CN104704361A - 线粒体毒性检测 - Google Patents
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Abstract
一种在药物筛选中有用的新方法。该方法对于检测物质对线粒体的作用,尤其是药物物质或候选药物物质的毒性或有益作用是有用的。该方法是基于活的人线粒体体外测量,但是在尽可能接近体内状态的环境中。该方法还可用于检测物质对线粒体呼吸的作用。该方法可以用于i)在来自健康个体的血液或所谓的血沉棕黄层(其是血小板和白血细胞的浓溶液)中的细胞中筛选并选择早期或晚期阶段的药物候选物,ii)检测患者对于已知的线粒体毒物的敏感性,iii)在临床试验中分析线粒体药物毒性,和/或iv)分析预期改善线粒体的功能的药物的有益作用。
Description
技术领域
本发明提供了用于药物筛选的新方法。特别地,该方法对于检测物质对线粒体的作用,尤其是药物物质或候选药物物质的毒性或有益作用是有用的。该方法是基于体外活的人线粒体中的测量,但是在尽可能接近体内状态的环境中。该方法还可用于检测物质对线粒体呼吸的影响。
背景技术
在药物开发中,难以估计当在人体中使用时,药物是否会影响产生能量的线粒体。由于如心脏或肝毒性作用,近年来由FDA批准的多种新药随后被撤回。因此,在1994年和2006年之间由FDA登记的新药中,38种药物均由于对肝和心脏的毒性作用被撤回,这是线粒体毒性的典型症状。显然,这些新药通过了批准以前进行的标准毒性检测,并且在用药物治疗了大量患者之后才观察到毒性作用。Dykens&Will(2007)指出,有证据表明,线粒体功能障碍在从市场上撤回的以及再次引入的具有严格限制的多种药物物质的毒性中起作用。
此外,在近几年,线粒体功能已经引起了很大的兴趣,并且通常认为线粒体功能障碍对于大量疾病的发病机制(例如肌肉疾病、神经病变、心肌病、脑病、败血症引起的多脏器功能衰竭)是起作用的因素。
目前,药物候选物的线粒体毒性大部分是在动物和细胞培养物中进行评价,其结果难以转化为未来的人类应用。
因此,存在对于开发用于线粒体毒性的检测(其是敏感的、可重复的、可靠的和容易的,并且其可以用于药物开发的检测)的需要。
发明内容
本发明涉及涉及含有线粒体的人血液成分的方法。开发的方法的优点是体外测量活的人线粒体中的药物毒性(或有益的影响),但是在尽可能接近体内的环境中。研究了血浆(这提供与体内环境非常接近的关联)中含线粒体的的人血液成分(白血细胞和/或血小板)。因此,所有的缓冲能力、血清白蛋白、电解质、水解酶等在测量期间存在。
该新颖的方法将直接导致人体中真实的毒性血液浓度的评估,这在作为当前使用方法的细胞培养和动物研究中是不可能的。因此,在相比现在显著更早的阶段检测和筛选候选药物物质的人类毒性是可能的。反过来,这将允许在更早的阶段排除有毒的候选药物,从而避免许多动物试验以及将来人的痛苦。这将促进在早期阶段选择候选药物物质,从而降低药物开发的总的时间和成本。
取决于试验的目的,该方法可用于具有不同的设定的不同环境。
因此,根据本发明的方法可用于以下各项,而不将范围限制于此:
1.筛选并选择来自健康个体血液或所谓的血沉棕黄层(buffy coat)(其是血小板和白血细胞的浓缩溶液)的细胞中的早期或晚期阶段的候选药物。
2.检测患者对于已知的线粒体毒物(mitochondrial toxicant)的敏感性。
3.在临床试验中分析线粒体药物毒性。
4.分析预期改善线粒体功能的药物的有益作用。
一种合适的用于筛选和选择候选药物或检测人对作用于线粒体的物质的敏感性(即,上面的项目1和2)的方法是包括以下(步骤):
i)使分离自人血液样品的含有活线粒体(live mitochondria)的细胞样品进行高分辨率呼吸测量(high-resolution respirometry)
ii)使细胞样品与提高线粒体内膜对质子的渗透性的物质接触,
ⅲ)加入包含介质(载体、媒介物,vehicle)中的检测物质的检测样品,
ⅳ)比较加入检测样品之前和之后的耗氧量(氧消耗)并且比较检测样品耗氧量与介质的对照样品的耗氧量,其中,耗氧量下降表明对线粒体的负面作用,
v)使来自iii)的样品与线粒体复合物I-功能抑制剂,如鱼藤酮接触,以表明依赖于复合物II-底物氧化的细胞呼吸,
和
vi)使来自v)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂,如抗霉素A接触以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化(auto-oxidation)。
用于筛选和选择潜在的候选药物或用于检测人对具有线粒体作用的物质的灵敏性(即,上面的项目1和2)的替代方案,是研究这类检测物质在复合物II筛选试验中的效果。在图11中示出了这种方法,并且包括:
i)使分离自人血液样品的含有活线粒体的细胞样品进行高分辨率呼吸测量,
ⅱ)使细胞样品与抑制复合物I呼吸的物质接触,
ⅲ)加入包含介质中的检测物质的检测样品,
ⅳ)加入使质膜透化(permeabilize)的物质,
ⅴ)将参比物质加入至iv)中得到的样品,以及
vi)加入抑制复合物III呼吸作用的物质。
比较检测的结果与由该方法获得的结果,其中,使用的检测物质与参比物质是相同的。在图11中示出了典型的结果,这表明候选药物能够,在一定程度上渗入质膜(即,实现呼吸的增加)。加入洋地黄皂苷(digitonin),这使得质膜是可渗透的,并不导致呼吸的进一步增加,即没有来自检测物质的进一步的作用。当加入参比物质(复合物II相关的底物(complex II-linked substrate),如琥珀酸)时,这通常是一种内源性底物,如琥珀酸盐,观察到呼吸增加并且实现最大容量(capacity)。然后将复合物III如抗霉素A加入,以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化。
与来自参比物质(其是内源性底物,如琥珀酸)的结果比较可以看出参比物质并不会渗透质膜。只有当例如使用洋地黄皂苷使膜透化时,呼吸才增加。进一步加入内源性物质并不改变呼吸,而加入复合物III抑制剂则阻断了线粒体呼吸。
用检测物质所观察到的图像明显地不同于图11中所示的图像。方法提供了有关检测物质是否能渗透质膜并且以积极方式影响线粒体耗氧活性(即,增加复合物II线粒体呼吸)的有价值的信息。因此,最理想的检测物质具有比a'高的水平(level)a,并且在这种情况下,水平a是水平b'或接近水平b'。在本文实施例中给出了更详细的描述。
另一种方法是研究检测物质对复合物I、复合物II和/或复合物IV呼吸的影响。通过研究复合物I、II和/或IV呼吸作用,可以获得关于特定物质对线粒体呼吸的影响的更多细节并且从而评价对于线粒体功能的任何正面或负面影响。图14示出了升高浓度的二甲双胍对复合物I、II和IV线粒体呼吸的影响。图中示出了随着二甲双胍浓度的增加,复合物I呼吸的特定的功能障碍,而复合物II和IV呼吸作用似乎不受影响。
通过随后加入ADP以及之后的额外的复合物I底物谷氨酸盐(见图3)以及之后加入升高量的检测物质(例如,二甲双胍)刺激复合物I的呼吸(OXPHOSCI)。
通过将复合物I抑制剂(例如,鱼藤酮)加入至细胞样品随后加入增加量的检测物质实现复合物II呼吸作用。
通过将N,N,N',N'-四甲基-对苯二胺(TMPD,0.5mM)电子供体加入至复合物IV实现复合物IV呼吸作用。由于TMPD的高水平的自动氧化,加入叠氮化钠(10mM),复合物IV抑制剂,将获得的这两种水平之间的差计算为特定的复合物IV活性。
一种用于研究候选药物在临床试验或在治疗方案(即,以上项目3和4)中对线粒体的作用的合适的方法是包括以下各项的方法:
i)使分离自人血液样品的含有活线粒体的细胞样品进行高分辨率呼吸测量,其中,细胞样品来自进行临床研究或进行治疗方案的个体,并且其中,在临床研究或治疗方案期间,检测物质已给予个体,
ii)使细胞样品与提高线粒体内膜对质子的渗透性的物质接触,
ⅲ)比较来自进行临床研究或治疗方案的个体的样品的耗氧量与来自对照组的对照样品的耗氧量,其中,耗氧量的下降表明对线粒体的负面作用,
iv)使来自iii)的样品与线粒体复合物I-功能抑制剂,如鱼藤酮接触,以表明依赖于复合物II-底物氧化的细胞呼吸,
和
v)使来自iv)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂,如抗霉素A接触以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化。
