CN108872597A - 基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒，属于食物过敏原技术领域。所述试剂盒包括以下试剂，包被有食物过敏原的检测板；洗涤缓冲液；样品稀释液；标准品或阳性质控品；生物素标记的抗人IgD抗体制剂；酶标记的亲和素溶液；底物显色液；终止液。本发明首次选用IgD来检测食物过敏原，并且是基于间接法制备的ELISA试剂盒，具有检测灵敏性强，准确度高，重现性好的特点，且能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到2ng/ml。

Description

基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及食物过敏原检测的技术领域，具体涉及基于IgD抗体检测食物过敏原的试剂盒，即食物过敏原特异性IgD检测试剂盒。
背景技术
过敏性疾病发病率占世界总人口的30％以上，被世界卫生组织列为21世纪的四大非感染性疾病之一。近年来过敏性疾病的发病率显著上升，成为全球关注的公众卫生问题，郭嘉等人对过敏性疾病流行病学调查结果显示，12亿总人口中有22％的人患有过敏性疾病，例如过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重的过敏反应等，严重影响人们的生活质量和生命安全。
食物过敏原如蛋品，花生，牛奶，黄豆，小麦，树木坚果，鱼类和甲壳类食物，是主要食物过敏原。其中甲壳类食物中，虾过敏原备受关注，据报道0.6％～2.8％的过敏性疾病患者对虾过敏；人们在虾肉中检测出至少13种IgE结合蛋白，但原肌球蛋白被鉴定为惟一的主要过敏原，相对分子质量介于34000～39000之间；据报道，原肌球蛋白是虾、蟹、牡蛎、乌贼等无脊椎动物的重要抗原，具有高度保守的氨基酸序列。鸡蛋过敏中，蛋白比蛋黄更易引起过敏，卵类黏蛋白为主要过敏原；其阳性率在儿童食物过敏中达35％，而成人过敏也高达12％。由于花生过敏反应的严重性及高发性，该过敏原引起医疗机构的广泛关注，据报道食物诱导的过敏反应中，花生过敏占10％～47％。近年来此类疾病日益增多，成为常见病、多发病，是我国健康及经济发展领域需要解决的重大问题。
目前，专利CN1620504A公开了用基于由特定物质的一部分基因得到的信息设计的引物进行PCR，用来测定食物中有无特定物质的方法，在检出食物中所含的微量成分和识别有害的特定物质过敏源方面是优异的，但是该方法依赖已知检测物的引物，但是PCR方法复杂，检测时间长，成本高；专利CN101285840A公开了一种食物中过敏原的检测方法，尽管该方法能够快速简单得到检测结果但是该专利中并未公开相关的检测抗体种类亚型，同时没有公开该方法检测食物过敏原的检测灵敏度和准确性。另外，以飞行质谱的分子量峰和图谱形状为基本参数来鉴定特征性的蛋白点。通过分析过敏原蛋白的特征对食物中过敏原进行检测鉴定，但是需要专门的大型精密仪器，检测成本高，分析困难需要专门的检测人员和分析人员
综上所述，虽然目前研究的有关食物过敏原检测的方法很多，但都存在检测速度慢，成本高，不适合批量检测的问题，而且需要特定的分析仪器进行机读，制约了食物中过敏原检测的发展。最重要的是目前尚无食物过敏原特异性IgD检测试剂盒存在。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于基于IgD检测食物过敏原的试剂盒，使该试剂盒具有较强的特异性和较高的灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒，包括以下组分：
包被有食物过敏原的检测板；
洗涤缓冲液；
样品稀释液；
标准品或阳性质控品；
生物素标记的抗人IgD抗体溶液；
酶标记的亲和素溶液；
底物显色液；
终止液。
优选的，所述食物过敏原的包被浓度为0.1～2000μg/ml。
优选的，所述包被有食物过敏原的检测板中食物过敏原的种类包括水产品类、畜禽类、蛋奶类、蔬菜类、水果类、谷物类或坚果类。
优选的，所述洗涤缓冲液为PBS缓冲液。
优选的，所述生物素标记的抗人IgD抗体溶液的质量浓度为0.01～8000μg/ml。
优选的，所述底物显色液为四甲基联苯胺底物溶液或2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸底物溶液。
优选的，所述样品稀释液为PBS缓冲液。
优选的，所述PBS缓冲液包括以下重量份的组分：8.0份NaCl，0.20份KCl，1.16份Na2HPO4，0.20份KH2PO4和1000份水；所述PBS缓冲液的pH值为7.0～7.6。
优选的，所述终止液为0.5～2mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30％～40％的氢氧化钠溶液。
