MX2015003980A - Prueba de toxicidad mitocondrial. - Google Patents

Abstract

Se describe un método novedoso para el análisis de fármacos. El método es útil para probar los efectos de sustancias en las mitocondrias, notablemente efectos tóxicos o benéficos de sustancias farmacéuticas o sustancias farmacéuticas candidatas. El método se basa en la medición en mitocondrias humanas vivas ex vivo, pero en un entorno lo más cercano a la situación in vivo como sea posible. El método también es útil para probar el impacto de sustancias en la respiración mitocondrial. El método se puede usar para i) análisis y selección de candidatos a fármacos en etapa inicial o posterior en células derivadas de sangre de individuos sanos o en la llamada capa leucocitaria, la cual es una solución concentrada de plaquetas y glóbulos blancos, ii) probar la sensibilidad de un paciente a un tóxico mitocondrial conocido, iii) analizar la toxicidad de fármacos mitocondriales en pruebas clínicas, y/o iv) analizar los efectos benéficos de fármacos destinados a mejorar la función mitocondrial.

Description

PRUEBA DE TOXICIDAD MITOCONDRIAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método novedoso que es útil en el análisis de fármacos. En particular, el método es útil para probar los efectos de sustancias en la mitocondria, notablemente efectos tóxicos o benéficos de sustancias farmacéuticas o sustancias farmacéuticas candidatas. El método se basa en la medición en mitocondrias humanas vivas ex vivo, pero en un entorno tan cerca de la situación in vivo como sea posible. El método también es útil para probar el impacto de las sustancias en la respiración mitocondrial.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el desarrollo de fármacos es difícil calcular si un fármaco tendrá efectos en las mitocondrias productoras de energía cuando se use en humanos. En años recientes, muchos de los fármacos nuevos aprobados por la FDA han sido posteriormente retirados debido a efectos tóxicos tales como cardio o hepatotoxicidad. Así, de los nuevos fármacos que fueron registrados por la FDA entre 1994 y 2006, 38 fármacos fueron retirados debido a efectos tóxicos en el hígado y corazón, los cuales son síntomas típicos de toxicidad mitocondrial. Evidentemente, estos nuevos fármacos pasaron la prueba de toxicidad estándar llevada a cabo antes de su REF.: 254805 aprobación, y los efectos tóxicos sólo fueron observados después de que un gran número de pacientes habían sido tratados con los fármacos. Dykens & Will (2007) señalan que la evidencia indica que la disfunción mitocondrial jugó un papel en la toxicidad de varias sustancias farmacéuticas que fueron retiradas del mercado y sólo reintroducidas con severas restricciones.

Además, en años recientes la función mitocondrial ha recibido mucho interés y se cree generalmente que la disfunción de las mitocondrias es un factor contribuyente a la patogénesis de un gran número de enfermedades (por ejemplo, trastornos musculares, neuropatías, cardiomiopatías, encefalopatía, insuficiencia orgánica múltiple inducida por sepsis).

Actualmente, la toxicidad mitocondrial de los candidatos a fármacos se evalúa principalmente en animales y cultivos celulares, resultados que son difíciles de traducir a uso en humanos futuro.

En consecuencia, existe la necesidad por desarrollar una prueba para toxicidad mitocondrial, que sea sensible, reproducible, confiable y fácil, y la cual se puede usar en pruebas de desarrollo de fármacos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método que incluye componentes de sangre humana que contienen mitocondrias. La ventaja del método desarrollado es la medición de la toxicidad de fármacos (o efectos benéficos) en mitocondrias humanas vivas ex vivo, pero en una situación lo más in vivo posible. Los componentes de sangre humana que contienen mitocondrias (glóbulos blancos y/o plaquetas) son investigados en plasma, lo cual proporciona una relación muy estrecha con la situación in vivo. De esta manera toda la capacidad reguladora de pH, albúmina de suero, electrolitos, enzimas hidrolizantes, etc., están presentes durante las mediciones.

El novedoso método se traducirá directamente en una estimación de una concentración sanguínea tóxica realista en humanos que no es posible en cultivos celulares o estudios con animales, que son los métodos actualmente usados. De esta manera, las sustancias farmacéuticas candidatas pueden ser probadas y analizadas para toxicidad en humanos en una etapa mucho más inicial de la que ahora es posible. A su vez, esto permitirá la eliminación de candidatos a fármacos tóxicos en una etapa más inicial, obviando de esta manera muchas de las pruebas animales y el sufrimiento humano futuro. Facilitará la selección de sustancias farmacéuticas candidatas en una etapa temprana, reduciendo así el tiempo y costo totales del desarrollo de fármacos.

El método también se puede usar en diferentes escenarios con variaciones en la instalación dependiendo del propósito del método.

Así, sin limitar el alcance a la misma, el método de acuerdo con la presente invención se puede usar para: 1. Analizar y seleccionar candidatos a fármacos en etapa inicial o tardía en células derivadas de sangre de individuos sanos o en la llamada capa leucocitaria, que es una solución concentrada de plaquetas y glóbulos blancos. 2. Probar la sensibilidad de un paciente a un agente tóxico mitocondrial. 3. Analizar la toxicidad de fármacos mitocondriales en pruebas clínicas. 4. Analizar los efectos benéficos de fármacos destinados a mejorar la función mitocondrial.

Un método adecuado para analizar y seleccionar candidatos a fármacos potenciales o para probar la sensibilidad de una persona a una sustancia con efecto en mitocondrias (es decir, elementos 1 y 2 arriba) es un método que comprende: i) someter una muestra de células que contenga mitocondrias vivas aisladas de una muestra de sangre humana a respirometría de alta resolución; ii) poner en contacto la muestra de células con una sustancia que incremente la permeabilidad de la membrana mitocondrial interior a protones, iii) añadir una muestra de prueba que comprenda una sustancia de prueba en un vehículo, iv) comparar el consumo de oxígeno antes y después de la adición de la muestra de prueba y comparar el consumo de oxígeno de la muestra de prueba con el consumo de oxígeno de una muestra de control del vehículo, en donde una reducción en el consumo de oxígeno indica un efecto negativo en las mitocondrias, v) poner en contacto la muestra que resulte de iii) con un inhibidor de la función del complejo I mitocondrial, tal como rotenona, para de esta manera elucidar la respiración celular que depende de la oxidación de sustratos de complejo II, y vi) poner en contacto la muestra que resulte de v) con un inhibidor de la función del complejo mitocondrial III, tal como antimicina A, para determinar cualquier actividad consumidora de oxígeno no mitocondrial, tal como auto-oxidación de la muestra.

Un protocolo alternativo para analizar y seleccionar potenciales candidatos a fármacos o para probar la sensibilidad de una persona a una sustancia con efecto en mitocondrias (es decir, puntos 1 y 2 arriba) es investigar el efecto de esta sustancia de prueba en un ensayo de análisis complejo II. Tal método se ilustra en la figura 11 y comprende : i) someter una muestra de células que contengan mitocondrias vivas aisladas de una muestra de sangre humana a respirometría de alta resolución, ii) poner en contacto la muestra de células con una sustancia que inhiba la respiración del complejo I, iii) añadir una muestra de prueba que contenga una sustancia de prueba en un vehículo, iv) añadir una sustancia que permeabilice la membrana de plasma, v) añadir una sustancia de referencia a la muestra obtenida en iv), y v) añadir una sustancia que inhiba la respiración de complejo III.

Los resultados de la prueba se comparan con los resultados obtenidos por el método, en donde la sustancia de prueba usada es idéntica a la sustancia de referencia. Un resultado típico se muestra en la figura 11, que muestra que el fármaco candidato es capaz hasta cierto grado de permear la membrana de plasma (es decir, se logra un incremento en la respiración). La adición de digitonina, la cual hace permeable la membrana de plasma, no da como resultado un incremento adicional en la respiración, es decir, ningún efecto adicional a partir de la sustancia de prueba. Cuando la sustancia de referencia (un substrato ligado a complejo II tal como succinato) es añadida, la cual es típicamente un substrato endógeno tal como un succinato, se observa un incremento en respiración y se logra capacidad máxima. Después se añade un complejo III, tal como antimicina A, para determinar cualquier actividad consumidora de oxígeno no mitocondrial, tal como auto-oxidación de la muestra.

En comparación con los resultados de la sustancia de referencia, la cual es un substrato endógeno tal como un succinato, se observa que la sustancia de referencia no permea la membrana de plasma. Sólo cuando la membrana es permeabilizada, por ejemplo, con digitonina, se incrementa la respiración. La agregación adicional de la sustancia endógena no cambia la respiración mientras que la adición del inhibidor de complejo III detiene la respiración mitocondrial.

Obviamente, el patrón observado con una sustancia de prueba puede diferir del mostrado en la figura 11. El método da información valiosa con respecto a si una sustancia de prueba puede permear la membrana de plasma e influir en la actividad consumidora de oxígeno mitocondrial de una manera positiva (es decir, incremento en la respiración mitocondrial de complejo II). En consecuencia, la sustancia de prueba más ideal tendrá un nivel a que será más alto que a' y en donde el nivel a es o se acerca al nivel b'. Más detalles se dan en los ejemplos de la presente.

Otro enfoque es estudiar la influencia de una sustancia de prueba en la respiración de complejo I, complejo II y/o complejo IV. Al estudiar la respiración de complejos I, II y/o IV se pueden obtener más detalles con respecto al impacto de una sustancia específica en la respiración mitocondrial y para evaluar cualquier efecto positivo o negativo en la función mitocondrial. La figura 14 muestra la influencia de incrementar la concentración de metformina en respiración mitocondrial de complejos I, II y IV. La figura muestra disfunción específica de respiración de complejo I con concentraciones cada vez más altas de metformina, mientras que la respiración de complejo II y IV parece no ser afectada.

La respiración de complejo I (OXPHOSci) fue estimulada por la adición subsecuente de ADP seguido por el substrato de complejo I adicional glutamato (véase figura 3) seguido por la adición de cantidades cada vez más altas de una sustancia de prueba (por ejemplo, metformina).

La respiración de complejo II se obtuvo mediante la adición de un inhibidor de complejo I (por ejemplo, rotenona) a una muestra de células seguida por la adición de cantidades cada vez más altas de una sustancia de prueba.

La respiración de complejo IV se obtuvo al añadir N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD, 0.5 mM), un donador de electrones a complejo IV. Debido al alto nivel de auto-oxidación de TMPD, azida de sodio (10 mM), un inhibidor de complejo IV fue añadida, y la diferencia entre los dos niveles obtenidos se calculó como la actividad de complejo IV específica.

Un método adecuado para investigar los efectos mitocondriales de candidatos a fármacos en pruebas clínicas o en regímenes de tratamiento (es decir, puntos 3 y 4 arriba) es un método que comprende: i) someter una muestra de células que contengan mitocondrias vivas aisladas de una muestra de sangre humana a respirometría de alta resolución, en donde la muestra de células es de una persona sometida a un estudio clínico o a un régimen de tratamiento, y en donde una sustancia de prueba ha sido administrada a la persona durante el estudio clínico o régimen de tratamiento, ii) poner en contacto la muestra de células con una sustancia que incremente la permeabilidad de las membranas mitocondriales interiores a protones, iii) comparar el consumo de oxígeno de la muestra de la persona sujeta al estudio clínico o a un régimen de tratamiento con el consumo de oxígeno de una muestra de control de un grupo de control, en donde una reducción en el consumo de oxígeno indica un efecto negativo en las mitocondrias, iv) poner en contacto la muestra que resulte de iii) con un inhibidor de la función del complejo mitocondrial I, tal como rotenona, para elucidar de esta manera la respiración celular que depende de la oxidación de substratos de complejo II, y v) poner en contacto la muestra que resulte de iv) con un inhibidor de la función del complejo mitocondrial III; tal como antimicina A, para determinar cualquier actividad consumidora de oxígeno no mitocondrial, tal como auto-oxidación de la muestra.

