器としては、例えば、図１ｂに示すような培養容器（図１ｂの中心部分の長方形のくぼみ部分が培養容器に相当する）等が挙げられる。
　培養容器の側面、詳しくは対向する側面には、該容器の外部から内部に通じる管状コネクタを設ける。管状コネクタは、１対（つまり２本）であってもよいし、２対以上を適宜設けてもよく、限定はされない。管状コネクタは、培養容器の内部側の端にアンカー構造が設けられていることが好ましい。当該アンカーの具体的な構造は、特に限定はされない。当該アンカー構造は、培養組織の収縮を極力抑え、所望の形状の肝組織を構築しやすくすることができる。また、本発明においては、管状コネクタを設けた培養容器の表面に、大気プラズマ処理、及び／又はフィブロネクチンによるコーティング処理を行っておくことが好ましい。当該処理により、培養した肝組織の脱離を抑制することができる。一方のコネクタから他方のコネクタの管内に通す棒状部材の太さは、肝組織中の主血管様構造の内径が所望の大きさ（例えば、前述した５０μｍ超かつ１０００μｍ以下）となるように適宜設計・選択すればよく、特に限定はされないが、例えば、５００μｍ程度であることが好ましい。また、棒状部材の材質についても特に制限はされないが、例えば、金属製、特にステンレス製の材質であることが好ましい。棒状部材の形状は、針状（例えば、シリンジ針等）やワイヤー状のものなど、所望の内径及び長さの主血管様構造が構築できるものであればよく、特に限定はされない。
　Ａ工程後の培養容器内への、肝細胞等を含むコラーゲンゲルの充填方法は、特に限定はされないが、肝組織の培養による収縮（特に、コラーゲンゲルの収縮）を考慮して充填量を適宜調整すればよい。ここで、充填するコラーゲンゲルに懸濁する肝細胞等の細胞密度は、限定はされないが、肝細胞（ＨｅｐＧ２細胞等）は、例えば、３×１０５~３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましく、３×１０６~３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、又は３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることも好ましい。また、ＨＵＶＥＣは、例えば、３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが好ましく、３×１０５~３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３×１０６~３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、又は３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることも好ましい。また、ＭＳＣは、例えば、０．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．５×１０５~０．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、０．５×１０６~０．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、又は０．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることも好ましい。さらに、上記コラーゲンゲルの密度は、限定はされないが、例えば、０．１~２０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、１~１０ｍｇ／ｍＬ、１~５ｍｇ／ｍＬ、又は３ｍｇ／ｍＬであることも好ましい。
　培養容器への上記充填後に、棒状部材を管状コネクタから抜去する。当該棒状部材を抜去した後の空間（ｈｏｌｌｏｗ　ｃｈａｎｎｅｌ）が、本発明の肝組織モデルにおける主血管様構造のベースとなる。
・Ｄ~Ｆ工程について
　培養容器内に肝細胞等を含むコラーゲンゲルの充填を行った後、当該コラーゲンゲル全体が浸漬するように培地を投入する、又は当該コラーゲンゲル全体を培地中に浸漬させる。具体的には、例えば、図２ａの（ｉｉ）のような状態にする。当該コラーゲンゲル全体を培養条件下に置くためである。上記の培地の投入や培地中への浸漬は、前述した棒状部材の抜去前に行っておいてもよいし、抜去後に行ってもよく、限定はされない。
