WO2012036225A1 - 細胞シート積層化物の製造方法、それより得られる血管網を有する細胞シート積層化物及びその利用方法 - Google Patents

細胞シート積層化物の製造方法、それより得られる血管網を有する細胞シート積層化物及びその利用方法 Download PDF

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cell
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gel
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勝久 坂口
清水　達也
関根　秀一
梅津　光生
岡野　光夫
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学校法人 東京女子医科大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell sheet laminate useful in the fields of medicine, biology, drug discovery, pharmacy, etc., a cell sheet laminate having a vascular network obtained therefrom, and a method for using the same.
  • This application is a priority claim application based on the Japanese application (Japanese Patent Application No. 2010-225201) filed on September 14, 2010.
  • animal cell culture technology has made significant progress, and research and development for animal cells has been extended to various fields.
  • the target animal cells can be used not only to commercialize the original cells, but also to produce their products, and to design effective drugs by analyzing the cells and their cell surface proteins. It is also being practiced to regenerate the patient's own cells outside the living body, or to improve the function of the cell and then return it to the living body for treatment.
  • techniques for culturing animal cells and techniques for evaluation, analysis, and utilization are one field that researchers are paying attention to.
  • many animal cells including human cells are adhesion-dependent. That is, when culturing animal cells in vitro, it is necessary to attach them to the substrate surface once. And it is necessary to peel the cultured cells while keeping the cultured form on the surface of the base material without peeling them apart.
  • organ transplants that attempt to replace difficult-to-treat organs with other people's organs have become common in recent years.
  • the target organs are very diverse, such as skin, cornea, kidney, liver, heart, etc., and the progress after surgery has improved remarkably, and has already been established as a medical technology.
  • corneal transplantation an eye bank was established in Japan about 50 years ago and transplantation activities began. However, the number of donors is still small, and there are about 20,000 patients who need corneal transplants in Japan alone, whereas it is said that there are only about 1/10 of the 2000 patients who can actually perform transplantation treatment. Yes.
  • corneal transplantation the current situation is that the next medical technology is required due to the shortage of donors. Under such circumstances, a technique for culturing and transplanting normal cells of a patient to a desired size has been developed.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 02-21865 (Patent Document 1) describes a cell culture support in which a substrate surface is coated with a polymer having an upper or lower critical solution temperature in water of 0 to 80 ° C. A new cell culture in which cells are cultured above the upper critical lysis temperature or above the lower critical lysis temperature and then exfoliated without enzyme treatment by bringing it to the upper critical lysis temperature or below the lower critical lysis temperature. The law is shown. Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Patent Document 2 uses this temperature-responsive cell culture substrate to cultivate skin cells at or below the upper critical lysis temperature or above the lower critical lysis temperature, and then upper critical It is described that cultured skin cells can be detached with low damage by setting the melting temperature to be equal to or higher than the melting temperature or lower than the lower critical melting temperature.
  • Non-Patent Document 1 FASEB. J. et al. , 20 (6), 708-710 (2006) (Non-Patent Document 1), it was attempted to laminate cell sheets in vivo, and it was shown that a 1 mm thick myocardial sheet laminate was obtained. . Among them, in order to obtain a thick cell sheet laminate, it has been found that it is essential to supply nutrients and oxygen to each laminated cell or each cell sheet. J. et al. , 20 (6), 708-710 (2006) (Non-Patent Document 1), it is necessary to repeatedly transplant the cell sheet into the living body, and each time the transplant site must be opened, There is a strong demand for a technique that can be easily laminated many times so as to solve this problem.
  • the present invention has been made with the intention of solving the above-described problems related to the lamination of cell sheets. That is, the present invention provides a novel method for producing a cell sheet laminate created based on a completely different idea from the prior art, a cell sheet laminate having a vascular network obtained therefrom, and a method for using the same. .
  • the present inventors have conducted research and development by adding studies from various angles. As a result, a flow path for perfusing the medium inside the gel is provided, vascular endothelial cells are induced, a vascular bed in which a vascular network is constructed in the gel is produced, and cell sheets are laminated on the vascular bed. It was found that a vascular network can be constructed in the cell sheet, and the cell sheet can be easily laminated thickly.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention produces a blood vessel bed in which a blood vessel network is constructed from the flow path for perfusing the medium provided in the gel to the surface, and the cell sheets are laminated on the blood vessel bed, whereby a blood vessel is formed in the cell sheet.
  • the present invention provides perfusion for a method for producing a laminated cell sheet characterized by constructing a net. Furthermore, this invention provides the cell sheet laminated body obtained from it. Furthermore, this invention provides the method of utilizing the cell sheet laminated body.
  • the present invention is very important to realize for the first time by using a cell structure based on a novel concept unparalleled in the world that a laminated cell sheet having a thickness can be produced in vitro using a vascular bed. It is considered an invention.
  • a vascular network can be constructed in a cell sheet, and if the cell sheet is laminated, a thick cell sheet laminate can be easily produced.
  • a laminated cell sheet is expected to be useful for regenerative medicine of various tissues as a tissue-like structure in vivo.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline of a procedure when creating a blood vessel bed according to Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline at the time of producing a blood vessel bed of Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline at the time of producing a blood vessel bed of Example 1.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS It is a figure which shows the outline
  • FIG. It is a figure which shows a mode that a vascular endothelial cell is migrated toward the flow path of the vascular bed of Example 1.
  • FIG. (A) shows a cross-sectional view of the cell sheet laminate.
  • a region indicated by a dotted line indicates a flow path in the collagen gel, and an arrowhead indicates a capillary network formed by migration of vascular endothelial cells from the cell sheet.
  • B shows what removed the gel and the cell sheet after hardening
  • A is a figure which shows the number (horizontal axis) of the cell sheet laminated
  • (B) is a figure which shows the thickness of a cell sheet when three cell sheets are laminated
  • the horizontal axis indicates the relationship between the number of stacked cell sheets, the number of times, and the thickness. It is a figure which shows the relationship between the cell sheet lamination
  • FIG. (A) shows the figure which flowed the red blood cell from the flow path
  • (B) is the figure which shows sectional drawing of the cell sheet laminated body produced with the blood vessel bed which has a flow path above and below the cell sheet laminated body.
  • FIG. (B) shows the figure which shows the outline
  • the object of the present invention is to easily produce a thick cell sheet laminate.
  • a vascular network be constructed in the cell sheet laminate as described above.
  • a blood vessel network can be easily constructed between the flow channel in the gel and the surface by providing a flow channel inside the gel and perfusing the culture medium into the flow channel.
  • suspending vascular endothelial cells in a medium to be perfused in the flow path in the gel allows a vascular network to be constructed between the flow path and the surface in the gel.
  • a vascular network to be constructed between the flow path and the surface in the gel.
  • the flow path is provided inside the gel, it is only necessary to create a region that is not filled with the gel, and what is used for this purpose is not particularly limited.
  • stainless steel wire, silicon wire, metal, polymer compound and the like are not particularly limited.
  • the blood vessel bed is a structure found in living tissues and organs, and refers to a structure combining capillaries and surrounding tissues.
  • the vascular bed functions to exchange oxygen, glucose, and other nutrients in living tissue through the thin walls of capillaries that are stretched infinitely in the vascular bed. Waste products such as carbon dioxide exude into capillaries in the vascular bed.
  • Waste products such as carbon dioxide exude into capillaries in the vascular bed.
  • the reason why the tissue fluid is kept relatively constant in the living tissue is that there is substance exchange in the capillaries.
  • a vascular bed that performs a function of efficiently exchanging oxygen, glucose, and other nutrients in a cell sheet is artificially produced in vitro and used.
  • the gel When producing a blood vessel bed having a flow path for perfusing a medium or the like inside the gel, the gel may be mixed with cells.
  • the cell type, the number of cells, the ratio, etc. to be mixed with the gel are not limited at all, but may be appropriately selected or adjusted according to the tissue, organ, site, application, etc. of the living body to be transplanted.
  • the cells used include cardiomyocytes, myocardial blasts, myoblasts, mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, Any one of fibroblasts, bone marrow-derived cells, fat-derived cells, or a mixture of two or more types of cells can be used, and the type is not limited.
  • preparation of artificial liver simulating liver tissue, or method for evaluating the function of liver tissue for example, hepatocytes, sinusoidal endothelial cells, Kupffer cells are used.
  • Stellate cells pit cells, bile duct epithelial cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow derived cells, adipose derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more types of cells
  • fibroblasts vascular endothelial progenitor cells
  • fibroblasts bone marrow derived cells
  • adipose derived cells mesenchymal stem cells
  • mesenchymal stem cells or a mixture of two or more types of cells
  • preparation of artificial kidney simulating kidney tissue for example, kidney cells, granule cells, collecting duct epithelial cells, wall side epithelium are used.
  • Cells podocytes, mesangial cells, smooth muscle cells, tubule cells, interstitial cells, glomerular cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial precursor cells, fibroblasts, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, mesenchymal stem cells Any one kind or a mixture of two or more kinds of cells may be mentioned, and the kind is not limited at all.
