CN106370855A - 基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒 - Google Patents

基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，属于生物检测领域。包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS‑T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、终止液，以及10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425‑600μm玻璃珠，应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。本发明可用于绵羊白细胞、血清、血浆及其它组织样品中Prdx6含量测定，灵敏度达pg级。

Description

基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心 ELISA试剂盒
技术领域
本发明属于生物快速检验检疫领域，通过构建绵羊过氧化物氧还酶6(Peroxiredoxin 6，Prdx6)重组表达质粒，制备绵羊Prdx6重组蛋白(rOaPrdx6)，利用特异性兔源抗绵羊Prdx6多克隆抗体和特异性鼠源抗绵羊Prdx6单克隆抗体，及优化样品前处理程序，以生物素-链霉亲和素(Streptavidin)-生物素(Biotin)-碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)BSaBA信号放大系统为基础，建立一种绵羊Prdx6含量测定双抗体夹心ELISA方法，并将其组装成易于使用的Prdx6含量测定试剂盒。
背景技术
过氧化物氧还酶6(Peroxiredoxin 6，Prdx6)广泛存在于原核和真核生物的细胞质中。其具有多种生物学功能，例如参与细胞增殖分化、保护自由基敏感蛋白、增强NK细胞的活性、介导哺乳动物细胞信号传导等。主要功能是利用硫氧还原蛋白将过氧化物以及超氧化物进行还原，消除代谢产生的过氧化物。
病原微生物侵入生物机体后，能够被吞噬细胞吞噬并导致大量活性氧(ROS)的产生，达到杀灭病原微生物的目的。通过这个过程可以将大部分的病原微生物清除，但是仍然有某些细胞内寄生菌可以逃避吞噬细胞的杀伤作用而存活在细胞内。其中过氧化物氧化还原酶家族(Peroxiredoxins,Prdxs)对ROS的清除可能是胞内寄生菌抵抗ROS氧化损伤作用，得以完成细胞内寄生的重要免疫逃避机制之一。Prdx6是Prdxs家族中的一员，可有效使ROS失活，有可能被胞内寄生菌利用达到清除胞内活性氧完成胞内寄生的目的。近几年研究还发现Prdx6除抗氧化作用外，还与糖尿病、癌症发生发展、脑和肺疾病、以及多种细胞因子的分泌与免疫损伤有关。因此，Prdx6有可能成为某些疾病诊断的生物标志分子。因此建立一种准确、快速检测组织细胞中Prdx6含量的检测方法，并组装成易于使用的Prdx6含量测定试剂盒能够为评估机体健康水平和抗氧化应激能力提供有效工具。
布鲁氏菌病(Brucellosis，布病)是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的严重危害公共卫生的人兽共患传染病。本课题组前期研究发现，绵羊白细胞层基因表达谱在布鲁氏菌强毒株感染与疫苗接种两种情况下发生变化。通过Real-time PCR证实，与健康羊相比，自然感染强毒株绵羊白细胞中Prdx6上调表达，而疫苗接种绵羊白细胞Prdx6基因的表达水平与强毒株感染存在差异。推测宿主Prdx6差异表达可能与布鲁氏菌的胞内寄生与增殖存在一定的相关性。
发明内容
本发明提供一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，以解决现有Prdx6含量测定ELISA方法不能检测绵羊Prdx6含量、以及检测限无法检测血清中Prdx6含量的问题，本发明通过构建绵羊过氧化物氧还酶6(OaPrdx6)重组表达质粒，制备绵羊Prdx6重组蛋白(rOaPrdx6)，利用特异性兔源抗绵羊Prdx6多克隆抗体和特异性鼠源抗绵羊Prdx6单克隆抗体，优化样品前处理程序，以BSaBA信号放大系统为基础，建立一种绵羊Prdx6含量测定双抗体夹心ELISA方法，并组装成易于应用的Prdx6含量测定试剂盒。可检测血清、白细胞、组织器官中Prdx6含量，同时可进一步探讨用于检测牛源、鼠源Prdx6含量。
本发明采取的技术方案是：
包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS-T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、3M NaOH终止液，以及血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠，其特征在于：应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，并进行封闭，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制备特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体，此单克隆抗作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。
