CN108614120A - 基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒 - Google Patents

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CN108614120A CN201810414088.XA CN201810414088A CN108614120A CN 108614120 A CN108614120 A CN 108614120A CN 201810414088 A CN201810414088 A CN 201810414088A CN 108614120 A CN108614120 A CN 108614120A
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Abstract

本发明提供的基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒，属于气传过敏原检测技术领域。所述试剂盒包括以下试剂，包被有抗人IgG4抗体的检测板；洗涤缓冲液；样品稀释液；标准品或阳性质控品；生物素标记的气传过敏原制剂；酶标记的亲和素溶液；底物显色液；终止液。本发明选用IgG4来检测气传过敏原，并且是基于捕获法制备的ELISA试剂盒，具有灵敏度高，重现性好特点，并能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到1ng/ml。

Description

基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及过敏原检测试剂盒的技术领域，具体涉及基于IgG4抗体捕获气传过敏原的试剂盒。
背景技术
过敏性疾病发病率占世界总人口的30％以上，被世界卫生组织列为21世纪的四大非感染性疾病之一。近年来过敏性疾病的发病率显著上升，成为全球关注的公众卫生问题，郭嘉等人对过敏性疾病流行病学调查结果显示，12亿总人口中有22％的人患有过敏性疾病，例如过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、气传过敏、药物过敏和严重的过敏反应等，严重影响人们的生活质量和生命安全。
气传过敏原如花粉颗粒、真菌孢子、尘螨、谷物面粉、动物毛发和尿液、鸟羽毛等是过敏性疾病的重要诱因，其中花粉是气传过敏原的主要来源，导致了10％～20％的变应性疾病的发生。不同的花粉有着不同的蛋白成分，其抗原性也不一致，不同花粉间可能存在交叉反应性。尘螨主要有屋尘螨、粉尘螨、宇尘螨等，是引起变应性鼻炎和支气管哮喘的重要过敏原。猫和狗是常见的动物过敏原的来源，在一些特定的工作环境中鼠、豚鼠、马、兔亦可成为重要的过敏原来源，以上动物的毛发、上皮、皮屑、尿液、唾液均可有很强的致敏性。近年来此类疾病日益增多，成为常见病、多发病，是我国健康及经济发展领域需要解决的重大问题
基于过敏性疾病“是一组由肥大细胞/嗜碱性粒细胞介导的疾病”的定义，对于已经致敏的易感者来说，任何能诱导大量肥大细胞/嗜碱性粒细胞激活的物质均会诱发过敏反应。在这些物质中，IgE介导的过敏反应无疑是研究最多，了解最深的一个，40余年的临床实践显示，IgE介导的过敏反应是过敏反应中的最重要亚型。传统认为气传性过敏原引起的过敏反应也是由IgE介导的过敏反应，例如，公开号为CN105403692A的中国专利公开了检测屋尘螨过敏原特异性IgE抗体的试剂盒及方法，公开号为CN103983789A的中国专利公开了一种用于特异性尘螨类过敏原IgE筛查的试纸条。可见，目前现有技术对气传过敏原的研究停留在由IgE介导的过敏反应，这会导致不能及时准确地确定过敏性疾病的发生。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于基于IgG4抗体检测气传过敏原的试剂盒，该试剂盒具有较强的特异性和较高的灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒，包括以下组分：
包被有抗人IgG4抗体的检测板；
洗涤缓冲液；
样品稀释液；
标准品或阳性质控品；
生物素标记的气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂；
酶标记的亲和素溶液；
底物显色液；
终止液。
优选的，所述抗人IgG4抗体的包被浓度为0.1～2000μg/ml。
优选的，所述洗涤缓冲液为PBS缓冲液。
优选的，所述生物素标记气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂的质量浓度独立为0.01～8000μg/ml。
优选的，所述生物素标记的抗人IgG4制剂为生物素标记的抗人IgGs的制剂或生物素标记的仅抗人IgG4的制剂。
优选的，所述样品稀释液为PBS缓冲液。
