发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于基于IgA抗体检测食物过敏原的试剂盒,该试剂盒具有较强的特异性和较高的灵敏度。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了基于IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒,包括以下组分:
包被有抗人IgA抗体的检测板;
洗涤缓冲液;
样品稀释液;
标准品或阳性质控品;
生物素标记的食物过敏原制剂和生物素标记的抗人IgA制剂;
酶标记的亲和素溶液;
底物显色液;
终止液。
优选的,所述抗人IgA抗体的包被浓度为0.1~2000μg/ml。
优选的,所述洗涤缓冲液为PBS缓冲液。
优选的,所述生物素标记食物过敏原制剂和生物素标记的抗人IgA制剂的质量浓度独立为0.01~8000μg/ml。
优选的,所述生物素标记的抗人IgA制剂为生物素标记的仅抗人IgA的制剂。
优选的,所述样品稀释液为PBS缓冲液。
优选的,所述PBS缓冲液的组分包括以下重量份的组分:8.0份NaCl,0.20份KCl,1.16份Na2HPO4,0.20份KH2PO4和1000份水;所述的PBS缓冲液的pH值为7.0~7.6。
优选的,所述终止液为0.5~2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30%~40%的氢氧化钠溶液。
优选的,所述酶标记的亲和素溶液浓缩液为使用时工作液的1~5000倍。
优选的,所述生物素标记食物过敏原制剂中食物过敏原的种类包括水产品类、畜禽类、蛋奶类、蔬菜类、水果类、谷物类和坚果类。
本发明提供的基于IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒,包括以下试剂,包被有抗人IgA抗体的检测板;洗涤缓冲液;样品稀释液;标准品或阳性质控品;生物素标记的食物过敏原制剂和生物素标记的抗人IgA制剂;酶标记的亲和素;底物显色液;终止液。本发明首次选用IgA抗体来检测食物过敏原,并且是基于捕获法制备的ELISA试剂盒,具有特异性强,灵敏高,重现性好的特点,并能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到1ng/ml。
进一步的,本发明提供的基于IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒,标准品或阳性质控品为人IgA蛋白。生物素标记的食物过敏原蛋白可以检测血浆、血清等液体中的经口进食的任何食物诱导机体产生的过敏原特异性IgA,具有检测食物过敏原的种类多,应用范围广的特点。
具体实施方式
本发明提供了基于IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒,包括以下试剂:
包被有抗人IgA抗体的检测板;
洗涤缓冲液;
样品稀释液;
标准品或阳性质控品;
生物素标记的食物过敏原制剂和生物素标记的抗人IgA制剂;
酶标记的亲和素溶液;
底物显色液;
终止液。
本发明提供ELISA试剂盒包括包被有抗人IgA抗体的检测板。所述抗人IgA抗体的包被浓度优选为0.1~2000μg/ml,更优选为0.1~100μg/ml。本发明中,所述抗人IgA抗体优选为仅抗人IgA的单克隆抗体。本发明中,所述检测板的种类优选为透明的聚苯乙烯板和不透明的白色聚苯乙烯板。所述透明的聚苯乙烯板用于定量检测;所述不透明的白色聚苯乙烯板用于定性检测。
本发明提供的ELISA试剂盒包括洗涤缓冲液。在本发明中,所述洗涤缓冲液优选为PBS缓冲液。所述的PBS缓冲液的溶质优选包括以下重量份的组分8.0份NaCl,0.20份KCl,1.16份Na2HPO4和0.20份KH2PO4;所述的PBS溶液的pH值为7.0~7.6。
本发明提供的ELISA试剂盒包括生物素标记的食物过敏原制剂。所述生物素标记食物过敏原制剂的质量浓度优选为0.01~8000μg/ml,更优选为0.1~1000μg/ml,最优选为0.1~100μg/ml。本发明中,所述生物素标记食物过敏原制剂中食物过敏原的种类包括水产品类、畜禽类、蛋奶类、蔬菜类、水果类、谷物类或坚果类等。其中水产品类包括鱼、虾、蟹、贝、蛤等;畜禽类包括猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉;蛋奶类包括鸡蛋、牛奶等;蔬菜类包括萝卜、蘑菇、芹菜、辣椒、青椒;水果类包括柑橘、橙子、香蕉、苹果、猕猴桃、芒果、葡萄、菠萝、番茄;谷物类包括小麦、燕麦、大米、玉米、黄豆、豌豆;坚果类包括松子、花生、榛子、核桃、开心果等。