　その後、棒状部材を抜去した管状コネクタから培地を灌流させる。培養する肝組織（コラーゲンゲル等）が管状コネクタから脱離していない状態で、管状コネクタ中に培地を流入させることで、棒状部材を抜去した後の空間（ｈｏｌｌｏｗ　ｃｈａｎｎｅｌ）に培地を灌流させることができる。これにより、培養する肝組織内部からも栄養分が提供され、図２ａの（ｉｉ）~（ｉｖ）に示すように、コラーゲンゲル中の肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞が培養される。その結果、主血管様構造や類洞様構造など、３次元組織としての肝組織全体の構築が効果的に行われる。当該培地の灌流は、例えば、図２ｂに示すように、培養容器全体を培地に浸漬させ、外部ポンプ等を用いて、管状コネクタから培養組織内に灌流させることも好ましい態様である。
　ここで、上述した培地の灌流の条件としては、限定はされないが、例えば、培地の流量を、シアストレスが１×１０−８~１０Ｐａとなるように調整することが好ましく、１×１０−６~５Ｐａ、１×１０−４~３Ｐａ、又は１×１０−３~１Ｐａとなるように調整することも好ましい。なお、上記シアストレス（τ［Ｐａ］）は、以下の計算式で算出することができる。
　τ＝（４μＱ）／（πＲ３）［Ｐａ］
　　μ：培地の粘性率（Ｐａ・ｓ）
　　Ｑ：流量（ｍ３／ｓ）
　　Ｒ：主血管半径（ｍ）
（例えば、本願実施例の場合、主血管様構造の直径：５００μｍ、流量：１ｍＬ／ｈｏｕｒの場合、シアストレス：０．０１８Ｐａとなる。但し、培地ＤＭＥＭ（３７℃）の粘性率は、文献値：０．０００７８Ｐａ・ｓを使用。）
　肝組織に関するその他の培養条件については、生体組織を培養する際に周知の条件を適宜採用することができる。例えば、培地の種類については、ダルベッコ改変イーグル培地、ハムＦ−１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｍ１９９培地、血管内皮細胞増殖培地、肝細胞培養培地等が好ましく挙げられ、これらの混合物を用いることもできる。また、ウシ胎児血清、内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子などの成長因子を添加したものを用いることもできる。培養の温度条件ついては、例えば、３５~４０℃が好ましく、より好ましくは３７℃であり、培養期間は、例えば、２~２０日程度が好ましいが、特に限定はされない。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜材料・方法＞
細胞培養
　肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞は、１０％のウシ胎児血清及び１％の１００倍濃度ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）によって培養した。ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）はキットに含まれる成長因子及び１％の１００倍濃度ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加した内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ−２）によって培養した。不死化ＭＳＣ（間葉系幹細胞）は１０％のウシ胎児血清、１％の１００倍濃度非必須アミノ酸溶液及び１％の１００倍濃度ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加したＤＭＥＭによって培養した。全ての細胞は３７℃、５％ＣＯ２環境において培養した。
培養容器・灌流デバイスの作製
　培養容器としても用いられる灌流デバイスは、３Ｄプリンタによって造型した（アクリル樹脂製）。デバイスは超音波洗浄機によって洗浄後、７０％エタノールによって滅菌した。クリーンベンチ内で乾燥させた後、細胞及びコラーゲンゲルの接着性向上のため、デバイスを５分間の大気プラズマで処理し、１０μｇ／ｍＬのウシ由来フィブロネクチンに浸漬して３７℃で２時間コーティング処理を行った。デバイスはＭｇ２＋，Ｃａ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に入れ、最大で１週間４℃で保管した。組織構築の直前に、針（テルモ社製：シリンジ針２５Ｇ（直径：０．５０ｍｍ、材質：ステンレス鋼））をコネクタに通した。
組織構築及び培養