如从上面所看到的,这些方法几乎是相同的,仅变化了所检测的样品,即该样品是检测物质还是进行临床试验或治疗方案的个体的细胞样品。根据临床试验或治疗方案,进行临床试验或治疗方案的个体接受检测或药物物质或潜在药物物质。这意味着,分离自该个体的血液样品的线粒体已暴露于所讨论的药物物质或潜在的药物物质,并且因此,通过本文描述的方法可以观察这类物质对线粒体呼吸的任何影响。
线粒体呼吸后使用呼吸测量法(测量)。在本文的实例中描述了合适的设置,但是如果需要的话,本领域技术人员将知道如何改变,或者调整设置,或者是否使用另一装置。
血液样品可以是静脉血液样品。可以分离和使用血小板或白血细胞,或它们的组合。
增加线粒体内膜对质子的渗透性的物质的合适的实例是羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)、羰基氰间-氯苯腙(CCCP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)或另一质子载体(protonophore)。
在本文的实例和所附权利要求中给出了有关这些方法的进一步的细节。
下面给出了关于以上方法的细节。
1.筛选并选择来自健康个体的血液或所谓的血沉棕黄层(其是血小板和白血细胞的浓缩溶液)的细胞中的早期或晚期阶段的候选药物
这种方法包括:
ⅰ)使分离自人静脉血液样品的含有活线粒体的细胞样品在37℃恒定温度,在400至25μM O2范围的氧浓度下进行高分辨率呼吸测量
ⅱ)使细胞样品与提高线粒体内膜对质子渗透性的物质,如羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)、羰基氰间-氯苯腙(CCCP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)或另一质子载体接触以获得存在于血小板中的线粒体的电子传递系统(electron transport system)的最大容量(capacity)。
ⅲ)加入包含介质中的检测物质的检测样品;相比于介质加入,通常以逐步增加的剂量加入,
ⅳ)比较加入检测样品之前和之后的耗氧量并且比较检测和介质之间的耗氧量,其中,耗氧量下降表明对线粒体的负面作用,
v)使来自iii)的样品与线粒体复合物I功能抑制剂,如鱼藤酮接触,以表明依赖于复合物II-底物氧化的细胞呼吸,
和
vi)使来自v)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂,如抗霉素A接触以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化,
下降可能是显著的或剂量依赖性的。
如上面提到的,人血液样品来自健康个体。通常,如本文实施例所描述的获得样品。细胞通常是血小板或白血细胞或它们的组合。
细胞可以在人血浆(在某些情况下,受试者自己的血浆)中悬浮,或者它们可以在,含有例如蔗糖、HEPES、K-乳糖酸盐(K-lactobionate)、氯化镁、磷酸二氢钾、EGTA和BSA的含水缓冲液或其它合适的缓冲液中悬浮。pH通常调节至pH 7.0至7.5之间,特别是7.1。通常,对于完整的血小板或白血细胞,溶解在血浆中是优选的以尽可能模拟体内环境。然而,在某些情况下,或作为对血浆溶解液的补充,可以使用加入5mM葡萄糖的磷酸缓冲盐(可用于与血浆组比较),或更多细胞内类型的含Kreb循环中间体的缓冲液用于透化血小板或白血细胞。细胞内类型可以用于透化血小板(和WBC)并且,其中,线粒体呼吸底物可以过量存在(以可饱和的量)以便最大化电子传递并增加测定的分辨率。
从人血液样品获得的细胞可以完整地或透化地进行检测。
取决于使用完整的还是透化的血小板或白血细胞(SUIT方案-底物-解偶联剂-抑制剂滴定(SUIT protocol-Substrate-Uncoupler-InhibitorTitration)),使用不同的试验方案。通常使用完整血小板或白血细胞。在一个试验中,使用透化的血小板或白血细胞以尽可能多地收集不同的呼吸复合物的容量信息。血小板的透化是通过将细胞施加至使细胞的质膜对底物和ADP可渗透的洋地黄皂苷或其它物质而进行的。其它物质可以是皂苷或Triton-x(曲拉通-x)。如从本文的实例可看出的,发现洋地黄皂苷的最佳剂量是1μg/1x106血小板。
通常将细胞以200x 106/ml至400x 106/ml的浓度悬浮于装置的玻璃室(glass chamber)中。
检测样品可以以升高的浓度加入数次以识别对线粒体产生不利作用(即毒性作用)的最小浓度。检测物质的初始和最终浓度取决于该物质的效力,但一般会在亚微摩尔至毫摩尔的范围内。
因此,该方法可以用于确定哪些剂量水平是安全的以及哪些是不安全从而应该避免的。
该方法也可以用于彼此比较两种或更多种药物物质或候选药物物质以识别具有最安全曲线(最安全谱)的物质。因此,用研究中的(一种或多种)其它物质重复该方法并且比较获得的结果。相比正常水平具有最小的呼吸作用下降的物质是有关线粒体毒性作用的最安全的物质。
图7-9示出了这种比较的结果。图7示出了从使用抗糖尿病药的两个试验中获得的结果;一个试验涉及用药物物质曲格列酮滴定,以及另一试验使用罗格列酮。图7清楚地表明,有关线粒体毒性,罗格列酮是比曲格列酮更安全的药物物质。曲格列酮由于毒性作用已经不再存在于市场上。
图8示出了从使用米诺环素和多西环素的两个试验获得的结果,结果表明多西环素比米诺环素更安全。
图9示出了从使用西立伐他汀和辛伐他汀(simvastatin)的两个试验获得的结果,结果表明辛伐他汀比西立伐他汀更安全。事实上,西立伐他汀已经撤出市场,而辛伐他汀仍然存在于市场上。
加入羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP),或增加线粒体内膜对质子的渗透性的另一物质以获得存在于血小板中的线粒体的电子传递系统的最大容量。如从本文的实施例看出的,约5μM至约100μM的浓度产生合适的反应。当将血浆用于溶解血小板团时,发现最佳浓度是约100μM,合适的范围是约50μM至约200μM,并且当使用磷酸盐缓冲液时(PBS),较低的浓度是最佳的,即约6μM,2μM至约20μM范围。
在加入检测物质后的适当的时间点(例如,从1到10分钟),顺序加入复合物I(CI)抑制剂,例如鱼藤酮和复合物III(CIII)抑制剂,如抗霉素-A以抑制电子传递系统(ETS),提供残留的、非线粒体耗氧量,在进一步分析中从不同的呼吸参数中减去该耗氧量。该方法能够评价特定的线粒体呼吸,并且也可以揭示检测的化合物的自动氧化特性。
以对应于样品中约2μM以及约1μM至约5μM范围终浓度的量加入鱼藤酮。如果使用另一复合物I抑制剂,最终浓度应具有导致与使用鱼藤酮相同效果的尺度。
以对应于样品中约1μg/ml以及约0.1μg/ml至约10μg/ml范围终浓度的量加入抗霉素-A。如果使用另一复合物III抑制剂,最终浓度应该具有导致与使用抗霉素-A相同效果的尺度。
通常在鱼藤酮后加入抗霉素-A,以便确定复合物I抑制后的复合物II活性。
由本发明的实施例和所述权利要求书可清楚地了解试验的细节。
2.检测患者对于已知的线粒体毒物的敏感性。
如今注册并使用了多种已知的线粒体毒物(线粒体毒性剂)。然而,在药物治疗开始之前,医生想知道患者是否对这些药物敏感。一个实例是被广泛使用的抗癫痫药丙戊酸,如果给予不合适的患者,该药物可能会导致严重的脑或肝损伤。
这样的方法本质上与上面的项目1)所述的相同。该方法包括
i)使分离自人静脉血液样品的含有活线粒体的细胞在37℃恒定温度,在400至25μM O2范围的氧浓度下进行高分辨率呼吸测量,
ii)使细胞样品与羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP),或增加线粒体内膜对质子的渗透性的另一物质接触以获得存在于血小板中的线粒体电子传递系统的最大容量,
iii)相比介质加入,以逐步增加的剂量加入检测样品
iv)比较加入检测样品之前和之后的耗氧量,其中,耗氧量下降表明对线粒体的负面作用,
v)使得来自iv)的样品与线粒体复合物I-功能抑制剂,如鱼藤酮接触,以表明依赖于复合物II-底物氧化的细胞呼吸,
和
vi)使来自v)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂,如抗霉素A接触以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化。
本文中,人血液样品取自经历用特定药物物质或候选药物物质进行特定治疗的患者,并且检测样品包含特定的药物物质或候选药物物质。