本发明中,所述ELISA试剂盒包括样品稀释液。所述样品稀释液为pH值为7.0~7.6的PBS缓冲液。所述PBS缓冲液的组分包括下列重量份组分:8.0份NaCl,0.20份KCl,1.16份Na2HPO4、0.20份KH2PO4和1000份水。
本发明提供的ELISA试剂盒包括标准品或阳性质控品。所述标准品或阳性质控品为人IgA蛋白。
本发明提供的ELISA试剂盒包括终止液。所述终止液为0.5~2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30%~40%的氢氧化钠溶液。
本发明提供的ELISA试剂盒包括酶标记的亲和素溶液。所述酶标记的亲和素溶液为使用时工作液的1~5000倍。所述酶标记的亲和素溶液的来源没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的酶标记的亲和素溶液即可。
本发明提供的ELISA试剂盒包括底物显色液。本发明中,所述底物显色液的添加量优选为0.02~0.2ml/孔,更优选为0.03~0.16ml/孔。所述底物显色液优选为四甲基联苯胺(TMB)底物溶液或2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)底物溶液。所述四甲基联苯胺的质量浓度优选为0.02~0.05%;所述2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的质量浓度优选为0.05~0.1mg/ml。
本发明中,所述的基于IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒的制备方法,优选包括包被有抗人IgA抗体的检测板的制备。
本发明中,所述包被有抗IgA抗体的检测板的制备方法优选包括以下步骤:
1)用包被缓冲液稀释抗人IgA抗体,得到包被液;
2)将所述步骤1)得到的包被液添加到检测板的反应孔中,4℃过夜;
3)次日,一次洗涤所述步骤2)中过夜的检测板孔后,添加封闭液,孵育后再次洗涤。
本发明用包被缓冲液稀释抗人IgA抗体,得到包被液。本发明中,所述稀释的方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的稀释的技术方案即可。本发明中,所述包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液。本发明中,所述碳酸盐缓冲液的浓度优选为0.01~0.2mol/L。所述碳酸盐缓冲液的pH值优选为8.5~9.5。
本发明中,所述包被液的浓度优选为0.1~2000μg/ml,更优选为0.1~100μg/ml。
得到包被液后,本发明将所述包被液添加到检测板的反应孔中,4℃过夜。本发明中,每个反应孔中包被液的体积优选为0.02~0.2ml包被液。
本发明中,所述4℃过夜优选在静置的条件下进行,利于抗人IgA抗体稳固地包被在检测板中。
次日,一次洗涤所述过夜的检测板孔后,添加封闭液,孵育后再次洗涤。本发明对所述一次洗涤的方法没有限制,采用本领域技术人员所熟知的洗涤的技术方案即可。本发明中,所述洗涤缓冲液的添加量优选为至少等于包被液的体积;所述一次洗涤的次数优选为2~6次;所述单次洗涤的孵育时间优选为每次0~5min(下同)。
所述一次洗涤后,将一次洗涤后的检测板加入封闭液,孵育后再次洗涤。本发明中,所述封闭液优选为质量浓度为含1%~5%的小牛血清白蛋白的PBS缓冲液。所述封闭液的添加量优选为至少包被液的体积。本发明中,所述孵育的时间优选为10~200min。所述孵育的温度优选为10~40℃,更优选为15~35℃。
所述孵育后,本发明将检测板进行再次洗涤,在本发明中,所述再次洗涤的方法与上述技术方案所述一次洗涤的方法相同,在此不再赘述。
所述再次洗涤后,本发明优选自然控干检测板中的水分后,用真空袋密封检测板,得到包被有抗人IgA抗体的检测板。
基于IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
1)将待测样本、标准品、阴性对照品分别添加到包被有抗人IgA抗体的检测板中,进行一次孵育后进行第一次洗涤;
2)向所述步骤1)中洗涤后的检测板中加入生物素标记的食物过敏原制剂,二次孵育后进行第二次洗涤;
3)向所述步骤2)中洗涤后的检测板中加入酶标记的亲和素,三次孵育后进行第三次洗涤;