本发明所述绵羊Prdx6重组蛋白是通过原核表达系统制备的，所述的原核表达系统是由下列步骤得到的：
(1)提取羊血液白细胞层细胞总RNA反转cDNA为模板，进行PCR扩增，获得绵羊Prdx6基因，克隆到pMD18-T-Simple载体上，之后将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组表达质粒pET-30a-OaPrdx6；
(2)将pET-30a-OaPrdx6转化至E.coli BL21-Codonplus细胞中诱导表达重组绵羊Prdx6蛋白，挑取经鉴定确证的单菌落，接种于5mL含50mg/L卡那抗性的液体LB培养基中，37℃培养2h，然后按1:500比例接种于200mL的含50mg/L卡那抗性的新鲜液体LB培养基中，37℃振荡培养1h，加终浓度0.4mM的IPTG,继续振荡培养5.5h后，离心收集菌体；
(3)菌体重悬于上样缓冲液，该缓冲液包括20mM磷酸钠，30mM咪唑，0.5M氯化钠，pH8.0，超声裂解后，10000g离心15min，取上清，经镍柱纯化，上样后继续加入约10个柱体积的上样缓冲液；用洗脱液洗脱，该洗脱液包括20mM磷酸钠，0.5M咪唑，0.5M氯化钠，pH 8.0；用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液为0.01M pH 8.0的PBS，更换5次透析液，每2h换一次，用PEG20000进行浓缩，透析去除小分子，经SDS-PAGE鉴定纯度后,分装、放入-80℃冰箱备用。
本发明所述所述基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述BSaBA检测信号放大系统是由下列步骤得到的：
每孔加入100μL 0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗结合检测用鼠单克隆抗体，37℃反应1h，洗孔3-4次，按分子数摩尔比1:2-3加入100μLSaBA复合检测液结合生物素标记的羊抗鼠二抗，37℃反应30min，洗孔3-4次，加入100μL 1g/L对硝基苯磷酸盐(PNPP)37℃放置15min显色，再加入100μL 3M NaOH终止反应，使用酶标仪405nm波长测定吸光度值；
所述SaBA复合检测液制备是在pH7.4磷酸盐缓冲体系中，将链霉亲合素和碱性磷酸酶标记的生物素以分子数比1:2-3的比例混合，制得。
本发明所述所述稀释液为1％脱脂乳PBS溶液，pH 7.4。
本发明所述捕获用兔源多克隆抗体包被的酶标板制备步骤如下：
(1)用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液做为包被液，将捕获抗体稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜；
(2)取出预包被酶标板，用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；
(3)每孔加入200μL 0.1M氯化铵封闭液，37℃孵育1h；
(4)用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；
(5)吹干兔源多克隆抗体包被的酶标板，铝铂袋密封包装备用。
本发明所述血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠应用于血液中白细胞处理步骤中，具体如下：
(1)10×红细胞裂解浓贮液成份为氯化铵80g/L；碳酸氢钾10g/L；EDTA 3.7g/L，使用前平衡至37℃，稀释10倍使用；
(2)是将全血样品3000转/分钟离心15min，吸取上层血浆置于-80℃保存。向抗凝管中加入2-3倍体积37℃预热的红细胞裂解液，充分混匀并有效裂解红细胞后3000转/分钟离心10min，弃去上清，重复操作直至管底剩下单一的白细胞沉淀；加入1-0.5倍体积的Φ425-600μm玻璃珠，旋涡震荡1-3min后，63-65℃水浴5min，12000转/分钟离心1min，取上清应用常规方法测定总蛋白浓度，做好记录待检。
本发明所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒的操作方法，包括：
(1)根据待检样本的数量取出预包被酶标板，剩余酶标板放回冰箱保存，设置标准品孔、空白孔和样品孔，标准品孔加入经稀释液稀释至终浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125和3.9pg/mL 9个浓度梯度的标准品蛋白，每孔100μL，空白孔加等体积稀释液，样品孔加入待检样本，37℃孵育75min；