优选的，所述PBS缓冲液的组分包括以下重量份的组分：8.0份NaCl，0.20份KCl，1.16份Na2HPO4，0.20份KH2PO4和1000份水；所述的PBS缓冲液的pH值为7.0～7.6。
优选的，所述终止液为0.5～2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30％～40％的氢氧化钠溶液。
优选的，所述酶标记的亲和素溶液为使用时工作液的1～5000倍。
优选的，所述生物素标记的气传过敏原制剂中气传过敏原的种类包括户尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、德国小蠊、美洲大蠊、狗上皮、猫上皮、艾蒿、黄花蒿、大籽蒿、葎草、三裂叶豚草、矮豚草、梯牧草、桦树、杨树、柳树、榆树、白蜡、法国梧桐、松树、柏树、软叶针葵、交链孢霉、烟曲霉、特异青霉、黑根霉、黑曲霉、谷物面粉、鸟羽毛、蜂毒、乳胶或百合花。
本发明提供的基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒，包括以下试剂，包被有抗人IgG4抗体的检测板；洗涤缓冲液；样品稀释液；标准品或阳性质控品；生物素标记气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂；酶标记的亲和素溶液；底物显色液；终止液。本发明采用首次选用IgG4抗体来检测气传过敏原，并且是基于捕获法制备的ELISA试剂盒，具有检测特异性强，灵敏度高的特点，并能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到2ng/ml。
进一步的，本发明提供的基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒，标准品或阳性质控品是人IgG4溶液。生物素标记的气传过敏原蛋白可以检测血清、血浆等液体中的任何经空气传播的过敏原诱导机体产生的过敏原特异性IgG4，具有检测气传过敏原的种类多，应用范围广的特点。
附图说明
图1为本发明试剂盒制备和使用流程图；
图2为实施例1中IgG4抗体捕获气传过敏原的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒，包括以下试剂：
包被有抗人IgG4抗体的检测板；
洗涤缓冲液；
样品稀释液；
标准品或阳性质控品；
生物素标记的气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂；
酶标记的亲和素溶液；
底物显色液；
终止液。
本发明提供ELISA试剂盒包括包被有抗人IgG4抗体的检测板。所述抗人IgG4抗体的包被浓度优选为0.1～2000μg/ml，更优选为0.1～100μg/ml。本发明中，所述抗IgG4抗体优选为抗人IgG4的单克隆抗体。本发明中，所述检测板的种类优选为透明的聚苯乙烯板和不透明的白色聚苯乙烯板。所述透明的聚苯乙烯板用于定量检测；所述不透明的白色聚苯乙烯板用于定性检测。
本发明提供的ELISA试剂盒包括洗涤缓冲液。在本发明中，所述洗涤缓冲液优选为PBS缓冲液。所述的PBS缓冲液优选包括以下重量份的组分8.0份NaCl，0.20份KCl，1.16份Na2HPO4和0.20份KH2PO4和1000份水；所述的PBS缓冲液的pH值为7.0～7.6。
本发明提供的ELISA试剂盒包括生物素标记气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂。所述生物素标记气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂的质量浓度优选为0.01～8000μg/ml，更优选为0.1～1000μg/ml，最优选为0.1～100μg/ml。本发明中，所述生物素标记气传过敏原制剂中气传过敏原的种类包括经呼吸道吸入的任何种类的过敏原，例如户尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、德国小蠊、美洲大蠊、狗上皮、猫上皮、艾蒿、黄花蒿、大籽蒿、葎草、三裂叶豚草、矮豚草、梯牧草、桦树、杨树、柳树、榆树、白蜡、法国梧桐、松树、柏树、软叶针葵、交链孢霉、烟曲霉、特异青霉、黑根霉、黑曲霉、谷物面粉、鸟羽毛、蜂毒、乳胶或百合花。
本发明中，所述ELISA试剂盒包括样品稀释液。所述样品稀释液为pH值为7.0～7.6的PBS缓冲液。所述PBS缓冲液的组分包括下列重量份组分：8.0份NaCl，0.20份KCl，1.16份Na2HPO4、0.20份KH2PO4和1000份水。
本发明提供的ELISA试剂盒包括标准品或阳性质控品。所述标准品或阳性质控品为人IgG4蛋白。
本发明提供的ELISA试剂盒包括终止液。所述终止液为0.5～2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30％～40％的氢氧化钠溶液。
本发明提供的ELISA试剂盒包括酶标记的亲和素溶液。所述酶标记的亲和素溶液为使用时工作液的1～5000倍。所述酶标记的亲和素溶液的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酶标记的亲和素溶液即可。
