CN105652002B - 一种基于唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法 - Google Patents

Abstract

一种基于唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法，涉及一种用于检测糖链标志物的凝集素芯片，具体涉及一种基于蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。目的在于提供一种非损伤，通过鉴别唾液中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。该基于唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，所述测试凝集素探针组包括蚕豆凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、豌豆凝集素、四棱豆凝集素‑Ⅱ和四棱豆凝集素‑Ⅰ，其中四棱豆凝集素‑Ⅱ和四棱豆凝集素‑Ⅰ作为内参凝集素。采用该凝集素芯片检测糖链标志物具有对人体无损伤、样品用量少、检测结果快且灵敏度高的优点，可以应用于鉴别是否患有胃癌。

Description

一种基于唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测糖链标志物的凝集素芯片，具体涉及一种基于蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。

背景技术

胃癌是一类常见的恶性肿瘤，由于缺乏显著的早期特征，在全球范围内具有很高的发病率和死亡率，在东亚、东欧、南美地区尤为严重。目前常用的胃癌诊断标志物包括：CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、AFP等，但都存在局限性。病理组织学检查仍是目前胃癌诊断的金标准，但鉴于组织学检查固有的缺陷如损伤性检查、不能动态检测、存在取样差异等，因此寻求非损伤性检查，进行胃癌早期诊断，是防控胃癌的关键。

随着社会的进步，科学技术的发展，人们对医学检查的要求也越来越高，要求无创、简便、快速的疾病检查诊断方法。与血清标本相比，唾液采集安全方便、无创伤和无血源性疾病传播的危险，而且近年来，唾液作为临床样本已被广泛应用于多种疾病诸如艾滋病、自身免疫性疾病、酒精性肝硬化、囊性纤维病、糖尿病、心血管病、龋病等的药物水平监测、病情监控和疗效评价当中。

研究发现肿瘤发生时，蛋白质糖基化的异常会导致糖链发生种类和丰度的改变，相应的和这些糖链相互作用的糖结合蛋白的表达也发生异常改变，从变化的唾液糖蛋白糖链中可以找到与疾病相关的生物标志物。

随着分子生物学及细胞生物学的发展，糖蛋白糖型被更多的研究者所关注，糖链与糖链，糖链与蛋白，糖链与细胞外基质的相互作用调控细胞识别、信号传递、细胞内吞以及细胞生长、分化和凋亡等生物学行为。

例如在胃癌的研究方面已发现了一些功能性糖链，其中有代表性的是胃癌细胞中N-乙酰葡糖氨转移酶V（GnT-V）上调表达导致合成β1,6连接的N-乙酰葡糖胺分支型N-糖链（β1,6GlcNAc branched N-Glycan），这种分支型糖链影响了连环蛋白络氨酸磷酸化，导致β连环蛋白和P120蛋白的受损，破坏了连环蛋白与N-糖链结合的稳定性，影响了细胞间的粘着能力，增加了细胞的转移侵染能力。以及胃癌细胞中核心岩藻糖基化N-糖链的下调以及αGlcNAc的减少，提高了肿瘤细胞有丝分裂活性，导致细胞异常增殖。

上述研究说明在疾病中糖蛋白的糖基化发生了异常改变，而不同疾病，其功能性糖链与细胞外基质作用发生的异常改变不同，通过检测这种异常改变，我们可以判断为何种疾病。

随着糖生物学与糖组学研究的发展，生物芯片已成为取得相关信息的重要手段，提供了快速、高效高通量筛选差异糖链的方法，从全新的角度解析了胃癌发生、发展过程中潜在的分子机制以及发现新的生物标志物，凝集素芯片通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，能够检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的异常变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一。且可以与多种检测手段联用，快速、准确检测出待测样本中糖链数量及种类的差异。具有检测样品用量少、高通量、灵敏度极高的优点，有助于发展新的诊断和监测胃癌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非损伤，通过鉴别唾液中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。

本发明提供一种基于唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，所述测试凝集素探针组包括蚕豆凝集素（VVA）、橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）、豌豆凝集素（PSA）、四棱豆凝集素-Ⅱ（PTL-Ⅱ）和四棱豆凝集素-Ⅰ（PTL-Ⅰ），其中四棱豆凝集素-Ⅱ（PTL-Ⅱ）和四棱豆凝集素-Ⅰ（PTL-Ⅰ）作为内参凝集素。