(2)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入检测用单克隆抗体2μg/mL，每孔100μL，37℃孵育60min；
(3)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育60min；
(4)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入SaBA复合检测液，每孔100μL，37℃孵育30min；
(5)洗涤4-5次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入1g/L PNPP底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15min，每孔加入3M NaOH终止液100μL；
(6)酶标仪读取OD405；
(7)常规方法测定待检样品总浓度C0(mg/mL)；
(8)结果判定：以空白孔OD405值调零，各标准品浓度对数为横坐标，对应浓度阳性孔OD405为纵坐标建立曲线，样品孔OD405带入标准曲线方程推算浓度对数X，10X即为待检样品中Prdx6浓度C(pg/mL)，并可以将C0和C进行单位统一换算后，计算C/C0即为相对总蛋白质量百分比浓度。
本发明所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，用于检测绵羊血清、血浆、白细胞、组织器官样品、加标样品中的Prdx6的含量以及原核表达基因工程菌中重组蛋白Prdx6的含量。
本发明建立的检测绵羊Prdx6双抗体夹心酶联免疫吸附分析方法(ELISA)并组装成易于使用的Prdx6含量测定试剂盒，为进一步研究Prdx6在机体疾病发生、发展、转归的标志作用，以及能否用于辅助区别诊断布病自然感染和疫苗免疫提供可应用的Prdx6含量测定工具。本发明为探讨Prdx6在机体生理病理状态下的变化水平提供分子检测工具，同时研究布鲁氏菌感染宿主反应分子机制及新型分子诊疗监测方法提供可应用的检测工具，对研究机体Prdx6含量变化与疾病的关系具有重要意义。
本发明的有益效果是：提供了新的红细胞裂解液和白细胞破碎方法，保证血液样品中红细胞破碎完全和白细胞总蛋白提取完全，而且适当的63-65℃温育，可有效的防止血液中可能污染的致病微生物对环境和从业人员的污染，同时并不影响白细胞总蛋白的提取效率。该双抗夹心ELISA检测试剂盒，利用生物素-亲和素特异性吸附特性，引入新的生物素-链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶(BSaBA)信号放大系统，链霉亲和素与生物素之间特异性强，亲和力高，且具有放大效应，对硝基苯磷酸盐(PNPP)相对稳定，是碱性磷酸酶比较敏感稳定的生色底物，使得检测方法敏感度显著提高，达到皮克(pg)级水平，充分体现该检测方法和试剂盒的优势。同时，以对硝基苯磷酸盐(PNPP；英文别名：Disodium 4-nitrophenylphosphate；分子式：C6H4NO6PNa2·6H20)为生色底物，该生色底物性质稳定，可一次性配制后分装放入-20℃贮存，随时取用，底物不降解，保证检测结果的准确性和重复性，较以往使用的生色底物易于降解、必须现用现配，具有明显的优势。本试剂盒所使用的抗体，可与牛、小鼠组织样品中的Prdx6结合，因此其应用的广泛性值得进一步探讨。
附图说明
图1为rOaPrdx6表达与纯化SDS-PAGE电泳分析图；
M：Marker；1：菌体上清总蛋白；2:表达菌未诱导组；3：杂蛋白流穿液；4：透析浓缩后rOaPrdx6；
图2为抗OaPrdx6单克隆抗体和多克隆抗体纯化SDS-PAGE分析图；
M：Marker；1：纯化的腹水型单抗；2：纯化的多抗；
图3为Western Blot分析制备的抗绵羊Prdx6抗体与Prdx6结合特异性图，其中：
(1)为多克隆抗体特异性分析；(2)为单克隆抗体特异性分析；
M：Marker；1：rOaPrdx6；2：诱导表达菌；3：羊外周血白细胞胞内总蛋白；
图4为Western Blot分析制备的抗绵羊Prdx6抗体与不同动物Prdx6结合特性图，其中：
(1)为多克隆抗体结合特性；(2)为单克隆抗体结合特性
不同动物Prdx6按从左至右顺序分别为：绵羊Prdx6、山羊Prdx6、牛Prdx6、小鼠Prdx6；
图5(1)为抗原作用时间优化图；
图5(2)为检测抗体作用时间优化图；
图6为标准曲线绘制图，其中：
(1)为各Prdx6浓度对应OD值；(2)为线性范围内标准曲线图。
具体实施方式
包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS-T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、3M NaOH终止液，以及血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠，其特征在于：应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，并进行封闭，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制备特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体，此单克隆抗作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。