本发明提供的ELISA试剂盒包括底物显色液。本发明中，所述底物显色液的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。所述底物显色液优选为四甲基联苯胺(TMB)底物溶液或2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)底物溶液。所述四甲基联苯胺的质量浓度优选为0.02～0.05％；所述2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的质量浓度优选为0.05～0.1mg/ml。
本发明中，所述的基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒的制备方法，优选包括包被有抗人IgG4抗体的检测板的制备。
本发明中，所述包被有抗人IgG4抗体的检测板的制备方法优选包括以下步骤：
1)用包被缓冲液稀释抗人IgG4抗体，得到包被液；
2)将所述步骤1)得到的包被液添加到检测板的反应孔中，4℃过夜；
3)次日，一次洗涤所述步骤2)中过夜的检测板孔后，添加封闭液，孵育后再次洗涤。
本发明用包被缓冲液稀释抗人IgG4抗体，得到包被液。本发明中，所述稀释的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的稀释的技术方案即可。本发明中，所述包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液。所述碳酸盐缓冲液的浓度优选为0.01～0.2mol/L。所述碳酸盐缓冲液的pH值优选为8.5～9.5。
本发明中，所述包被液的浓度优选为0.1～2000μg/ml，更优选为0.1～100μg/ml。
得到包被液后，本发明将所述包被液添加到检测板的反应孔中，4℃过夜。本发明中，每个反应孔中包被液的体积优选为0.02～0.2ml包被液。
本发明中，所述4℃过夜优选在静置的条件下进行，利于抗人IgG4抗体稳固的包被在检测板中。
次日，一次洗涤所述过夜的检测板孔后，添加封闭液，孵育后再次洗涤。本发明对所述一次洗涤的方法没有限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤的技术方案即可。本发明中，所述洗涤缓冲液的添加量优选为至少包被液的体积；所述一次洗涤的次数优选为2～6次；所述单次洗涤的孵育时间优选为每次0～5min(下同)。
所述一次洗涤后，本发明将一次洗涤后的检测板加入封闭液，孵育后再次洗涤。本发明中，所述封闭液优选为质量浓度为1％～5％的小牛血清白蛋白的PBS缓冲液。所述封闭液的添加量优选为至少包被液的体积。本发明中，所述孵育的时间优选为10～200min。所述孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。
所述孵育后，本发明将检测板进行再次洗涤，在本发明中，所述再次洗涤的方法与上述技术方案所述一次洗涤的方法相同，在此不再赘述。
所述再次洗涤后，本发明优选自然控干检测板中的水分后，用真空袋密封检测板，得到包被有抗人IgG4抗体的检测板。
基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测样本、标准品、阴性对照品添加到包被有抗人IgG4抗体的检测板中，进行一次孵育后进行第一次洗涤；
2)向所述步骤1)中洗涤后的检测板中加入生物素标记的气传过敏原制剂或生物素标记的抗人IgG4抗体制剂，二次孵育后进行第二次洗涤；
3)向所述步骤2)中洗涤后的检测板中加入酶标记的亲和素或酶标记的链霉亲和素溶液，三次孵育后进行第三次洗涤；
4)向将所述步骤3)中洗涤后的检测板中加入底物显色液，四次孵育后，向检测板中添加终止液，得到显色的检测板；
5)根据所述步骤4)得到的显色检测板，得到定性或定量结果。
本发明将待测样本添加到包被有抗人IgG4抗体的检测板中，一次孵育后进行第一次洗涤。本发明中，所述待测样本包括血清或血浆等含有IgG4抗体的液体。所述血清或血浆等液体的稀释度为1～32000倍。
本发明中，为了使检测结果准确可信，优选还设置空白对照孔、阴性对照孔、标准品孔，且保证每个反应孔添加的液体量一致。所述空白孔中优选添加样品稀释液；所述阴性对照孔中优选添加无过敏的健康血清或血浆等液体标本；所述标准品孔或阳性质控孔优选添加人IgG4蛋白。
本发明中，所述一次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述一次孵育的时间优选为10～200min。
本发明中，所述第一次洗涤温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃；所述洗涤缓冲液的添加量优选为至少包被液的体积；所述一次洗涤的次数优选为2～6次；所述单次洗涤的孵育时间优选为每次0～5min(下同)。