优选的，所述酶标记的亲和素溶液的浓度为使用时工作液的1～5000倍。
本发明提供的基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒，包括以下试剂，包被有食物过敏原的检测板；洗涤缓冲液；样品稀释液；标准品或阳性质控品；生物素标记的抗人IgD抗体制剂；酶标记的亲和素溶液；底物显色液；终止液。本发明选用IgD来检测食物过敏原，并且基于间接法制备的ELISA试剂盒，具有检测灵敏性强的特点，并能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到2ng/ml。
本发明提供的基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒，标准品或阳性质控品是人IgD蛋白，食物过敏原蛋白包被酶标板可以检测血浆、血清等液体中的经口进食的任何食物诱导机体产生的过敏原特异性IgD，具有检测食物过敏原的种类多，应用范围广的特点。采用生物素-亲和素系统能够有效提高检测结果的灵敏度。
附图说明
图1为本发明试剂盒制备和使用流程图；
图2为实施例1中IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒，包括以下试剂：
包被有食物过敏原的检测板；
洗涤缓冲液；
样品稀释液；
标准品或阳性质控品；
生物素标记的抗人IgD抗体溶液；
酶标记的亲和素溶液；
底物显色液；
终止液。
本发明提供的ELISA试剂盒包括包被有食物过敏原的检测板。所述食物过敏原的包被浓度优选为0.1～2000μg/ml，更优选为0.2～1000μg/ml。本发明中，所述包被有食物过敏原的检测板中食物过敏原的种类包括水产品类、畜禽类、蛋奶类、蔬菜类、水果类、谷物类或坚果类。所述水产品类包括鱼、虾、蟹、贝和蛤等。所述畜禽类包括猪肉、鸡肉、牛肉和羊肉等。蛋奶类包括鸡蛋和牛奶等。所述蔬菜包括萝卜、蘑菇、芹菜、辣椒和青椒等。所述水果类包括柑橘、橙子、香蕉、苹果、猕猴桃、芒果、葡萄、菠萝和番茄等。所述谷物类包括小麦、燕麦、大米、玉米、黄豆和豌豆等。所述坚果类包括松子、花生、榛子、核桃和开心果。
本发明中，所述检测板的种类优选为透明的聚苯乙烯板和不透明的白色聚苯乙烯板。所述透明的聚苯乙烯板用于定量检测；所述不透明的白色聚苯乙烯板用于定性检测。
本发明提供的ELISA试剂盒包括洗涤缓冲液。所述洗涤缓冲液优选为PBS缓冲液。所述的PBS缓冲液的溶质优选包括以下重量份的组分：8.0份NaCl，0.20份KCl，1.16份Na2HPO4和0.20份KH2PO4和1000份水；所述的PBS溶液的pH值优选为7.0～7.6，更优选为7.2～7.5。
本发明中，所述ELISA试剂盒包括样品稀释液。所述样品稀释液为pH值为7.0～7.6的PBS缓冲液。
本发明提供的ELISA试剂盒包括生物素标记的抗人IgD抗体制剂。所述生物素标记的抗人IgD抗体制剂的质量浓度优选为0.01～8000μg/ml，更优选为0.1～5000μg/ml，进一步优选为1～500μg/ml。所述生物素标记的抗人IgD抗体制剂的添加体积优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.2～0.1ml/孔。本发明中，所述抗人IgD抗体优选为抗人IgD的单克隆抗体。
本发明提供的ELISA试剂盒包括标准品或阳性质控品。所述标准品或阳性质控品为人IgD蛋白。所述阳性质控品的质量浓度优选为0.01～1000μg/ml，更优选为0.1～100μg/ml；所述阳性质控品的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.2～0.1ml/孔。
本发明提供的ELISA试剂盒包括酶标记亲和素溶液。本发明中，所述酶标记亲和素溶液为使用时工作液的1～5000倍。本发明对所述酶标记亲和素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酶标记亲和素溶液即可。所述酶标记亲和素的溶液优选为HPR标记链霉亲和素溶液。
IgD本发明提供的ELISA试剂盒包括底物显色液。所述底物显色液为四甲基联苯胺底物溶液或2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸底物溶液。所述四甲基联苯胺的质量浓度优选为0.02～0.05％；所述2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的质量浓度优选为0.05～0.1mg/ml。