Como puede verse a partir de lo anterior, los métodos son casi idénticos y sólo varían con respecto a qué muestras son probadas, es decir, si es una sustancia de prueba o una muestra de células de una persona sometida ya sea a una prueba clínica o a un régimen de tratamiento. La persona sometida a la prueba clínica o a un régimen de tratamiento recibe una sustancia de prueba o fármaco o una sustancia farmacéutica potencial de acuerdo con la prueba clínica o régimen de tratamiento. Esto significa que las mitocondrias aisladas de una muestra de sangre de tal persona han sido expuestas a la sustancia farmacéutica o sustancia farmacéutica potencial en cuestión y en consecuencia, cualquier efecto de esta sustancia en la respiración mitocondrial puede ser observado por el método descrito en la presente.

La respiración mitocondrial es seguida por el uso de respirometría. Las configuraciones adecuadas se describen en los ejemplos de la presente, pero una persona experta en la téenica sabrá cómo cambiar o ajustar las configuraciones si se requiere o si se usa otro aparato.

La muestra de sangre puede ser una muestra de sangre venosa. Plaquetas o glóbulos blancos o una combinación de los mismos pueden ser aislados o usados.

Ejemplos adecuados de sustancias que incrementan la permeabilidad de las membranas mitocondriales internas a protones son p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP), m-clorofenilhidrazona de cianuro de carbonilo (CCCP), 2,4-dinitrofenol (DNP) u otro protonóforo.

En los ejemplos de la presente y las reivindicaciones anexas, se dan detalles adicionales para los métodos.

A continuación se dan detalles con respecto a los métodos anteriores. 1. Análisis y selección de candidatos a fármaco en etapa inicial o tardía en células derivadas de sangre de individuos sanos o en la llamada capa leucocitaria , que es una solución concentrada de plaquetas y glóbulos blancos Este método comprende i) someter una muestra de células que contengan mitocondrias vivas aisladas de una muestra de sangre venosa humana a respirometría de alta resolución a concentraciones de oxígeno en el intervalo de 400-25 mM de O2 a una temperatura constante de 37°C, ii) poner en contacto la muestra de células con una sustancia que incremente la permeabilidad de las membranas mitocondriales interiores a protones tales como p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP), m-clorofenilhidrazona de cianuro de carbonilo (CCCP), 2,4-dinitrofenol (DNP) u otro protonóforo para obtener capacidad máxima del sistema de transporte de electrones de las mitocondrias presentes en las plaquetas, iii) añadir una muestra de prueba que comprenda una sustancia de prueba en un vehículo; la adición es normalmente en una dosis que se incrementa gradualmente, en comparación con la adición de vehículo, iv) comparar el consumo de oxígeno antes y después de la adición de la muestra de prueba y comparar el consumo de oxígeno entre la prueba y el vehículo, en donde una reducción en el consumo de oxígeno indica un efecto negativo en las mitocondrias, v) poner en contacto la muestra que resulte de iii) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial I, tal como rotenona, para elucidar así la respiración celular dependiente de oxidación de los substratos de complejo II, y vi) poner en contacto la muestra que resulte de v) con el inhibidor de la función de complejo mitocondrial III, tal como antimicina A, para determinar cualquiera actividad consumidora de oxígeno no mitocondrial tal como auto- oxidación de la muestra.

La reducción puede ser significativa o depender de la dosis.

Como se mencionó arriba, la muestra de sangre humana es de individuos sanos. Normalmente la muestra se obtiene como se describe en los ejemplos de la presente. Las células son normalmente ya sea plaquetas o glóbulos blancos o una combinación de los mismos.

Las células pueden ser suspendidas en plasma humano (en algunos casos el propio plasma del sujeto) o puede suspenderse en amortiguador acuoso que contenga por ejemplo sacarosa, HEPES, k-lactobionato, cloruro de magnesio, fosfato diácido de potasio, EGTA y BSA o cualquier otro amortiguador adecuado. El pH se ajusta normalmente a un pH de entre 7.0 y 7.5, notablemente 7.1. Normalmente, la disolución en plasma se prefiere para plaquetas intactas o para glóbulos blancos para de esta manera imitar la mejor situación in vivo posible. Sin embargo, en ciertas situaciones, o como un complemento de la disolución en plasma, se puede usar una solución salina reguladora de pH de fosfato con la adición de 5 mM de glucosa (se puede usar para la comparación con las corridas de plasma), o un tipo más intracelular de amortiguador que contenga intermedios de ciclo de Kreb para plaquetas permeabilizadas o glóbulos blancos. El tipo intracelular se usaría para plaquetas permeabilizadas (y glóbulos blancos) y donde los substratos respiratorios mitocondriales estarían presentes en exceso (en cantidades saturables) para maximizar el transporte de electrones e incrementar la resolución del ensayo.

Las células obtenidas de la muestra de sangre humana pueden ser ensayadas ya sea intactas o permeabilizadas.

Se usan diferentes protocolos experimentales pueden ser usados dependiendo de si plaquetas o glóbulos blancos intactos o permeabilizados (protocolo SUIT - titulación de substrato-desacoplador-inhibidor). En general, se usan plaquetas o glóbulos blancos intactos. Las plaquetas o glóbulos blancos permeabilizados se usan para acumular tanta información como sea posible sobre la capacidad de los diferentes complejos respiratorios durante un experimento. La permeabilización de la plaqueta se lleva a cabo al someter las células a digitonina u otras sustancias que hacen a la membrana de plasma de las células permeable a substratos y ADP. Otras sustancias pueden ser saponina o triton-x. Como se ve a partir de los ejemplos de la presente, una dosis óptima de digitonina se encontró que era di mg/lx 106 plaquetas.

Las células se suspenden normalmente en la cámara de vidrio del aparato a una concentración de 200 x 106/ml a 400 x 106/ml.

La muestra de prueba puede añadirse varias veces a concentraciones cada vez más altas para identificar de esta manera la concentración mínima que dé un efecto negativo en las mitocondrias (es decir, efecto tóxico). La concentración inicial y final de la sustancia de prueba depende de la potencia de la sustancia, pero normalmente están en un intervalo a partir de la escala submicromolar a la milimolar.

Así, el método se puede usar para determinar qué niveles de dosis son seguros y cuáles no y, en consecuencia, deben ser evitados.

El método también se puede usar para comparar dos o más sustancias farmacéuticas o sustancias farmacéuticas candidatas entre sí para identificar de esta manera la sustancia con el perfil más seguro. Así, el método se repite con las demás sustancias bajo investigación y los resultados obtenidos son comparados. La sustancia que tenga la reducción más baja en respiración en comparación con el nivel normal es la sustancia más segura con respecto a los efectos tóxicos mitocondriales.

Las figuras 7-9 muestran el resultado de esta comparación. La figura 7 muestra los resultados obtenidos a partir de dos experimentos con antidiabéticos; uno incluye titulación con la sustancia farmacéutica troglitazona y el otro experimento con el uso de rosiglitazona. La figura 7 demuestra claramente que la rosiglitazona es una sustancia farmacéutica más segura que la troglitazona con respecto a la toxicidad mitocondrial. La troglitazona ya no está en el mercado debido a efectos tóxicos.

La figura 8 muestra los resultados obtenidos a partir de dos experimentos usando minocielina y doxiciclina, las cuales indican que la doxiciclina es más segura que la minociclina.

La figura 9 muestra los resultados obtenidos a partir de dos experimentos usando cerivastatina y simvastatina, que demuestran que la simvastatina es más segura que la cerivastatina. De hecho, la cerivastatina ya ha sido retirada del mercado, mientras que la simvastatina aún está en el mismo. p-(Trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP) u otra sustancia que incrementa la permeabilidad de la membrana mitocondrial interior a protones se añade para obtener capacidad máxima del sistema de transporte de electrones de las mitocondrias presentes en las plaquetas. Como se ve de los ejemplos en la presente una concentración de aproximadamente 5 a alrededor de 100 mM da una respuesta adecuada. Cuando se usa plasma para disolver el sedimento de plaquetas, se encontró que un concentración óptima era de aproximadamente 100 mM con un intervalo adecuado de alrededor de 50 a aproximadamente 200 mM, y cuando se usó solución salina amortiguada con fosfato (PBS) una concentración más baja fue óptima, en particular aproximadamente 6 mM con un intervalo de 2 a aproximadamente 20 mM.

En un punto en tiempo adecuado después de que la sustancia de prueba ha sido añadida (tal como de 1 a 10 min), se añaden secuencialmente un inhibidor de complejo I (CI) tal como rotenona y un inhibidor de complejo III (CIII) tal como antimicina-A para inhibir el sistema de transporte de electrones (ETS) que proporciona el consumo de oxígeno no mitocondrial y residual, lo cual se resta de los parámetros respiratorios diferentes en análisis adicionales. Este procedimiento hace posible la evaluación de la respiración mitocondrial específica y también puede revelar propiedades de auto-oxidación de compuestos probados.

La rotenona se añade en una cantidad que corresponde a una concentración final en la muestra de aproximadamente 2 mm con un intervalo de alrededor de 1 a aproximadamente 5 mM. Si otro inhibidor de complejo I es usado la concentración final debe tener un tamaño que lleve al mismo efecto a que si se usa rotenona.

La antimicina-A se añade en una cantidad que corresponde a una concentración final en la muestra de aproximadamente 1 mg/ml con un intervalo de alrededor de 0.1 a aproximadamente 10 pg/ml. Si se usa otro inhibidor de complejo III la concentración final debe tener un tamaño que lleve al mismo efecto que si se usa antimicina-A.

La antimicina-A siempre se añade después de la rotenona para poder determinar la actividad de complejo II después de la inhibición de complejo I.

Los detalles de los experimentos aparecen de los ejemplos y reivindicaciones en la presente. 2. Prueba de la sensibilidad de un paciente a un agente tóxico mitocondrial conocido Actualmente muchos de los agentes tóxicos mitocondriales conocidos están registrados y son usados. Sin embargo, el médico quisiera saber, antes de que se inicie el tratamiento con un fármaco, si el paciente es sensible a estos fármacos. Un ejemplo es el fármaco anti-epiléptico ampliamente usado ácido valproico, el cual puede causar severo daño cerebral o hepático si se da a los pacientes equivocados.