  • the cells used include adrenal medullary cells, adrenal cortical cells, spherical layer cells, bundled layers Examples include cells, upper layer cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more cells. There are no restrictions on its type.
  • cells used include epidermal keratinocytes, melanocytes, napped muscle cells, hair follicle cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibers
  • examples include blast cells, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more cells, and the types thereof are not limited at all.
  • the cells used may be cells collected from the tissue constituting the mucous membrane.
  • mucosa examples include buccal mucosa, gastric mucosa, intestinal mucosa, olfactory epithelium, oral mucosa and uterine mucosa.
  • the cells collected from the mucosal tissue any one type or a mixture of two or more types of cells can be mentioned, and the type is not limited at all.
  • the gel used in the present invention is not particularly limited, but a gel made of a biodegradable polymer is convenient when the obtained cell sheet laminate is intended to be used for transplantation into a living body. In that case, the biodegradable polymer part disappears in the living body, and the laminated cell sheet of the present invention is connected through the living body and the blood vessel.
  • the type of such biodegradable polymer is not particularly limited, and examples thereof include collagen, fibrin, gelatin, polysaccharides, elastin, fibronectin, laminin, chitin, chitosan and the like alone or a mixture of two or more. Etc.
  • the present invention uses the gel having a vascular network thus obtained, and uses it as a vascular bed to construct a vascular network on a cell sheet engrafted thereon. That is, the present invention provides a technique for constructing a vascular network in a cell sheet by using an artificial substance called a gel.
  • a gel an artificial substance called a gel.
  • what is circulated in the vascular bed is not particularly limited to a medium, blood, serum or the like, but a medium that can be easily handled includes a medium.
  • the type of the medium is not particularly limited, but a medium suitable for the cells constituting the cell sheet cultured on the vascular bed is preferable. For example, if cell sheets made of cardiomyocytes are laminated on the vascular bed, M199 medium for culturing cardiomyocytes is suitable.
  • the type of cells used in the cell sheet of the present invention is not particularly limited, and cells obtained from a site to be transplanted using the obtained cell sheet laminate, or cells derived from an organ or tissue to be evaluated are used. Use it.
  • the cells used include cardiomyocytes, myocardial blasts, myoblasts, mesenchymal stem cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, Any one of fibroblasts, bone marrow-derived cells, fat-derived cells, or a mixture of two or more types of cells can be used, and the type is not limited.
  • liver tissue For the purpose of regeneration of liver tissue, preparation of artificial liver simulating liver tissue, or method for evaluating the function of liver tissue, for example, hepatocytes, sinusoidal endothelial cells, Kupffer cells are used. , Stellate cells, pit cells, bile duct epithelial cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow derived cells, adipose derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more types of cells There are no restrictions on the type.
  • kidney cells For the purpose of regeneration of kidney tissue, preparation of artificial kidney simulating kidney tissue, or method for evaluating kidney function, for example, kidney cells, granule cells, collecting duct epithelial cells, wall side epithelium are used.
  • Any one kind or a mixture of two or more kinds of cells may be mentioned, and the kind is not limited at all.
  • the cells used include adrenal medullary cells, adrenal cortical cells, spherical layer cells, bundled layers Examples include cells, upper layer cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more cells. There are no restrictions on its type.
  • cells used include epidermal keratinocytes, melanocytes, napped muscle cells, hair follicle cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibers
  • examples include blast cells, bone marrow-derived cells, adipose-derived cells, mesenchymal stem cells, or a mixture of two or more cells, and the types thereof are not limited at all.
  • the cells used may be cells collected from the tissue constituting the mucous membrane.
  • mucosa examples include buccal mucosa, gastric mucosa, intestinal mucosa, olfactory epithelium, oral mucosa and uterine mucosa.
  • the cells collected from the mucosal tissue any one type or a mixture of two or more types of cells can be mentioned, and the type is not limited at all.
  • the content ratio of the cells is not particularly limited. At this time, if vascular endothelial cells, vascular endothelial precursor cells, and the like are mixed in the cell sheet, the vascular network is efficiently constructed in the cell sheet, which is advantageous.
  • Examples of the cells used in the present invention include cells directly collected from living tissues, cells directly collected and differentiated in a culture system, or cell lines, but the type is not limited at all. Although the origin of these cells is not particularly limited, for example, humans, rats, mice, guinea pigs, marmosets, rabbits, dogs, cats, sheep, pigs, goats, monkeys, chimpanzees, or immunodeficient animals thereof However, when the cell sheet laminate of the present invention is used for human treatment, it is preferable to use cells derived from humans, pigs, monkeys, and chimpanzees.
  • the cells used in the present invention are not particularly limited, but for example, the cells may be fluorescently stained and / or dyed by at least one method such as a reagent, protein, gene and the like.
  • a cell into which a reporter gene has been introduced if the fluorescence from the reporter protein produced by the expression of the reporter gene or the fluorescence emitted when the reporter protein reacts with a specific substrate is detected, the cell sheet or The activity of the cell sheet laminate can be known.
  • the reporter gene or reporter protein to be used is not particularly limited, and examples thereof include green fluorescent protein (GFP), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), DsReD, ⁇ -glucuronidase, LacZ, maple, luciferase, alkaline phosphatase and the like. Can be mentioned.
  • a method for introducing a gene into a cell may be a conventional method, and is not particularly limited. Examples thereof include a lipofection method, a virus vector method, a calcium phosphate method, an electroporation method, a DEAE dextran method, and a microinjection method.
  • transgenic animals in which a reporter gene is introduced into the host genome may be used by using these gene introduction methods.
  • the promoter sequence that regulates the expression of the reporter gene is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the purpose of detecting the reporter gene expression.
  • the cell sheet in the present invention is obtained by culturing cells in a temperature range where the polymer hydration power is weak on a cell culture support having a surface coated with a polymer whose hydration power changes in a temperature range of 0 to 80 ° C. It can be obtained by peeling the cultured cells into a sheet by changing the medium to a temperature at which the hydration power of the polymer is strong. At that time, the cells are cultured in a temperature range where the hydration power of the polymer is weak on a cell culture support having a surface coated with a polymer whose hydration power changes in the temperature range of 0 to 80 ° C. Usually, the temperature is preferably 37 ° C., which is a temperature for culturing cells.
  • the temperature-responsive polymer used in the present invention may be either a homopolymer or a copolymer.
  • a polymer examples include polymers described in JP-A-2-21865. Specifically, for example, it can be obtained by homopolymerization or copolymerization of the following monomers.
  • the monomer that can be used include a (meth) acrylamide compound, an N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative, or a vinyl ether derivative. Two or more of these can be used.
  • copolymerization with monomers other than the above monomers, grafting or copolymerization of polymers, or a mixture of polymers and copolymers may be used.
  • poly-Nn-propylacrylamide (a homopolymer) Lower critical solution temperature 21 ° C), poly-Nn-propylmethacrylamide (27 ° C), poly-N-isopropylacrylamide (32 ° C), poly-N-isopropylmethacrylamide (43 ° C), poly- N-cyclopropylacrylamide (at 45 ° C), poly-N-ethoxyethylacrylamide (at about 35 ° C), poly-N-ethoxyethylmethacrylamide (at about 45 ° C), poly-N-tetrahydrofurfurylacrylamide (at the same) About 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl meth
  • Monomers for copolymerization used in the present invention include polyacrylamide, poly-N, N-diethylacrylamide, poly-N, N-dimethylacrylamide, polyethylene oxide, polyacrylic acid and salts thereof, polyhydroxyethyl methacrylate, Examples thereof include water-containing polymers such as polyhydroxyethyl acrylate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, cellulose, and carboxymethyl cellulose, but are not particularly limited.
  • the method for coating the surface of each of the above-described polymers used in the present invention is not particularly limited.
  • the substrate and the monomer or polymer may be irradiated with an electron beam (EB), ⁇ -rays, ultraviolet rays, It can be carried out by any of plasma treatment, corona treatment, organic polymerization reaction, or physical adsorption such as coating and kneading.
  • the coating amount of the temperature-responsive polymer on the culture substrate surface is preferably in the range of 1.1 to 2.3 ⁇ g / cm 2 , preferably 1.4 to 1.9 ⁇ g / cm 2 , and more preferably 1. 5 to 1.8 ⁇ g / cm 2 .
  • the coating amount is less than 1.1 ⁇ g / cm 2 , the cells on the polymer are difficult to peel off even when a stimulus is applied, and the working efficiency is remarkably deteriorated. Conversely, if it is 2.3 ⁇ g / cm 2 or more, it is difficult for cells to adhere to the region, and it becomes difficult to sufficiently attach the cells. In such a case, if the cell-adhesive protein is further coated on the temperature-responsive polymer coating layer, the temperature-responsive polymer coating amount on the substrate surface may be 2.3 ⁇ g / cm 2 or more.
  • the coverage of the temperature responsive polymer good 9.0 ⁇ g / cm 2 or less, preferably well 8.0 ⁇ g / cm 2 or less, expediently 7.0 ⁇ g / cm 2 or less.