如上面项目1)描述的,检测样品可以以升高的浓度加入数次以识别对线粒体产生不利作用(即毒性作用)的最小浓度。检测物质的初始和最终浓度取决于该物质的效力,但一般最多是通过(through)或稳定状态的10倍以构成组织中的药物积累。
因此,该方法可以用于确定哪些剂量水平是安全的以及哪些是不安全从而应该避免的。
该方法还可以用于确定,在一系列可能性中应该选择哪种药物物质给予特定患者。因此,该方法可以涉及彼此比较两种或更多种药物物质或候选药物物质以鉴别在所研究患者中具有最安全曲线的物质。因此,用其它物质重复该方法并且比较获得的结果。对于所讨论的患者,相比正常水平具有最小的呼吸作用下降的物质是有关线粒体毒性作用的最安全的物质。
所有有关所述方法的各个部分的细节如上文所描述的并且对其进行引用。
3.在临床试验中分析线粒体药物毒性。
临床试验可以是任何试验,例如剂量探索研究(dose-finding study),人体安全性研究等,并且方法是基于简单的血液采样。短期急性作用,长期慢性作用都可以进行评价。突出的实例是HIV药物,长期使用后,它可以带来线粒体障碍的症状(由于线粒体DNA耗尽)。至此,本发明方法的一大优势是能够测定药物物质的结合毒性以及受试者血浆中它的循环代谢产物。
这样的方法与上面描述的基本相同,但人血液样品取自本研究招募的受试者以及作为对照组的健康的个体。因此,受试者在血液取样前已经接受了药物物质或潜在药物物质。在整个治疗方案或临床研究期间,通过规律地从所讨论受试者中采集血液样品,进行线粒体呼吸(测定)。
因此,这类方法更具体地包括:
i)使分离自人静脉血液样品的含有活线粒体的细胞在37℃恒定温度,在400至25μM O2范围的氧浓度下进行高分辨率呼吸测量,其中,人血液样品获得自进行临床研究或治疗方案的受试者,并且其中,在临床研究或治疗方案期间,检测物质已经给予受试者,
ii)使细胞样品与羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP),或增加线粒体内膜对质子的渗透性的另一物质接触以获得存在于血小板中的线粒体电子传递系统的最大容量,
iii)比较来自进行临床研究,或治疗方案的个体的人血液样品的耗氧量与来自对照组的个体的人血液样品的耗氧量,其中,相比于对照,耗氧量的下降表明对线粒体的负面作用,
iv)使来自ii)的样品与线粒体复合物I-功能抑制剂,如鱼藤酮接触,以表明依赖于复合物II-底物氧化的细胞呼吸,
和
v)使来自iv)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂,如抗霉素A接触以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化。
在本发明上下文中,临床研究可以是任何研究,包括临床前研究和长期的安全性研究。如从上面所看到的,个体也可以是患有疾病或病症的患者,并且经受采用一种或多种药物物质或候选药物物质的治疗方案。
样品可以来自一个个体或者可以是来自多个个体的汇集样品。在一些情况下,血浆收集自在临床试验或其他方面中用药物进行治疗的患者。血浆应当离心并可以冷冻保存直到进行分析。血浆包含母体药物(parentdrug)以及药物代谢物(其与母体药物一样或比母体药物对线粒体毒性更大)。血浆应该解冻并且健康的血小板或白血细胞(WBC)可以浸没在该血浆中以观察它是否会影响线粒体功能,使用该方法存在多个好处,包括不需要将来自临床试验的血液急切运输而用于分析。
所有有关本方法的各个部分的细节如本文所描述的并且对其进行参考。
4.分析预期改善线粒体功能的药物的有益作用
可以在衍生自健康个体的血液或血沉棕黄层的细胞中进行临床试验前的大(规模)筛查方案。可以在治疗前和治疗期间以及在改变剂量之后,在患者(通常儿童)的血液中进行分析。
该方法与项目3中描述的方法基本相同,但在治疗前和在治疗期间或改变剂量或给予途径或形式后从患者采集人血液样品。分析样品并比较结果。因此,可以在治疗(或治疗的任何变化)前采集第一血液样品以及可以在治疗期间和治疗的任何变化之后采集第二血液样品。治疗的效果也可以通过检测治疗过程当前所采集的样品而进行。
因此,这种方法包括:
i)使分离自人静脉血液样品的含有活线粒体的细胞在37℃恒定温度,在400至25μM O2范围的氧浓度下进行高分辨率呼吸测量,并且其中,采集血液样品之前,检测物质已经给予个体,
ii)使细胞样品与羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP),或增加线粒体内膜对质子的渗透性的另一物质接触以获得存在于血小板中的线粒体电子传递系统的最大容量,以及
iii)比较第一人血液样品耗氧量与第二血液样品的耗氧量,其中,耗氧量的下降表明对线粒体的不利作用,以及耗氧量的增加表明对线粒体的积极的作用,
iv)使来自ii)的样品与线粒体复合物I-功能抑制剂,如鱼藤酮接触,以表明依赖于复合物II-底物氧化的细胞呼吸。
和
v)使来自iv)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂,如抗霉素A接触以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化。
将结果与对照或参比进行比较。
可以用第三、第四、第五等样品(根据所研究的变化的类型)重复步骤i)至步骤v)。
第一样品可以是对照样品,即在任何治疗开始之前采集的血样。可替代地,第一样品和第二样品表示在治疗方案期间的不同时间点采取的血样。例如,如果治疗方案持续一周,那么在第1天采集第一样品(参比样品),并在第2天采集第二样品(并且在之后的天数采集其他样品)。如果剂量方案改变,在剂量改变之前,采集第一血液样品,以及在剂量改变后,采集第二血液样品。
图10示出了相比对照,潜在的候选药物对线粒体呼吸的有益作用和毒性作用的试验路径(实验轨迹,experimental trace)。
所有有关本方法的各个部分的细节如本文所描述的并且对其进行参考。
线粒体功能
线粒体功能障碍在由核或线粒体DNA突变所致的主呼吸链疾病中被识别,并且也参与病症如,亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏症和帕金森氏疾病,以及过度炎症的结果,如败血症(Brealey et al.,2002;Ferreira et al.,2010;Kones,2010;Rosenstock et al.,2010)。
线粒体功能研究对于线粒体生理学和发病机制二者的基础研究,以及对线粒体疾病的诊断是必要的。研究线粒体功能的常用方法是通过分光光度法测定受损线粒体中各个电子传递系统(ETS)复合物的最大酶活性。因为样品可以冻结,此方法的优点是便捷地贮存并运输到具有高通量分析的中心试验室设备(Haas et al.,2008)。然而,线粒体及其构件并不作为独立的单元工作。在ETS中,呼吸链复合物相互连接,该复合物反过来聚集成多酶复合物和超复合物(Lenaz和Genova,2009)。线粒体经过融合和分裂,与其他亚细胞区室形成网络和串扰(Picard et al.,2011)。这清楚地强调了需要分析线粒体功而不损伤细胞或最小程度损伤细胞并且尽可能接近生理学环境。这可以使用极谱测定细胞中的线粒体呼吸来实现(Kitchens 和Newcomb,1968)。可以在具有天然周围介质,例如血浆的完整细胞中利用内源性底物分析呼吸。此外,由于细胞膜的透化,外源底物和抑制剂可以直接进入线粒体,并且(可以实现)研究的ETS的各个复合物,而不需要损伤细胞或纯化线粒体。(Hutter et al.,2006)。
当选择用于证明线粒体功能障碍的组织时,最佳选择是给定患者中的被疾病过程影响最深的组织。然而,这几乎是不可能的,这是由于与来自内部器官如脑、肝和心脏的活组织检查相关的侵入和风险。因此,使用其它组织和最常用的肌肉细胞和皮肤成纤维细胞(Haas et al.,2008)。
相比肌肉或皮肤活组织检查,血小板是存活的线粒体的可容易获得的来源,并且采样创伤较小。已经在多种疾病中证实了血小板线粒体改变,血小板线粒体改变主要影响其他器官系统(Hauptmann et al.,2006;Krige et al.,1992)以及老化进程(Merlo Pich et al.,1996;Xu et al.,2007),因此被提出将血小板线粒体改变作为系统性线粒体功能障碍的潜在标记( et al.,2010;Xu et al.,2007)。血小板也非常适用于极谱分析(Kitchens和Newcomb,1968; et al.,2010)。
根据本发明的方法的发展
在试验部分报道的研究的目的是建立一种方法,并深度评估体外完整的活细胞中正常血小板的呼吸功能和使用高分辨率呼吸测量法深度评估透化细胞中的各个复合物的功能。其次,研究了在寒冷的环境中和室温下存储的影响,性别和年龄的影响,以及第三,应用至不同的参比群的该方法的一致性(的影响)。