Este método es en esencia el mismo que el descrito en i) arriba. El método comprende i) someter células que contengan mitocondrias vivas aisladas de una muestra de sangre venosa humana a respirometría de alta resolución a concentraciones de oxígeno en el intervalo de 400-25 mM de 02 a una temperatura constante de 37°C, ii) poner en contacto la muestra de células con p- (trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP) u otra sustancia que incremente la permeabilidad de la membrana mitocondrial interior a protones para obtener capacidad máxima del sistema de transporte de electrones de las mitocondrias presentes en las plaquetas, iii) añadir una muestra de prueba que comprenda la sustancia en una dosis que se incremente gradualmente, en comparación con la adición de vehículo, iv) comparar el consumo de oxígeno antes y después de la adición de la muestra de prueba, en donde una reducción en el consumo de oxígeno indica un efecto negativo en la mitocondria, v) poner en contacto la muestra que resulte de iv) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial I, tal como rotenona, para elucidar así la respiración celular dependiente de oxidación de substratos de complejo II, y vi) poner en contacto la muestra que resulte de v) con el inhibidor de la función de complejo mitocondrial III, tal como antimicina A, para determinar cualquier actividad consumidora de oxígeno no mitocondrial, tal como auto-oxidación de la muestra.

Aquí, la muestra de sangre humana se tomó de un paciente que puede sufrir un tratamiento específico con una sustancia farmacéutica o sustancia farmacéutica candidata específica y la muestra de prueba contiene la sustancia farmacéutica o sustancia farmacéutica candidata específica.

Como se describió arriba en 1), la muestra de prueba puede ser añadida varias veces a concentraciones cada vez más altas para identificar la concentración mínima que dé efecto negativo en la mitocondria (es decir, efecto tóxico). La concentración inicial y final de la sustancia de prueba depende de la potencia de la sustancia, pero normalmente será hasta 10 veces los niveles mínimos o en estado estacionario para compensar la acumulación de fármaco en tejidos.

Así, el método se puede usar para determinar qué niveles de dosis que son seguros y cuáles no, y en consecuencia, deben ser evitados.

El método también puede usarse para determinar qué sustancia farmacéutica de una serie de posibilidades debe ser seleccionada para el paciente particular. Así, el método puede incluir la comparación de dos o más sustancias farmacéuticas o sustancias farmacéuticas candidatas entre sí para poder identificar la sustancia con el perfil más seguro en el paciente en cuestión. De esta manera, el método se repite con otras sustancias y los resultados obtenidos se comparan. La sustancia que tenga la reducción más baja en respiración en comparación con el nivel normal es la sustancia más segura con respecto a los efectos tóxicos mitocondriales para el paciente en cuestión.

Todos los detalles relacionados con las partes individuales del método son como los descritos en la presente arriba y se hace referencia a los mismos. 3. Análisis de la toxicidad de fármacos mitocondriales en pruebas clínicas La prueba clínica puede ser cualquier prueba, por ejemplo, estudios de búsqueda de dosis, estudios de seguridad en humanos, etc., y el método se basa en una toma de muestras de sangre simple. Tanto los efectos a corto plazo, agudos, a largo plazo y crónicos pueden ser evaluados. Un ejemplo sorprendente es la medicación para V1H, la cual puede dar síntomas de insuficiencia mitocondrial después de uso a largo plazo (debido a la depleción de ADN mitocondrial). Para este fin es una gran ventaja del presente método que hace posible la determinación de la toxicidad combinada de la sustancia farmacéutica así como sus metabolitos circulantes en el plasma del sujeto.

Tal método es esencialmente el mismo que el descrito arriba, pero la muestra de sangre humana se toma del sujeto inscrito en el estudio y de individuos sanos que funcionan como un grupo de control. En consecuencia, el sujeto ha recibido una sustancia farmacéutica o una sustancia farmacéutica potencial antes de que se tome la muestra de sangre. La respiración mitocondrial puede ser seguida durante el régimen de tratamiento o estudio clínico completo al tomar regularmente una muestra de sangre del sujeto en cuestión .

Así, tal método comprende más específicamente i) someter células que contengan mitocondrias vivas aisladas de una muestra de sangre venosa humana a respirometría de alta resolución a concentraciones de oxígeno en el intervalo de 400-25 mm de O2 a una temperatura constante de 37°C, en donde la muestra de sangre humana se obtiene de una persona sometida a un estudio clínico o a un régimen de tratamiento, y en donde una sustancia de prueba ha sido administrada a la persona durante el estudio clínico o régimen de tratamiento, ii) poner en contacto la muestra de células con p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP) u otra sustancia que incremente la permeabilidad de la membrana mitocondrial interior a protones para obtener capacidad máxima del sistema de transporte de electrones de las mitocondrias presentes en las plaquetas, iii) comparar el consumo de oxígeno de la muestra de sangre humana de una persona sometida al estudio clínico o régimen de tratamiento con el consumo de oxígeno de una muestra de sangre humana de una persona de un grupo de control, en donde una reducción en el consumo de oxígeno en comparación con el control indica un efecto negativo en las mitocondrias, iv) poner en contacto la muestra que resulte de ii) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial I, tal como rotenona, para elucidar así la respiración celular dependiente de oxidación de substratos de complejo II, y v) poner en contacto la muestra que resulte de iv) con el inhibidor de la función de complejo mitocondrial III; tal como antimicina A, para determinar cualquier actividad consumidora de oxígeno no mitocondrial, tal como auto-oxidación de la muestra.

En el presente contexto un estudio clínico puede ser cualquier estudio que incluya estudios preclínicos y estudios de seguridad a largo plazo. Como se vio de lo anterior, la persona también puede ser un paciente que sufra de una enfermedad o trastorno y sea sometida a un régimen de tratamiento con una o más sustancias farmacéuticas o sustancias farmacéuticas candidatas.

Las muestras pueden ser de un individuo o pueden ser muestras agrupadas de más individuos. En algunos casos el plasma se recolecta de pacientes que sufren tratamiento con un fármaco en pruebas iniciales o de otro modo. El plasma debe ser centrifugado y se puede congelar y almacenar hasta que pueda hacerse el análisis. El plasma contendría fármaco de origen así como metabolitos farmacéuticos (los cuales pueden ser tan tóxicos como o más mitocondrias que el fármaco de origen). El plasma sería descongelado y las plaquetas o glóbulos blancos (BC, por sus siglas en inglés) sanos podrían ser sumergidos en este plasma para ver si afectaría la función mitocondrial. Hay varios beneficios con esto incluyendo que no hay necesidad de transportar sangre de pruebas clínicas urgentemente para análisis.

Todos los detalles relacionados con las partes individuales del método son como los descritos aquí y se hace referencia a los mismos. 4. Análisis de los efectos benéficos de fármacos destinados a mejorar la función mitocondrial Grandes programas de análisis antes de pruebas clínicas pueden ejecutarse en células derivadas de sangre de individuos sanos o de capa leucocitaria. El análisis también se puede llevar a cabo en la sangre del paciente (comúnmente niños) antes del tratamiento y durante el tratamiento y después de cambios en la dosis.

El método es esencialmente idéntico al método descrito en el punto 3, pero las muestras de sangre humana se toman de los pacientes antes y durante el tratamiento o después de cambios en la dosis o ruta o forma de administración. Las muestras son analizadas y los resultados comparados. Así, una primera muestra de sangre se puede tomar antes del tratamiento (o cualquier cambio en el tratamiento) y una segunda muestra de sangre se puede tomar durante el tratamiento o después de cualquier cambio en el tratamiento. El efecto del tratamiento también puede ser seguido por probar las muestras tomadas actualmente durante el tratamiento.

Así, este método comprende i) someter células que contengan las mitocondrias vivas aisladas de una muestra de sangre venosa humana a respirometría de alta resolución a concentraciones de oxígeno en el intervalo de 400-25 mM de O2 a una temperatura constante de 37°C, y en donde una sustancia de prueba ha sido administrada a la persona antes de que se tome la muestra de sangre, ii) poner en contacto la muestra de célula con p- (triflouorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP) u otra sustancia que incremente la permeabilidad de la membrana mitocondrial interior a protones para obtener capacidad máxima del sistema de transporte de electrones de las mitocondrias presentes en las plaquetas, y iii) comparar el consumo de oxígeno de una primera muestra de sangre humana con el consumo de oxígeno de una segunda muestra de sangre, en donde una reducción en el consumo de oxígeno indica un efecto negativo en las mitocondrias y un incremento en el consumo de oxígeno indica un efecto positivo en las mitocondrias, iv) poner en contacto la muestra que resulte de ii) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial I, tal como rotenona, para elucidar así la respiración celular dependiente de oxidación de substratos de complejo II, y v) poner en contacto la muestra que resulte de iv) con el inhibidor de función de complejo mitocondrial III, tal como antimicina A, para determinar cualquier actividad consumidora de oxígeno no mitocondrial, tal como auto-oxidación de la muestra.

El resultado se compara con un control o referencia.

Las etapas i)-v) pueden repetirse con una tercera, cuarta, quinta, etc., muestras dependiendo del tipo de cambio que se investigue.

La primera muestra puede ser una muestra de control, es decir, una muestra de sangre tomada antes de que se inicie cualquier tratamiento. Como alternativa, la primera y la segunda muestras representan muestras de sangre tomadas en diferentes puntos en tiempo durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, si un régimen de tratamiento dura una semana, la primera muestra puede tomarse el día 1 (muestra de referencia) y la segunda muestra el día 2 (y muestras adicionales tomarse en los días siguientes). Si se cambia un régimen de dosis, la primera muestra de sangre puede tomarse antes de que la dosis sea cambiada y la segunda muestra después de que la dosis sea cambiada.

La figura 10 muestra las trazas experimentales de un efecto benéfico y tóxico en la respiración mitocondrial de un candidato a fármaco potencial en comparación con un control.

Todos los detalles con respecto a las partes individuales del método son como los descritos en la presente y se hace referencia a los mismos.

Función de las mitocondrias La disfunción mitocondrial se reconoce en las enfermedades de la cadena respiratoria primaria debido a mutaciones en el ADN nuclear o mitocondrial y también está implicada en trastornos tales como Huntington, Alzheimer y enfermedad de Parkinson así como el resultado de inflamación excesiva tal como en sepsis (Brealcy et al., 2002; Ferreira et al., 2010; Kones, 2010; Rosenstock et al., 2010).

El estudio de la función mitocondrial es esencial tanto para una investigación básica de la fisiología mitocondrial y de los mecanismos patógenos, como para el diagnóstico de enfermedades mitocondriales. Un método común para investigar la función mitocondrial es la determinación de la actividad enzimática máxima de los complejos del sistema de transporte de electrones (ETS, por sus siglas en inglés) individuales en mitocondrias interrumpidas por espectrofotometría. El beneficio de este procedimiento es un fácil almacenamiento y transporte a las instalaciones en laboratorios centrales con análisis de alta emisión toda vez que las muestras pueden ser congeladas (Haas et al., 2008). Sin embargo, la mitocondria y sus componentes no funcionan como unidades aisladas. Los complejos de cadena respiratoria son interconectados en el ETS que a su vez se acumulan a complejo de varias enzimas y súper complejos (Lenaz y Genova, 2009). Las mitocondrias sufren fusión y fisión, forman redes e interferencia con otros compartimientos subcelulares (Picard et al., 2011). Esto resalta claramente la necesidad de analizar la función mitocondrial sin, o al menos con muy poca interrupción celular y con un ambiente lo más fisiológico posible. Esto puede lograrse usando mediciones polarográficas de respiración mitocondrial en células (Kitchens y Newcomb, 1968). La respiración puede ser analizada en células intactas con medios circundantes naturales, tales como plasma, utilizando substratos endógenos. Además, con la permeabilización de la membrana celular se puede lograr un acceso directo a la mitocondria para substratos e inhibidores exógenos, y complejos individuales del ETS investigarse sin la necesidad de interrupción celular y purificación mitocondrial (Hutter et al., 2006).