向所述第一次洗涤后的检测板中加入生物素标记的气传过敏原制剂或生物素标记的抗人IgG4抗体制剂，二次孵育后进行第二次洗涤。本发明中，所述生物素标记的气传过敏原制剂的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。
本发明中，所述二次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述二次孵育的时间优选为10～200min。
本发明中，所述第二次洗涤的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤方法即可。
所述第二次洗涤后，本发明向得到的检测板中加入酶标记的亲和素溶液，三次孵育后进行第三次洗涤。本发明中，所述酶标记的亲和素在使用前进行稀释，所述稀释的倍数优选1～5000倍。在本发明中，所述酶标记的亲和素溶液的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。
本发明中，所述三次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述三次孵育的时间优选为10～200min。
本发明中，所述第三次洗涤的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤方法即可。
三次洗涤后，本发明向得到的检测板中加入底物显色液，四次孵育后，向检测板中添加终止液，得到显色的检测板。
本发明中，所述底物显色液的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。
本发明中，所述四次孵育的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃。所述孵育的时间优选为1～45min，更优选为10～30min。
本发明中，所述终止液的浓度为0.5～2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30％～40％的氢氧化钠溶液。所述终止液的添加量优选为0.02～0.2ml/孔，更优选为0.03～0.16ml/孔。
观察或检测所述得到的显色的检测板，得到定性或定量结果。
本发明中，所述定性结果是通过肉眼观察检测板的反应孔内颜色，在空白对照孔和阴性对照孔均不显色，阳性质控孔显色的情况下，样品孔显色那么判断为待检样品为阳性；反之，在空白对照孔和阴性对照孔均不显色，阳性质控孔显色的情况下，样品孔不显色，那么待检样品为阴性。
本发明中，所述定量结果是通过检测检测板反应孔中溶液的OD值来判断，以空白对照孔调零后测各孔的OD值，并以标准曲线为基础进行定量检测。所述检测优选为当以ABTS显色，则检测波长设置为405nm；当TMB显色时，则检测波长设置为450nm。
本发明中，所述生物素标记的抗人IgG4制剂与标准品和包被有抗人IgG4抗体的检测板采用双抗体夹心法制备标准曲线。所述标准曲线为四参数Logistic曲线拟合方程:Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；其中A＝2.01734；B＝-0.47225；C＝735.00029；D＝0.12788；R2＝0.99618。X表示IgG4抗体的质量浓度，Y表示OD值。IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒检测范围为0.488～2000ng/ml。
下面结合实施例对本发明提供的基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
包被：用碳酸盐缓冲液将特异性抗人IgG4单克隆抗体稀释至蛋白质含量为2.0μg/ml的包被液。聚苯乙烯板的每个反应孔中分别加入0.05ml包被液，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，每孔加入0.35ml洗涤缓冲液，洗涤3次，每次孵育1.5min。(简称洗涤，下同)；
封闭：每个反应孔中分别加入0.05ml含2％小牛血清白蛋白的PBS缓冲液，pH：7.2(封闭液)，15～35℃孵育120min，弃去孔内溶液，洗涤同上；
加入梯度稀释的人IgG4蛋白(标准品孔，浓度见表1)、PBS缓冲液(空白对照孔)、非过敏志愿者血清(阴性对照孔)和待测样品即可疑户尘螨、蒿草花粉和葎草花粉过敏患者血清(样品孔，血清均用PBS缓冲液稀释100倍，见表2)。15～35℃孵育60min，然后洗涤；
加检测抗体：标准品孔和空白对照孔每孔加入0.05ml生物素标记的抗人IgGs单克隆抗体(浓度为2000ng/ml)，阴性对照孔和样品孔每孔分别加入相应的生物素标记的户尘螨过敏原粗提液、生物素标记的大籽蒿草过敏原粗提液和生物素标记的葎草花粉过敏原粗提液，15～35℃孵育60min，然后洗涤；