本发明所述绵羊Prdx6重组蛋白是通过原核表达系统制备的，所述的原核表达系统是由下列步骤得到的：
(1)提取羊血液白细胞层细胞总RNA反转cDNA为模板，进行PCR扩增，获得绵羊Prdx6基因，克隆到pMD18-T-Simple载体上，之后将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组表达质粒pET-30a-OaPrdx6；
(2)将pET-30a-OaPrdx6转化至E.coli BL21-Codonplus细胞中诱导表达重组绵羊Prdx6蛋白，挑取经鉴定确证的单菌落，接种于5mL含50mg/L卡那抗性的液体LB培养基中，37℃培养2h，然后按1:500比例接种于200mL的含50mg/L卡那抗性的新鲜液体LB培养基中，37℃振荡培养1h，加终浓度0.4mM的IPTG,继续振荡培养5.5h后，离心收集菌体；
(3)菌体重悬于上样缓冲液，该缓冲液包括20mM磷酸钠，30mM咪唑，0.5M氯化钠，pH8.0，超声裂解后，10000g离心15min，取上清，经镍柱纯化，上样后继续加入约10个柱体积的上样缓冲液；用洗脱液洗脱，该洗脱液包括20mM磷酸钠，0.5M咪唑，0.5M氯化钠，pH 8.0；用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液为0.01M pH 8.0的PBS，更换5次透析液，每2h换一次，用PEG20000进行浓缩，透析去除小分子，经SDS-PAGE鉴定纯度后,分装、放入-80℃冰箱备用。
本发明所述所述基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述BSaBA检测信号放大系统是由下列步骤得到的：
每孔加入100μL 0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗结合检测用鼠单克隆抗体，37℃反应1h，洗孔3-4次，按分子数摩尔比1:2-3加入100μLSaBA复合检测液结合生物素标记的羊抗鼠二抗，37℃反应30min，洗孔3-4次，加入100μL 1g/L对硝基苯磷酸盐(PNPP)37℃放置15min显色，再加入100μL 3M NaOH终止反应，使用酶标仪405nm波长测定吸光度值；
所述SaBA复合检测液制备是在pH7.4磷酸盐缓冲体系中，将链霉亲合素和碱性磷酸酶标记的生物素以分子数比1:2-3的比例混合，制得。
本发明所述所述稀释液为1％脱脂乳PBS溶液，pH 7.4。
本发明所述捕获用兔源多克隆抗体包被的酶标板制备步骤如下：
(1)用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液做为包被液，将捕获抗体稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜；
(2)取出预包被酶标板，用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；
(3)每孔加入200μL 0.1M氯化铵封闭液，37℃孵育1h；
(4)用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；
(5)吹干兔源多克隆抗体包被的酶标板，铝铂袋密封包装备用。
本发明所述血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠应用于血液中白细胞处理步骤中，具体如下：
(1)10×红细胞裂解浓贮液成份为氯化铵80g/L；碳酸氢钾10g/L；EDTA 3.7g/L，使用前平衡至37℃，稀释10倍使用；
(2)是将全血样品3000转/分钟离心15min，吸取上层血浆置于-80℃保存。向抗凝管中加入2-3倍体积37℃预热的红细胞裂解液，充分混匀并有效裂解红细胞后3000转/分钟离心10min，弃去上清，重复操作直至管底剩下单一的白细胞沉淀；加入1-0.5倍体积的Φ425-600μm玻璃珠，旋涡震荡1-3min后，63-65℃水浴5min，12000转/分钟离心1min，取上清应用常规方法测定总蛋白浓度，做好记录待检。
本发明所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒的操作方法，包括：
(1)根据待检样本的数量取出预包被酶标板，剩余酶标板放回冰箱保存，设置标准品孔、空白孔和样品孔，标准品孔加入经稀释液稀释至终浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125和3.9pg/mL 9个浓度梯度的标准品蛋白，每孔100μL，空白孔加等体积稀释液，样品孔加入待检样本，37℃孵育75min；
(2)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入检测用单克隆抗体2μg/mL，每孔100μL，37℃孵育60min；