Cuando se selecciona qué tejido investigar para la evidencia de disfunción mitocondrial, la mejor opción es el tejido más profundamente afectado por el proceso de enfermedad en un paciente dado. Sin embargo, esto es raramente posible debido a la invasividad y riesgos asociados con biopsias de órganos internos tales como el cerebro, corazón e hígado. Por lo tanto, otros tejidos se usan y más comúnmente células musculares y fibroblastos de piel (Haas et al., 2008).

Las plaquetas son una fuente fácilmente obtenible de mitocondrias viables y la toma de muestras es menos invasiva en comparación con biopsia de músculo o piel. Las alteraciones mitocondriales en plaquetas han sido demostradas en una variedad de enfermedades, afectando principalmente otros sistemas de órganos (Hauptmann et al., 2006; Krige et al., 1992) así como en el proceso de envejecimiento (Merlo Pich et al., 1996; Xu et al., 2007) y ha sido por lo tanto propuesta para servir como un marcador potencial de la disfunción mitocondrial sistémica (Sjóvall et al., 2010; Xu et al., 2007). Asimismo, las plaquetas son muy adecuadas para el análisis polarográfico (Kitchens y Newcomb, 1968; Sjóvall et al., 2010).

Desarrollo de un método de acuerdo con la invención El objetivo del estudio reportado en la sección experimental era establecer una metodología y hacer una evaluación a profundidad de la función respiratoria de las plaquetas normales ex vivo en células viables intactas y la función de complejos individuales en células permeabilizadas usando respirometría de alta resolución. En segundo lugar, el impacto del almacenamiento en ambiente frío y a temperatura ambiente fueron estudiados, la influencia del género y edad y en tercer lugar, la consistencia del método aplicado a diferentes cohortes de referencia.

Para detalles relacionados con la disposición experimental se hace referencia a la sección experimental.

Se presentan datos que reflejan función respiratoria mitocondrial de plaquetas normales de varias cohortes de referencia diferentes. La fosforilación oxidante equivale a aproximadamente 85% de la producción de energía en la plaqueta en el descanso (Kilkson et al., 1984) y aparte la glicólisis, b-oxidación de ácidos grasos también contribuye al suministro del substrato (Cesar et al., 1987). Una capacidad respiratoria disponible de plaquetas intactas, es decir, qué tanta respiración se puede incrementar por el desacoplador FCCP a partir del estado de rutina, fue más alta en plaquetas suspendidas en plasma en comparación con PBS como se indica por las referencias en ETS/rutina (tabla 2). Esto probablemente refleja los tipos y niveles variables de suministro en substrato en los diferentes medios. La capacidad respiratoria disponible de plaquetas intactas fue de aproximadamente 64%, cuando los experimentos fueron llevados a cabo en PBS con glucosa únicamente como substrato exógeno, en comparación con aproximadamente 88% cuando las células fueron incubadas y analizadas en su propio plasma en donde tienen un suministro de substrato fisiológico. Cuando se expusieron a oligomicina, la capacidad respiratoria disponible fue generalmente más baja, aproximadamente 28% en PBS-glucosa y 25% en plasma, reflejando posiblemente vías de oxidación dependientes de energía comprometidas de glucosa y otros substratos en células con producción de ATP inhibida.

En células permeabilizadas, tanto glicólisis como b-oxidación son derivadas al proporcionar cantidades saturantes de substratos al ciclo de ácido cítrico. El resultado es un ETS y circuito de protones que pueden evaluarse sin que los substratos sean limitadores de la velocidad. Un consumo de oxígeno máximo, ya sea estimulado por ADP (acoplado) o FCCP (desacoplado), podría ser incrementado por -50% adicional en células permeabilizadas en comparación con células intactas. Esto sugiere una etapa limitadora de velocidad del suministro de substrato en células intactas estimuladas que no está presente en el estado en reposo toda vez que la respiración de rutina fue similar no obstante el medio de suspensión. Plaquetas intactas usan NADH y entrada de electrones a través del complejo I casi exclusivamente ya que ninguna respiración conducida por complejo II fue detectable después de la inhibición de complejo I por rotenona. El descubrimiento de que los valores de respiración de ETS de células intactas estuvieron en el mismo intervalo que para OXPHOSci de células permeabilizadas dio más sustento a esta noción. Esto también enfatiza la importancia de alimentar el ETS con electrones tanto de complejo I como de complejo II en la unión Q para establecer así un transporte de electrones máximo en células permeabilizadas. Con un suministro de substrato no restringido, el complejo I contribuye aproximadamente 2/3 y el complejo II 1/3 de la respiración total a una entrada de electrones convergente. No se observó que la ATP sintasa causara ninguna limitación de velocidad significativa ya que la capacidad respiratoria estimulada por ADP y FCCP máxima fue similar con una relación OXPHOSci+n/ETSci+n cerca de uno. Asimismo, la respiración de las plaquetas presentó un estrecho acoplamiento a la fosforilación oxidante como lo demuestra una baja respiración LEAK en relación con una capacidad respiratoria máxima y relaciones ETS/LEAK correspondientemente altas en células tanto intactas como permeabilizadas. Observamos un estado LEAK más alto en células permabilizadas comparadas con intactas. Aunque la permeabilización de la membrana de plasma con digitonina podría afectar la permeabilidad de la membrana mitocondrial, esto no es sustentado por nuestros descubrimientos toda vez que hubo un gran margen de seguridad de la concentración de digitonina observada en los experimentos de titulación de digitonina. Tampoco hubo efecto en la respiración por citocromo C exógeno y de esta manera la membrana exterior mitocondrial permaneció intacta. Una explicación más probable es que con un suministro de substrato saturante un gradiente de protones más alto a través de la membrana interior puede generarse incrementando la respiración de LEAK toda vez que esta velocidad de respiración básica se mantiene en proporción con la fuerza motriz de protones (Nicholls, 1977).

La reducción en la función mitocondrial con la edad ha estado ampliamente implicada (Lesnefsky y Hoppel, 2006; Vendelbo y Nair, 2011). En plaquetas observamos una reducción en la respiración de complejo II con la edad sin un efecto en la función respiratoria general, un efecto principalmente relacionado con una diferencia entre la cohorte pediátrica y adulta. La reducción en la respiración pareció ser específica de complejo II toda vez que un efecto más descendente en complejo III, complejo IV o la ATP-sintasa también debió haber influido en la actividad OXPHOS o ETS máxima.

La diferencia entre la respiración de rutina y la respiración LEAK se atribuye generalmente a la producción de ATP en descanso. Ya que el estado LEAK permaneció al mismo nivel a lo largo del periodo de vida estudiado, el incremento en la respiración de rutina observado en la presente sugeriría una producción de ATP basal incrementada con la edad. Generalmente hay una reducción en la velocidad metabólica en descanso con la edad (Johannsen y Ravussin, 2010) pero cómo afecta a varios tejidos aún no está claramente elucidado. Por qué las plaquetas requerirían de una producción de ATP basal incrementada con la edad no es claro a partir del presente estudio.

En comparación con las contrapartes suecas adultas, los voluntarios japoneses presentaron una respiración LEAK aproximadamente 27% más alta. Esto dio como resultado una ETScu/LEAK incrementada significativamente en la respiración impulsada por substrato de complejo II pero una OXPHOSci/LEAK y OXPHOSci+n/LEAK significativamente reducidas. Los japoneses y caucásicos han reportado presentar diferencias en patrones de enfermedad (Benfante, 1992). Esto se ha explicado por diferencias tanto genéticas pero también debido a los factores de alimentación y estilo de vida ya que las diferencias, en gran medida, desaparecen en la población migratoria (Yamori, 2006). La comida japonesa es tradicionalmente rica en pescado y otros productos del mar que tienen un alto contenido de FFA con propiedades desacoplantes (Cha et al., 2001; Davis et al., 2008). Un desacoplamiento leve ha sido sugerido como benéfico en términos de envejecimiento debido a una fuerza motriz de protones reducida y como resultado menos producción de arroz (Brand, 2000). ADN Mitocondrial japonés es dominado por el haplogrupo D en comparación con el europeo en donde el haplogrupo H es predominante. Con respecto al tamaño de muestra pequeño, las diferencias vistas en nuestro estudio podrían entonces ser ya sea genéticas o relacionadas con el estilo de vida o una combinación de ambas. Estudios adicionales se requieren para aclarar estas materias. Los niveles de respiración de muestras de cordón umbilical fueron generalmente más altos en comparación con las demás cohortes. Esto es probablemente un reflejo de los diferentes requisitos entre la vida intra y extrauterina. Sin embargo, datos sobre la función mitocondrial en vida fetal son escasos (Yanicostas et al., 2011).

El método presentado podría servir potencialmente como un auxiliar a la presente evaluación estándar de enfermedad mitocondrial sospechosa que normalmente incluye biopsias musculares. De esta manera estamos actualmente recolectando datos de varias cohortes diferentes tales como pacientes con trastornos neurodegenerativos y niños recién nacidos con trastornos mitocondriales sospechados. Queríamos por lo tanto evaluar las limitaciones presentadas por el almacenamiento y volumen de muestra pequeño. Incluso a pesar de que el almacenamiento en viales de EDTA no es un medio optimizado para plaquetas, parece haber sólo alteraciones menores en la función respiratoria después de 24 horas de almacenamiento en sangre. Para efectos de diagnóstico, una muestra podría entonces ser potencialmente transportada a instalaciones centrales durante distancias más largas con posibilidad conservada de análisis de la capacidad respiratoria en plaquetas viables. En niños muy pequeños puede haber limitaciones de qué tanta sangre puede ser extraída para diferentes análisis y por lo tanto evaluamos cómo las concentraciones de plaquetas podrían usarse y aún obtener valores confiables. A 50 x 106 plaquetas/ml el consumo de oxígeno absoluto fue de sólo aproximadamente 25 nmol/ml para un experimento complejo. Los estados respiratorios no fueron afectados cuando se evaluaron a diferentes concentraciones con la excepción de ETSci+n, que fue ligeramente reducido a 50 x 106 plaquetas/ml. La razón de esto no está completamente clara pero el efecto máximo de FCCP y su impacto de unión no específica a otras membranas celulares puede ser alterado con el contenido celular reducido incluso si se titula cuidadosamente.

La fuerza del presente método es la capacidad para combinar análisis de plaquetas tanto intactas como permeabilizadas. El análisis de células intactas suspendidas en el propio plasma del sujeto es un escenario experimental probablemente muy similar a las condiciones fisiológicas. Esto hace posible estudiar no sólo defectos genéticos inherentes sino también defectos mitocondriales inducidos por factores exógenos tales como toxinas o farmacéuticos. Información adicional puede obtenerse de células permeabilizadas en donde protocolos de titulación diferentes (SUIT) pueden ser usados para desplazar el control de flujo a diferentes partes del sistema respiratorio para elucidar en dónde se sitúa la patología.