上述凝集素探针组还包括花生凝集素（PNA）、欧洲卫矛凝集素（EEL）、番茄凝集素（LEL）和孤挺花凝集素（HHL）。

本发明还提供基于唾液蛋白检测糖链标志物的方法，包括唾液采集、唾液蛋白处理与荧光标记、凝集素芯片制备及孵育和对荧光图像进行中值分析步骤，所述凝集素芯片制备及孵育步骤中凝集素芯片采用蚕豆凝集素（VVA）、橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）、豌豆凝集素（PSA）、四棱豆凝集素-Ⅱ（PTL-Ⅱ）和四棱豆凝集素-Ⅰ（PTL-Ⅰ）做芯片矩阵，其中四棱豆凝集素-Ⅱ（PTL-Ⅱ）和四棱豆凝集素-Ⅰ（PTL-Ⅰ）作为内参凝集素。

所述凝集素芯片中还包括花生凝集素（PNA）、欧洲卫矛凝集素（EEL）、番茄凝集素（LEL）和孤挺花凝集素（HHL）。

上述对荧光图像进行中值分析后，检测标志物的方法检测标准为：将荧光图像进行中值分析的Fold-change值作为判定标准，最低标准为，PTL-Ⅱ和PTL-Ⅰ无变化，VVA上调，同时AAL、PSA都下调；最高标准为，PTL-Ⅱ和PTL-Ⅰ无变化，VVA、PNA、EEL、LEL、HHL都上调，同时AAL、PSA都下调。

所述Fold-change >2和Fold-change<0.5上调和下调表达的糖链，所述Fold-change值是通过将样品每个凝集素对应的归一化后荧光强度比基础对照组的归一化后荧光强度得到。

所述基础对照组为从健康人群提取的唾液样品。

对荧光图像进行中值分析步骤中通过软件将芯片扫描结果图转化为数据，将原始数据中小于背景值加两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本6个重复点的有效值再取平均值（AS），每组平均值表示为组内每个样本平均值（AS）的均值（AG）±标准偏差（SDG），得到归一化后荧光强度（NFI）。

本发明中唾液采集、唾液蛋白处理与荧光标记、凝集素芯片制备及孵育步骤分别如下所示：

（1）唾液采集：

饭后两小时，约9点到10点之间，生理盐水漱口三次后迅速采集自然分泌的全唾液，唾液采集至少1 ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂（每毫升唾液加入1μL）防止蛋白降解；

（2）唾液蛋白处理与荧光标记：

将收集到的全唾液经12 000 rpm 4℃离心10 min后吸取上清弃去不溶沉淀物，上清液再经0.22 μm孔径的滤膜过滤，过滤后样本经Cy3荧光染料标记后用除盐柱去掉游离荧光；

（3）凝集素芯片制备及孵育：

1）玻片的环氧修饰

将玻片用无水乙醇清洗三次，每次10min，甩干浸泡入250mL 10%NaOH溶液中，避光，摇床上反应12h后超声15min，超纯水清洗四次，每次2min，无水乙醇清洗两次，每次2min，甩干，再将玻片浸泡到200mL 10% GPTS溶液中，避光，摇床上孵育反应3h，对玻片进行环氧化修饰，超声清洗15min，无水乙醇清洗三次，每次10min，甩干后将玻片干燥3h，保存备用；

2）凝集素芯片的制备

设计凝集素芯片矩阵，选用1mg/mL BSA作阴性质控，Cy3荧光染料标记的BSA作位置标记，与5种凝集素共同构成6×7矩阵，每种凝集素重复点样6次，每张芯片上重复8个矩阵，在384孔板中按矩阵设计顺序依次加入配制好的点样液，在环氧修饰片基上点制芯片，在室温且湿度为55%~65%的环境中孵育6h后，37℃真空干燥芯片，使凝集素固定于芯片上，将制备好的凝集素芯片放置于4℃干燥器，避光保存，备用；

3）凝集素芯片的封闭

将点制好的凝集素芯片从4℃干燥器中取出，回温，首先用PBST、PBS各清洗玻片一次，每次3 min，离心甩干，将凝集素芯片与600 µl封闭缓冲液在芯片杂交盒中孵育，25℃旋转反应1 h，封闭结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次3 min，甩干；