加酶标记的亲和素溶液：每孔分别加入0.05ml辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液，15～35℃孵育30min，然后洗涤；
加底物液显色：每孔分别加入新鲜配制的TMB底物溶液0.05ml，15～35℃避光孵育25min；
终止反应：每孔分别加入2mol/L硫酸溶液0.05ml；
检测OD值：将酶标板置于酶标仪上，检测波长450nm处的吸光度值(OD450)，以空白对照孔调零后测各孔的OD值(表1)，并绘制标准曲线。本实验每个孔均做复孔，实验重复3次。
表1人IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒的标准品浓度及其OD值
序号 标准品(ng/ml) OD450值(均值)
1 2000 1.301
2 1000 1.124
3 500 0.967
4 250 0.834
5 125 0.693
6 62.5 0.604
7 31.25 0.512
8 15.63 0.490
9 7.813 0.339
10 3.906 0.262
11 1.953 0.200
12 0.977 0.174
13 0.488 0.161
14 0 0.155
根据1、3、5、7、9、11、13和14的IgG4标准品的浓度和OD值数据绘制标准曲线，如图2，根据标准曲线得到四参数Logistic曲线拟合方程:Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；其中A＝2.01734；B＝-0.47225；C＝735.00029；D＝0.12788；R2＝0.99618。由实施例1可以得到：(1)IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒检测范围为0.488～2000ng/ml；(2)IgG4抗体的检测灵敏度为1ng/ml。
表2人IgG4抗体捕获气传过敏原特异性IgG4抗体的情况
由以上实施例可知，本发明提供的基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒，选用IgG4来检测气传过敏原，并且基于捕获法制备的ELISA试剂盒，具有检测灵敏性强，准确度高，重现性好的特点，并能够一次处理大批量的样品。实施例证明本发明提供的试剂盒检测灵敏度达到1ng/ml。具有检测气传过敏原的种类多，应用范围广的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基于IgG4抗体捕获气传过敏原的ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
包被有抗人IgG4抗体的检测板；
洗涤缓冲液；
样品稀释液；
标准品或阳性质控品；
生物素标记的气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂；
酶标记的亲和素溶液；
底物显色液；
终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗IgG4抗体的包被浓度为0.1～2000μg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记气传过敏原制剂和生物素标记的抗人IgG4制剂的质量浓度独立为0.01～8000μg/ml。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗人IgG4制剂为生物素标记的抗人IgGs或生物素标记的仅抗人IgG4的制剂。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为PBS缓冲液。
7.根据权利要求3或6所述的试剂盒，其特征在于，所述PBS缓冲液包括以下重量份的组分：8.0份NaCl，0.20份KCl，1.16份Na2HPO4，0.20份KH2PO4和1000份水；所述PBS缓冲液的pH值为7.0～7.6。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为0.5～2.0mol/L的硫酸溶液或质量浓度为30％～40％的氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的亲和素溶液的浓度为使用时工作液的1～5000倍。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记气传过敏原制剂中气传过敏原的种类包括户尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、德国小蠊、美洲大蠊、狗上皮、猫上皮、艾蒿、黄花蒿、大籽蒿、葎草、三裂叶豚草、矮豚草、梯牧草、桦树、杨树、柳树、榆树、白蜡、法国梧桐、松树、柏树、软叶针葵、交链孢霉、烟曲霉、特异青霉、黑根霉、黑曲霉、蜂毒、谷物面粉、鸟羽毛、乳胶或百合花。
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