(3)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育60min；
(4)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入SaBA复合检测液，每孔100μL，37℃孵育30min；
(5)洗涤4-5次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入1g/L PNPP底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15min，每孔加入3M NaOH终止液100μL；
(6)酶标仪读取OD405；
(7)常规方法测定待检样品总浓度C0(mg/mL)；
(8)结果判定：以空白孔OD405值调零，各标准品浓度对数为横坐标，对应浓度阳性孔OD405为纵坐标建立曲线，样品孔OD405带入标准曲线方程推算浓度对数X，10X即为待检样品中Prdx6浓度C(pg/mL)，并可以将C0和C进行单位统一换算后，计算C/C0即为相对总蛋白质量百分比浓度。
本发明所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，用于检测绵羊血清、血浆、白细胞、组织器官样品、加标样品中的Prdx6的含量以及原核表达基因工程菌中重组蛋白Prdx6的含量。
下边通过具体实验例进一步说明本发明及效果。
实验例1绵羊Prdx6重组蛋白制备
1)制备用于扩增绵羊Prdx6基因编码区序列引物：
Prdx6-S:5/–CATATGCCCGGAGGTCTCCTCCTCG–3/；
Prdx6-HisA:5/–CTCGAGTGGCTGGGGTGTGTAGCGGAG–3/
2)提取绵羊外周血淋巴细胞总RNA，逆转录为cDNA作为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：预变性95℃2分钟，变性93℃50秒，退火60℃45秒，延伸72℃1分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟，经琼脂糖凝胶电泳验证，获得目的基因并克隆至pMD-18T-simple载体上得到pMD-18T-OaPrdx6，应用限制性内切酶Nde I和Xho I对pMD-18T-OaPrdx6和pET-30a进行双酶切反应，将酶切后得到的OaPrdx6编码区DNA片段与表达载体pET-30a连接构建重组表达质粒pET-30a-OaPrdx6；
3)将重组表达质粒pET-30a-OaPrdx6转化至E.coli BL21(DE3)Codonplus表达菌中进行终浓度0.4M表达，进行亲和层析，纯化得到重组绵羊Prdx6蛋白(rOaPrdx6)，见图1。
实验例2抗绵羊Prdx6多克隆抗体的制备
1)第一次免疫吸取蛋白量为1mg rOaPrdx6蛋白与等体积完全佐剂混合并乳化，将乳化液滴入水中，若液滴能够完整的浮于水面，即判定为乳化完全，可以用于免疫；
2)新西兰大白兔背部皮下多点免疫，免疫后轻轻按压注射点，使乳化剂散开；
3)15天为一个免疫周期，二免使用不完全佐剂制备乳化免疫原用于免疫，方法同上；
4)三免之后，每次免疫7天后测血清效价，效价理想心脏采血，收集待检血清纯化，见图2。
5)常规蛋白杂交Westen Blot技术分析证明，所制备的抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体可与绵羊、山羊、牛、小鼠组织中天然Prdx6蛋白发生特异性结合，见图3和图4。
实验例3抗绵羊Prdx6单克隆抗体的收集与纯化
1)细胞株复苏
A.冻存细胞株从液氮中取出，置于37℃温水中融化；
B.细胞株1000rpm离心5min，弃上清；
C.含20％胎牛血清的1640培养基重悬细胞后转入细胞培养瓶并添加适量培养基；
D.观察细胞状态，及时换液传代；
2)腹水型单抗的制备
A.经产Balb/C鼠，腹腔注射高压灭菌的液体石蜡0.5mL，常规饲养备用；
B.在注射石蜡后七天左右，选择生长状态良好细胞瓶内的细胞，用基础培养基将细胞吹下转入15mL离心管中，1000rpm离心5min，适量基础培养基重悬使细胞浓度在106个/mL左右，小鼠腹腔注射细胞悬液1mL，常规饲养；
C.小鼠腹围达到一定程度后采集腹水，12000rpm离心30min，取透明上清纯化，见图2；
3)常规蛋白杂交Westen Blot技术分析证明，所制备的抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体可与绵羊、山羊、牛、小鼠组织中天然Prdx6蛋白发生特异性结合，见图3和图4。
实验例4棋盘法确定最佳抗体对工作浓度