在试验部分作出有关试验设置参考的细节。
列出了数据,反映出多个不同的参比群的正常的血小板线粒体呼吸功能。在静息血小板(Kilkson et al.,1984)中氧化磷酸化占约85%的能源生产,并且此外,糖酵解、脂肪酸β氧化也有助于底物供应(Cesar et al.,1987)。如ETS/常规中的差异说所表明的,相比在PBS中的血小板,悬浮于血浆中的血小板的完整血小板的备用呼吸容量(spare respiratory capability)(即,通过解偶联剂FCCP从常规状态增加的呼吸量)更高(表2)。这可能反映了不同培养基中的不同类型和水平的底物供应。当在葡萄糖作为唯一的外源性底物的PBS中进行试验时,完整血小板的备用呼吸容量为约64%,相比较而言,当细胞在具有生理底物供应的其自身的血浆中进行孵育和分析时,其备用呼吸容量为约88%。当暴露于寡霉素时,备用呼吸容量通常较低,在PBS-葡萄糖中约28%以及在血浆中约25%,这可能反映了具有被抑制的ATP生产的细胞中葡萄糖和其他底物的受损的能量依赖性氧化途径。
在透化细胞中,通过将饱和量的底物提供至柠檬酸循环而绕过糖酵解和β氧化。结果是ETS和质子通路,其可以被评估而不需对底物进行限速。最大耗氧量,无论是ADP-(偶联的)还是FCCP刺激的(解偶联的),相比完整细胞,在透化细胞中可以增加另外的50%。由于不考虑悬浮介质,常规呼吸是相似的,这表明在受刺激的完整细胞中的非限速的底物供应步骤,其不存在于静息状态下。因为通过鱼藤酮抑制复合物I后,不可检测到复合物II驱动的呼吸作用,所以完整的血小板几乎完全使用NADH和通过复合物I输入电子。完整细胞的ETS呼吸值与透化细胞OXPHOSCI在相同的范围内,该发现对上面这个观点提供了进一步的支持。这还强调了将来自复合物I和复合物II的电子提供至ETS进入Q连接(Q-junction)从而在透化细胞中建立最大的电子传递的重要性。在汇集的电子输入中,在不限制底物供应的情况下,复合物I约占总呼吸的2/3和复合物II约占总呼吸的1/3。当ADP-和FCCP-刺激的呼吸容量与接近1的OXPHOSCI+II/ETSCI+II比相似时,未观察到ATP合酶引起任何显著的速率限制。此外,如通过相对于最大呼吸容量的低的LEAK呼吸以及在完整和透化细胞中的对应的高的ETS/LEAK比率所证明的,血小板呼吸显示出与氧化磷酸化紧密的偶联。我们在透化细胞中观察到比完整细胞更高的LEAK状态。虽然用洋地黄皂苷透化质膜可能影响线粒体膜的渗透性,我们的发现并不支持该观点,因为在洋地黄皂苷滴定试验中观察到洋地黄皂苷浓度的较大的安全界限(safety margin)。外源细胞色素C对呼吸也不产生影响,并且因此,线粒体外膜仍然保持完整。更有可能的解释是,由于基础呼吸速率与质子驱动力成比例,在饱和底物供应的情况下,可以产生跨内膜的更高的质子梯度从而升高LEAK呼吸(Nicholls,1977)。
与老化相关的线粒体功能下降涉及广泛(Lesnefsky和Hoppel,2006;Vendelbo和Nair,2011)。在血小板中,我们观察到复合物II呼吸作用随着老化下降,而不影响总的呼吸功能,这种作用主要涉及到儿童组和成人组之间的差异。呼吸的下降似乎是复合物II特异性的,因为位于更下游的复合物III、复合物IV或ATP合酶也可能具有受影响的最大的OXPHOS或ETS活性。
常规呼吸和LEAK呼吸之间的差别通常归因于静息ATP产生。由于LEAK状态在研究的年龄跨度内保持相同的水平,本文所观察到的常规呼吸的增加表明随着老化,基础ATP生产增加。通常,随着老化,静息代谢率下降(Johannsen和Ravussin,2010),但是并未阐明它是如何影响各种组织的。从本研究来看,并不清楚为什么随着老化,血小板需要增加基础ATP生产。相比成人瑞典对应群体,日本志愿者表现出约27%更高的LEAK呼吸。这就导致在复合物II底物驱动的呼吸中的显著增加的ETSCII/LEAK,以及显著下降的OXPHOSCI/LEAK和OXPHOSCI+II/LEAK。报告显示了日本人和白种人在疾病模式中的差异(Benfante,1992)。通过遗传差异,并且也由于食品和生活方式因素都可以解释这点,因为这种差异,在相当大程度上,在移民的人口中消失(Yamori,2006)。日本食物传统富含具有解偶联特性的高含量FFA的鱼类和其他海鲜产品(Cha et al.,2001;Davis et al.,2008)。在老化方面,温和的解偶联由于降低的质子原动力(motive force)已建议为有利的,并且因此产生更少的ROS(Brand,2000)。日本线粒体DNA主要由单倍群D主导,相比欧洲则是以单倍群H为主。考虑到小的样品尺寸,在本研究中发现的差异可能因而是遗传相关的或生活方式相关的或它们二者的组合。需要进一步的研究以澄清这些问题。来自脐带样品的呼吸水平比其他组群普遍更高。这可能是子宫内和子宫外的生活之间的不同需求的反映。然而,胎儿生命中线粒体功能的数据很少(Yanicostas et al.,2011)。
本发明方法可以潜在地作为对目前对疑似线粒体疾病的标准评价(通常包括肌肉活组织检查)的补充。因此,我们目前正在收集来自多个不同的组群的数据,如具有神经退行性疾病的患者和具有疑似线粒体疾病的新生儿。因此,我们希望评估由存储和小样品量所带来的局限性。即使存储于EDTA小瓶中对于血小板而言并不是优化的环境,在血液存储24小时后,呼吸功能似乎仅有轻微的改变。出于诊断的目的,样品因此可以潜在地经更长的路程运输至中心设备处,并且在存活的血小板中维持用于分析呼吸能力的可能性。对于非常小的孩子可能要限制可以抽取的用于不同分析的血液的量,并且我们从而评估可以使用的血小板浓度并且仍然获得可靠的值。对于整个试验,绝对耗氧量在50x 106血小板/ml时仅为约25nmol/ml。当在不同浓度下评价时,除了ETSCI+II(其轻微降低50×106血小板/ml)呼吸状态未受影响。其原因目前尚不完全清楚,但是,即使小心滴定,以降低的细胞内含物可能改变FCCP的最大效应及其对与其他细胞膜的非特异性结合的影响。
本方法的优点是结合完整的和透化的血小板的分析的能力。分析悬浮于受试者自身血浆中的完整细胞是与生理条件非常相似的试验设置。这使得有可能不仅研究固有的遗传缺陷,而且还研究由外源因子如毒素或药物引起的线粒体缺陷。可以从透化细化中获得更多信息,其中,可以使用不同的滴定(SUIT)方案用于将流量控制(flux control)转移至呼吸系统的不同部分,以阐明病状所处的位置。
尽管在评估线粒体生物能量功能(Brand and Nicholls,2011)中,呼吸测量被视为优选的方法之一,以及血小板线粒体似乎是存活的人线粒体的优良来源,该方法有局限性。影响线粒体的疾病或多或少地是组织特异性的,并且已知线粒体DNA中的突变在不同的组织中以不同的比率表达,这种现象被称为异质性。同样地,如果在所分析的组织中基本不存在改变,那么改变(突变)是不被识别的。细胞具有补偿降低的ATP水平的能力,并且通常表现出阈值,在该点不再发生补偿并且随后发生器官衰竭(Rossignol et al.,2003)。因此,难于预测在什么水平下降的线粒体呼吸应该认为是病理性的。然而,所有的上述限制并不是独特地存在于本发明方法中,而是在无论使用何种组织或技术的情况下都存在。在本发明滴定方案的情况下,我们没有包括复合物IV的特异性测量,这通常是由结合抗坏血酸盐的人工电子供体TMPD完成从而保持TMPD下降。TMPD/抗坏血酸盐进行由不同的含金属蛋白质(如细胞色素C)催化的自动氧化并且也是氧浓度依赖性的。由于我们样品制备的性质,非特异性的细胞材料和血浆的量变化,因此,对于TMPD/抗坏血酸盐自动氧化不能做任何背景校正。
结论
血小板的呼吸测量非常适合在体外生理条件下用于研究人线粒体。已经证明利用高分辨率呼吸测量用微小样品量并且在存储最多24小时之后可以获得可靠的结果。通过应用不同的SUIT方案,可以获得不同组群之间的细胞呼吸能力和差异的详细信息并且我们描述了如何评估这些结果。这种方法可以适用于评估外源性触发的以及内源性的线粒体病症并且目前我们正在评估用于这些目的方法。
附图说明
图1.表示洋地黄皂苷滴定的示意性轨迹。血小板以100*106/ml的浓度悬浮于最初包含5mM琥珀酸盐和1mM ADP的MiR05缓冲液中。常规稳定后,呼吸复合物I通过鱼藤酮抑制,随后逐步(20μg)滴定洋地黄皂苷,直到未检测到进一步的增加。