本发明提供的ELISA试剂盒包括终止液。所述终止液为0.5～2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30％～40％的氢氧化钠溶液，更优选为1.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为35％的氢氧化钠溶液。
本发明中，所述的基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒的制备方法，优选包括包被有食物过敏原的检测板的制备方法。
本发明中，所述包被有食物过敏原的检测板的制备方法优选包括以下步骤：
1)用包被缓冲液稀释食物过敏原，得到食物过敏原包被液；
2)将所述步骤1)得到的食物过敏原包被液添加到检测板的反应孔中，4℃过夜；
3)次日，一次洗涤所述步骤2)中过夜的检测板孔后，添加封闭液，孵育后再次洗涤。
本发明用包被缓冲液稀释食物过敏原，得到包被液。本发明中，所述稀释的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的稀释的技术方案即可。本发明中，所述包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液。所述碳酸盐缓冲液的浓度优选为0.01～0.2mol/L。所述碳酸盐缓冲液的pH值优选为8.5～9.5。
得到包被液后，本发明将所述包被液添加到检测板的反应孔中，4℃过夜。本发明中，每个反应孔中包被液的体积优选为0.02～0.2ml/孔。
本发明中，所述4℃过夜优选在静置的条件下进行，利于食物过敏原稳固的包被在检测板中。
次日，一次洗涤所述过夜的检测板孔后，添加封闭液，孵育后再次洗涤。本发明对所述一次洗涤的方法没有限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤的技术方案即可。本发明中，所述洗涤缓冲液的添加量优选为至少包被液的体积；所述一次洗涤的次数优选为2～6次；所述单次洗涤的孵育时间优选为每次0～5min(下同)。
所述一次洗涤后，本发明将一次洗涤后的检测板加入封闭液，孵育后再次洗涤。本发明中，所述封闭液优选为质量浓度为1％～5％的小牛血清白蛋白PBS缓冲液。所述封闭液的添加量优选为至少包被液的体积。本发明中，所述孵育的时间优选为10～200min。所述孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。
所述孵育后，本发明将检测板进行再次洗涤，在本发明中，所述再次洗涤的方法与上述技术方案所述一次洗涤的方法相同，在此不再赘述。
所述再次洗涤后，本发明优选自然控干检测板中的水分后，用真空袋密封检测板，得到包被有食物过敏原的检测板。
本发明中，所述生物素标记的抗人IgD抗体制剂的浓度优选为0.01～8000μg/ml，更优选为0.1～1000μg/ml，最优选为0.1～100μg/ml。
本发明还优选提供了基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测样本添加到包被有食物过敏原的检测板孔中，将PBS添加到包被有人IgD蛋白的检测板孔中，进行一次孵育后进行第一次洗涤；
2)向所述步骤1)中洗涤后的检测板中加入生物素标记的抗人IgD抗体制剂，二次孵育后进行第二次洗涤；
3)向所述步骤2)中洗涤后的检测板中加入酶标记的亲和素溶液溶液，三次孵育后进行第三次洗涤；
4)向将所述步骤3)中得到洗涤检测板中加入底物显色液，四次孵育后，向检测板中添加终止液，得到显色的检测板；
5)根据所述步骤4)得到的显色检测板，得到定性或定量结果。
本发明将待测样本添加到包被有食物过敏原的检测板中，一次孵育后进行第一次洗涤。本发明中，所述待测样本包括血清、血浆等含有IgD抗体的液体。所述待测样本的添加量优选为每孔0.02～0.2ml。所述血清或血浆等液体的稀释度为1～32000倍。稀释血清或血浆用溶液为所述试剂盒中的稀释液。
本发明中，为了使检测结果准确可信，优选还设置空白对照孔、阴性对照孔、标准品孔或阳性质控孔，且保证每个反应孔添加的液体量一致。所述空白对照孔中优选为碳酸盐缓冲液包被的酶标板孔，加入PBS缓冲液作为样品；所述阴性对照孔中优选为食物过敏原包被的酶标板孔中加入无过敏史人群的血清或血浆等液体样品；所述标准品孔或阳性质控孔优选为用含人IgD蛋白的碳酸盐缓冲液包被的酶标板孔中加入PBS缓冲液作为样品。
本发明中，所述一次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述一次孵育的时间优选为10～200min。
本发明中，所述第一次洗涤温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃；所述洗涤缓冲液的添加量优选为至少包被液的体积；所述一次洗涤的次数优选为2～6次；所述单次洗涤的孵育时间优选为每次0～5min(下同)。