4）唾液样本的凝集素芯片检测

将荧光标记的唾液蛋白3 µg与孵育缓冲液混匀，配置成600µl上样体系，并均匀加载在盖玻片上，盖上封闭后的凝集素芯片，于芯片杂交仪中25℃避光旋转孵育3 h，孵育结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5 min，离心甩干。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过固定于芯片上的特定凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以快速检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式变化后的标志物，通过标志物的变化，迅速判断出是否样品中功能性糖链变化对应是否产生胃部癌变。

附图说明

图1、2为本发明凝集素芯片上两种凝集素探针布局图；

图3-7分别为5种凝集素PTL-I、PTL-II、WGA、PWM、SNA识别的糖链；

图8为PTL-I与PTL-II的相对荧光信号值；

图9-15分别为7种凝集素芯片VVA、PNA、EEL、LEL、HHL、AAL、PSA的结果散点图。

具体实施方式

下面通过给出的具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。

选取健康志愿者12例，且一周之内未服用任何药物，已确诊的胃癌患者64例（胃癌Ⅰ期21例，二期18例，三期20例，四期5例），其年龄分布如表1所示。

表1

将健康志愿者作为基础对照组，已确证的胃癌患者作为样品组。

（1）唾液采集：

将上述人群在饭后2小时，即9-10点之间，用生理盐水漱口三次后迅速采集自然分泌的全唾液，唾液采集至少1ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解，每毫升唾液加入1μL；

（2）唾液蛋白处理与荧光标记：

将收集的全唾液经12000 rpm 4℃离心10 min后吸取上清弃去不溶沉淀物，上清液再经0.22 μm孔径的滤膜过滤掉细菌和其它微生物，过滤后样本经Cy3荧光染料标记后用Sephadex G-25除盐柱去掉游离荧光，标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育；

（3）凝集素芯片制备及孵育：

1）玻片的环氧修饰

将未处理的玻片用无水乙醇清洗三次，每次10min，离心甩干后将玻片浸泡入250mL10%NaOH溶液中，摇床上轻摇反应，避光过夜，超声15min，再用超纯水清洗4次，每次2min，无水乙醇清洗2次，每次2min，甩干离心后再将玻片浸泡到200mL10%GPTS溶液中，摇床上轻摇，避光反应3h，然后超声清洗15min，无水乙醇清洗3次，每次10min，离心甩干，完成芯片的环氧化修饰，将修饰好的玻片放置于4℃干燥器中保存备用；

2）凝集素芯片的制备

制备好的凝集素芯片的点样设计如图2所示，每张芯片共分为4个矩阵，每个矩阵规格为12*10，每个样品点重复三次，在室温且湿度为55%~65%的环境中孵育6h后，37℃真空干燥芯片，使凝集素固定于芯片上，将制备好的凝集素芯片放置于4℃干燥器，避光保存，备用；

3）凝集素芯片的封闭

将点制好的凝集素芯片从4℃干燥器中取出，回温，首先用PBST、PBS各清洗玻片一次，每次3 min，离心甩干，将凝集素芯片与600 µl封闭缓冲液在芯片杂交盒中孵育，25℃旋转反应1 h，封闭结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次3 min，甩干，用Genepix4000B芯片扫描仪扫描封闭后芯片，检查封闭效果；

4）唾液样本的凝集素芯片检测

将荧光标记的唾液蛋白3 µg与孵育缓冲液混匀，配置成600µl上样体系，并均匀加载在盖玻片上，盖上封闭后的凝集素芯片，于芯片杂交仪中25℃避光旋转孵育3 h，孵育结束后用PBST、PBS各清洗玻片两次，每次5 min，离心甩干；

5）数据的扫描与分析

使用Genepix4000B芯片扫描仪扫描芯片，GenePix3.0软件从芯片扫描结果图圈点分析后，导出GPR文件，根据其中的数据信息进行分析，原始数据中小于背景值加两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本12个重复点的有效值再取平均值（AS），每组平均值表示为组内每个样本平均值（AS）的均值（AG）±标准偏差（SDG）。