用包被液分别将多抗倍比稀释到终浓度为4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，并按照浓度梯度加入到酶标孔中，每一纵排为同一浓度多抗稀释液，在4℃条件下包被过夜；用0.1M氯化铵溶液封闭，200μL/孔，37℃1h；1％脱脂乳PBS稀释rOaPrdx6蛋白到终浓度为1μg/mL，加入到酶标板中，设立每组抗体对组合工作浓度的空白对照；PBS倍比稀释单抗到终浓度为8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL，并按照浓度梯度加入到酶标孔中，每一横排为同一浓度单抗稀释液，在37℃条件下反应1h；1:4000比例稀释生物素标记二抗100μL/孔，37℃反应1h；再加入100μL/孔的SaBA复合检测液，室温反应30min，加入1g/L PNPP 100μL/孔37℃放置15min显色，加入100μL/孔3M NaOH终止反应，使用酶标仪405nm波长测定吸光度(OD405)，选择P/N最大抗体对组合，见表1和表2；
表1
表2
实验例5抗原作用时间与检测抗体作用时间的优化
抗原作用时间设置45min、60min、75min、90min和120min五个时间段梯度,检测抗体作用时间设置30min、45min、60min、75min和90min五个时间段梯度。设定阳性孔OD值为P，阴性孔OD值为N，选择P/N值最高的抗原作用时间与检测抗体作用时间，见图5。
实验例6绵羊Prdx6双抗体夹心BSaBA-ELISA标准曲线的构建
稀释液稀释rOaPrdx6标准品到终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125和3.9pg/mL，这8个浓度的标准品用作标准曲线的建立，并设置空白孔。绘制出双抗体夹心ELISA标准曲线，其中以空白孔调零，标准品rOaPrdx6抗原的浓度对数作为横坐标，以检样孔OD值作为纵坐标，绘制标准曲线。对测定数据进行回归分析，得出回归方程和标准曲线。根据标准曲线图可见所制备的基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒检测敏感性达pg级水平，见表3和图6。
表3
实验例7本试剂盒提供血液样品中白细胞总蛋白检样的处理方法与步骤
1)红细胞裂解液的选择：
比较分析两种红细胞裂解液(红细胞裂解液A和红细胞裂解液B)破坏红细胞且保护白细胞的效果，最终确定最优红细胞裂解液配方。红细胞裂解液A：0.5％NP-40、15mMNaCl、5mM EDTA、1mM PMSF、50mM Tris.Cl(pH 6.8)；红细胞裂解液B：8g/L氯化铵、1g/L碳酸氢钾、0.37g/L EDTA。根据实验结果确定本专利所使用的红细胞裂解液配方为8g/L氯化铵、1g/L碳酸氢钾、0.37g/L EDTA，见表4；
表4
比较分析五种白细胞破碎方法及细胞破碎后处理条件对白细胞总蛋白提取效率影响，最终确定最优白细胞破碎处理方法。优化以下五种白细胞破碎方法，A：反复冻融；B：淋巴细胞裂解液；C：超声；D：SDS；E：玻璃珠；优化以下五种细胞破碎后处理条件，A：瞬时离心；B：5000rpm离心1min；C：12000rpm离心1min；D：65℃温育5min，5000rpm离心1min；E：91℃温育16s，5000rpm离心1min。根据实验结果确定本专利所使用的白细胞破碎方法为加入1-0.5倍体积的Φ425-600μm玻璃珠，旋涡震荡1min后(可适当延长至2-3min，不影响检测结果)，63-65℃水浴5min，12000rpm离心1min，取上清为白细胞总蛋白，见表5；
表5
3)最终得到规范处理血液样本获得循环血白细胞检测样品流程，即血液中白细胞样品处理步骤是将全血样品3000rpm离心15min后吸取上层血浆置于-80℃保存。向抗凝管中加入2-3倍体积37℃预热的红细胞裂解液，充分混匀并有效裂解红细胞后3000rpm离心10min，弃去上清，重复操作直至管底剩下肉眼可见单一的白细胞沉淀。加入1-0.5倍体积的Φ425-600μm玻璃珠，旋涡震荡1min后(可适当延长至2-3min，不影响检测结果)，63-65℃水浴5min，12000rpm离心1min，取上清常规方法测定总蛋白浓度，做好记录待检，见表6。
表6
实验例8一种绵羊Prdx6双抗体夹心BSaBA-ELISA检测试剂盒的组装与性能评价
按常规方法将抗OaPrdx6兔源多抗包被液加入酶标板，4℃过夜，PBS-T洗板3次，每次1min；1％NH4Cl 37℃封闭60min，弃封闭液，37℃干燥，真空包装并注明批号。根据实施例4～7优化后绵羊Prdx6双抗体夹心BSaBA-ELISA检测最佳反应条件和试剂，进行试剂盒组装，其中包括rOaPrdx6标准品、稀释液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L PNPP底物显色液、3M NaOH终止液、20×PBS-T浓缩洗涤液、10×红细胞裂解液、Φ425-600μm玻璃珠、抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、密封袋，试剂盒中试剂组成清单、操作方法与说明等，对组装完成的试剂盒按照常规方法实施进一步性能评价。主要性能评价指标包括准确性评价、重复性评价(批内重复性和批间重复性)、灵敏度评价、试剂盒保质期分析(捕获抗体破坏实验、标准品破坏实验和检测抗体破坏实验)。最终确定组装的绵羊Prdx6双抗体夹心BSaBA-ELISA检测试剂盒与其原检测方法各项指标相当，有效期1年。