图2.完整血小板的试验方案。内源性(常规)呼吸后,经由通过寡霉素(1μg/ml)诱导复合物V-依赖性的(LEAK)呼吸。通过滴定质子载体,羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP,在PBS中平均浓度为6μM,在血浆中平均浓度为100μM)实现最大呼吸,随后分别加入鱼藤酮(2μM),和随后的抗霉素-A(1μg/ml),复合物I和III抑制,用于测量剩余耗氧量。在图上方示出诱导的呼吸状态和使用的呼吸底物。ETS=电子传递系统。
图3.透化血小板的试验方案。来自试验的曲线示出了使用底物、解偶联剂、抑制剂滴定方案的耗氧率。在图的上方限定了诱导的呼吸状态和激活的呼吸复合物。用洋地黄皂苷透化血小板并且同时加入复合物I(CI)底物苹果酸盐和丙酮酸盐(分别为5mM)。通过随后加入ADP(1mM),以及之后加入的另外的复合物I底物谷氨酸盐(5mM)激活氧化磷酸化(OXPHOS)。加入复合物(CII)-相关的底物琥珀酸盐(10mM)使得能够通过复合物I和复合物II二者汇聚电子输入。通过寡霉素(1μg/ml)抑制OXPHOS,揭示了复合物V-依赖性的(LEAK)呼吸。通过滴定质子载体,羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP,平均浓度6μM))滴定诱导电子传递系统(ETS)的最大呼吸容量。通过鱼藤酮(2μM)抑制复合物I,揭示了复合物II支持的呼吸。通过加入复合物III抑制剂抗霉素A(1μg/ml)揭示剩余的非线粒体耗氧。未显示加入TMPD(0.5mM)和叠氮化物(10mM)。在图上方示出诱导的呼吸状态和使用的呼吸底物。
图4.年龄和性别与血小板线粒体呼吸的相关性。A,常规呼吸(日常呼吸,routine respiration)与年龄之间的相关性,各个点都是两个重复的值的平均值。B,ETSCII以及C,OXPHOSCI+II呼吸与年龄之间的相关性。D,ETSCI+II呼吸在性别之间的比较。对于呼吸状态的定义见图3。
图5.在透化血小板中,血小板浓度对不同的呼吸状态的影响。在50至400*106血小板/ml范围浓度下,在不同状态的底物、抑制剂滴定方案中的耗氧量。对于呼吸状态的定义见图3。N=5,每一个试验进行两次,*=P<0.05。
图6.在透化血小板中,保存对不同的呼吸状态的影响。血液保存在室温或4℃下的倾斜板上的K2EDTA真空采血管。在72小时时,所有参数除了LEAK呼吸均比时间0时显著下降。对于呼吸状态的定义见图3。N=4,每一个试验进行两次,*=P<0.05。
图7.来自曲格列酮和罗格列酮线粒体毒性检测的试验轨迹。在含110mM蔗糖、20mM HEPES,20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mM MgCl2,10mM KH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值为7.1的缓冲液中的200*106个细胞/ml的人血小板。如通过下降的氧通量所示,具有较高浓度的曲格列酮显示出线粒体毒性。在标记处加入FCCP(2μM)、鱼藤酮(2μM)和抗霉素(1μg/ml)。FCCP=羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙。
图8示出了来自米诺环素和多西环素的线粒体毒性检测的试验曲线。含110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mMMgCl2,10mM KH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值为7.1的缓冲液中的200*106个细胞/ml的人血小板。如通过下降的氧通量所示,具有较高的浓度的米诺环素表现出线粒体毒性。多西环素也显示出毒性,但相比于米诺环素较不明显。在标记处加入FCCP(2μM)、鱼藤酮(2μM)和抗霉素(1μg/ml)。FCCP=羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙。
图9示出了来自西立伐他汀和辛伐他汀的线粒体毒性检测的试验曲线。含110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mM MgCl2,10mM KH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值为7.1的缓冲液中的200*106个细胞/ml的人血小板。如通过下降的氧通量所示,具有较高浓度的西立伐他汀显示出线粒体毒性。在标记处加入FCCP(2μM)、鱼藤酮(2μM)和抗霉素(1μg/ml)。FCCP=羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙。
图10示出了相比对照,新型候选药物对线粒体呼吸的有益作用和毒性作用的试验迹线。含110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mMK-乳糖酸盐、3mM MgCl2,10mM KH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值为7.1的缓冲液中的200*106个细胞/ml的人血小板。在标记处加入FCCP(2μM)、鱼藤酮(2μM)和抗霉素(1μg/ml)。在迹线的上面表示在每个滴定步骤加入的剂量。建议的药物增加线粒体呼吸至2mM累积剂量,此后,随着进一步滴定呼吸下降,说明具有线粒体毒性。FCCP=羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙
图11是线粒体复合物II筛选试验的示意图。它示出了用于评估新的细胞可渗透的线粒体底物的方案。在检测中,在完整细胞中用呼吸复合物I抑制剂鱼藤酮抑制线粒体功能。在质膜透化之前和之后,比较候选药物与内源性底物以评价生物能增强或抑制。
图12是线粒体汇聚(convergent)呼吸筛选试验的示意图。它描述了用于评估新的细胞可渗透的线粒体底物潜能的方案。在检测中,通过解偶联线粒体与质子载体FCCP激活线粒体活性。滴定候选药物以获得最大水平汇聚的(复合物I和复合物II衍生的)呼吸。加入鱼藤酮后,获得复合物II-依赖性的刺激。加入复合物III抑制剂抗霉素以评估非线粒体耗氧。
图13示出了相比完整的人血小板(图12中所示测定)中的对照(琥珀酸二钠),随着药物逐步滴定,呼吸增加(每单位氧通量)。
图14分别示出了依赖线粒体复合物I、II和IV的耗氧量。用如上所述的方法在缓冲液中存在不同浓度的二甲双胍下测定耗氧量。随着二甲双胍浓度增加,看见复合物I呼吸的显著下降。数据表示为平均值和标准偏差。*P<0.05,***:P<0.001,相对于介质(0mM二甲双胍)。含110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mM MgCl2,10mM KH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值为7.1的缓冲液中的200*106个细胞/ml的人血小板。
具体实施方式
实验部分
材料和方法
1.1获取人体样品
该研究得到瑞典兰德地区伦理评审委员会(regional ethical reviewboard)(成人:113/2008和644/2009,儿童:59/2009)以及日本东京医科大学伦理委员会(ethics committee of Tokyo Medical University)(许可号1514)批准。对于瑞典成年人,从兰德斯科讷大学医院(UniversityHospital)献血中心收集健康献血者的血液样品,以及收集膝盖受伤后接受康复治疗的健康成人的血液样品。日本组由健康成年志愿者组成。在获取书面知情同意之后获得样品。根据相同的程序和方案以及在双方研究站由相同的研究人员进行试验。儿科对照样品获得自进行轻微的择期性手术的患者。书面知情同意书获得自父母或监护人,并且在麻醉诱导前抽血。在正常怀孕健康个体分娩后中采集脐带血样品。在获取书面知情同意之后获得样品。
如果没有另外说明,所有的化学品购自Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)。
1.2血小板制备