  • the coating amount of the temperature-responsive polymer is 9.0 ⁇ g / cm 2 or more, even if the cell-responsive protein is further coated on the temperature-responsive polymer coating layer, it is not preferable because cells hardly adhere.
  • the kind of such cell adhesion protein is not limited at all, for example, collagen, laminin, laminin 5, fibronectin, Matrigel, etc. alone or a mixture of two or more thereof can be mentioned.
  • the cell adhesion protein coating method may be in accordance with a conventional method.
  • an aqueous solution of the cell adhesion protein is applied to the substrate surface, and then the aqueous solution is removed and rinsed.
  • the present invention is a technique for using a cell sheet itself as much as possible using a temperature-responsive culture dish. Therefore, it is not preferable that the coating amount of the cell adhesive protein on the temperature-responsive polymer layer becomes extremely large. Measurement of the coating amount of the temperature-responsive polymer and the coating amount of the cell adhesion protein may be carried out in accordance with a conventional method.
  • the method of directly measuring the cell attachment part using FT-IR-ATR the same as the pre-labeled polymer
  • a method of inferring from the amount of labeled polymer immobilized by a method and immobilized on the cell attachment portion may be used, and any method may be used.
  • the number of cells to be seeded at the time of culturing varies depending on the animal species of the cells used, but is generally 0.4 ⁇ 10 6 to 2.5 ⁇ 10 6 cells / cm 2 , preferably 0.5 ⁇ 10 6 to 2.1 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 is preferable, and 0.6 ⁇ 10 6 to 1.7 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 is more preferable.
  • the seeding concentration is 0.4 ⁇ 10 6 cells / cm 2 or less, cell proliferation is generally poor, and the degree of expression of the function of the obtained cell sheet is deteriorated, which is not preferable in practicing the present invention.
  • the temperature of the cultured substrate to which the cultured cells are attached is equal to or higher than the upper limit critical dissolution temperature of the coating polymer on the cultured substrate. It can be made to peel by making it below the critical solution temperature. At that time, it can be carried out in a medium or in another isotonic solution, and can be selected according to the purpose. For the purpose of detaching and recovering cells faster and more efficiently, use a method of tapping or shaking the substrate, or a method of stirring the medium using a pipette, alone or in combination. May be.
  • the culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited.
  • the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal calf serum (FCS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
  • FCS fetal calf serum
  • poly (N-isopropylacrylamide) is known as a polymer having a lower critical solution temperature at 31 ° C. In the free state, dehydration occurs in water at a temperature of 31 ° C. or more, and polymer chains aggregate and become cloudy. Conversely, at a temperature of 31 ° C. or lower, the polymer chain is hydrated and dissolved in water. In the present invention, this polymer is coated and fixed on the surface of a substrate such as a petri dish. Therefore, if the temperature is 31 ° C. or higher, the polymer on the substrate surface is similarly dehydrated.
  • the substrate surface is hydrophobic. Become. Conversely, at a temperature of 31 ° C. or lower, the polymer on the substrate surface is hydrated, but the polymer chain is coated and fixed on the substrate surface, so that the substrate surface becomes hydrophilic. At this time, the hydrophobic surface is an appropriate surface on which cells can attach and proliferate, and the hydrophilic surface becomes a surface on which cells cannot attach, and the cells or cell sheet in culture are peeled off only by cooling. Will be allowed to.
  • the base material to be coated substances generally capable of giving form such as glass, modified glass, polystyrene, polymethylmethacrylate, etc., which are usually used for cell culture, such as polymer compounds other than those mentioned above, are used. All ceramics can be used.
  • the shape of the culture substrate in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a dish, a multiplate, a flask, a cell insert that is cultured on a porous membrane, or a flat membrane. It is done.
  • the base material to be coated include substances that can generally give form, such as glass, modified glass, polystyrene, polymethylmethacrylate, and the like, which are usually used for cell culture, such as polymers other than those described above. Examples thereof include compounds and ceramics.
  • the cell sheet in the present invention is not damaged by proteolytic enzymes such as dispase and trypsin during culture. Therefore, the cell sheet peeled from the substrate has an adhesive protein, and when the cells are peeled into a sheet shape, the cell-to-cell desmosome structure is retained to some extent. This makes it possible to adhere well when placed on the vascular bed and to engraft efficiently.
  • dispases which are proteolytic enzymes, are known to be capable of being detached with 10-40% of the cell-cell desmosome structure retained, but the cell-substrate base membrane-like protein, etc. The resulting cell sheet is weak in strength.
  • the cell sheet of the present invention has a desmosome structure and a basement membrane-like protein remaining in 60% or more, and can obtain various effects as described above.
  • the method for producing a laminate of cell sheets in the present invention is not particularly limited.
  • the cultured cells are peeled off in a sheet form, and the cultured cell sheets are separated from each other using a cultured cell moving jig as necessary. Obtained by stacking.
  • the temperature of the medium is not more than that temperature when the polymer coated on the surface of the culture substrate has an upper critical solution temperature, and particularly if it is more than that temperature if the polymer has a lower critical solution temperature.
  • the culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited.
  • the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal calf serum (FCS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
  • FCS fetal calf serum
  • a jig is not limited in terms of material and shape as long as it can capture the peeled cell sheet, but such materials are usually polyvinylidene difluoride (PVDF), silicon Polyvinyl alcohol, urethane, cellulose and derivatives thereof, chitin, chitosan, collagen, gelatin, fibrin glue, etc. are used in contact with the cell sheet in the form of a membrane, porous membrane, nonwoven fabric or woven fabric.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • silicon Polyvinyl alcohol, urethane, cellulose and derivatives thereof, chitin, chitosan, collagen, gelatin, fibrin glue, etc. are used
  • a thick cell sheet laminate can be obtained.
  • the vascular network was not constructed as in the present invention, only about three layers could be laminated in order for the laminated cell sheets to continue to survive.
  • four or more cell sheets can be laminated.
  • the lamination method is not particularly limited, but it is preferable to laminate the cell sheets of 3 layers or less in multiple times, rather than laminating the cell sheets at once. Further, it is preferable that the layering time is set when the vascular network connected to the vascular bed is sufficiently constructed.
  • the number of times of lamination is not particularly limited as long as it is appropriately matched to the purpose for which the cell sheet laminate is used, but is preferably 5 layers or more, more preferably 10 layers or more, and further preferably 15 layers or more. If the thickness of the cell sheet laminate is increased, the effects of the present invention can be remarkably received, and a large amount of cells can be transplanted at the transplant destination.
  • a structure having channels on both the upper surface side and the lower surface side of the cell sheet laminate can be obtained. It becomes possible to efficiently introduce nutrients and oxygen into the cell sheet laminate by connecting the slag to the living body side.
  • a structure having a channel on both the upper surface and the lower surface of the cell sheet laminate is obtained by overlaying a gel provided with a channel on the cell sheet laminated on the vascular bed. be able to.
  • the produced cell sheet laminate has a blood vessel-like flow path connected to the inside of the cell sheet on the upper surface and the lower surface. Nutrition and oxygen can be efficiently introduced into the cell sheet laminate by connecting the flow path and the blood vessel on the living body side.
  • the construction method of the blood vessel network is not limited at all.
  • the flow rate of the medium to be perfused in the gel is not particularly limited, and the flow rate at which the flow path in the gel is not destroyed is set to the maximum flow rate, and the perfused medium oozes into the gel,
  • the flow rate at which the medium can reach the gel surface may be the minimum flow rate.
  • the numerical value cannot be specifically shown because factors such as the size of the flow path and the properties of the gel greatly influence.
  • perfusion may be performed by changing the flow rate of the medium.
  • perfusion culture is performed by changing the flow rate of the medium in the upper and lower flow paths of the cell sheet laminate, a phenomenon in which vascular endothelial cells migrate toward the flow path on the side where the medium is perfused faster is observed. Therefore, by promoting migration of vascular endothelial cells, a cell sheet laminate having a mature capillary network can be obtained.
  • the flow rate of the medium to be perfused may be changed up and down at regular intervals.
  • the cell sheet laminated product laminated on the vascular bed may be a method of culturing by irrigating the medium from the flow path formed in the gel in the vascular bed, and a sealed container capable of keeping the temperature, humidity and atmosphere constant. It may be a method of culturing by immersing in a medium filled with the above, or a method of culturing by irrigating the medium from a flow path formed in a gel in the blood vessel bed while being immersed in the medium. Cultivation by a method in which the medium is perfused from the flow path formed in the gel in the vascular bed while being immersed in the medium may promote the formation of blood vessels in the vascular bed and the formation of blood vessels in the cell sheet laminate.
  • the dissolved oxygen concentration of the medium rises, and blood vessel formation is promoted.
  • Various factors greatly influence the pressure applied depending on the size of the container, the size of the cell sheet laminate to be cultured, and the amount of the culture medium. In the present invention, it may be 5 mmHg or more, preferably 10 mmHg or more, and most preferably 15 mmHg or more.