Aunque la respirometría puede considerarse como uno de los métodos preferidos para evaluar la función bioenergética mitocondrial (Brand y Nicholls, 2011), y las mitocondrias plaquetarias parecen ser una buena fuente de mitocondrias humanas viables, el método tiene limitaciones. Las enfermedades que afectan las mitocondrias pueden ser más o menos específicas de tejido y se sabe que las mutaciones en mtADN son expresadas a diferentes relaciones en diferentes tejidos, un fenómeno conocido como heteroplasmia. De esta manera, las alteraciones podrían no ser reconocidas si no están presentes sustancialmente en el tejido analizado. Las células tienen la capacidad de compensar niveles cada vez más bajos de ATP y normalmente exhiben un umbral cuando la compensación ya no se puede presentar y sigue una insuficiencia de órganos (Rossignol et al., 2003). Es entonces difícil predecir a qué nivel una respiración mitocondrial reducida podría considerarse patológico. Sin embargo, todas las limitaciones anteriores no son únicas para el presente método sino que existen independientemente de qué tejido o téenica esté siendo usada. Con el presente protocolo de titulación no incluimos mediciones específicas de complejo IV que normalmente se lleva a cabo por el donador de electrones artificial TMPD en conjunto con ascorbato para mantener TMPD reducido. TMPD/ascorbato se somete a auto-oxidación catalizada por diferentes proteínas que contienen metal (tales como citocromo c) y es también dependiente de la concentración de oxígeno. Debido a la naturaleza de la preparación de nuestras muestras, la cantidad de material celular inespecífico y plasma varían y por lo tanto no es posible hacer cualquier corrección de fondo para auto-oxidación de TMPD/ascorbato.

Conclusión Mediciones respiratorias de plaquetas son muy adecuadas para estudiar mitocondrias humanas en condiciones fisiológicas ex vivo. Se demuestra que resultados confiables pueden ser obtenidos con pequeñas cantidades de muestra y después de almacenamiento hasta 24 horas usando respirometría de alta resolución. Al aplicar diferentes protocolos SUIT, información detallada de la capacidad respiratoria de las células y diferencias entre diferentes cohortes pueden obtenerse y describimos cómo evaluar estos resultados. Este enfoque puede ser adecuado para evaluar trastornos mitocondriales desencadenados en forma exógena así como endógenos y estamos actualmente evaluando el método para estos fines.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Trazo representativo de titulación de digitonina. Plaquetas a una concentración de 100* 106/ml suspendidas en amortiguador MÍR05 contienen inicialmente succinato 5 mM y ADP 1 mM. Después de la estabilización un complejo de respiración de rutina I fue inhibido por rotenona seguido por titulación con digitonina gradual (20 pg) hasta que ya no se detectar incremento adicional.

Figura 2. Protocolo experimental de plaquetas intactas. La respiración endógena (de rutina) fue seguida por la inducción de respiración independiente de complejo V (LEAK) por oligomicina (1 mg/ml). Respiración máxima fue lograda por titulación del protonófero, p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP, en una concentración media de PBS de 6 mM, en concentración mediana de plasma de 100 mM) seguida por rotenona (2 mM) y posteriormente antimicina-A (1 pg/ml), inhibición de complejo I y III, respectivamente, para la medición del consumo de oxígeno residual. Los estados respiratorios inducidos y los substratos respiratorios usados se indican arriba de la gráfica. ETS = Sistema de transporte de electrones.

Figura 3. Protocolo experimental de plaquetas permeabilizadas. Traza de experimento que muestra velocidad de consumo de oxígeno usando un substrato, desacoplador, protocolo de titulación de inhibidor. Estados respiratorios inducidos y complejos respiratorios activados se definen arriba de la gráfica. Plaquetas fueron permeabilizadas con digitonina y los substratos de complejo I (CI) malato y piruvato (5 mM, respectivamente) fueron añadidos simultáneamente. La fosforilación oxidante (OXPHOS) fue estimulada por la adición subsecuente de ADP (1 mM) seguida por el substrato de complejo I adicional glutamato (5 mM). La adición del substrato ligado a complejo II (CII) succinato (10 mM) hizo posible una entrada de electrones convergente tanto por medio del complejo I como del complejo II. OXPHOS Fue inhibido por oligomicina (1 m / l) revelando una respiración independiente de complejo V (LEAK): La capacidad respiratoria máxima del sistema de transferencia de electrones (ETS) fue inducida por titulación del protonófero, p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP, concentración media de 6 mM)). La inhibición de complejo I por rotenona (2 mM) reveló respiración sustentada por complejo II. El consumo de oxígeno no mitocondrial residual fue expuesto por la adición del inhibidor de complejo III antimicina-A (1 mg/ml). La adición de TMPD (0.5 mM) y azida (10 mM) no es presentada. Los estados respiratorios inducidos y los substratos respiratorios usados se indican arriba de la gráfica.

Figuras 4A-4D. Correlación de edad y sexo con respiración mitocondrial plaquetaria. Figura 4A, correlación entre respiración rutinaria con la edad, los puntos individuales son medias de valores duplicados. Figura 4B, correlación entre respiración de ETSCII y Figura 4C, OXPHOSCI+II y edad. Figura 4D, comparación de la respiración de ETSCI+II entre género. Para una definición de los estados respiratorios véase la figura 3.

Figura 5. Efecto de la concentración plaquetaria en diferentes estados de respiración en plaquetas permeabilizadas. Consumo de oxígeno en diferentes etapas del substrato, protocolo de titulación de inhibidor a concentraciones que varían de 50 a 400* 106 plaquetas/ml. Para definición de los estados respiratorios véase figura 3. N = 5, cada experimento se llevó a cabo por duplicado, * = p < 0.05.

Figura 6. Efecto del almacenamiento en diferentes estados respiratorios en plaquetas permeabilizadas. La sangre se almacenó en tubos vacutainer de K2EDTA en una mesa en inclinación ya sea a temperatura ambiente o a 4°C. A 72 horas todos los parámetros excepto la respiración LEAK fueron reducidos significativamente en comparación con tiempo 0. Para definición de los estados respiratorios véase figura 3. N = 4, cada experimento se hizo por duplicado, * = p < 0.05.

Figura 7. Trazo experimental de ensayo de toxicidad mitocondrial de troglitazona y rosiglitazona. Plaquetas humanas a 200*106 células/ml en un amortiguador que contenía sacarosa 110 mM, HEPES 20 mM, taurina 20 mM, K-lactobionato 60 mM, MgCl23 mM, KH2P0410 mM, EGTA 0.5 mM, BSA 1 g/1, pH 7.1. La troglitazona presenta toxicidad mitocondrial como lo demuestra flujos de oxígeno reducidos con concentraciones más altas. FCCP (2 mM), rotenona (2 mM) y antimicina (1 mg/ml) añadidas cuando se indica. FCCP = p-(Trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo.

La figura 8 muestra un trazo experimental de ensayo de toxicidad mitocondrial de minocielina y doxiciclina. Plaquetas humanas a 200*106 células/ml en un amortiguador que contenía sacarosa 110 mM, HEPES 20 mM, taurina 20 mM, K-lactobionato 60 mM, MgCl23 mM, KH2PO410 mM, EGTA 0.5 mM, BSA 1 g/1, pH 7.1. La minociclina presenta toxicidad mitocondrial como lo demuestran los flujos de oxígeno reducidos con concentraciones más altas. La doxiciclina también muestra una toxicidad pero menos pronunciada en comparación con minociclina. FCCP (2 mM), rotenona (2 mM) y antimicina (1 pg/ml) añadidas donde se indica. FCCP = p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo.

La figura 9 muestra un trazo experimental de ensayo de toxicidad mitocondrial de cerivastatina y simvastatina. Plaquetas humanas a 200*106 células/ml en un amortiguador que contenía sacarosa 110 mM, HEPES 20 mM, taurina 20 mM, K-lactobionato 60 mM, MgCl23 mM, KH2PO410 mM, EGTA 0.5 mM, BSA 1 g/1, pH 7.1. La cerivastatina presenta toxicidad mitocondrial como lo demuestran los flujos de oxígeno reducidos con concentraciones más altas. La doxiciclina también muestra una toxicidad pero menos pronunciada en comparación con minociclina. FCCP (2 mM), rotenona (2 mM) y antimicina (1 mg/ml) añadidas donde se indica. FCCP = p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo.

La figura 10 muestra trazos experimentales de efectos benéficos y tóxicos en respiración mitocondrial de un novedoso candidato a fármaco en comparación con control. Plaquetas humanas a 200*106 células/ml en un amortiguador que contenía sacarosa 110 mM, HEPES 20 mM, taurina 20 mM, K-lactobionato 60 mM, MgCl23 mM, KH2P0410 mM, EGTA 0.5 mM, BSA 1 g/1, pH 7.1. La minocielina presenta toxicidad mitocondrial como lo demuestran los flujos de oxígeno reducidos con concentraciones más altas. FCCP (2 mM), rotenona (2 mM) y antimicina (1 mg/ml) añadidas donde se indica. La dosis añadida a cada etapa de titulación se indica arriba del trazo. El fármaco propuesto incrementa la respiración mitocondrial a 2 mM de dosis acumulada siempre que la respiración se reduce con titulación adicional, indicando toxicidad mitocondrial. FCC = p- (trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo.

La figura 11 es una figura esquemática del ensayo de análisis de complejo mitocondrial II. Muestra el protocolo para evaluar novedosos substratos mitocondriales permeables a células. En el ensayo, la función mitocondrial en células intactas es reprimida con el inhibidor de complejo respiratorio I rotenona. Candidatos a fármaco se comparan con substratos endógenos antes y después de permeabilización de la membrana de plasma para evaluar el incremento o inhibición bioenergética.

La figura 12 es una figura esquemática del ensayo de análisis de respiración convergente mitocondrial. Describe el protocolo para evaluar la potencia de novedosos substratos mitocondriales permeables a células. En el ensayo, la actividad mitocondrial se estimula al desacoplar las mitocondrias con el protonóforo FCCP. Candidatos a fármacos son titulados para obtener el nivel de respiración convergente máxima (derivada del complejo I y complejo II). Después de la adición de rotenona, se obtiene estimulación dependiente de complejo II. El inhibidor de complejo III antimicina se añade para evaluar consumo de oxígeno no mitocondrial.

Las figuras 13A-13C muestran el incremento en respiración (flujo de oxígeno por unidad) con la titulación gradual de fármacos en comparación con control (succinato disódico) en plaquetas humanas intactas (ensayo descrito en la figura 12).

La figura 14 muestra el consumo de oxígeno dependiente de complejos mitocondriales I, II y IV, respectivamente. El consumo de oxígeno fue medido a diferentes concentraciones de metformina presente en amortiguador con métodos como los descritos arriba. Con concentraciones cada vez más altas de metformina, se observa una reducción significativa en la respiración de complejo I.

Los datos se expresan como media y desviación estándar. * p < 0.05, ***; p < 0.001 En comparación con vehículo (0 mM de metformina). Plaquetas humanas a 200*106 células/ml en un amortiguador que contenía 110 mM de sacarosa, 20 mM de HEPES, 20 mM de taurina, 60 mM de K-lactobionato, 3 mM de MgCl2, 10 mM de KH2P04, 0.5 mM de EGTA y 1 g/1 de BSA, pH 7.1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Sección experimental Materiales y métodos 1.1 Adquisición de muestras humanas El estudio fue aprobado por la mesa de revisión ética regional de Lund, Suecia (adultos: 113/2008 y 644/2009, niños: 59/2009) y el comité de ética de la Universidad Médica de Tokio, Japón (permiso No.1514). Para los adultos suecos, muestras de sangre fueron tomadas de donadores de sangre saludables en la central de donadores de sangre, hospital de la Universidad Skane, Lund y los adultos saludables que eran sometidos a rehabilitación después de lesión de rodilla. La cohorte japonesa consistió en voluntarios adultos saludables. Se obtuvieron muestras después de que se adquirió un consentimiento informado escrito. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los mismos procedimientos y protocolos y por los mismos investigadores en ambos sitios de investigación. Las muestras de control pediátricas fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía electiva menor. Se adquirió un consentimiento informado por escrito de los padres o cuidador y se tomó la sangre antes de la inducción de anestesia. Se tomaron muestras de sangre de cordón umbilical después del suministro de individuos sanos que eran sometidos a embarazo normal. Las muestras se obtuvieron después de que se adquirió un consentimiento informado por escrito.