　ＨｅｐＧ２細胞（３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ），ＨＵＶＥＣ（３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、ＭＳＣ（０．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ又は０．０５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を懸濁した３ｍｇ／ｍＬの中性化Ｉ型コラーゲンを灌流デバイスに充填した。ゲル化のため３７℃でインキュベートした後、針（前記シリンジ針２５Ｇ）を抜去して空洞流路を形成し、デバイスを培地に浸漬した。組織培養用培地として、非灌流条件及び通常密度ＭＳＣ・灌流条件においては１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭと、キットに含まれる成長因子及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＥＧＭ２を１：１で混合したものを用いた。また低密度ＭＳＣ・灌流条件においては１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭを用いた。空洞流路に１００μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をシリンジ及びシリンジポンプを用いて注入した。２０分間のインキュベートの後、流路の上面に細胞を接着させるためデバイスを裏返してさらに２０分間インキュベートした。その後再び灌流デバイスを元の位置に戻し、８０分経過後、ペリスタルティックポンプを用いて１ｍＬ／ｈｏｕｒの流量で培地を灌流した。組織内での流れは、墨汁とＰＢＳを２：１で混合したものをシリンジポンプによって注入することで可視化した。
組織学的解析
　培養４日後、組織は４％パラフォルムアルデヒドによって固定し、パラフィンに包埋した。組織は５μｍに薄切し、ＨＥ染色及び免疫染色に供した。ＨＥ染色については、薄切切片を脱パラフィン及び再水和し、マイヤーのヘマトキシリン及びエオシンＹ・エタノール溶液によって染色した。免疫染色については、再水和後の薄切切片をオートクレーブ装置により１２１℃、１５分間処理し、抗原賦活化を行った。切片を超純水によって洗浄後、４％ブロックエースで２０分間ブロッキングした。次に１％ブロックエースで希釈した１次抗体で一晩インキュベートした。本実施例では、１次抗体としてＣＤ３１（１：２００，ＢＢＡ７，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ），ＥｐＣＡＭ（１：２００，ａｂ７１９１６，Ａｂｃａｍ　ＰＬＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ），ａｌｂｕｍｉｎ（１：１００，ＭＡＢ１４５５，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ），ＣＹＰ２Ｄ６（１：１００，ＡＶ４１６７５，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。切片をＰＢＳで洗浄した後、２次抗体で１時間インキュベートした。さらにヘキストを用いて対比染色を行った。
遺伝子発現解析
　培養７日後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　ＲＮＡを用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ−ｓｅｑ用のライブラリはＴｒｕｓｅｑ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｍＲＮＡによって調製した。シーケンスはＮｏｖａＳｅｑ　６０００によって行った。取得したデータは、ＳＴＡＲ、ＲＳＥＭ、ｅｄｇｅＲによって解析した。ＧＯエンリッチメント解析はＤＡＶＩＤによって行い、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒによりグラフ化した。
細胞密度分布の測定
　主血管周辺の細胞密度分布の評価のため、固定した組織をＯＣＴコンパウンドに包埋し、７ｕｍに薄切した。ヘキストで染色した切片の画像をＩｍａｇｅＪによって解析した。画像を閾値処理及びｗａｔｅｒｓｈｅｄ処理によって二値化した。次いで、主血管の上側及び下側の領域の細胞数をａｎａｌｙｚｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｐｌｕｇｉｎによって計数した。
アルブミンの定量
　培養上清に含まれるアルブミンの定量のため、培地を４日後及び７日後に採取し、測定まで−８０℃に保管した。サンプルは融解後、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡキットによって定量した。
＜結果＞
管状肝組織の構築
　ヒトの肝臓は肝動脈、門脈、中心静脈といった大血管及び類洞からなる脈管系を持つ。肝臓及び類洞の正確な構造を模すためには、収縮と血管新生を含む自己組織化プロセスが有力な手法である。そこで、肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をコラーゲンゲルに分散させた組織を作製することとした。大血管（主血管）様構造の作製及び維持のため、組織の収縮に抗して組織を把持するアンカー付きの管状コネクタを備えた灌流デバイスを用いた。また、このデバイスは大気プラズマ及びフィブロネクチンによってコーティングすることで細胞及びコラーゲンの接着性を向上させた。以上の方針に基づき、ヒト肝に類似した形態を有する管状の肝組織を設計した。この管状肝組織において、類洞様構造は細胞によって自己組織化され、さらに主血管様構造に接続されている。この主血管様構造は灌流デバイスに接続されているため、作製された肝組織は灌流可能である。
　管状肝組織は図２ａに示すように作製した。まずＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣ、ＭＳＣを懸濁したコラーゲン溶液を大気プラズマ及びフィブロネクチンコートを施した灌流デバイス内に注入した（図２ａ（ｉ））。コラーゲンのゲル化後、コネクタに通してあった棒状部材（針）を抜去することで空洞流路を構築した（図２ａ（ｉｉ））。続いて、空洞流路にＨＵＶＥＣを注入し、流路壁面を被覆した（図２ａ（ｉｉｉ））。ペリスタルティックポンプを用いて構築した主血管に培地を灌流した（図２ａ（ｉｖ），図２ｂ）。主血管に灌流できていることを示すため、４日灌流した後、墨汁を注入した（図２ｃ）。注入したインクは灌流デバイスの注入側のコネクタから主血管へと流入した、排出側コネクタから排出された。この際に肝組織及び灌流デバイスの接合部からの漏れは観察されなかった。これらの結果より、灌流デバイスがアンカー及び表面処理の効果により、培地灌流の圧力や組織収縮による応力に抗して肝組織を把持可能であることが示唆された。
組織学的解析により、灌流によって類洞様構造が形成されることが示された
　肝組織の培養条件を正確に決定するため、以下の三種類の培養条件を試行した：通常密度ＭＳＣ（０．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）・非灌流条件、低密度ＭＳＣ（０．０５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）・灌流条件、通常密度ＭＳＣ（０．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）・灌流条件。図３ａ−ｃに示すように、収縮量は低密度ＭＳＣ・灌流条件において最小だったが、これはマトリゲル（登録商標）に細胞を播種した場合（前掲の非特許文献１参照）と同様に、コラーゲンに細胞を分散させた組織においてもＭＳＣが収縮に寄与することを示している。また、この結果は、収縮が組織密度の向上と血管新生に重要であると考えられていることから、通常密度ＭＳＣが実験条件として好ましいことも示唆している。続いて、組織の構造をより詳細に調べるため、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色を行った。その結果、形態は異なるものの、両灌流条件において主血管周辺に細胞が凝集体を形成したことが観察された。一方、非灌流条件においてはそのような凝集体の形成は見られなかった。