  • a method for promoting the construction of a capillary network in the cell sheet laminate and between the cell sheet laminate and the vascular bed a medium for perfusing the vascular bed, a medium for immersing the entire vascular bed, or a medium for both Among them, a method of adding a factor that promotes angiogenesis can be mentioned.
  • the factor added here is not particularly limited as long as it is a factor that induces angiogenesis.
  • vascular endothelial growth factor VEGF
  • HGF hepatocyte growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • a factor that promotes angiogenesis added to the medium one may be selected from the above, or two or more may be combined.
  • concentration of the factor that promotes angiogenesis added to the medium is appropriately optimized because various factors such as the type and number of cells contained in the cell sheet, the size of the cell sheet, the type of vascular bed, etc. have a great influence. I can't show it here.
  • the temperature, humidity, and atmosphere at the time of perfusion culture of the cell sheet laminate are not limited at all, as long as they follow the standard method used when cells are cultured.
  • the laminated cell sheet may be cultured by perfusing the medium from the flow path formed in the gel in the vascular bed, and the culture container filled with a sealed container that can keep the temperature, humidity, and atmosphere constant. You may immerse and culture
  • the medium is perfused from the flow path formed in the gel in the vascular bed while being immersed in a culture container filled with a closed container that can keep the temperature, humidity, and atmosphere constant, and filled with the medium. It is a method of culturing.
  • the cell sheet laminate laminated on the vascular bed by gel is peeled off from the vascular bed of the gel, and the living body of animals including humans And a method of reimplanting onto a vascular bed derived from a piece of living tissue excised from the above, a flap, or an artificial vascular bed provided with arteries and veins.
  • An artificial vascular bed provided with a vascular bed derived from a piece of biological tissue, a flap, or an artery and a vein holds the artery and vein derived from the living body, and is obtained in the present invention via these artery and vein.
  • the method of making the vascular bed derived from a living body is not particularly limited, a piece of living tissue in which an artery and a vein are connected to each other is cut off with an electric knife or the like, and one piece of living tissue, an artery and a vein are each provided. A method of creating a connected state and indwelling it in the living body for about a week while maintaining the state can be mentioned.
  • the artificial vascular bed refers to a vascular bed-like structure in which a capillary network is constructed and the space between the capillary networks is filled with gel and / or cells.
  • the method for producing the artificial blood vessel bed is not particularly limited.
  • an arterial-venous loop in which an artery and a vein are anastomosed is contained in a region separated by a sterile container and separated.
  • a method of constructing a capillary network by filling a gel in the region and placing it in a living body.
  • the cells contained in the artificial blood vessel bed are not particularly limited, and are appropriately selected depending on the site to be transplanted and the use.
  • the cell sheet laminate obtained in the present invention can be transplanted to a predetermined site in a living body.
  • the method is not particularly limited, and examples thereof include a method of connecting a flow path provided in the cell sheet laminate of the present invention and a blood vessel on the living body, a method of attaching the cell sheet laminate to the living body, and the like.
  • Blood vessel guidance may be performed in advance on the transplant site, and there is no particular limitation.
  • the method of performing blood vessel induction is not particularly limited.
  • FGF which is a blood vessel growth factor
  • FGF which is a blood vessel growth factor
  • the transplanted cell sheet laminate of the present invention will exhibit functions in a human body for a long period of time. And the expression level of a function can be controlled by the magnitude
  • a cell sheet laminate is, for example, a cardiomyocyte, myocardial blast, myoblast, or mesenchymal stem cell as a constituent cell, heart failure, ischemic heart disease, myocardial infarction, cardiomyopathy, myocarditis, It is used for the treatment of diseases selected from the group consisting of hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy. It is specified and is not particularly limited.
  • the cell sheet of the present invention and its three-dimensional structure are transplanted to an animal, it becomes an animal for pharmaceutical evaluation.
  • the expression level of a function can be controlled with the magnitude
  • animals used herein include rats, mice, guinea pigs, marmosets, rabbits, dogs, pigs, chimpanzees, and immunodeficient animals thereof, but are not particularly limited.
  • Such a transplanted animal is used for the purpose of, for example, a cardiac function evaluation system in which a test substance is administered to this animal and the influence of the test substance on the cardiac function is determined, but is particularly limited. is not.
  • cardiomyocytes isolated and cultured from the hearts of postnatal day 0 SD rats were used. After cardiac enucleation from pups, cardiomyocytes were isolated using collagenase Type II (manufactured by Worthington), an enzyme that degrades collagen, which is a major component of tissue. Isolated cardiomyocytes were seeded in a temperature-responsive culture dish ( ⁇ 35 mm, Dish Upcell Type-E (manufactured by CellSeed)) at a concentration of 320 ⁇ 10 4 cells / dish. Four days later, when the cardiomyocytes became confluent on the surface of the culture dish, the temperature was lowered to 20 ° C. to collect the sheet-like cardiomyocyte group. In this experiment, a tissue laminated in three layers by pipetting was used.
  • collagenase Type II manufactured by Worthington
  • FIG. 2 shows a photograph of an apparatus corresponding to E in FIG. 1 and a schematic diagram for explaining a method for constructing a vascular network in a cell sheet using the apparatus.
  • FIG. 3 shows a view in which a flow path is formed with a collagen gel.
  • summary for perfusing a culture medium to this thing and the photograph (right) of an example of an apparatus are shown in FIG.
  • the arrow shown in FIG. 4 (left) indicates the direction in which the culture medium flows.
  • FIG. 5A A state of a blood vessel newly born by flowing an acrylic resin through the flow path and curing it was observed. As a result, it was revealed that an infinite number of capillary networks were formed between the vascular bed and the cell sheet (FIG. 5B).
  • FIG. 5 (A) indicates a capillary vessel formed by migration of vascular endothelial cells contained in the cell sheet toward the flow path in the vascular bed of the gel.
  • FIG. 5 (B) shows that the acrylic resin is allowed to flow through the gel flow path to be cured, and then the gel and the cell sheet are removed.
  • the tissue thickness of each layer was measured by binarizing the HE-stained image and measuring the thickness at 10 locations.
  • the measured values were 1 layer: about 7 ⁇ m, 2 layers: about 18 ⁇ m, 3 layers: about 24 ⁇ m, 4 layers: about 23 ⁇ m, 5 layers: about 26 ⁇ m, 6 layers: about 23 ⁇ m.
  • the thickness of the structure increased in proportion to the number of layers up to three layers, but the thickness of the structure in which three or more layers were stacked was almost the same as the thickness of the three layers (FIG. 6A). This is thought to be due to the fact that the supply of oxygen and nutrients by the diffusion in the cell sheet and the removal of waste products reach only 3 layers, and the cell sheets in the 4th layer and beyond are necrotized.
  • the primary cultured cardiomyocyte sheet contains fibroblasts, endothelial cells, and smooth muscle cells in addition to cardiomyocytes, so that it has blood vessels in the cell sheet and angiogenesis when gel culture is performed There is expected. Therefore, if a flow path in which a medium is perfused in a collagen gel is prepared and a primary cultured cardiomyocyte sheet is cultured on the collagen gel flow path, a blood vessel is born from the cell sheet, and if it is connected to an artificial flow path, even a thick tissue can be converted into a cardiomyocyte. It was thought that fresh medium would be supplied.
  • FIG. 3 layers + 3 layers + 3 layers were repeatedly laminated for a total of 15 days with an interval culture period of 5 days. As a result, a thickness of 78 ⁇ 11 ⁇ m was observed. As a result of perfusion culture of 3 layers + 3 layers + 3 layers over 15 days, the 9 layers could maintain a thickness of 115 ⁇ 10 ⁇ m without necrosis. Since this thickness exceeds the supply thickness of oxygen and nutrients due to diffusion from the surface, the effectiveness of the method of repeatedly laminating cell sheets after the blood vessel was constructed and the medium was supplied to the upper part was shown. . It was shown that a tissue structure that can be transplanted can be constructed by using the culture apparatus according to this experiment.
  • a blood vessel bed forming container designed so that a flow path was created above and below the cell sheet laminate was produced.
  • a stainless steel wire was placed on the acrylic frame, and the collagen gel solution was poured into the frame to be hardened and gelled.
  • the lower stainless steel wire was taken out to obtain a gel having a microchannel.
  • three layers of cardiomyocyte sheets were laminated by the method of Example 1.
  • a stainless steel wire was installed on the upper part of the cell sheet laminate, and the collagen gel solution was poured into the frame for gelation.
  • the upper stainless steel wire was taken out, and a flow channel was also created in the upper flow channel.
  • FIG. 9B a blood vessel-like structure in which upper and lower flow paths were formed was confirmed.
  • the vascular endothelial cells migrate toward the lower flow path having a high flow velocity, forming a vascular network (FIG. 9B).
  • the vascular network construction by vascular endothelial cells is influenced by the physical property of the flow rate of the medium and the vascular network is constructed.
  • the distance between the cell sheet and the flow path is within 100 ⁇ m, vascular endothelial cells migrate efficiently and a blood vessel-like tissue is constructed.