4)向将所述步骤3)中洗涤后的检测板中加入底物显色液,四次孵育后,向检测板中添加终止液,得到显色的检测板;
5)根据所述步骤4)得到的显色检测板,得到定性或定量结果。
本发明将待测样本添加到包被有抗人IgA抗体的检测板中,一次孵育后进行第一次洗涤。本发明中,所述待测样本包括血清、血浆等含有IgA抗体的液体。所述血清或血浆等液体的稀释度为1~32000倍。
本发明中,为了使检测结果准确可信,优选还设置空白对照孔、阴性对照孔、标准品孔,且保证每个反应孔添加的液体量一致。所述空白对照孔中优选添加样品稀释液;所述阴性对照孔中优选添加无过敏史人群的血清或血浆等液体标本;所述标准品孔或阳性质控孔优选添加人IgA蛋白。
本发明中,所述一次孵育的温度优选为10~40℃,更优选为15~35℃。所述一次孵育的时间优选为10~200min。
本发明中,所述第一次洗涤温度优选为10~40℃,更优选为15~35℃;所述洗涤缓冲液的添加量优选为至少包被液的体积;所述一次洗涤的次数优选为2~6次;所述单次洗涤的孵育时间优选为每次0~5min(下同)。
向所述第一次洗涤后的检测板中加入生物素标记的食物过敏原制剂,二次孵育后进行第二次洗涤。本发明中,所述生物素标记的食物过敏原制剂的添加量优选为0.02~0.2ml/孔,更优选为0.03~0.16ml/孔。
本发明中,所述二次孵育的温度优选为10~40℃,更优选为15~35℃。所述二次孵育的时间优选为10~200min。
本发明中,所述第二次洗涤的方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的洗涤方法即可。
所述第二次洗涤后,本发明向得到的检测板中加入酶标记的亲和素溶液,三次孵育后进行第三次洗涤。本发明中,所述酶标记的亲和素溶液在使用前进行稀释,所述稀释的倍数优选1~5000倍。本发明中,所述酶标记的亲和素的添加量优选为0.02~0.2ml/孔,更优选为0.03~0.16ml/孔。所述酶标记的亲和素溶液优选为酶标记的链霉亲和素溶液。
本发明中,所述三次孵育的温度优选为10~40℃,更优选为15~35℃。所述三次孵育的时间优选为10~200min。
本发明中,所述第三次洗涤的方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的洗涤方法即可。
三次洗涤后,本发明向得到的检测板中加入底物显色液,四次孵育后,向检测板中添加终止液,得到显色的检测板。
本发明中,所述底物显色液的添加量优选为0.02~0.2ml/孔,更优选为0.03~0.16ml/孔。所述底物显色液优选为四甲基联苯胺(TMB)底物溶液或2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)底物溶液。所述四甲基联苯胺的质量浓度优选为0.02~0.05%;所述2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的质量浓度优选为0.05~0.1mg/ml。
本发明中,所述四次孵育的温度优选为10~40℃,更优选为15~35℃。所述孵育的时间优选为1~45min,更优选为10~30min。
本发明中,所述终止液的浓度为0.5~2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30%~40%的氢氧化钠溶液。所述终止液的添加量优选为0.02~0.2ml/孔,更优选为0.03~0.16ml/孔。
观察或检测所述得到的显色的检测板,得到定性或定量结果。
本发明中,所述定性结果是通过肉眼观察检测板的反应孔内颜色,在空白对照孔和阴性对照孔均不显色,阳性质控孔显色的情况下,样品孔显色那么判断为待检样品为阳性;反之,在空白孔和阴性对照孔均不显色,阳性质控孔显色的情况下,样品孔不显色,那么待检样品为阴性。
本发明中,所述定量结果是通过检测检测板反应孔中溶液的OD值来判断,以空白对照孔调零后测各孔的OD值,并以标准曲线为基础进行定量检测。所述检测优选为当以ABTS显色,则检测波长设置为405nm;当TMB显色时,则检测波长设置为450nm。
本发明中,所述生物素标记的抗人IgA制剂与标准品和包被有抗人IgA抗体的检测板采用双抗体夹心法制备标准曲线。所述标准曲线得到四参数Logistic曲线拟合方程:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D;其中A=3.75773;B=-0.65594;C=34.80717;D=0.22839;R2=0.99632。X表示IgA的浓度,Y表示OD值。IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒检测范围为0.488~2000ng/ml。