Todos los químicos se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, E.U.A.) si no se indica lo contrario. 1.2 Preparación de plaquetas Para donadores de sangre, se tomaron muestras de los tubos de recolección al mismo tiempo que una donación de sangre planeada y en las demás cohortes adultas y niños por medio de punción venosa. Sangre de cordón umbilical se tomó directamente después de que el niño nacía ya sea por vía vaginal o por cesárea. Un volumen de 21 mi, de adultos, 6-12 mi, de niños, y 3-6 mi de cordón umbilical fue extraído en tubos K2EDTA (Vacuette®, Greiner Bio-One GmbH, Kremmünster, Austria). En estudios piloto, K2EDTA mostraron dar como resultado en mejor rendimiento y prohibir la activación plaquetaria en comparación con heparina, citrato y citrato ácido dextrosa (ACD) como anticoagulantes (datos no mostrados). Las muestras de sangre se prepararon frescamente y se analizaron dentro de 3-5 horas. Los tubos fueron centrifugados 15 minutos a 300 x g a temperatura ambiente, para producir un plasma rico en plaquetas (PRP). Este PRP fue pipeteado y centrifugado durante 5 minutos a 4,600 x g, a temperatura ambiente, produciendo un plasma casi libre de células y un sedimento plaquetario. El sedimento se disolvió en 1-3 mi del propio plasma del sujeto de control al pipetear suavemente para obtener un PRP altamente enriquecido con una concentración final media de 1,864 x 106/ml (intervalo 941-2498). 1.3 Respirometría de alta resolución La respiración se midió a una temperatura constante de 37°C en un oxígrafo de alta resolución (0xygraph-2k Oroboros Instruments, Inssbruck, Austria (Gnaiger et al., 2000)) en cámaras de vidrio de 2 mi con velocidad de agitador de 750 rpm. Los datos fueron registrados con DatLab software 4.3 (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) con la velocidad de muestreo puesta en 2 s. Todos los experimentos se llevaron a cabo a una concentración de oxígeno en el intervalo de 210-50 mM de 02. Si era necesario, se llevó a cabo reoxigenación al elevar parcialmente el tapón de la cámara para un breve equilibrio del aire. El flujo de oxígeno de fondo instrumental se midió en un conjunto separado de experimentos y se corrigió automáticamente para los siguientes experimentos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para mediciones de respiración en células permeabilizadas, las plaquetas fueron suspendidas en un medio de respiración mitocondrial (MÍR05) que contenía sacarosa 110 mM, HEPES 20 mM, taurina 20 mM, K-lactobionato 60 mM, MgCl23 mM, KH2PO410 mM, EGTA 0.5 mM, BSA 1 g/1, pH 7.1. (Gnaiger et al., 2000). Para experimentos en células intactas, las plaquetas fueron suspendidas ya sea en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) con la adición de 5 M de glucosa o en el propio plasma del sujeto de control. La calibración a saturación de aire se llevó a cabo cada día antes de iniciar los experimentos al dejar que agua Millipore o medios de respiración se agitaran con aire en la cámara de oxígrafo hasta que se obtuviera equilibrio y una señal estable. La concentración de oxígeno se calculó automáticamente a partir de la presión barométrica y los factores de solubilidad que fueron establecidos en 1.0 para agua, 0.92 para MIR05 y PBS glucosa y 0.89 para plasma (Baumgartl y Lübbers, 1983). 1.3.1 Protocolo experimental para plaquetas intactas La respiración integrada de células intactas con substratos mitocondriales endógenos se evaluó con dos diferentes protocolos de titulación. plaquetas fueron suspendidas ya sea en PBS-glucosa o el propio plasma del sujeto de control. Inicialmente, las muestras se dejaron estabilizar a un estado de respiración de rutina, revelando demandas de energía celular en reposo en fosforilación oxidante (OXPHOS). Para evaluar la contribución de respiración independiente de fosforilación con ADP, se añadió secuencialmente oligomicina (1 mg/ml, inhibidor de ATP-sintasa) induciendo un estado de respiración LEAK (conocido también como respiración en estado 4 inducida por oligomocina). La capacidad máxima del ETS se midió después de la titulación cuidadosa del protonóforo, p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP) hasta que ya no se detectara un incremento adicional en la respiración (en concentración media de PBS 6 mM, en concentración media de plasma 100 mM). Rotenona (2 mM, inhibidor de complejo I [CI]) y antimicina-A (1 pg/ml, inhibidor de complejo III [CIII]) fueron luego añadidas secuencialmente para inhibir el ETS proporcionando el consumo de oxígeno residual que se restó de los diferentes parámetros respiratorios en análisis adicionales.

Para evaluar la influencia en la capacidad respiratoria máxima por la inhibición de ATP-sintasa, se llevó a cabo un segundo protocolo experimental, en donde la capacidad ETS fue evaluada por titulación directa de FCCP después de la estabilización de respiración de rutina, seguida por los mismos inhibidores que arriba. Las relaciones de control se derivaron de respiración estimulada por FCCP y máxima dividida entre respiración LEAK (ETS/LEAK) y respiración de rutina (ETS/rutina). 1.3.2 Protocolo experimental para plaquetas permeabil izadas Para acceder al ETS con substratos exógenos en saturación e inhibidores la membrana de plasma se permeabilizó con el detergente digitonina. Un conjunto de experimentos se llevaron a cabo para establecer la concentración óptima de digitonina para inducir permeabilización máxima de la membrana de plasma sin afectar la membrana mitocondrial externa o interna. Plaquetas (200* 106/ml) fueron suspendidas en MIR05 y preincubadas con ADP 1 mM, succinato 5 mM y rotenona 1 mM. Digitonina 10 mg/ml se tituló hasta que la respuesta máxima en respiración se obtuviera (Gnaiger et al., 1998). Una gráfica representativa de un experimento de titulación se muestra en la figura 1. La dosis óptima se encontró que era 1 pg/l x 106 plaquetas. Citocromo c exógeno no indujo ningún efecto significativo en la respiración indicando que la membrana exterior mitocondrial había permanecido intacta (datos no mostrados).