  • FIG. 10 is a diagram showing an outline of the construction of a vascular network that is induced when a cell sheet laminate using a vascular bed is produced.
  • Vascular endothelial cells migrate toward the channel from the cell sheet (FIG. 10A) placed on the collagen gel (FIG. 10B), and the vascular endothelial cells cover the inner wall of the channel to form a luminal structure (FIG. 10C). ).
  • FIG. 10D the luminal structure connected to the gel flow channel and the vascular endothelial cells in the newly laminated cell sheet are connected, and blood vessel formation is performed.
  • FIG. 10E By repeating this process, a cell sheet laminate having a thickness can be produced (FIG. 10E).
  • a vascular network can be constructed in a cell sheet, and if the cell sheet is laminated, a thick cell sheet laminate can be easily produced.
  • a thick cell sheet laminate is useful for regenerative medicine of various tissues as a tissue-like structure in vivo.

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Abstract

灌流灌流　ゲル内部に設けた培地を灌流するための流路から表面へ血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層することで細胞シート内に血管網を構築させることを特徴とする細胞シート積層化物の製造方法。この製造方法であれば、細胞シート内に血管網を構築させられ、その細胞シートを積層化すれば厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することができるようになる。このような厚みのある細胞シート積層化物は生体内組織様のものとして、さまざまな組織の再生医療に有用なものである。

Description

細胞シート積層化物の製造方法、それより得られる血管網を有する細胞シート積層化物及びその利用方法
　本発明は、医学、生物、創薬、薬学等の分野において有用な細胞シート積層化物の製造方法、それより得られる血管網を有する細胞シート積層化物及びその利用方法に関するものである。本出願は、２０１０年９月１４日に提出された日本出願（特願２０１０－２２５２０１）を基礎とする優先権主張出願である。
　今日、動物細胞培養技術が著しく進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化したりするだけでなく、今や細胞やその細胞表層蛋白質を分析することで有効な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で再生したり、或いはその機能を高めたりしてから生体内へ戻し治療する等ということも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術、並びに評価、解析、利用する技術は、研究者が注目している一分野である。ところで、ヒト細胞を含め動物細胞の多くは付着依存性のものである。すなわち、動物細胞を生体外で培養しようとするときは、それらを一度、基材表面に付着させる必要性がある。そして、培養した細胞をばらばらに剥離させず、その基材表面上で培養した形態を保持したまま剥離させる必要性も出てきている。
　特に患者本人の細胞を生体外で再生する技術について言えば、近年、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換えようとする臓器移植が一般化してきた。対象となる臓器も皮膚、角膜、腎臓、肝臓、心臓等と実に多様で、また、術後の経過も格段に良くなり、医療の一技術としてすでに確立されつつある。一例として角膜移植をあげると、約５０年前に日本にもアイバンクが設立され移植活動が始められた。しかしながら、未だにドナー数が少なく、国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人いるのに対し、実際に移植治療が行える患者は約１／１０の２０００人程度でしかないといわれている。角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、ドナー不足という問題のため、次なる医療技術が求められているのが現状である。このような背景のもと、患者本人の正常な細胞を所望の大きさまで培養し移植しようとする技術が開発された。
　このような背景のもと、特開平０２－２１１８６５号公報（特許文献１）には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０～８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が示されている。また、特開平０５－１９２１３８号公報（特許文献２）には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。さらに、再表０２－００８３８７号公報（特許文献３）では温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上で心筋組織の細胞を培養し、心筋様細胞シートを得、その後、培地温度を上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下とし、培養した重層化細胞シートをポリマー膜に密着させ、そのままポリマー膜と共に剥離させること、及びそれを所定の方法で３次元構造化させることにより、構造欠陥の少ない、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの心筋様組織として幾つかの機能を備えた細胞シート、及び３次元構造が構築されることを見いだした。しかしながら、上述した従来技術では心筋様細胞シートの積層化は無限に行えるものではなく、３層程度が限界であり、簡便に多数回積層化できる技術が強く望まれていた。
　以上のような問題点を解決するため、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，２０（６），７０８－７１０（２００６）（非特許文献１）では生体内で細胞シートを積層化することが試みられ、１ｍｍ厚の心筋シート積層化物の得られたことが示されている。その中で、厚みのある細胞シート積層化物を得るためには、積層化された各細胞もしくは各細胞シートへ栄養や酸素が供給されることが必須であることが分かったが、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，２０（６），７０８－７１０（２００６）（非特許文献１）の方法では、生体内へ細胞シートを繰り返して移植する必要があり、その都度、移植部位を開口しなくてはならず、被移植側の負担の大きな方法であり、この課題を解決するような、簡便に多数回積層化できる技術が強く望まれていた。
特開平０２－２１１８６５号公報 特開平０５－１９２１３８号公報 再表０２－００８３８７号公報
ＦＡＳＥＢ。Ｊ．，２０（６），７０８－７１０（２００６）
　本発明は、上述したような細胞シートの積層化に関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想に基づいて創作した新規な細胞シート積層化物の製造方法、それより得られる血管網を有する細胞シート積層化物及びその利用方法を提供するものである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、ゲル内部に培地を灌流するための流路を設け、血管内皮細胞を誘導させ、ゲル内に血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層することで細胞シート内に血管網を構築させることができ、簡便に細胞シートを厚く積層化させられことを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明は、ゲル内部に設けた培地を灌流するための流路から表面へ血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層することで細胞シート内に血管網を構築させることを特徴とする細胞シート積層化物の製造方法灌流を提供するものである。さらに、本発明はそれより得られた細胞シート積層化物を提供するものである。さらに本発明は、その細胞シート積層化物を利用する方法を提供するものである。本発明は、血管床を利用して厚さをもった細胞シート積層化物を生体外において作製することができるという世界に類のない新規な発想による細胞構造物を使ってはじめて実現する極めて重要な発明と考えている。
　本発明に示される製造方法であれば、細胞シート内に血管網を構築させられ、その細胞シートを積層化すれば厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することができるようになる。このような厚みのある細胞シート積層化物は生体内組織様のものとして、さまざまな組織の再生医療に有用なものになると期待される。
実施例１の血管床作製時の手順の概要を示す図である。 実施例１の血管床作製時の概要を示す図である。 実施例１の血管床作製時の概要を示す図である。 実施例１の血管床へ培地を灌流させる装置の概要を示す図である。 実施例１の血管床の流路に向かって血管内皮細胞が遊走される様子を示す図である。（Ａ）は細胞シート積層化物の断面図を示す。点線で示す領域がコラーゲンゲル中の流路を示し、矢頭は細胞シートから血管内皮細胞が遊走して形成された毛細血管網を示す。（Ｂ）は流路からアクリル樹脂を流しこみ、硬化後、ゲルと細胞シートを除去したものを示す。 実施例１の細胞シートを積層化させたときの厚さを示す図である。（Ａ）は１度の操作で積層化した細胞シートの枚数（横軸）と、灌流培養後の細胞シートの厚さ（縦軸）を示す図である。（Ｂ）は３枚の細胞シートを血管床上に積層化し、一定期間灌流培養後、再度３枚の細胞シートを積層化し、その操作を繰り返した時の細胞シートの厚さを示す図である。横軸は積層化した細胞シートの枚数、回数と厚みの関係を示す。 実施例１の細胞シート積層化回数と厚みの関係を示す図である。 実施例２の細胞シート積層化物の上下に流路を持った血管床の概要を示す図である。 実施例２の細胞シート積層化物の上下に流路を持った血管床で細胞シート積層化物を作製したときの概要を示す図である。（Ａ）は流路から赤血球を流した図を示し、（Ｂ）は細胞シート積層化物の上下に流路を持った血管床で作製した細胞シート積層化物の断面図を示す図である。 実施例１および実施例２の血管床上で細胞シート積層化物を作製する際の概要を示す図である。