向所述第一次洗涤后的检测板中加入生物素标记的抗人IgD抗体制剂，二次孵育后进行第二次洗涤。
本发明中，所述二次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述二次孵育的时间优选为10～200min。
本发明中，所述第二次洗涤的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤方法即可。
所述第二次洗涤后，本发明向所述洗涤后的检测板中加入酶标记的亲和素溶液溶液，三次孵育后进行第三次洗涤。
本发明中，所述酶标记的亲和素溶液在使用前进行稀释，所述稀释的倍数优选1～5000倍。在本发明中，所述酶标记亲和素溶液的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。
本发明中，所述三次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述三次孵育的时间优选为10～200min。
本发明中，所述第三次洗涤的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤方法即可。
三次洗涤后，本发明向得到的检测板中加入底物显色液，四次孵育后，向检测板中添加终止液，得到显色的检测板。
本发明中，所述底物显色液的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。所述底物显色液优选为四甲基联苯胺(TMB)底物溶液或2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)底物溶液。
本发明中，所述四次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述孵育的时间优选为1～45min，更优选为10～30min。
本发明中，所述终止液的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。
观察或检测所述得到的显色的检测板，得到定性或定量结果。
本发明中，所述定性结果是通过肉眼观察检测板的反应孔内颜色，在空白对照孔和阴性对照孔均不显色，阳性质控孔显色的情况下，样品孔显色那么判断为待检样品为阳性；反之，在空白对照孔和阴性对照孔均不显色，阳性质控孔显色的情况下，样品孔不显色，那么待检样品为阴性。
本发明中，所述定量结果是通过检测酶标板反应孔中溶液的OD值来判断，以空白对照孔调零后测各孔的OD值，并以标准曲线为基础进行定量检测。所述检测优选为当以ABTS显色，则检测波长设置为405nm；当TMB显色时，则检测波长设置为450nm。
本发明中，采用常规方法制备标准曲线。所述标准曲线为四参数Logistic曲线拟合方程:Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；其中A＝3.39596；B＝-2.49676；C＝80.94434；D＝0.20580；R2＝0.99960。X表示IgD抗体的浓度，Y表示OD值。IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒检测范围为1.95～1000ng/ml。
下面结合实施例对本发明提供的基于IgD检测食物过敏原的试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
包被：用碳酸盐缓冲液将鸡蛋清、小麦和牛奶食物过敏原稀释至总蛋白质量浓度为10μg/ml的食物过敏原包被液；用碳酸盐缓冲液稀释人IgD蛋白得到标准品包被液(蛋白浓度见表1)，聚苯乙烯板的每个反应孔中分别加入0.05ml包被液，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，每孔加入0.35ml洗涤缓冲液，洗涤3次，每次孵育30s(简称洗涤，下同)；
封闭：每个反应孔中分别加入0.05ml含2％小牛血清白蛋白的PBS缓冲液(封闭液)，pH：7.2，15～35℃孵育120min，弃去孔内溶液，洗涤同上；
加入样品：可疑鸡蛋过敏患者血清、小麦过敏患者血清和牛奶过敏患者血清(待测血清)、正常人血清(阴性对照孔)用PBS缓冲液稀释20倍，每孔加入0.05ml稀释后的血清于相应的过敏原包被的酶标板孔中；标准品孔、空白对照孔每孔均加入0.05ml PBS，15～35℃孵育60min，然后洗涤；
加检测抗体：向每个反应孔中加入0.05ml质量浓度为2.83μg/ml的生物素标记的抗人IgD抗体溶液，15～35℃孵育60min后洗涤；
加酶标记的亲和素溶液：每孔分别加入0.05ml辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液，15～35℃孵育30min，然后洗涤；