对供血者,在计划供血的同时从收集管采集样品,以及在其他成人组或儿童组中经由静脉穿刺。脐带血在孩子通过阴道或剖腹产分娩后而直接采集。21ml的体积来自成人,6至12ml来自儿童,以及3至6ml来自脐带,它们采集于K2EDTA管(Greiner Bio-One GmbH,Kremmünster,澳大利亚)。在试验性研究中,相比肝素、柠檬酸盐和酸式柠檬酸葡萄糖(ACD)作为抗凝剂(数据未示出),K2EDTA被证明导致最佳收率并且抑制血小板活化。新鲜配制血液样品,并在3至5小时内进行分析。将试管在300×g室温下离心15分钟,以得到富血小板血浆(PRP)。吸出PRP,并在室温下在4600×g下离心5分钟,产生几乎不含细胞的血浆和血小板沉淀。通过温和吸打将沉淀溶解于1至3ml的对照受试者自身血浆中以获得高度富集的具有1864×106/ml的(941-2498范围)平均终浓度的PRP。
1.3高分辨率呼吸测量
在37℃恒定温度下在高分辨率液相氧电极(测氧描记器)(Oxygraph-2k Oroboros Instruments,因斯布鲁克,澳大利亚(Gnaiger et al.,2000))中,在具有750rpm搅拌速度的2ml玻璃腔室中测定呼吸。用DatLab软件4.3.(Oroboros Instruments,因斯布鲁克,澳大利亚)记录数据,采样速率设置为2s。所有试验均在氧浓度在210至50μM的O2范围内进行。如果有必要,通过部分提高室塞用于简短的空气平衡而进行复氧(reoxygenation)。在独立的试验组中测量仪器的背景氧通量,并在随后的试验中,根据制造商的说明自动校正。将血小板悬浮于含110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mM MgCl2,10mMKH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值为7.1的线粒体呼吸介质中(MiR05)(Gnaiger et al.,2000)中,用于透化细胞中的呼吸测定。将血小板悬浮于加有5mM葡萄糖的磷酸盐缓冲液(PBS)中或对照受试者自身血浆中用于完整细胞中的试验。每天开始试验前,通过在液相氧电极室让使Millipore水或呼吸介质与空气搅拌直到平衡进行空气饱和校准并且获得稳定的信号。由大气压和溶解度因数(对于水设定为1.0,MIR05和PBS葡萄糖为0.92和血浆为0.89)自动计算出氧浓度(Bau 和Lübbers, 1983)。
1.3.1用于完整血小板的试验方案
用两种不同的滴定方案评价具有内源性线粒体底物的完整细胞的整体呼吸。将血小板悬浮于PBS葡萄糖或对照受试者自身的血浆中。最初,样品在常规呼吸状态保持稳定,揭示出静息状态下对氧化磷酸化(OXPHOS)的细胞能量需求。为了评估不依赖于ADP磷酸化的呼吸贡献,依次加入寡霉素(1μg/ml,ATP合成酶抑制剂)从而诱导LEAK呼吸状态(也称为寡诱导状态4呼吸)。小心滴定质子载体,羰基氰对(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)直到未检测到呼吸的进一步增加后(在PBS中平均浓度为6μM,血浆中的平均浓度为100μM),测定ETS的最大容量。然后依次加入鱼藤酮(2μM,复合物I[CI]抑制剂)和抗霉素A(1μg/ml,复合物III[CIII]抑制剂)以抑制ETS,其提供剩余的耗氧量,在进一步的分析中从不同的呼吸参数中减去剩余的耗氧量。
为了评价ATP合酶抑制对最大呼吸容量的影响,进行第二试验方案,其中,在常规呼吸稳定之后,通过直接滴定FCCP,随后是如上所述的相同抑制剂来评价ETS容量。对照比例衍生自LEAK呼吸(ETS/LEAK)和常规呼吸(ETS/常规)除最大的FCCP刺激的呼吸。
1.3.2用于透化血小板的试验方案
为获得具有饱和外源性底物和抑制剂的ETS,用洗涤剂洋地黄皂苷透化质膜。进行一组试验以建立洋地黄皂苷诱导质膜最大透化而不影响线粒体外膜或内膜的最佳浓度。将血小板(200*106/ml)悬浮于MIR05并且用1mM的ADP、5mM琥珀酸盐和1μM的鱼藤酮预孵育。滴定洋地黄皂苷10μg/μl,直到获得最大的呼吸反应(Gnaiger et al.,1998)。在图1中示出了滴定试验的代表性曲线。发现最佳剂量是1μg/1x106血小板。外源性细胞色素C对呼吸并不诱导任何显著的作用,表明线粒体外膜仍然保持完好(数据未示出)。
使用底物、解偶联剂、抑制剂滴定(SUIT)方案建立呼吸容量,电子独立地流经复合物I和复合物II(CII)二者,并且经由Q-连接(CI+II)汇聚电子输入(Gnaiger,2009)。建立常规呼吸后,通过用洋地黄皂苷透化质膜并且伴随加入苹果酸盐(5mM)和丙酮酸盐(5mM)来开始滴定。通过加入ADP(1mM),以及另外地加入谷氨酸盐(5mM)来评价由NADH相关的底物驱动的复合物I的OXPHOS容量(OXPHOSCI或状态3CI)。接着,加入10mM琥珀酸盐,从而诱导最大的OXPHOS容量,具有通过复合物I和复合物II二者的汇聚输入(convergent input)(OXPHOSCI+II,或状态3CI+II)。使用寡霉素(1μg/ml)以抑制ATP合酶并诱导LEAK呼吸。随后通过滴定FCCP,获得ETS的最大汇聚呼吸容量(ETSCI+II,平均浓度6μM)。通过鱼藤酮(2μM)抑制复合物I以评估仅通过复合物II(ETSCII)的琥珀酸支持的ETS容量。最后,流经ETS的电子流通过加入抗霉素A(1μg/ml)而抑制,提供的残余耗氧量与ETS不相关。对照比率均衍生自LEAK呼吸除最大的氧化呼吸或最大的FCCP刺激呼吸(分别为OXPHOSCI+II/LEAK和ETSCI+II/分别LEAK)。分析的样品储存在-80℃。
1.4数据分析
使用Graph Pad PRISM(GraphPad Software version 5.01,La Jolla,CA,USA)进行统计评估。值表示为平均值±SEM,或单独的值。来自不同组群的所有值,除了脐带和用于完整细胞的对照比率(ETS/LEAK,ETS/常规),被发现具有D’Agostino和Pearson综合正态性检验的正态分布。通过在各组之间经由Tukey多重比较检验的单因素ANOVA与post hoc分析进行多组间的比较用于参数数据,以及进行Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验用于非参数数据。对于与年龄的相关性,使用线性回归。认为p值<0.05为统计学显著的。
2.结果
血液样品取自46名健康成年志愿者(24名来自瑞典以及22名来自日本),28男18女,中位年龄37岁(范围19-65岁)和25名儿童,18男7女,中位年龄4岁(范围1个月至12岁)和22例脐带血(13例来自剖腹产,9例来自阴道分娩)。
2.1血小板线粒体的产量、活力和完整性
计算来自全血的血小板浓度并且在制备高度富集的富血小板血浆后计算的产率平均为92%(±8%,N=16)。为了评价在制备方案后血小板的存活率,在血小板一步离心,即,300×g离心15分钟后对其进行呼吸测量,并且比较沉淀(pelletation)后的呼吸。未发现显著差异可以推断在整个分离过程中的良好的稳定性以及血小板活力(N=16,数据未显示)。
2.2完整血小板的线粒体呼吸
在图2中示出了完整细胞中的试验的代表性曲线并且在表1中示出了呼吸参数值。在完整细胞中呼吸仅由内源性底物驱动。在PBS-葡萄糖或血浆中孵育的细胞中的常规呼吸是相似的。LEAK呼吸非常低,小于1pmolO2/s/108血小板。由此而来的高的对照比率ETS/LEAK表明非常紧密偶联的呼吸。FCCP对ETS的最大刺激在没有寡霉素的试验中显著更高且如由对照比率ETS/常规所显示的,在悬浮于血浆中的非寡霉素处理的血小板中,备用呼吸容量显著高于悬浮于PBS葡萄糖。用鱼藤酮抑制复合物I抑制呼吸~99%并且在加入抗霉素A后没有发现进一步的抑制(表1)。在不同组群之间,在日本对照对脐带血最大FCCP刺激的呼吸(ETS)之间存在显著差异(15±1.3vs 23±2.3pmol O2/s/1*106血小板)。未发现其他显著差异。
2.2.1透化血小板的线粒体呼吸
开发SUIT方案以尽可能多地从单个试验中获得不同呼吸复合物的容量的信息。图3示出了加入底物和抑制剂的代表性迹线以及不同状态的定义。MiR05中的细胞的常规呼吸与孵育在PBS-葡萄糖或血浆中的完整血小板在相同的范围内。加入洋地黄皂苷后,当细胞质基质和腺嘌呤核苷酸扩散到周围介质时,发现呼吸稳定下降。苹果酸盐和丙酮酸盐作为复合物I底物存在,相比常规呼吸,ADP刺激使得呼吸增加~80%。加入谷氨酸盐用于另外的NADH生成和复合物I电子输入,呼吸又增加~10%(表2)。加入琥珀酸盐后,使得实现了来自复合物I和复合物II的汇聚电子流输入至ETS,并导致呼吸速率三倍于常规呼吸,但是仅利用复合物I底物,呼吸增加~50%。LEAK呼吸是最大偶联呼吸,OXPHOSCI+II的~15%。OXPHOSCI+II/LEAK的比例为~0.7,表明电子传递与ATP合成的良好的偶联并且与其他组织是相当的(Kuznetsov et al.,2002)(表2)。由质子载体FCCP诱导的最大呼吸容量ETSCI+II比OXPHOSCI+II高~5%。OXPHOS/ETS比率接近1并且表明在饱和内源性底物的情况下,磷酸化系统几乎没有施加通量限制。在鱼藤酮抑制复合物I后,ETSCII活性测定为复合物I和复合物II ETSCI+II结合活性的~35%。在日本参考材料中,具有复合物I底物的最大呼吸以及汇聚输入与它们的瑞典对应组相似。然而,LEAK呼吸和复合物II刺激的呼吸比来自瑞典和儿童组的值高~25%,导致降低的ETSCI+II/LEAK比率(表2)。来自脐带血的值不同在于在OXPHOS和ETS二者的最大呼吸表现出较大值。LEAK呼吸在绝对值以及比例值两者中也显著较高,因为所得到的比率更低(表2)。