　本発明は、厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することを目的としている。そのためには、上述したように細胞シート積層化物中に血管網が構築されることが求められる。本発明ではゲル内部に流路を設けその流路へ培地を灌流することで、ゲル内の流路と表面との間に簡便に血管網を構築させられることが分かった。その一つの技術として、例えば、ゲル表面へ血管内皮細胞を含む細胞シートを接着させ、ゲル内の流路に培地を灌流させると細胞シート内の血管内皮細胞がゲル内に流路へ向かって並び、結果としてゲル内に血管網を構築させられることが挙げられる。その他の技術としては、ゲル内の流路に灌流させる培地に血管内皮細胞を懸濁させるとゲル内の流路と表面の間に血管網を構築させられることが挙げられる。ゲル内部に流路を設ける際、ゲルが充填されない領域が作りだされればよく、そのために利用されるものは特に限定されない。例えば、ステンレスワイヤー、シリコンワイヤー、金属、高分子化合物等、特に限定されるものではない。
　血管床とは、生体組織、臓器で見られる構造であり、毛細血管とその周辺の組織を合わせた構造をいう。血管床は、血管床内に無数に張り巡らされた毛細血管の薄い壁を介し、生体組織内の酸素、ブドウ糖、その他の栄養素を交換する機能を果たしている。二酸化炭素のような老廃物は血管床の毛細血管内へ滲出する。生体組織において組織液が比較的一定に保たれているのは、毛細血管での物質交換が存在するからである。本発明においては、細胞シート内に効率的に酸素、ブドウ糖、その他の栄養素を交換する機能を行う血管床を生体外において人工的に作製し、利用した。
　ゲル内部に培地等を灌流させる流路を有する血管床を作製する際、ゲルに細胞を混合して作製しても良い。その際にゲルと混合させる細胞種、細胞数、割合等については何ら限定されるものではないが、移植する生体の組織、臓器、部位、用途等に応じて適宜選択、又は調整すればよい。例えば、心筋組織の再生、或いは心筋機能を評価する方法を目的とした場合、使用する細胞としては心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。肝組織の再生、肝組織を模擬した人工肝臓の作製、或いは肝組織の機能を評価する方法等を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。腎組織の再生、腎組織を模擬した人工腎臓の作製、或いは腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。副腎組織の再生、副腎を模擬した人工副腎の作製、或いは副腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。皮膚の再生、或いは皮膚機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。粘膜組織の再生、或いは粘膜組織の機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、粘膜を構成する組織から採取される細胞を使用すればよい。粘膜の種類としては、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜などが挙げられる。粘膜組織から採取される細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。
　本発明で使用するゲルは特に限定されないが、得られた細胞シート積層化物を生体内へ移植治療に利用することを目的とした場合は、生分解性ポリマーからなるゲルが好都合である。また、その場合、生分解性ポリマー部が生体内で消失し、本発明の細胞シート積層化物が生体と血管を通して繋がることとなる。そのような生分解性ポリマーの種類は特に限定されないが、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、多糖類、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。等が挙げられる。
　本発明は、こうして得られた血管網を有するゲルを利用し、それを血管床としてその上に生着した細胞シートへ血管網を構築させようとするものである。すなわち、本発明はゲルという人工物を利用することでも細胞シート内に血管網を構築させる技術を提供するものである。その際、血管床内を循環させるものは培地、血液、血清等と特に限定されるものではないが、取り扱いが簡便なものとしては培地が挙げられる。その培地の種類についても特に限定されるものではないが、血管床上で培養される細胞シートを構成する細胞に適したものが好ましい。例えば、心筋細胞からなる細胞シートを血管床上で積層化するならば心筋細胞を培養するＭ１９９培地などが好適である。
　本発明の細胞シートに使用される細胞の種類は特に限定されるものではなく、得られた細胞シート積層化物を使って移植したい部位の細胞、又は評価を行いたい臓器由来若しくは組織由来の細胞を使用すれば良い。例えば、心筋組織の再生、或いは心筋機能を評価する方法を目的とした場合、使用する細胞としては心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。肝組織の再生、肝組織を模擬した人工肝臓の作製、或いは肝組織の機能を評価する方法等を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。腎組織の再生、腎組織を模擬した人工腎臓の作製、或いは腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。副腎組織の再生、副腎を模擬した人工副腎の作製、或いは副腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。皮膚の再生、或いは皮膚機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。粘膜組織の再生、或いは粘膜組織の機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、粘膜を構成する組織から採取される細胞を使用すればよい。粘膜の種類としては、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜などが挙げられる。粘膜組織から採取される細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。
上記の細胞の含有比率についても特に限定されるものではない。その際、細胞シート内に血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞等が混合されていると、細胞シート内に血管網の構築が効率良く行われ、好都合である。
　本発明で用いられる細胞は、生体組織から直接採取した細胞、直接採取し培養系等で分化させた細胞、或いは細胞株が挙げられるがその種類は、何ら制約されるものではない。これらの細胞の由来は特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが、本発明の細胞シート積層化物をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、サル、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。
　本発明に利用される細胞は特に限定するものではないが、例えば細胞を試薬、タンパク質、遺伝子等の少なくとも１つ以上の方法によって蛍光染色及び/または色素染色したものでも良い。レポーター遺伝子が導入されている細胞を利用した際、レポーター遺伝子が発現して作られるレポータータンパクによる蛍光、又はレポータータンパクが特異的な基質と反応する際に放出する蛍光を検出すれば、細胞シート又は細胞シート積層体の活性を知ることができる。利用されるレポーター遺伝子、又はレポータータンパク質は特に限定されないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ＤｓＲｅＤ、β－グルクロニダーゼ、ＬａｃＺ、カエデ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等が挙げられる。細胞へ遺伝子を導入する方法は定法に従えば良く、特に限定されないが、例えば、リポフェクション法、ウイルスベクター法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。また、これらの遺伝子導入法を利用して、レポーター遺伝子が宿主ゲノム内に導入された遺伝子導入動物（トランスジェニック　アニマル）由来の細胞を利用しても良い。レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーター配列についても特に限定されるものではなく、レポーター遺伝子発現の検出目的に応じ、適宜選択すればよい。
　本発明における細胞シートは、０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培地をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した細胞をシート状に剥離させることで得られる。その際、細胞は０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２－２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－（若しくはＮ，Ｎ－ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃～５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ－Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ－Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ－Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ、Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ポリ－Ｎ、Ｎ－ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
　本発明で用いられる、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１～２．３μｇ／ｃｍ２の範囲が良く、好ましくは１．４～１．９μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１．５～１．８μｇ／ｃｍ２である。１．１μｇ／ｃｍ２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ２以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ２以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ２以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ－ＩＲ－ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。
　本発明の方法において、培養時に播種する細胞数は使用細胞の動物種によって異なるが、一般的に０．４×１０６～２．５×１０６個／ｃｍ２が良く、好ましくは０．５×１０６～２．１×１０６個／ｃｍ２が良く、さらに好ましくは０．６×１０６～１．７×１０６個／ｃｍ２が良い。播種濃度が０．４×１０６個／ｃｍ２以下の場合、一般に細胞の増殖が悪く、得られる細胞シートの機能の発現程度が悪化し、本発明を実施する点において好ましくない。本発明においては、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培地中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。
　以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。
　被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
　本発明における培養基材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。