　これらの違いはそれぞれＨＵＶＥＣ及びＨｅｐＧ２のマーカーであるＣＤ３１及びＥｐＣＡＭの免疫染色により検証した（図３ｇ−ｉ）。非灌流条件においては、ＣＤ３１陽性細胞、ＥｐＣＡＭ陽性細胞は疎に分布していたものの、類洞様構造は観察されなかった（図３ｇ）。低密度ＭＳＣ・灌流条件においては、ほとんどの凝集体の細胞はＥｐＣＡＭで染色され、ＣＤ３１陽性のものはほとんど観察されなかった（図３ｈ）。これらに対し、通常密度ＭＳＣ・灌流条件のＣＤ３１陽性の領域は非灌流のものと比べて明らかに大きかった（図３ｉ）。ＣＤ３１陽性の領域は管腔構造を形成しており、さらに類洞と同じように主血管に接続しているように観察された。類洞様構造の密度は主血管周辺で高く、距離が離れるにつれて減少する傾向にあった。さらに、類洞様構造はＥｐＣＡＭ陽性のＨｅｐＧ２細胞に隣接しており、これはヒト肝臓において類洞が肝細胞（ヘパトサイト）によって囲まれているのと類似した形態である。これらの結果は、灌流が組織内部において類洞様構造を形成するために必要不可欠であることを示唆するとともに、ＭＳＣが類洞様構造の形成に寄与していることを示唆している。
　次に、それぞれ肝臓で産生される主要なタンパク質及び代謝酵素であるアルブミン及びＣＹＰ２Ｄ６の免疫染色を実施した（図４ａ，ｂ）。その結果、アルブミンとＣＹＰ２Ｄ６は灌流条件において比較的強く検出された。これは灌流によって組織の機能が正常に維持されたことを示唆している。また予期していたとおり、アルブミンの主血管からの距離に応じた減衰率は、ＣＹＰ２Ｄ６のそれよりもやや大きかった。これはヒト肝臓におけるゾネーション（酸素が豊富な領域ではアルブミンなどのタンパク産生が多く、酸素が少ない領域では異物代謝活性が高いことを示す用語）が部分的に再現されたことを示唆している。
遺伝子発現解析により、灌流が血管新生関連の遺伝子発現を亢進することが示された
　灌流が肝組織のグローバルな遺伝子発現に与える影響を調べるため、培養７日後のサンプルについてＲＮＡ−ｓｅｑを実施した（図５ａ−ｄ）。その結果、９５４の発現変動遺伝子（調整後　ｐ−ｖａｌｕｅ＜０．０５かつｌｏｇ２［ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ］≧１の条件で定義）が検出された（図５ａ）。これらの発現変動遺伝子のうち、５２０が非灌流、４３４が灌流条件においてそれぞれ亢進されていた。特に灌流条件においては、血管新生に関わる遺伝子（ＶＥＧＦＣ：血管内皮細胞増殖因子の一種、ＨＧＦ：ヘパトサイト増殖因子、ＦＧＦ５：線維芽細胞増殖因子の一種、ＣＤ３４：血管新生を行う内皮細胞の発現する膜貫通型タンパク質、ＣＯＬ８Ａ１：血管新生部位において発現する細胞外マトリクス）の亢進が見られた。これは灌流条件においてのみ類洞様構造の形成が観察されたという組織学的解析の結果と一致する。また、灌流が肝臓の機能に与える影響を調べるため肝臓関連遺伝子について調査を行った。肝臓関連遺伝子として、第１~３相の薬剤代謝に関わる遺伝子、及び肝機能を制御することが知られている核内レセプターの遺伝子の合計２６１個を先行文系に基づいて選んだ。その結果、大半の遺伝子（２４６個）についてはその発現レベルが維持されていることが分かった（図５ｂ）。灌流条件で培養した組織から抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの量が非灌流の４．６倍多かったことを合わせて考慮すると、灌流は細胞の生存率だけでなく、代謝機能も維持することが示唆される。
　さらに灌流の効果を調べるため、次にＧｅｎｅ　ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）エンリッチメント解析を行った（図５ｃ，ｄ）。予想どおり、血管新生に関わる生物学的プロセス（（ＧＯ：００４５７６６，ＧＯ：０００１５２５）が灌流条件において亢進されていた。一方、非灌流条件では免疫反応及び炎症反応に関わるもの（ＧＯ：０００６９５５，ＧＯ：０００６９５４，ＧＯ：０００６９５３）が亢進されていたことから、非灌流条件の組織は何らかの非健康的な状態にあったと考えられる。
機能解析により、主血管及び類洞様構造を通じた物質交換が示された