下面结合实施例对本发明提供的基于IgA抗体捕获食物过敏原的试剂盒进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
包被:用碳酸盐缓冲液将特异性抗人IgA单克隆抗体稀释至蛋白质含量为2.0μg/ml的包被液。聚苯乙烯板的每个反应孔中分别加入0.05ml包被液,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,每孔加入0.35ml洗涤缓冲液,洗涤3次,每次孵育1.5min(简称洗涤,下同);
封闭:每个反应孔中分别加入0.05ml含2%小牛血清白蛋白的PBS缓冲液,pH:7.2(封闭液),15~35℃孵育120min,弃去孔内溶液,洗涤同上;
加入梯度稀释的人IgA蛋白(标准品孔,浓度见表1)、PBS缓冲液(空白对照孔)、非过敏志愿者血清(阴性对照孔)和待测样品即可疑鸡蛋、螃蟹和小麦过敏患者血清(样品孔,血清均用PBS缓冲液稀释100倍,见表2)。15~35℃孵育60min,然后洗涤;
加检测抗体:标准品孔和空白对照孔每孔加入0.05ml生物素标记的抗人IgA单克隆抗体(浓度为2000ng/ml),阴性对照孔和样品孔每孔分别加入相应的生物素标记的鸡蛋清过敏原粗提液、生物素标记的螃蟹过敏原粗提液和生物素标记的小麦过敏原粗提液,15~35℃孵育60min,然后洗涤;
加酶标记的亲和素溶液:每孔分别加入0.05ml辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液,15~35℃孵育30min,然后洗涤;
加底物液显色:每孔分别加入新鲜配制的TMB底物溶液0.05ml,15~35℃避光孵育17min;
终止反应:每孔分别加入2mol/L硫酸溶液0.05ml;
检测OD值:将酶标板置于酶标仪上,检测波长450nm处的吸光度值(OD450)(表1),并绘制标准曲线。本实验每个孔均做复孔,实验重复3次。
表1人IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒的标准品浓度及其OD450值
序号 |
标准品(ng/ml) |
OD450(均值) |
1 |
2000 |
3.5685 |
2 |
1000 |
2.9750 |
3 |
500 |
2.8868 |
4 |
250 |
2.8097 |
5 |
125 |
2.7409 |
6 |
62.5 |
2.3850 |
7 |
31.25 |
1.9285 |
8 |
15.63 |
1.4894 |
9 |
7.813 |
1.2854 |
10 |
3.906 |
0.8733 |
11 |
1.953 |
0.5826 |
12 |
0.977 |
0.4881 |
13 |
0.488 |
0.4078 |
14 |
0 |
0.2832 |
根据序号1、3、5、7、9、11、13和14的IgA标准品的浓度和OD值绘制标准曲线,如图2,根据标准曲线得到四参数Logistic曲线拟合方程:
Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D;其中A=3.75773;B=-0.65594;C=34.80717;
D=0.22839;R2=0.99632。由实施例1可以得到:(1)IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒检测范围为0.488~2000ng/ml;(2)IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒的灵敏度为1ng/ml。
表2人IgA抗体捕获食物过敏原特异性IgA抗体的情况
由以上实施例可知,本发明提供的基于IgA抗体捕获食物过敏原的ELISA试剂盒,选用IgA抗体检测食物过敏原,并且基于捕获法制备的ELISA试剂盒,具有检测灵敏性强,准确度高,重现性好的特点,并能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到1ng/ml。具有检测食物过敏原的种类多,应用范围广的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。