2.3年龄和性别的相关性
两种呼吸状态阐释了与年龄的显著相关性。如图4A、图4B所示,随着年龄,常规呼吸增加((r2=0.15,p<0.05)和ETSCII略有下降(r2=0.14,p<0.05)(不包括脐带数据)。图4C中由OXPHOSCI+II所例证的,所有其他呼吸参数之间没有显著的变化。在完整的或透化的血小板中均未发现呼吸参数与性别之间的相关性(图4D)。
2.4不同血小板浓度的呼吸的线性
评价不同血小板浓度下的呼吸。在所有状态下,在100-400×106plt/ml的范围内,呼吸保持线性。在50×106plt/ml的浓度时,最大FCCP刺激下降20-25%(图5)。大多数的另外的试验用200×106/ml的血小板浓度进行。当在不同的日子(separate days)通过对相同的个体进行试验来评价时,该方法表现出良好的可再现性。在不同的呼吸参数中变异系数为6-13%(见表3)。
2.5长时间的血液储存对呼吸参数的影响
评价全血储存对线粒体呼吸的影响。新鲜抽取的血液在室温或4℃储存于倾斜板上的EDTA小瓶中长达72小时。经过24小时后,呼吸保持稳定。在48小时,底物刺激的呼吸状态,即OXPHOSCI、OXPHOSCI+II和ETSCI+II有朝着降低的呼吸能力的明显趋势。在72小时,所有参数除了LEAK呼吸都显著下降(图6)。
3.用于白血细胞(WBC)的方案
3.1样品制备
在K2EDTA管(Greiner Bio-One GmbH,Kremmünster,澳大利亚)中采集患者现有的动脉血管的40ml最大体积的血液。在对照中,血液样品在K2EDTA管中经由静脉穿刺采集。通过Ficoll梯度(REF)离心从全血中分离白细胞。生理盐水中洗涤后,将细胞重悬浮于200至400微升盐水中,这取决于产量,连同50至100μl受试者自身的血浆。取样5小时内进行呼吸测量。来自呼吸测量室的分析内含物冷冻保藏直至进一步使用。
3.2高分辨率呼吸测量
将白细胞以2.5-5*106细胞/ml的最终浓度置于2ml液相氧电极室。在完整细胞中,呼吸介质由受试者自身的血浆组成,对于透化细胞,呼吸介质包含110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mM MgCl2,10mM KH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值7.1(MiR05)[Gnaiger et al.,2000]。测定是在37℃的恒定温度下,在高分辨率液相氧电极(Oxygraph-2k Oroboros Instruments,因斯布鲁克,澳大利亚)中进行。用DatLab软件4.3.(Oroboros Instruments,因斯布鲁克,澳大利亚)记录氧浓度(μM)和氧通量(氧浓度的负时间导数;pmol O2*s-1*10-6细胞)。所有试验在210至50μM的O2范围的氧浓度下进行。每一天进行空气饱和度的校准。在独立的试验组中测量仪器的背景氧通量,并在随后的试验中,根据制造商的说明自动校正。
由大气压和溶解度因数(对于水设定为1.0,MIR05为0.92和血浆为0.89)自动计算出氧浓度。
使用三种底物-解偶联剂-抑制剂滴定(SUIT)方案,一种在完整细胞以及两种在透化细胞中[Pesta和Gnaiger,2012]。由于质膜渗透性差,在完整细胞中利用外源性底物的刺激是有限的。因此仅由内源性底物保持呼吸。细胞悬浮于受试者自身的血浆中,并进行常规呼吸以稳定。将寡霉素(1μg/ml)加入至呼吸室中以诱导状态4样呼吸,(LEAK或状态4u)呼吸主要是由于线粒体内膜质子的渗漏。随后通过解偶联剂FCCP的逐步(20-40μM)滴定获得最大的氧通量。最终,通过加入鱼藤酮(2μM)以及之后的抗霉素A(1μg/ml)抑制复合物I和复合物III。从线粒体呼吸稳定状态值中减去剩余氧通量。在透化细胞中进行第二和第三SUIT方案。对于两个方案而言,起始步骤是一样的。细胞稳定在常规呼吸后,通过加入洋地黄皂苷使血浆细胞膜透化(3μg/1*106细胞,最佳浓度在不同组的试验中进行评价,数据未显示)。同时,将复合物I底物苹果酸盐和丙酮酸盐(分别为5mM)加入到该呼吸室。随后加入ADP(1mM)刺激呼吸并且表示氧化磷酸化容量(OXPHOS或状态3)用于特异性NADH相关的底物结合。通过丙酮酸盐脱氢酶在线粒体基质中将丙酮酸盐转化为乙酰-CoA并且因此OXPHOS容量有可能受到缺陷工作机制或被抑制的酶的限制。通过随后加入谷氨酸盐(5mM),绕过丙酮酸盐脱氢酶,并且实现最大的NADH相关的复合物I呼吸,OXPHOSCI。随后加入琥珀酸盐(10mM)刺激OXPHOSCI+II,并使得通过复合物I和复合物II经由C-连接电子汇聚输入。从这里,SUIT方案开始有差异。在SUIT-2中,通过鱼藤酮(2μM)抑制复合物I-相关的呼吸,用仅通过复合物II的电子输入来分裂OXPHOSCII能力。随后,通过加入抗霉素A在复合物III中抑制电子传递系统(ETS),并且从线粒体呼吸稳定态中减去剩余氧通量。
在SUIT-3中,在最大OXPHOSCI+II容量之后,通过寡霉素(1μg/ml)抑制ATP合酶以评估LEAKCI+II(状态4)呼吸(主要由质子穿过线粒体内膜滑移或渗漏造成)。通过逐步(2-4μM)滴定FCCP评价通过不具有氧化磷酸化的呼吸作用的最大电子传递,ETSCI+II。通过加入鱼藤酮评价未偶联至氧化磷酸化的复合物II相关的呼吸,ETSCII,并随后通过抗霉素-A抑制ETS。在该点,在SUIT-2和-3方案中进行复氧至160-180μM O2。通过将N,N,N',N'-四甲基-对苯二胺(TMPD 0.5mM)电子供体加入至复合物IV评价复合物IV的活性。由于TMPD的自动氧化,加入叠氮化钠(10mM)复合物IV抑制剂,将获得的这两种水平之间的差别计算为复合物IV活性。
以下给出了用于筛选潜在的候选药物的更多具体的方案
使用了两种筛选方案。
(1)在包含110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mM MgCl2,10mM KH2PO4、0.5mM EGTA、1g/l的BSA,pH值为7.1的缓冲液中用分离的血小板或白血细胞进行初始筛选(复合物II作用)。用内源性底物进行基线呼吸后,用2mM鱼藤酮抑制复合物I。逐步滴定溶于DMSO的药物候选物至100μM、500μM和5mM的终浓度。接着,用洋地黄皂苷(1mg/1*106plt)使细胞膜透化。稳定呼吸后,加入10mM的琥珀酸盐,并且在呼吸稳定化后,通过加入抗霉素至终浓度为1μg/mL终止试验,并测得剩余呼吸。图11示出了用于评价新的细胞可渗透的线粒体底物的方案。在检测中,在完整细胞中用呼吸复合物I抑制剂鱼藤酮抑制线粒体功能。在质膜透化之前和之后,比较候选药物与内源性底物以评价生物能增强或抑制。图11是线粒体复合物II筛选试验的示意图。它示出了用于评估新的细胞可渗透的线粒体底物的方案。在检测中,在完整细胞中用呼吸复合物I抑制剂鱼藤酮抑制线粒体功能。在质膜透化之前和之后,比较候选药物与内源性底物以评价生物能增强或抑制。
(2)在第二方案中,使用汇聚呼吸,如以上所述的相同呼吸缓冲液和细胞浓度。建立基础呼吸后,以2mM的浓度加入线粒体解偶联剂FCCP。将溶于DMSO的候选药物逐步滴定至100μM、200μM、400μM、600μM、1mM、2mM、5mM和10mM的最终浓度。指出了达到最大汇聚呼吸所需要的浓度。通过加入2μM鱼藤酮和1μg/mL抗霉素终止试验,并测量剩余呼吸。图12描述了用于评估新的细胞可渗透的线粒体底物潜能的方案。在检测中,通过解偶联线粒体与质子载体FCCP激活线粒体活性。滴定候选药物以获得最大水平的汇聚(复合物I和复合物II衍生的)呼吸。加入鱼藤酮后,获得复合物II-依赖性的刺激。加入复合物III抑制剂抗霉素以评估非线粒体耗氧量。图12是线粒体汇聚呼吸筛选试验的示意图。它描述了用于评估新的细胞可渗透的线粒体底物潜能的方案。在检测中,通过解偶联线粒体与质子载体FCCP激活线粒体活性。滴定候选药物以获得最大水平的汇聚(复合物I和复合物II衍生的)呼吸。加入鱼藤酮后,获得复合物II-依赖性的刺激。加入复合物III抑制剂抗霉素以评估非线粒体耗氧量。