加底物液显色：每孔分别加入新鲜配制的TMB底物溶液0.05ml，15～35℃避光孵育14min；
终止反应：每孔分别加入2mol/L硫酸溶液0.05ml；
检测OD值：将酶标板置于酶标仪上，检测波长450nm处的吸光度(OD)值，以空白对照孔调零后测各孔的OD值(表1)，并绘制标准曲线(附图2)，根据标准曲线计算食物过敏原特异性IgD抗体的浓度(表2)。本实验每个孔均做复孔，实验重复3次。
表1人IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒的标准品浓度及其OD值
序号 人IgG2蛋白浓度(ng/ml) OD值(均值)
1 1000 3.3749
2 500 3.2943
3 250 3.2337
4 125 2.5656
5 62.5 1.295
6 31.25 0.6247
7 15.625 0.3145
8 7.8125 0.2192
9 3.90625 0.2028
10 1.953125 0.1881
11 0.9765625 0.1872
12 0.48828125 0.1816
13 0.244140625 0.1651
14 0 0.1767
根据序号1、3、5、7、9、10和14的OD值数据绘制标准曲线，如附图1，根据标准曲线得到四参数Logistic曲线拟合方程:Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；其中A＝3.39596；B＝-2.49676；C＝80.94434；D＝0.20580；R2＝0.99960。由实施例1可以得到：(1)IgD抗体检测气传过敏原的ELISA试剂盒检测范围为1.95～1000ng/ml；(2)IgD抗体检测气传过敏原的ELISA试剂盒的灵敏度为2ng/ml。
表2人IgD抗体检测可疑过敏患者血清食物过敏原特异性IgD抗体的情况
由以上实施例可知，本发明提供的基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒，选用IgD来检测食物过敏原，并且基于间接法制备的ELISA试剂盒，具有检测灵敏性强，准确度高，重现性好的特点，并能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到2ng/ml。具有检测食物过敏原的种类多，应用范围广的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基于IgD抗体检测食物过敏原的ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
包被有食物过敏原的检测板；
洗涤缓冲液；
样品稀释液；
标准品或阳性质控品；
生物素标记的抗人IgD抗体溶液；
酶标记的亲和素溶液；
底物显色液；
终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述食物过敏原的包被浓度为0.1～2000μg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有食物过敏原的检测板中食物过敏原的种类包括水产品类、畜禽类、蛋奶类、蔬菜类、水果类、谷物类或坚果类。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗人IgD抗体溶液的质量浓度为0.01～8000μg/ml。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为四甲基联苯胺底物溶液或2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸底物溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为PBS缓冲液。
8.根据权利要求4或7所述的试剂盒，其特征在于，所述PBS缓冲液包括以下重量份的组分：8.0份NaCl，0.20份KCl，1.16份Na2HPO4，0.20份KH2PO4和1000份水；所述PBS缓冲液的pH值为7.0～7.6。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为0.5～2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30％～40％的氢氧化钠溶液。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的亲和素溶液的浓度为使用时工作液的1～5000倍。
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