Se usó un protocolo de titulación de inhibidor, desacoplador, substrato (SUIT) para establecer las capacidades respiratorias con flujo de electrones a través tanto de complejo I como complejo II (CII) por separado así como entrada de electrones convergentes por medio de la unión Q (CI+II) (Gnaiger, 2009). Una vez que se estableció respiración de rutina, la titulación fue iniciada con permeabilización de la membrana de plasma con digitonina y una adición concomitante de malato (5 mM) y piruvato (5 mM). La capacidad OXPHOS de complejo I, conducida por substratos relacionados con NADH, se evaluó al añadir ADP (1 mM), y adicionalmente glutamato (5 mM) (OXPHOSci, o estado 3Ci)-Secuencialmente, se añadieron 10 mM de succinato induciendo capacidad OXPHOS máxima con entrada convergente a través tanto de complejo I como de complejo II (OXPHOSci+n , o estado 3ci+n). Se usó oligomicina (1 mg/ml) para inhibir la ATP sintasa e inducir respiración LEAK. La capacidad respiratoria convergente máxima del ETS se obtuvo subsecuentemente al titular FCCP (ETSci+n, concentración media 6 mM). Complejo I fue inhibido por rotenona (2 mM) para evaluar la capacidad ETS soportada por succinato a través de complejo II únicamente (ETSen). Finalmente, el flujo de electrones a través del ETS fue inhibido por la adición de antimicina-A (1 pg/ml) proporcionando el consumo de oxígeno residual no relacionado con el ETS. Relaciones de control fueron derivadas a partir de la respiración oxidante máxima o respiración estimulada por FCCP máxima dividida entre respiración LEAK (OXPHOSCI+II/LEAK y ETSCI+II/LEAK, respectivamente). Las muestras analizadas fueron almacenadas a -80°C. 1.4 Análisis de los datos Se llevó a cabo evaluación estadística usando Graph Pad PRISM (GraphPad Software versión 5.01, La Jolla, CA, E.U.A.). Los valores se presentan como media ± SEM, o valores individuales. Todos los valores de las diferentes cohortes, excepto para cordón umbilical y relaciones de control para células intactas (ETS/LEAK, ETS/rutina), se encontró que se distribuían normalmente con la prueba de normalidad ómnibus D'Agostino y Pearson. La comparación entre varios grupos se llevó a cabo mediante ANOVA de una vía con análisis post hoc entre grupos por la prueba de comparación múltiple de Tukey, para datos paramétricos y la prueba de Kruskal-Wallis con prueba de comparación múltiple de Dunn para los datos paramétricos. Para correlación con edad, se usó regresión lineal. Un valor p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. 2. Resultados Muestras de sangre se tomaron de 46 voluntarios adultos sanos (24 de Suecia y 22 de Japón), 28 masculinos y 18 femeninos, con edad promedio de 37 años (rango de 19-65 años) y 25 niños, 18 hombres y 7 mujeres, con edad media de 4 (intervalo 1 mes-12 años) y 22 cordones umbilicales (13 de cesárea y 9 de parto vaginal). 2.1 Rendimiento, viabilidad e integridad de mitocondrias plaquetarias La concentración de plaquetas se midió a partir de sangre entera y el rendimiento calculado después de la preparación del plasma rico en plaquetas altamente enriquecido, fue en promedio 92% (±8%, n = 16). Para evaluar la viabilidad de las plaquetas después del protocolo de preparación, se llevó a cabo respirometría en plaquetas centrifugadas una etapa, es decir, 300 x g durante 15 minutos y se comparó con la respiración después de la sedimentación. No se pudieron observar diferencias significativas concluyendo buena estabilidad y viabilidad de las plaquetas a lo largo del proceso de aislamiento (N = 16 datos no mostrados). 2.2 Respiración mitocondrial de plaquetas intactas Una gráfica representativa de un experimento en células intactas se muestra en la figura 2 y los valores de parámetros respiratorios se muestran en la tabla 1. En células intactas la respiración sólo es conducida por substratos endógenos. La respiración de rutina fue similar en células incubadas ya sea en PBS-glucosa o plasma. La respiración LEAK fue muy baja, debajo de 1 pmol O2/s/108 plaquetas. La relación de control ETS/LEAK consecuentemente alta indica una respiración muy estrechamente acoplada. La estimulación máxima del ETS con FCCP fue significativamente más alta en experimentos sin oligomicina y capacidad respiratoria sustituta, como lo indica la relación de control ETS/rutina, fue significativamente más alta en plaquetas no tratadas con oligomicina suspendidas en plasma en comparación con PBS glucosa. La inhibición de complejo I con rotenona inhibió la respiración en alrededor de 99% y no se observó inhibición adicional después de la adición de antimicina-A (tabla 1). Entre las diferentes cohortes hubo una diferencia significativa entre la respiración estimulada por FCCP máxima (ETS) en los controles japoneses versus sangre de cordón umbilical (15 ± 1.3 vs 23 ± 2.3 pmol C>2/s/l*106 plaqueta). No se observaron otras diferencias significativas. 2.2.1 Respiración mitocondrial de plaquetas permeabil izadas El protocolo SUIT fue desarrollado para adquirir tanta información como fuera posible sobre la capacidad de los diferentes complejos respiratorios a partir de un solo experimento. Una traza representativa con adiciones de substrato e inhibidor y definiciones de los diferentes estados se ilustra en la figura 3. La respiración de rutina de células en MÍR05 estuvo en el mismo intervalo que para plaquetas intactas incubadas en PBS-glucosa o plasma. Después de la adición de digitonina se observó una reducción constante de la respiración mientras los substratos citosólicos y nucleótidos de adenina se difundían en medios circundantes. En presencia de malato y piruvato como substratos de complejo I, la estimulación con ADP incrementó la respiración en ~ 80% en comparación con la respiración de rutina. Con glutamato añadido para generación de NADH adicional y entrada de electrones de complejo I, la respiración se incrementó en otros -10% (tabla 2). Después de la adición de succinato, el flujo de electrones convergente con entrada tanto de complejo I como de complejo II al ETS fue logrado, y dio como resultado velocidades de respiración tres veces a aquellas de la respiración rutinaria y un incremento de -50% a partir de la respiración sólo con substratos de complejo I. La respiración LEAK fue -15% de la respiración acoplada máxima, OXPHOSci+n. La relación OXPHOSCI+II/LEAK de -7.0 indicó buen acoplamiento de transporte de electrones a la síntesis de ATP y es comparable con otros tejidos (Kuznetsov et al., 2002) (tabla 2). La capacidad respiratoria máxima, ETSci+n, inducida por el protonóforo FCCP, fue -5% más alta en comparación con OXPHOSci+n- La relación OXPHOS/ETS estuvo cerca de uno e indica que casi ninguna limitación de flujo es ejercida por el sistema de fosforilación a substratos exógenos en saturación. La actividad ETScu, medida después de la inhibición del complejo I por rotenona, fue -35% de las actividades combinadas de complejo I y complejo II, ETSCI+II. En el material de referencia japonés, respiración máxima con substratos de complejo I así como entrada convergente fue similar a sus contrapartes suecas. Sin embargo, tanto la respiración LEAK como la respiración estimulada por complejo II fueron aproximadamente 25% más altas en comparación con los valores de las cohortes suecas y pediátricas dando como resultado una relación ETS CI+II/LEAK reducida (tabla 2). Los valores de sangre de cordón umbilical difirieron al exhibir valores más altos de respiración máxima en ambos OXPHOS así como ETS. La respiración LEAK también fue significativamente más alta tanto en valores absolutos así como proporcionalmente, ya que las relaciones resultantes fueron inferiores (tabla 2). 2.3 Correlación de edad y sexo Dos estados respiratorios demostraron correlaciones significativas con la edad. La respiración rutinaria se incrementó (r2 = 0.15, p<0.05) y la ETScu se redujo ligeramente (r2 = 0.14, p<0.05) con la edad (los datos de cordón umbilical no se incluyen) como se muestra en las figuras 4A y 4B. Entre todos los demás parámetros respiratorios, no hubo cambios significativos, ejemplificados con OXPHOSCI+II en la figura 4C. No se observaron correlaciones entre parámetros respiratorios y género ni en plaquetas intactas ni en permeabilizadas (figura 4D). 2.4 Línearidad de respiración a diferentes concentraciones de plaquetas La respiración a diferentes concentraciones de plaquetas fueron evaluadas. En el intervalo de 100-400 x 106 plt/ml la respiración permaneció lineal en todos los estados. A una concentración de 50 x 106 plt/ml la estimulación con FCCP máxima se redujo en 20-25% (figura 5). La mayoría de los experimentos adicionales se llevaron a cabo con una concentración de plaquetas de 200 x 106/ml. El método mostró buena reproducibilidad cuando se evaluó por experimentos llevados a cabo a partir de los mismos individuos en días separados. El coeficiente de variación fue 6-13% en los diferentes parámetros respiratorios (tabla 3). 2.5 La influencia de almacenamiento de sangre prolongado en parámetros respiratorios El efecto de almacenamiento de sangre entera en la respiración mitocondrial fue evaluado. Sangre recién extraída se almacenó en viales de EDTA ya sea a temperatura ambiente o a 4°C en una mesa de inclinación durante hasta 72 horas. Después de 24 horas la respiración permanecía estable. A 48 horas hubo una clara tendencia hacia una capacidad respiratoria reducida de los estados de respiración estimulados por substrato es decir, OXPHOSci, OXPHOSCI+II y ETSCO+II· A 72 horas todos los parámetros excepto respiración LEAK se habían reducido significativamente (figura 6). 3. Protocolo para glóbulos blancos (WBC) 3.1 Preparación de las muestras En pacientes, un volumen máximo de 40 mL de sangre fue extraído de una línea arterial existente en tubos K2EDTA (Vacuette®, Greiner Bio-One GmbH, Kremmünster, Austria). En controles, las muestras de sangre se tomaron por medio de punción venosa en tubos K2EDTA. Los leucocitos fueron aislados de sangre entera por centrifugación con gradiente Ficoll (Bóyum REF). Después de lavar en solución salina normal, las células fueron resuspendidas en 200-400 ml de solución salina, dependiendo del rendimiento, junto con 50-100 ml del propio plasma del sujeto. Las mediciones respirométricas se llevaron a cabo dentro de 5 horas de muestreo. Los contenidos analizados a partir de la cámara de respirometría se almacenaron congelados hasta uso adicional. 3.2 Respirometría de alta resolución Los leucocitos fueron puestos en la cámara de oxígrafo de 2 mi a una concentración final de 2.5-5*106 células/ml. En células intactas los medios de respiración consistieron en el propio plasma del sujeto y para células permeabilizadas un medio de respiración que contenía sacarosa 110 mM, HEPES 20 mM, taurina 20 mM, K-lactobionato 60 mM, MgCl2 3 mM, KH2P04 10 mM, EGTA 0.5 mM, BSA 1 g/1, H 7.1 (MÍR05) [Gnaiger et al., 2000]. Las mediciones se llevaron a cabo a una temperatura constante de 37°C en un oxígrafo de alta resolución (0xygraph-2k Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) . La concentración de oxígeno (mM) y el flujo de oxígeno (tiempo negativo derivado de concentración de oxígeno; pmol O2*s1*106 células) se registró con software DatLab 4.3. (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria). Todos los experimentos se llevaron a cabo a una concentración de oxígeno en el intervalo de 210-50 mM de 02. La calibración a saturación de aire se llevó a cabo cada día. El flujo de oxígeno de fondo instrumental se midió en un conjunto separado de experimentos y se corrigió automáticamente para los experimentos siguientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La concentración de oxígeno se calculó automáticamente a partir de factores de presión y solubilidad barométrica que se establecieron a 1.0 para agua, 0.92 para MIR05 y 0.89 para plasma.

Se usaron tres protocolos de substrato-desacoplador-inhibidor-titulación (SUIT), uno en células intactas y dos en células permeabilizadas [Pesta y Gnaiger, 2012]. En células intactas la estimulación con substratos exógenos es limitada debido a una deficiente permeabilidad sobre la membrana de plasma. La respiración es por lo tanto mantenida por substratos endógenos únicamente. Las células fueron suspendidas en el propio plasma del sujeto y se dejaron para respiración de rutina estabilizar. Se añadió oligo icina (1 mg/ml) a la cámara de respiración para inducir una respiración tipo estado 4 (LEAK o estado 4u) en donde la respiración es principalmente debido a la fuga de protones sobre la membrana mitocondrial interna. El flujo de oxígeno máximo se obtuvo posteriormente mediante titulación gradual (20-40 mM) del desacoplador FCCP. Finalmente complejo I y complejo III fueron inhibidos al añadir rotenona (2 mM) y posteriormente antimicina-A (1 mg/ml). El flujo de oxígeno residual se restó de los valores en estado estacionario de respiración mitocondrial. El segundo y tercer protocolos SUIT se llevaron a cabo en células permeabilizadas. Las etapas iniciales fueron las mismas para ambos protocolos. Una vez que las células se habían estabilizado a respiración de rutina, la membrana de células de plasma se permeabilizó con la adición de digitonina (3 mg/l*106 células, concentración óptima evaluada en un conjunto diferente de experimentos, datos no mostrados). Simultáneamente, substratos de complejo I m lato y piruvato (5 M respectivamente) se añadieron a la cámara de respiración. La adición subsecuente de ADP (1 mM) estimuló la respiración y representa capacidad de fosforilación oxidante (OXPHOS o estado 3) para esa combinación de substrato específica enlazada a NADH. Piruvato se convierte en acetil-CoA por piruvato deshidrogenasa en la matriz mitocondrial y en consecuencia la capacidad OXPHOS podría ser restringida con un trabajo defectuoso o enzima inhibida. Con la adición subsecuente de glutamato (5 mM), piruvato deshidrogenasa es/fue derivada y la respiración de complejo 1 enlazada a NADH máxima, OXPHOSci, fue obtenida. La adición subsecuente de succinato (10 mM) estimuló OXPHOSCI+II con entrada convergente de electrones a través tanto de complejo I como de complejo II por medio de la unión Q. A partir de ahí los protocolos SUIT divergieron. En SUIT, la respiración enlazada a complejo I fue inhibida por rotenona (2 mM) produciendo capacidad OXPHOScu con entrada de electrones a través de complejo II únicamente. Posteriormente, el sistema de transporte de electrones (ETS) fue inhibido en complejo III al añadir antimicina-A y el flujo de oxígeno residual se restó de los estados fijos de respiración mitocondrial.

En SUIT-3, después de una capacidad OXPHOSCI+II máxima, ATP sintasa fue inhibida por oligomicina (1 mg/ml) para evaluar respiración LEAKci+n (estado 4) que es causada predominantemente por deslizamiento o derrame de protones sobre la membrana mitocondrial interna. El transporte de electrones máximo a través de respiración con fosforilación oxidante, ETSCI+II, se evaluó por la titulación gradual (2-4 mM) de FCCP. La respiración ligada a complejo II, no acoplada a fosforilación oxidante, ETScu, se evaluó al añadir rotenona y posteriormente ETS fue inhibido por antimicina-A. En este punto se llevó a cabo la reoxigenación, tanto en los protocolos SUIT-2 como 3 a un nivel de 160-180 mM de 02. La actividad de complejo IV fue evaluada al añadir N,N,N',N'-tetrametil-p-fenildiamina (TMPD 0.5 mM), un donador de electrones a complejo IV. Debido a la auto-oxidación de TMPD azida de sodio (10 mM), un inhibidor de complejo IV se añadió y la diferencia entre los dos niveles obtenidos se calculó como la actividad de complejo IV.

A continuación se dan protocolos más específicos para analizar potenciales candidatos a fármaco.