实验例9一种绵羊Prdx6双抗体夹心BSaBA-ELISA检测试剂盒的应用
1)根据待检样本的数量取出适量预包被酶标板，剩余酶标板装入密封袋放回2-8℃冰箱保存。设置标准品孔、空白孔和样品孔。标准品孔加入经稀释液稀释至终浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125和3.9pg/mL 9个浓度梯度的标准品蛋白，每孔100μL，空白孔加等体积稀释液，样品孔加入待检样本，37℃孵育75min；
2)洗涤3次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入稀释后检测单抗(2μg/mL)，每孔100μL，37℃孵育60min；
3)洗涤3次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入生物素标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育60min；
4)洗涤3次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入SaBA复合检测液，每孔100μL，37℃孵育30min；
5)洗涤4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入PNPP底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15min，每孔加入3M NaOH终止液100μL；
6)酶标仪读取OD405；
7)常规方法测定待检样品总浓度C0(mg/mL)
8)结果判定：以空白孔OD405值调零，各标准品浓度对数为横坐标，对应浓度阳性孔OD405为纵坐标建立曲线，样品孔OD405带入标准曲线方程推算浓度对数X，10X即为待检样品中Prdx6浓度C(pg/mL)，将C0和C进行单位统一换算后，计算C/C0即为相对总蛋白质量百分比浓度。

Claims (8)

1.一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，包括抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体预包被酶标板、绵羊Prdx6重组蛋白标准品、稀释液、20×PBS-T浓缩洗涤液、检测用单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠二抗、SaBA复合检测液、1g/L的对硝基苯磷酸盐PNPP底物显色液、3M NaOH终止液，以及血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠，其特征在于：应用制备的绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制得特异性抗绵羊Prdx6兔源多克隆抗体，其作为捕获抗体包被于酶标板，并进行封闭，利用绵羊Prdx6重组蛋白作为标准品，以绵羊Prdx6重组蛋白作为免疫原制备特异性抗绵羊Prdx6鼠源单克隆抗体，此单克隆抗作为检测抗体，及BSaBA检测信号放大系统，组装成绵羊Prdx6含量测定试剂盒。
2.根据权利要求1所述的基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于绵羊Prdx6重组蛋白是通过原核表达系统制备的，所述的原核表达系统是由下列步骤得到的：
(1)提取羊血液白细胞层细胞总RNA反转cDNA为模板，进行PCR扩增，获得绵羊Prdx6基因，克隆到pMD18-T-Simple载体上，之后将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组表达质粒pET-30a-OaPrdx6；
(2)将pET-30a-OaPrdx6转化至E.coli BL21-Codonplus细胞中诱导表达重组绵羊Prdx6蛋白，挑取经鉴定确证的单菌落，接种于5mL含50mg/L卡那抗性的液体LB培养基中，37℃培养2h，然后按1:500比例接种于200mL的含50mg/L卡那抗性的新鲜液体LB培养基中，37℃振荡培养1h，加终浓度0.4mM的IPTG,继续振荡培养5.5h后，离心收集菌体；
(3)菌体重悬于上样缓冲液，该缓冲液包括20mM磷酸钠，30mM咪唑，0.5M氯化钠，pH8.0，超声裂解后，10000g离心15min，取上清，经镍柱纯化，上样后继续加入约10个柱体积的上样缓冲液；用洗脱液洗脱，该洗脱液包括20mM磷酸钠，0.5M咪唑，0.5M氯化钠，pH 8.0；用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液为0.01M pH 8.0的PBS，更换5次透析液，每2h换一次，用PEG20000进行浓缩，透析去除小分子，经SDS-PAGE鉴定纯度后,分装、放入-80℃冰箱备用。
3.根据权利要求1所述基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述BSaBA检测信号放大系统是由下列步骤得到的：