利用凝集素芯片分别对健康志愿者、I、II、III和IV期胃癌患者唾液进行检测，通过GenePix3.0软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将各期胃癌患者结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度（NFI）在I期胃癌、II期胃癌、III期胃癌分别比健康对照组（Control）得到Fold-change值，我们认为Fold-change >2和Fold-change < 0.5为胃癌患者相较于健康人在唾液中上调和下调表达的糖链。

本发明分别选取37种凝集素芯片进行测试，37种凝集素芯片如表2所示。

表2

通过实验发现，37种凝集素芯片与唾液种糖蛋白链结合后唾液中糖型发生变化，说明上述凝集素芯片对唾液总蛋白糖链都有不同程度的识别。

发现其中12种凝集素在四种不同分期胃癌患者唾液种均发生一致的差异表达，如表3所示，但具有显著性差异的只有7种，其中凝集素VVA、PNA、EEL、LEL、HHL识别的糖链在胃癌患者唾液中上调, 凝集素AAL、PSA识别的糖链在胃癌患者唾液中下调。

表3

表中数据表示该组的凝集素芯片结果中每个对应NFI平均值相对于对照组NFI平均值的Fold-change值。I期，I期胃癌；II期，II期胃癌；III期，III期胃癌；IV期，IV期胃癌；―，无显著差异。

通过单因素分析发现存在5种Lectin：PTL-I、PTL-II、WGA、PWM、 SNA识别的糖链任意两组样本间均没有差异，如图3-7所示，并通过NormFinder软件分析所有Lectin相对信号强度的稳定值，见表4，选取了数据最为稳定的凝集素PTL-II与PTL-I，同时PTL-II相对荧光信号高于PTL-I，如图8所示，综合所有因素，选择相对荧光信号强度最为稳定的PTL-II与PTL-I为内参Lectin。

表4候选内参凝集素相对荧光信号强度稳定值

经过对表3、表4，图3、图4、图9-15中数据的筛选，本发明设计了一套用于检测胃癌患者唾液蛋白中糖链标志物的凝集素探针组合，如表5所示。

表5 凝集素探针组合

通过实验发现检测标志物的方法检测标准为：最低标准，PTL-Ⅱ和PTL-Ⅰ无变化，VVA上调，同时AAL、PSA都下调；最高标准为：PTL-Ⅱ和PTL-Ⅰ无变化，VVA、PNA、EEL、LEL、HHL都上调，同时AAL、PSA都下调。

且通过上述实施例设计得到的凝集素探针组合

因此构成的凝集素探针组合最少包括蚕豆凝集素（VVA）、橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）、豌豆凝集素（PSA）、四棱豆凝集素-Ⅱ（PTL-Ⅱ）和四棱豆凝集素-Ⅰ（PTL-Ⅰ）5种必要凝集素，如图1所示，最多包括蚕豆凝集素（VVA）、橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）、豌豆凝集素（PSA）、四棱豆凝集素-Ⅱ（PTL-Ⅱ）和四棱豆凝集素-Ⅰ（PTL-Ⅰ）、花生凝集素（PNA）、欧洲卫矛凝集素（EEL）、番茄凝集素（LEL）和孤挺花凝集素（HHL）9种必要凝集素。

通过上述实施例可以发现通过凝集素芯片与唾液糖蛋白结合，通过检测糖链标志物，通过不同标志物的变化规律，可以判断是否发生癌变。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.凝集素在制备基于唾液蛋白检测区分健康受试者与胃癌患者的糖链标志物的凝集素芯片中的应用，其特征在于：所述凝集素芯片包括测试凝集素探针组，所述测试凝集素探针组包括蚕豆凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、豌豆凝集素、四棱豆凝集素-Ⅱ和四棱豆凝集素-Ⅰ，其中四棱豆凝集素-Ⅱ和四棱豆凝集素-Ⅰ作为内参凝集素；所述凝集素芯片还包括花生凝集素、欧洲卫矛凝集素、番茄凝集素、孤挺花凝集素和麦胚凝集素；检测标志物的方法检测区分标准为：将凝集素芯片的荧光图像进行中值分析的Fold-change值作为判定标准，最低标准为，PTL-Ⅱ和PTL-Ⅰ无变化，VVA上调，同时AAL、PSA都下调；最高标准为，PTL-Ⅱ和PTL-Ⅰ无变化，VVA、PNA、EEL、LEL、HHL都上调，同时AAL、PSA都下调。