　本発明における細胞シートは培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、基材から剥離された細胞シートは接着性蛋白質を有し、細胞をシート状に剥離させた際には細胞－細胞間のデスモソーム構造がある程度保持されたものとなる。このことにより、血管床上へ載せたとき良好に接着することができ、効率良く生着することができるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞－細胞間のデスモソーム構造については１０～４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞－基材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。
　本発明における細胞シートの積層体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、必要に応じ、細胞シートを移動させるための治具を利用しても良い。そのような治具としては、剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば材質、形状共に何ら限定されるものではないが、それらの材質としては、通常、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリングルー等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として細胞シートに接触させて使用される。
　かくして本発明により、厚みのある細胞シート積層化物が得られる。本発明のように血管網を構築させなかった場合、積層化された細胞シートが生存し続けるためには３層程度の積層しかできなかった。本発明によれば細胞シートを４層以上積層化することができるようになる。その際、積層化方法は特に限定されないが、一度に細胞シートを積層化するよりも、３層以下の細胞シートを複数回に分けて積層化する方が好ましい。また、その積層化時期は血管床と繋がる血管網が十分に構築されたときとする方が好ましい。積層化回数は、細胞シート積層化物が使用される目的に適宜合わせれば良く特に問われないが、好ましくは５層以上、より好ましくは１０層以上、さらに好ましくは１５層以上が良い。細胞シート積層化物の厚みが増せば、本発明の効果を顕著に受けられ、また移植先においても大量の細胞を移植できることとなり好都合である。
　また、本発明では２枚の細胞シート積層化物の天上面同士を重ね合わせることで、細胞シート積層化物の上面側及び下面側双方に流路を有した構造体を得ることができ、その流路を生体側と繋ぐことで効率良く細胞シート積層物内に栄養、酸素を導入することもできるようになる。
　別の方法として、血管床上へ積層化された細胞シート上に、さらに流路を設けたゲルを重層することで、細胞シート積層化物の上面及び下面の双方に流路を有した構造体を得ることができる。作製された細胞シート積層化物は、上面及び下面に細胞シート内部と繋がった血管様構造の流路を持つ。その流路と生体側との血管が繋がることで効率良く細胞シート積層物内に栄養、酸素を導入することもできるようになる。
　本発明においては、その血管網の構築方法については何ら限定されるものではない。その際、ゲル中で灌流される培地の流速は特に限定されるものではなく、ゲル内の流路が破壊されない程度の流速を最大の流速とし、灌流された培地がゲル内へ浸み出し、培地がゲル表面へ到達できる流速を最小の流速とすれば良い。その数値としては流路のサイズやゲルの性質等の因子が大きく影響するため具体的に示すことはできない。
　血管床上へ積層化された細胞シート上に、さらに流路を設けたゲルを重層することで上面及び下面の双方に流路を有した細胞シート積層化物を作製する際、細胞シート積層化物の上下の流路において、培地の流速を変えて灌流させてもよい。細胞シート積層化物の上下の流路で培地の流速を変えて灌流培養させた場合、より速く培地が灌流する側の流路に向かって血管内皮細胞が遊走する現象がみられる。そのため、血管内皮細胞の遊走が促進されることにより、成熟した毛細血管網を有した細胞シート積層化物が得られる。細胞シート積層化物の上側と下側の両方の流路に血管内皮細胞が遊走させるために、灌流させる培地の流速を、一定時間毎に上下で入れ替える方法でも良い。
　細胞シート積層化物を灌流培養する際の温度、湿度、雰囲気は、細胞を培養する際に利用する定法に従えば良く、何ら限定するものではない。その際、血管床上で積層化された細胞シート積層化物は、血管床中のゲルに形成された流路から培地を灌流させて培養する方法でも良く、温度、湿度、雰囲気が一定に保てる密閉容器に満たした培地中に浸漬させて培養する方法でも良く、培地に浸漬した状態で血管床中のゲルに形成された流路から培地を灌流させて培養する方法でも良い。培地に浸漬した状態で血管床中のゲルに形成された流路から培地を灌流させる方法で培養すると、血管床中での血管形成や、細胞シート積層体内の血管形成が促進され、良い。
　温度、湿度、雰囲気が一定に保てる密閉容器を加圧しながら血管床上で積層化された細胞シート積層化物を培養すると、培地の溶存酸素濃度が上昇し、血管形成が促進され、良い。加圧力は容器の大きさ、培養する細胞シート積層化物の大きさ、培地の量により、様々な因子が大きく影響するため、適宜最適化すればよい。本発明においては、５mmHg以上でもよく、好ましくは、１０mmHg以上でもよく、最も好ましくは、１５mmHg以上が良い。
　細胞シート積層化物内、及び細胞シート積層化物と血管床との間に毛細血管網の構築を促進させる方法として、血管床に灌流させる培地、又は血管床全体を浸漬させる培地、若しくはその両方の培地中に、血管新生を促進する因子を添加する方法が挙げられる。ここで添加する因子としては、血管新生を誘導する因子であれば良く、特に限定するものではない。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、アンギオポエチン、トランスフォーミング増殖因子-β（ＴＧＦ－β）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ＭＭＰ、又は上述した因子のファミリータンパク等が挙げられる。培地に添加する血管新生を促進する因子としては、上述の中から一つを選んでも良く、二以上を組み合わせても良い。培地に添加する血管新生を促進する因子の濃度は、細胞シートに含まれる細胞の種類、数、細胞シートの大きさ、血管床の種類他、様々な因子が大きく影響するため、適宜最適化すればよく、ここでは具体的に示すことはできない。
　細胞シート積層化物を灌流培養する際の温度、湿度、雰囲気は、細胞を培養する際に利用される定法に従えば良く、何ら限定するものではない。その際、細胞シートが積層化物は、血管床中のゲルに形成された流路から培地を灌流させて培養しても良く、温度、湿度、雰囲気が一定に保てる密閉容器を満たした培養容器に培地を満たしたものに浸漬して培養してもよい。最も好ましい方法としては、温度、湿度、雰囲気が一定に保てる密閉容器を満たした培養容器に培地を満たしたものに浸漬しつつ、血管床中のゲルに形成された流路から培地を灌流させて培養する方法である。
　本発明により作製される細胞シート積層化物に成熟した血管網を構築される方法として、ゲルによる血管床上に積層化した細胞シート積層体を、ゲルの血管床から剥離し、ヒトを含む動物の生体から切除した生体組織片由来の血管床、皮弁、又は動脈及び静脈を備えた人工血管床上に再移植する方法が挙げられる。生体組織片由来の血管床、皮弁、又は動脈及び静脈を備えた人工血管床は、生体由来の動脈と静脈を保持しており、これらの動脈と静脈を介して、本発明で得られた細胞シート積層化物が毛細血管網で繋がることにより、生体内の所定部位に移植することが可能な細胞シート積層化物が得られる。なお、生体由来の血管床を作る方法は特に限定されるものではないが、動脈と静脈がそれぞれ繋がっている生体組織片を電気メス等で切離し、生体組織片と動脈と静脈がそれぞれ１本ずつ繋がった状態を作り出し、その状態を維持したまま、一週間程度、生体内に留置する方法が挙げられる。また、人工血管床とは、毛細血管網が構築され、毛細血管網の間をゲル及び／または細胞により充填された血管床様構造物のことをいう。人工血管床を作製する方法は特に限定される訳ではないが、例えば、無菌的な容器内により区切られた領域内に生体内の動脈と静脈を吻合した動脈―静脈ループを内包し、区切られた領域内にゲルを充填し、生体内に留置することで毛細血管網を構築させる方法が挙げられる。人工血管床に含まれる細胞は、特に限定されるものではなく、移植する部位、用途により適宜選択される。
　本発明で得られた細胞シート積層化物を生体内の所定部位に移植することができる。その方法は特に問われないが、本発明の細胞シート積層化物に設けられた流路と生体側の血管を繋げる方法、細胞シート積層化物表面を生体へ付着させる方法等が挙げられ、その際、移植部位にあらかじめ血管誘導を施されていても良く特に限定されるものではない。ここで、血管誘導を施す方法も特に限定されるものではないが、例えば、血管増殖因子であるＦＧＦをミクロスフィアに包埋し、このミクロスフィアの組成、大きさ、注入範囲を変えながら生体に８～１０日間作用させる方法、ポリエチレンテレフタレートメッシュを任意の大きさに切り、袋状のものを作製し、そのバッグの内側に、高濃度アガロース溶液に溶解させたＦＧＦを入れ、８～１０日間後、そのバッグを除去することにより、血管誘導された空間を作製する方法などが挙げられる。
　ヒトに対し、本発明の細胞シート積層体を利用すれば、移植された細胞シート積層体はヒトの生体内で機能を長期間発現することとなる。そして、剥離された細胞シート積層体の大きさや形状、もしくは両者で機能の発現量を制御できる。このような細胞シート積層体は、例えば構成する細胞として、心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞とすれば、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う各疾患の治療を目的に使用されるが、使用する細胞種によって適宜、移植先が特定され、特に限定されるものではない。
　動物に対し、本発明の細胞シート及びその三次元構造体が移植されれば、医薬品評価用動物となる。そして、剥離された細胞シート積層体の大きさや形状で機能の発現量を制御できる。ここで使用される動物はラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが特に限定されるものではない。このような移植動物は、例えば、被検物質をこの動物に投与し、当該被検物質の心機能への影響を判定する心機能評価システム等を目的に使用されるが、特に限定されるものではない。
　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
（心筋細胞シートの作製方法）
　本実験は生後0日のSD系ラットの心臓から単離培養した心筋細胞を使用した。仔ラットから心臓摘出後、組織主要構成要素であるコラーゲンを分解する酵素であるコラゲナーゼ TypeII（Worthington社製）を用い心筋細胞を単離した。単離した心筋細胞を320×104　cell/dishの濃度で温度応答性培養皿（φ35 mm、 Dish Upcell Type-E（ CellSeed社製）） に播種した。4日後、心筋細胞が培養皿表面でコンフルエント状態になったところで20℃に温度を降下させることでシート状の心筋細胞群を回収した。本実験ではピペッティングにより3層に積層した組織を使用した。
（流路を設けたゲルの作製方法）
　図１に示すようにアクリルフレームにステンレスワイヤーを設置し、そのフレーム内へコラーゲンゲル溶液を流し込み硬化させゲル化させた。その後、ステンレスワイヤーを取り出し、マイクロ流路を有したゲルが得られた。図１のＥに相当する装置の写真及び当該装置を用いて細胞シート内に血管網を構築する方法を説明する模式図を図２に示す。図３はコラーゲンゲルで流路を形成した図を示す。またこのものへ培地を灌流するための装置概要の模式図（左）及び装置の一例の写真（右）を図４に示す。図４（左）に示される矢印は培地が流れる方向を示す。