每孔加入100μL 0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗结合检测用鼠单克隆抗体，37℃反应1h，洗孔3-4次，按分子数摩尔比1:2-3加入100μLSaBA复合检测液结合生物素标记的羊抗鼠二抗，37℃反应30min，洗孔3-4次，加入100μL 1g/L对硝基苯磷酸盐(PNPP)37℃放置15min显色，再加入100μL 3M NaOH终止反应，使用酶标仪405nm波长测定吸光度值；
所述SaBA复合检测液制备是在pH7.4磷酸盐缓冲体系中，将链霉亲合素和碱性磷酸酶标记的生物素以分子数比1:2-3的比例混合，制得。
4.根据权利要求1所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述稀释液为1％脱脂乳PBS溶液，pH 7.4。
5.根据权利要求1所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：捕获用兔源多克隆抗体包被的酶标板制备步骤如下：
(1)用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液做为包被液，将捕获抗体稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜；
(2)取出预包被酶标板，用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；
(3)每孔加入200μL 0.1M氯化铵封闭液，37℃孵育1h；
(4)用PBS-T洗涤液洗孔3-4次，200μL/孔，每次1min；
(5)吹干兔源多克隆抗体包被的酶标板，铝铂袋密封包装备用。
6.根据权利要求1所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于：血液样品预处理用的10×红细胞裂解液浓贮液和Φ425-600μm玻璃珠应用于血液中白细胞处理步骤中，具体如下：
(1)10×红细胞裂解浓贮液成份为氯化铵80g/L；碳酸氢钾10g/L；EDTA3.7g/L，使用前平衡至37℃，稀释10倍使用；
(2)是将全血样品3000转/分钟离心15min，吸取上层血浆置于-80℃保存。向抗凝管中加入2-3倍体积37℃预热的红细胞裂解液，充分混匀并有效裂解红细胞后3000转/分钟离心10min，弃去上清，重复操作直至管底剩下单一的白细胞沉淀；加入1-0.5倍体积的Φ425-600μm玻璃珠，旋涡震荡1-3min后，63-65℃水浴5min，12000转/分钟离心1min，取上清应用常规方法测定总蛋白浓度，做好记录待检。
7.如权利要求1所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒的操作方法，包括：
(1)根据待检样本的数量取出预包被酶标板，剩余酶标板放回冰箱保存，设置标准品孔、空白孔和样品孔，标准品孔加入经稀释液稀释至终浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125和3.9pg/mL 9个浓度梯度的标准品蛋白，每孔100μL，空白孔加等体积稀释液，样品孔加入待检样本，37℃孵育75min；
(2)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入检测用单克隆抗体2μg/mL，每孔100μL，37℃孵育60min；
(3)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入0.4-0.5μg/mL生物素标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育60min；
(4)洗涤3-4次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入SaBA复合检测液，每孔100μL，37℃孵育30min；
(5)洗涤4-5次，每次1min，标准品孔、空白孔和样品孔均加入1g/L PNPP底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15min，每孔加入3M NaOH终止液100μL；
(6)酶标仪读取OD405；
(7)常规方法测定待检样品总浓度C0(mg/mL)；
(8)结果判定：以空白孔OD405值调零，各标准品浓度对数为横坐标，对应浓度阳性孔OD405为纵坐标建立曲线，样品孔OD405带入标准曲线方程推算浓度对数X，10X即为待检样品中Prdx6浓度C(pg/mL)，并可以将C0和C进行单位统一换算后，计算C/C0即为相对总蛋白质量百分比浓度。
8.如权利要求1所述的一种基于BSaBA信号放大系统的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于用于检测绵羊血清、血浆、白细胞、组织器官样品、加标样品中的Prdx6的含量以及原核表达基因工程菌中重组蛋白Prdx6的含量。
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