在汇聚呼吸筛选试验中,相比在完整细胞未偶联线粒体的对照,利用逐步滴定的理想化合物表现出更强的呼吸作用。请参阅图12中的示意方案,并且在图13中举例说明了来自利用化合物实例标号3、5、13的试验的图。图13表明相比完整的人血小板(图12)中的对照(琥珀酸二钠),随着药物逐步滴定,呼吸增加(每单位氧通量)。
期望的化合物的性质
(1)在鱼藤酮抑制的完整(细胞)中按照CII筛选方案,理想的化合物以低浓度刺激呼吸,透化后对于琥珀酸盐刺激的呼吸没有抑制效果。用线粒体毒素抑制呼吸后,呼吸应该终止。请参见图1,以及下面的列表。
a>b表示a大于b
a>>b表示a远大于b
a→b表示a的值接近b的值
化合物的期望属性:
·达到低药物浓度的最大值
·a>>a′
·a→b′
·c→c′
·d→d′
对于细胞膜不可透的化合物在试验中鉴定为:
·a→a′
当在以下情况下,鉴定由药物候选物诱导的非线粒体耗氧
·d>d′。
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Claims (32)
1.一种方法,包括:
i)使分离自人血液样品的含有活线粒体的细胞样品进行高分辨率呼吸测量,
ii)使所述细胞样品与提高线粒体内膜对质子的渗透性的物质接触,
iii)加入包含介质中的检测物质的检测样品,
iv)比较加入所述检测样品之前和之后的耗氧量并且比较所述检测样品的耗氧量与所述介质的对照样品的耗氧量,其中,所述耗氧量下降表明对所述线粒体的负面作用,
v)使来自iii)的样品与线粒体复合物I-功能抑制剂接触,
和
vi)使来自v)的样品与线粒体复合物III-功能抑制剂接触。
2.一种方法,包括:
i)使分离自人血液样品的含有活线粒体的细胞样品进行高分辨率呼吸测量,其中,所述细胞样品来自进行临床研究或进行治疗方案的个体,
ii)使所述细胞样品与提高线粒体内膜对质子的渗透性的物质接触,
iii)比较来自进行临床研究或治疗方案的所述个体的样品的耗氧量与对照样品的耗氧量,其中,耗氧量下降表明对所述线粒体的负面作用,
iv)使来自iii)的所述样品与线粒体复合物I-功能抑制剂接触,
和
v)使来自iv)的所述样品与线粒体复合物III-功能抑制剂接触。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,在37℃的恒定温度下,在400-25μM O2范围的氧浓度下进行所述高分辨率呼吸测量。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,加入提高线粒体内膜对质子的渗透性的物质以获得存在于所述样品中的线粒体的电子传递系统的最大容量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,提高线粒体内膜对质子的渗透性的所述物质选自羰基氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)、羰基氰间-氯苯腙(CCCP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)和其他质子载体、和它们的混合物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,以0.1至10μM,如0.5至5μM、1至3μM或约2μM范围的浓度加入提高线粒体内膜对质子的渗透性的所述物质。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,提高线粒体内膜对质子的渗透性的所述物质是FCCP。
8.根据权利要求1、3至6中任一项所述的方法,其中,所述介质是有机溶剂,如,例如乙醇、异丙醇、甲醇、DMSO(二甲基亚砜)、DMF(二甲基甲酰胺)或DMA(二甲基乙酰胺)。
9.根据权利要求1、3至8中任一项所述的方法,其中,所述检测样品是液体形式并且所述检测样品包含已知浓度的所述检测物质。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,以逐渐升高的浓度加入所述检测样品。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,逐步加入检测样品导致所述检测样品的终浓度为1μM至10mM。
12.根据权利要求1、3至11中任一项所述的方法,其中,iii)中的所述对照样品与所述检测样品相同,但不具有检测样品的内含物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,加入所述线粒体复合物I-功能抑制剂以表明依赖于复合物II底物氧化的细胞呼吸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,以0.1至10μM,如0.5至5μM、1至3μM或约2μM范围的浓度加入所述线粒体复合物I-功能抑制剂。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述线粒体复合物I-功能抑制剂是鱼藤酮。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,加入所述线粒体复合物III-功能抑制剂以测定任何非线粒体耗氧活性,如所述样品的自动氧化,
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,以约0.1至10μg/ml,如约0.5至5μg/ml、约0.75至2μg/ml或1μg/ml的终浓度加入所述线粒体复合物III-功能抑制剂。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述线粒体复合物III-功能抑制剂是抗霉素A。
19.根据权利要求2至18中任一项所述的方法,其中,所述对照样品来自对照组。
20.根据权利要求2至19中任一项所述的方法,其中,所述对照样品在任何处理开始之前采集。
21.根据权利要求1、3至18中任一项所述的方法,用于筛选药物候选物。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,用于检测受试者对药物物质或药物候选物的敏感性。
23.根据权利要求2至20中任一项所述的方法,用于在临床试验中评价检测物质的线粒体毒性。
24.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,用于分析物质对线粒体功能的作用。
25.根据权利要求22所述的方法,其中,所述细胞样品分离自所述受试者。
26.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,用于评价能够刺激线粒体呼吸和ATP产生的化合物。
27.一种方法,包括:
i)使分离自人血液样品的含有活线粒体的细胞样品进行高分辨率呼吸测量,
ii)使所述细胞样品与抑制复合物I呼吸的物质接触,
iii)加入包含介质中的检测物质的检测样品,
iv)加入使质膜透化的物质,
v)将参比物质加入至iv)中获得的所述样品,以及
vl加入抑制复合物III呼吸作用的物质,并且
比较获得的耗氧量与当在步骤iii)中使用所述参比物质且因此省略检测样品的加入而进行所述方法时所获得的耗氧量。
28.根据权利要求27所述的方法,其中,使所述质膜透化的所述物质是洋地黄皂苷。
29.根据权利要求28所述的方法,其中,以5μg/ml至约250μg/ml的浓度加入洋地黄皂苷。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法,其中,所述参比物质是复合物II相关的底物,如琥珀酸盐。
31.根据权利要求30所述的方法,其中,所述参比物质的终浓度是约0.1至约20mM。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法,其中,有关i)-vi)各个步骤的细节如在权利要求3、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、21、24、和/或26中任一项所限定的。
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