（コラーゲンゲル上での細胞シートの積層化）
　細胞シートを多数積層してコラーゲンゲルに接着させた。具体的方法として、培養皿上に2~6層の心筋細胞シートを浮遊させ、ピペットエイドで培地を出入れして培養皿上で一度に積み上げた後に、30分間インキュベートして接着一体化させた。その後、コラーゲンゲル上に接着させた。図５（右）に示す灌流培養バイオリアクターにおいて、血管床に積層化した細胞シート積層化物を培地中に浸漬させつつ、流路から培地を灌流させて培養を行った。
（細胞シートとコーラゲンゲル血管床へとの間の血管新生）
　血管床上で細胞シートを灌流培養すると、ラットの心臓から単離した細胞中に含まれる血管内皮細胞が、流路に向かって遊走し、血管床と細胞シートの間に毛細血管網を形成した（図５Ａ）。流路にアクリル樹脂を流し、硬化させることで新生した血管の様子を観察した。その結果、血管床と細胞シートとの間に無数の毛細血管網が形成されていることが明らかとなった（図５Ｂ）。
（コラーゲンゲル血管床上細胞シートの加圧灌流培養法）
　細胞シートの積層化枚数の増加に伴い、細胞の代謝に必要な酸素量も増加する。そこで、灌流培養させる溶存酸素量を増加させる目的で、血管床を設置する密閉容器に、加圧する機構を備えた装置を追加し、上述した方法に加えて加圧灌流培養を行った。20mmHgで加圧した場合、加圧せずに培養した時に比べ、培地中の溶存酸素量も増加し、細胞シート内の血管網構築並びに血管床と細胞シート積層化物との間の血管網形成が促進された（データは示さず）。以後の実験においては、20mmHgの加圧培養にて実験を行った。
（一度に積層化する方法）
　コラーゲンゲル血管床上で細胞シートを５日間の灌流培養後、灌流装置から積層心筋細胞シート付きコラーゲンゲルをはずしてパラフォルムアルデヒド4%で組織固定した後、パラフィンにて切片に切り出した。パラフィン切片をHE染色によって観察した各層の断面の画像を図５（Ａ）に示す。図５の（Ａ）に示す黒い矢頭は、細胞シートに含まれていた血管内皮細胞がゲルの血管床中の流路に向かって遊走して形成された毛細血管を示す。図５（Ｂ）はゲルの流路にアクリル樹脂を流して硬化させ、その後にゲルと細胞シートを除去したものを示す。各層の組織の厚さを測定方法は、HE染色画像を2値化して10か所の厚みを測定した。その結果、2層・3層の厚みは積層数に比例して厚さが増加しているが、4層以上になると組織厚が増加することなく厚みの変化がなかった。測定値は1層：約7 μm、2層：約18 μm、3層：約24 μm、4層：約23 μm、5層：約26 μm、6層：約23 μmという結果になった。すなわち、3層までは積層数に比例して組織の厚みは増加したが、3層以上積層した組織厚はすべて3層の厚さとほぼ同様になった（図６Ａ）。これは、細胞シート内の拡散による酸素・栄養の供給、老廃物の除去が3層までしか届かずに、４層目以上の細胞シートが壊死してしまうことが原因として考えられる。
（多段階による積層化方法）
　そこで、コラーゲンゲル内人工流路と細胞シートにより血管網が構築されてから、繰り返し積層を行うことを考案した。初代培養心筋細胞シートには心筋細胞以外に線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞が含まれているため、細胞シート内に血管を有していることとゲル培養を行うと血管新生を行うことが期待される。そこで、コラーゲンゲル内に培地を灌流した流路を作製し、そのコラーゲンゲル流路上で初代培養心筋細胞シートを培養すると細胞シートから血管が新生され人工流路と繋がれば厚い組織でも心筋細胞に新鮮な培地が供給されると考えた。そこで供給される血管が構築されてから、繰り返し細胞シートの積層を行った。前述の実験より、灌流培養時に1度で積層する限界数は3層であった事と、人工流路と細胞シートとの間に血管網が構築し接続するのに5日間を要する事を参照に繰り返し実験を行った。その結果を図６Ｂに示す。具体的には5日間のインターバルで積層数は3枚以内で積重していく方法を行った。今回、（１）3層+3層：6層計10日間培養したものと、（２）3層＋3層＋2層：8層計15日間、（３）3層＋3層＋3層：9層計15日間を灌流培養した組織と、単一積層（３層、５日間）の組織と比べて、厚みがどのように変化したのかを観察した。培養後、検体はパラフォルムアルデヒド４％で固定し、パラフィン切片をHEで染色した。染色した各々の組織を図７に示した。3層＋3層＋3層を5日間のインターバル培養期間を置いて、計15日間の繰り返し積層を行った。その結果、78±11 μmの厚みが観察された。そして、3層＋3層＋3層を15日間かけて灌流培養を行った結果、9層は壊死することなく115±10μmの厚みを維持することが出来た。この厚みは、表面からの拡散による酸素・栄養の供給厚みを超えていることから、血管が構築されて上部へ培地が供給されてから繰り返し細胞シート積層していく方法の有効性が示された。本実験による培養装置を使用すれば移植可能な組織構築の構築が可能なことが示された。
（流路を設けたゲルの作製方法）
　図８に示すように、細胞シート積層化物の上下に流路が作製されるよう設計した血管床形成容器を作製した。アクリルフレームにステンレスワイヤーを設置し、そのフレーム内へコラーゲンゲル溶液を流し込み硬化させゲル化させ、下部のステンレスワイヤーを取り出し、マイクロ流路を有したゲルを得た。その後、実施例１の方法により、３層の心筋細胞シートを積層化した。その後、細胞シート積層化物の上部にステンレスワイヤーを設置し、そのフレーム内へコラーゲンゲル溶液を流し込みゲル化させ、上部のステンレスワイヤーを取り出して、上部の流路にも流路を作製した。本実験においては、下部の流路の流速を５００μＬ／min（図８（左）、Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ　Ａ）、上部の流路の流速を２５０μＬ／min（図８（左）、Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ　Ｂ）にて培養を行い、図４のバイオリアクターにて５日間の灌流培養を行った。灌流培養後、細胞シート内の毛細血管網と血管床の流路とが繋がっているか確かめるため、下部の流路から血液を灌流した（図９Ａ）。その結果、細胞シートの上部の色が変化し、ゲルと細胞シート積層化物の間に流路が形成されていることが分かった。さらに、上下の流路の形成された血管様構造を確認した（図９Ｂ）。その結果、流速の早い下部の流路に向かって血管内皮細胞が遊走し、血管網を形成していることがわかった（図９Ｂ）。細胞シート積層化物の上下の流速を上述と逆にした場合、流速の早い上部の流路に向かって血管内皮細胞が遊走した。このことから、血管内皮細胞による血管網構築は、培地の流速という物理的特性に影響されて血管網を構築されることが示唆された。さらに、細胞シートと流路との間が100μｍ以内の距離であれば、効率的に血管内皮細胞が遊走し、血管様組織が構築されることが示唆された。
（細胞シート積層化物の血管新生モデル）
　図１０には、血管床をつかった細胞シート積層化物の作製時に誘導される血管網の構築の概要を示す図である。コラーゲンゲル上に載せた細胞シート（図１０Ａ）から血管内皮細胞が流路に向かって遊走し（図１０Ｂ）、流路の内壁を血管内皮細胞が覆い、管腔構造が形成される（図１０Ｃ）。その後、さらに上層に細胞シート積層体を移植しすると（図１０Ｄ）、ゲル流路と繋がった管腔構造と、新たに積層化した細胞シート内の血管内皮細胞とが繋がり、血管形成がおこなわれる（図１０Ｅ）。この過程を繰り返すことで、厚さをもった細胞シート積層物を作製することができる（図１０Ｅ）。
　本発明に示される製造方法であれば、細胞シート内に血管網を構築させられ、その細胞シートを積層化すれば厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することができるようになる。このような厚みのある細胞シート積層化物は生体内組織様のものとして、さまざまな組織の再生医療に有用なものである。

Claims (18)

  1. 　ゲル内部に培地を灌流するための流路を設け、血管内皮細胞を誘導させ、ゲル内に血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層することで細胞シート内に血管網を構築させることを特徴とする細胞シート積層化物の製造方法。
  2. 　ゲル内に血管網を構築させる方法が、血管内皮細胞を含む細胞シートをゲル表面に付着させる方法である、請求項１記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  3. 　ゲルが生分解性ポリマー及び／または細胞、請求項１、２のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  4. 　生分解性ポリマーがコラーゲンゲル及び／またはフィブリンゲルである、請求項３記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  5. 　温度、雰囲気を一定に保つことができる密閉容器の培地に、細胞シートを積層化した血管床を浸漬させた、請求項１～４のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  6. 　密閉容器内部を加圧した、請求項５記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  7. 　培地が、血管新生を促進する因子を含み、毛細血管密度を高めたものである、請求項１～６のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  8. 　細胞シートが、０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培地をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した細胞をシート状で剥離させたものである、請求項１～７のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  9. 　０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１～８のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  10. 　２枚の細胞シート積層化物の天上面同士を重ね合わせることを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  11. 　血管床上へ積層化された細胞シート上に、さらに流路を設けたゲルを重層することを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  12. 　細胞シート積層化物の上下の流路で、灌流させる培地の流速が異なる、請求項１１記載の細胞シート積層化物の製造方法。
  13. 　請求項１～１２の製造方法で得られる、血管網を有する細胞シート積層化物。
  14. 　細胞シートが積層化された回数が４以上である、請求項１３記載の細胞シート積層化物。
  15. 　細胞が、心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したものである、請求項１３または１４のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
  16. 　血管内皮細胞が含まれる、請求項１５記載の細胞シート積層化物。
  17. 　得られた細胞シート積層化物を生体内へ移植することを特徴とする、請求項１３～１６のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の利用方法。
  18. 　心筋組織へ移植し、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも1種の心臓の疾患または障害の治療を目的とする、請求項１７記載の細胞シート積層化物の利用方法。
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