Se utilizaron dos protocolos de análisis. (1) Análisis inicial, efecto de complejo II, se llevó a cabo con plaquetas aisladas o glóbulos blancos en un amortiguador que contenía 110 mM de sacarosa, HEPES 20 mM, taurina 20 mM, K-lactobionato 60 mM, MgCl23 mM, KH2PO410 mM, EGTA 0.5 mM, BSA 1 g/1, pH 7.1. Después de que la respiración de línea de base con substratos endógenos fue establecida, complejo I fue inhibido con rotenona 2 M. Los candidatos a fármaco disueltos en DMSO fueron titulados en etapas hasta concentraciones finales de 100 mM, 500 mM y 5 mM. Posteriormente, las membranas celulares fueron permeabilizadas con digitonina (1 mg/l*106 plt). Después de la respiración estabilizada, se añadió succinato 10 mM y después de que se estabilizó la respiración el experimento fue concluido por la adición de antimicina a una concentración final de 1 mg/mL y se midió la respiración residual. La figura 11 muestra el protocolo para evaluar novedosos substratos mitocondriales permeables a células. En el ensayo, la función mitocondrial en células intactas es suprimida con el inhibidor de complejo I respiratorio rotenona. Los candidatos a fármaco se comparan con substratos endógenos antes y después de la permeabilización de la membrana de plasma para evaluar el incremento bioenergético o inhibición. La figura 11 es una figura esquemática del ensayo de análisis de complejo II mitocondrial. Muestra el protocolo para evaluar novedosos substratos mitocondriales permeables a células. En el ensayo, la función mitocondrial en células intactas es reprimida con el inhibidor de complejo I respiratorio rotenona. Los candidatos a fármaco se comparan con substratos endógenos antes y después de la permeabilización de la membrana de plasma para evaluar incremento bioenergético o inhibición. (2) En el segundo protocolo, respiración convergente, el mismo amortiguador de respiración y concentraciones de células que los descritos arriba fueron usados. Una vez que se estableció la respiración basal, el desacoplador mitocondrial FCCP se añadió a una concentración de 2 mM. Los candidatos a fármaco disueltos en DMSO se titularon por etapas a 100 mM, 200 mM, 400 mM, 600 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM y 10 mM de concentración final. La concentración necesaria para alcanzar respiración convergente máxima fue indicada. El experimento se terminó por la adición de 2 mM de rotenona y 1 mg/ml de antimicina y la respiración residual fue medida. La figura 12 describe el protocolo para evaluar la potencia de novedosos substratos mitocondriales permeables a células. En el ensayo, la actividad mitocondrial es estimulada al desacoplar la mitocondria con el protonóforo FCCP. Candidatos a fármaco son titulados para obtener el nivel de respiración convergente máxima (derivada de complejo I y complejo II). Después de la adición de rotenona, se obtiene estimulación dependiente de complejo II. El inhibidor de complejo III antimicina se añade para evaluar consumo de oxígeno no mitocondrial. La figura 12 es una figura esquemática del ensayo de análisis de respiración convergente mitocondrial. Describe el protocolo para evaluar la potencia de novedosos substratos mitocondriales permeables a células. En el ensayo, la actividad mitocondrial es estimulada al desacoplar las itocondrias con el protonóforo FCCP. Candidatos a fármaco son titulados para obtener el nivel de respiración convergente máxima (derivada del complejo I y complejo II). Después de la adición de rotenona, se obtiene una estimulación dependiente de complejo II. El inhibidor de complejo III antimicina se añade para evaluar el consumo de oxígeno no mitocondrial.

En el ensayo de análisis de respiración convergente un compuesto ideal despliega una respiración más alta con la titulación gradual en comparación con el control en mitocondrias desacopladas en células intactas. Favor de referirse al protocolo esquemático en la figura 12 y gráficas ejemplificadoras a partir de experimentos con compuestos ejemplares número 3, 5 y 13 en la figura 13. La figura 13 muestra el incremento en respiración (flujo de oxígeno por unidad) con la titulación gradual de fármacos en comparación con el control (succinato disódico) en plaquetas humanas intactas (figura 12).

Propiedades del compuesto deseado (1) El compuesto ideal estimula respiración en rotenona intacta inhibida a baja concentración en el protocolo de análisis CII sin efecto inhibitorio en la respiración estimulada por succinato después de pemeabilización. Después de la inhibición de respiración con toxinas mitocondriales, se debe detener la respiración. Favor de referirse a la figura 1 y el listado abajo. a > b significa que a es mayor que b. a » b significa que a es mucho mayor que b. a ® b significa que el valor de a se acerca al valor de b.

Propiedades deseadas de los conpuestos: • valor máximo de a alcanzado a baja concentración de fármaco. • a » a • a ® b' • c ® c' • d ® d' Los conpuestos impermeables a la membrana celular son identificados en el ensayo como: • a—»a' El consumo de oxígeno no mitocondrial inducido por candidatos a fármaco se identifica cuando • d > d' Referencias Baumgártl, H., Lübbers, D., 1983. Microaxial needle sensor for polarographic measurement of local 02 pressure in the cellular range of living tissue. Its construction and properties., in: Gnaiger, E., Forstner, H. (Eds.), Polarographic Oxygen Sensors. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp.37-65.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para analizar y seleccionar candidatos a fármaco potenciales o para probar la sensibilidad de una persona a una sustancia con efecto en mitocondrias, caracterizado porque comprende: i) someter una muestra de componentes de sangre humana que contenga mitocondrias a respirometría de alta resolución, ii) poner en contacto la muestra de células con una sustancia que incremente el derrame de la membrana mitocondrial interior a protones, iii) añadir una muestra de prueba que comprenda una sustancia de prueba en un vehículo, iv) comparar el consumo de oxígeno antes y después de la adición de la muestra de prueba y comparar el consumo de oxígeno de la muestra de prueba con el consumo de oxígeno de una muestra de control del vehículo, en donde una reducción en el consumo de oxígeno indica un efecto negativo en las mitocondrias, v) poner en contacto la muestra de iii) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial I, y vi) poner en contacto la muestra de v) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial III.

2. Un método para investigar los efectos mitocondriales de candidatos a fármaco en pruebas clínicas o en regímenes de tratamiento, caracterizado porque comprende: i) someter una muestra de componentes de sangre humana que contengan mitocondria a respirometría de alta resolución, en donde la muestra de células es de una persona sometida a un estudio clínico o a un régimen de tratamiento, y en donde una sustancia de prueba ha sido administrada a la persona durante el estudio clínico o régimen de tratamiento, ii) poner en contacto la muestra de células con una sustancia que incremente el derrame de la membrana mitocondrial interna a protones, iii) comparar el consumo de oxígeno de la muestra de la persona sometida al estudio clínico o a un régimen de tratamiento con el consumo de oxígeno de una muestra de control, en donde una reducción en el consumo de oxígeno indica un efecto negativo en las mitocondrias, iv) poner en contacto la muestra de iii) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial I, y v) poner en contacto la muestra de iv) con un inhibidor de la función de complejo mitocondrial III.

3 . El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la respirometría de alta resolución se lleva a cabo a concentraciones de oxígeno en el intervalo de 400-25 mM de 02a una temperatura constante de 37°C.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia que incrementa el derrame de la membrana mitocondrial interior a protones se añade para obtener capacidad máxima del sistema de transporte de electrones de las mitocondrias presentes en la muestra.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia que incrementa el derrame de la membrana mitocondrial interior a protones se selecciona de p- (trifluorometoxi)fenilhidrazona de cianuro de carbonilo (FCCP), m-clorofenilhidrazona de cianuro de carbonilo (CCCP), 2 ,4-dinitrofenol (DNP) y otros protonóforos, y mezclas de los mismos .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia que incrementa el derrame de la membrana mitocondrial interior a protones se añade a una concentración en el intervalo de 0.1 a 10 mM, tal como de 0.5 a 5 mM, de 1 a 3 m o aproximadamente 2 mM.

7 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sustancia que incrementa el derrame de la membrana mitocondrial interior a protones es FCCP.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-6, caracterizado porque el vehículo es un solvente orgánico tal como por ejemplo etanol, isopropanol, metanol, DMSO (sulfóxido de dimetilo), DMF (dimetilformamida) o DMA (dimetilacetamida).

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-8, caracterizado porque la muestra de prueba está en forma líquida y la muestra de prueba contiene una concentración conocida de la sustancia de prueba.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la muestra de prueba se añade en concentraciones gradualmente más altas.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la adición gradual de muestra de prueba se traduce en concentraciones finales de 1 mM a 10 mM de la muestra de prueba.

12 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-11, caracterizado porque la muestra de control en iii) es idéntica a la muestra de control pero sin contenido de sustancia de prueba.

13 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de la función de complejo mitocondrial I se añade para elucidar la respiración celular dependiente de oxidación de substratos de complejo II.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de función de complejo mitocondrial I se añade a una concentración en un intervalo de 0.1 a 10 mM, tal como de 0.5 a 5 mM, de 1 a 3 mM o aproximadamente 2 mM.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de la función de complejo mitocondrial I es rotenona.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de la función de complejo mitocondrial III se añade para determinar cualquier actividad no consumidora de oxígeno mitocondrial tal como auto-oxidación de la muestra.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de la función de complejo mitocondrial III se añade a una concentración final de aproximadamente 0.1 a 10 mg/ml tal como alrededor de 0.5 a 5 pg/ml, de aproximadamente 0.75 a 2 pg/ml o 1 pg/ml.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de la función de complejo mitocondrial III es antimicina A.

19 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-18, caracterizado porque la muestra de control es de un grupo de control.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-19, caracterizado porque la muestra de control se toma antes de que inicie cualquier tratamiento.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-18, caracterizado porque es para analizar candidatos a fármaco.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque es para probar la sensibilidad de un sujeto a una sustancia farmacéutica o un candidato a fármaco.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-20, caracterizado porque es para evaluar la toxicidad mitocondrial de una sustancia de prueba en ensayos clínicos.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque es para analizar el efecto de una sustancia en la función mitocondrial.

25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la muestra de células se aísla del sujeto.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque es para evaluar un compuesto capaz de estimular la respiración mitocondrial y la producción de ATP.

27. Un método para analizar y seleccionar candidatos a fármaco potenciales o para probar la sensibilidad de una persona a una sustancia con efecto en mitocondrias, caracterizado porque comprende: i) someter una muestra de componentes de sangre humana que contenga mitocondria de una muestra de sangre humana a respirometría de alta resolución, ii) poner en contacto una muestra de células con una sustancia que inhiba la respiración de complejo I, iii) añadir una muestra de prueba que contenga una sustancia de prueba en un vehículo, iv) añadir una sustancia que permeabilice la membrana de plasma, v) añadir una sustancia de referencia a la muestra obtenida en iv), en donde la sustancia de referencia es un substrato ligado a complejo ii), y vi) añadir una sustancia que inhiba la respiración de complejo III, y comparar el consumo de oxígeno obtenido con el consumo de oxígeno obtenido cuando el método se lleve a cabo usando la sustancia de referencia en la etapa iii) y de esta manera omitir la adición de una muestra de prueba.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la sustancia que permeabiliza la membrana de plasma es digitonina.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la digitonina se añade a una concentración de 5 mg/ml a aproximadamente 250 pg/ml.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizado porque la sustancia de referencia es succinato.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la concentración final de la sustancia de referencia es de aproximadamente 0.1 a alrededor de 20 mM.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-31, caracterizado porque los detalles para las etapas individuales i)-vi) son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 3, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 24 y/o 26.