　類洞様構造の機能を試験するため、まず主血管に墨汁を注入し、組織への浸透を検証した（図６ａ−ｆ）。図６ａに示すように、注入した墨汁は主血管だけでなく、その周辺においても確認された。組織中での墨汁の局在をより詳細に解析するため、墨汁陽性の領域を明視野画像から閾値処理によって抽出し（図６ｂ，ｃ）、免疫染色像と重ね合わせた（図６ｄ−ｆ）。この結果、得られた重ね合わせ像によると、墨汁陽性の領域は主血管の端から１６０μｍの距離まで到達していた。加えて、墨汁陽性の領域は、ＣＤ３１陽性の類洞様構造と共局在していたことから、類洞様構造が主血管に接続していることが示唆された。さらに、主血管周辺の細胞密度分布を解析した（図６ｊ）。解析対象領域の細胞数は灌流条件において２２．９個だったが、これは非灌流条件の２．３倍であった。特に、細胞密度は主血管から２００μｍ以内の領域において、非灌流のものと比較して有意に高かった。この細胞密度分布の違いから、灌流によって酸素及び栄養分が供給され、またその勾配が形成されたことが示唆される。最後に、培養４日後及び７日後において、ＥＬＩＳＡ法を用いて培養液に分泌されたアルブミンの濃度及び累積量を計測・算出した。図６ｋに示すように、培養７日後において、灌流条件のアルブミン量は非灌流の場合の５．５倍であった。以上のことから、物質交換（組織への物質流入及び組織からの物質流出）が主血管及び類洞様構造を通じた灌流によって達成されたと判断される。
＜考察＞
　本実施例においては、灌流デバイスと細胞株を分散したコラーゲンゲルとを組み合わせることで灌流可能な主血管様構造及び類洞様構造を有する管状肝組織を作製できることが示された。組織学的解析及び遺伝子発現解析により、主血管様構造を通じた灌流が類洞様構造の血管形成を促進すること、及び肝組織の生存率及び機能を維持することが示された。肝臓関連遺伝子の多くは、大きくは亢進されなかったが、灌流した組織から抽出されたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ量が、非灌流のものと比較して多かったことから、組織全体として考えれば、灌流条件の肝組織は非灌流のものに比べて高い機能を有すると認められた。遺伝子発現解析により、非灌流条件では炎症に関するＧＯターム（生物学的プロセス）が亢進されることが分かった。この結果は、非灌流の組織においては、酸素及び栄養の欠乏している深部の死細胞の刺激によって、生細胞が炎症状態になっている可能性を示唆している。また、物質交換の機能が細胞密度の計測及びアルブミン量の計測によって示された。なお、非灌流と灌流条件の比較しか行っていないものの、非灌流が流量ゼロの極限であることを考慮すれば、物質交換の効率は灌流の流量によって制御されると考えられる。さらに、本実施例では、肝組織を作製するための細胞としてＨｅｐＧ２細胞、ＨＵＶＥＣ、ＭＳＣを使用したが、これらの細胞は容易に他種の実質細胞、内皮細胞、間葉系幹細胞に置換可能であることを考慮すれば、本実施例の手法は、一般的な主血管様構造及び毛細血管様構造を有する各種臓器・組織等の３次元組織モデルの構築に適用可能であると考えられる。また、使用する細胞として、株化細胞のほかに、初代細胞やｉＰＳ細胞由来の細胞を用いることでより生体に近い組織が構築できる可能性がある。さらには、細胞の密度及び比率、ＥＣＭゲルの濃度、灌流の流量、培地組成といった培養に関するパラメータを、目的の各種臓器・組織により適宜設定することも上記可能性を高める要因になると考えられる。
　従来より、主血管様構造の作製方法は様々なものが提案されている。例として、組織に埋め込まれたアルギン酸ファイバーを溶かすことで心臓組織に内皮細胞で覆われた流路を作製する手法、ハイドロゲルの３Ｄプリントを用いて真皮線維芽細胞を分散した組織中に主血管様構造を作製する方法などがある。毛細血管（類洞）様構造もまた、細胞の自発的な血管形成を利用した種々の方法が提案されている。例として、脂肪組織由来細胞により血管新生した皮膚組織や、ｉＰＳ細胞由来肝内胚葉細胞、ＭＳＣ、ＨＵＶＥＣの自己組織化を利用して構築された肝芽（ｌｉｖｅｒ　ｂｕｄ）などがある。さらに、主血管様構造及び毛細血管様構造の構築方法を組み合わせたアプローチも提案されている。しかしながら、高い密度の実質細胞を充填した組織で主血管様構造及び毛細血管様構造の両方を構築するのは、困難であった。この理由として、高密度の実質細胞と毛細血管様構造を有する組織を作製するために有力な手法は組織中にＭＳＣを導入し、組織収縮を誘引するものであるが、このような組織収縮条件下においては主血管と外部接続用ポートの接続を維持するのが困難であることが挙げられる。この技術的障壁を、アンカー付きのコネクタを使用したり、また大気プラズマ及びフィブロネクチンによって表面処理した灌流デバイスとすることによって解決できることを本発明者は実証した。
　本発明の３次元肝組織モデルは、培地や所望の薬剤等を灌流させることができる主血管様構造と、それに接続された類洞様構造とを併せ持つものであり、実際の肝組織により近い代謝及びタンパク質産生等の機能を有するものとなり得る。そのため、本発明の３次元肝組織モデルは、例えば、肝機能を改善する若しくは亢進させる物質、又は肝機能障害を予防若しくは治療する物質をスクリーニングするための創薬試験ツール、あるいは、創薬において、候補化合物の肝臓での代謝速度や産生される代謝産物の組成、又はその候補化合物や代謝産物が肝臓に与える影響等を予測評価するための試験ツールとして用いることができ、さらには、肝臓の再生医療用として用いることができるといった、有用性・実用性に優れたものである。

Claims (14)

  1. 　主血管様構造及び類洞様構造を有する３次元肝組織モデル。
  2. 　主血管様構造は灌流可能なものである、請求項１に記載の３次元肝組織モデル。
  3. 　主血管様構造は、外部の灌流デバイスに接続されている又は接続可能なものである、請求項１又は２に記載の３次元肝組織モデル。
  4. 　類洞様構造の一部は、主血管様構造に接続されている、請求項１~３のいずれか１項に記載の３次元肝組織モデル。
  5. 　３次元肝組織は、コラーゲンゲル中に分散した肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を培養して作製されたものである、請求項１~４のいずれか１項に記載の３次元肝組織モデル。
  6. 　肝細胞が、肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞であり、血管系細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であり、間葉系細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項１~５のいずれか１項に記載の３次元肝組織モデル。
  7. 　３次元肝組織は、該組織を貫通する主血管様構造の周囲に、類洞様構造を含む肝組織が形成された、管状の組織である、請求項１~６のいずれか１項に記載の３次元肝組織モデル。
  8. 　肝機能を改善する若しくは亢進させる物質、又は肝機能障害を予防若しくは治療する物質をスクリーニングするためのものである、請求項１~７のいずれか１項に記載の３次元肝組織モデル。
  9. 　肝臓の再生医療に用いられるものである、請求項１~７のいずれか１項に記載の３次元肝組織モデル。
  10. 　主血管様構造及び類洞様構造を有する３次元肝組織モデルの作製方法であって、
    　（Ａ）培養容器の側面に、対向するように、該容器の外部から内部に通じる管状コネクタを設け、一方のコネクタから他方のコネクタの管内に、主血管様構造を形成するための棒状部材を通す工程（Ａ工程）、
    　（Ｂ）Ａ工程後の培養容器内に、肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を含むコラーゲンゲルを充填する工程（Ｂ工程）、
    　（Ｃ）棒状部材を管状コネクタから抜去する（Ｃ工程）、
    　（Ｄ）Ｃ工程の前又は後に、培養容器中の前記コラーゲンゲル全体が浸漬するように培地を投入する、又は培養容器中の前記コラーゲンゲル全体を培地中に浸漬させる工程（Ｄ工程）、
    　（Ｅ）棒状部材を抜去した管状コネクタから培地を灌流させる工程（Ｅ工程）、並びに
    　（Ｆ）Ｄ工程及びＥ工程により、前記コラーゲンゲル中の肝細胞、血管系細胞、及び間葉系細胞を培養する工程（Ｆ工程）
    を含む、前記作製方法。
  11. 　Ａ工程において、管状コネクタを設けた培養容器の表面に、大気プラズマ処理、及び／又はフィブロネクチンによるコーティング処理を行う、請求項１０に記載の作製方法。
  12. 　管状コネクタは、培養容器の内部側の端にアンカー構造が設けられている、請求項１０又は１１に記載の作製方法。
  13. 　肝細胞が、肝がん由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞であり、血管系細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）であり、間葉系細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項１０~１２のいずれか１項に記載の作製方法。
  14. 　請求項１~８のいずれか１項に記載の３次元肝組織モデルの作製方法である、請求項１０~１３のいずれか１項に記載の作製方法。
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