TWI616533B - 粒線體毒性試驗 - Google Patents

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Abstract

一種在藥物篩選上有用的新穎方法，此方法有用於測試物質對粒線體之影響，特別是藥物物質或候選藥物物質之毒性或有益作用。本發明方法主要在活體外活的人類粒線體之測量方法，但其係於儘可能近似活體內的情況之環境中。本方法亦可有效的測試物質對粒線體呼吸作用的影響。
本方法可被用於i)在衍生自健康個體的血液或俗稱膚色血球層(buffy coat)之細胞中，早期或後期篩選及選擇候選藥物，該膚色血球層是血小板及白血球細胞之濃縮液，ii)測試病人對已知粒線體毒物的敏感性，iii)在臨床試驗分析藥物的粒線體毒性，及/或iv)分析欲改善粒線體功能藥物的有益作用。

Description

粒線體毒性試驗
本發明提供一種在藥物篩選上有用的新穎方法，尤其是，該方法有用於測試物質對粒線體之影響，特別是藥物物質或候選藥物物質之毒性或有益作用。本發明方法主要在活體外、人類活的粒線體測試，但其係於儘可能的接近活體內條件之環境中。本方法亦可有效的測試物質對粒線體的影響。
在藥物的開發中，很難評估當用於人類時是否藥物將影響產生能量的粒線體。近幾年來，許多食品藥物管理局核准的新藥已因為後來如心臟或肝臟毒性而被撤銷。由此，自1994到2006年食品藥物管理局註冊的新藥中，有38個藥物因對肝臟及心臟的毒性作用而被撤銷，他們都是典型的粒線體毒性症狀。明顯地，這些新藥在許可上市前都通過標準的毒性試驗，而且這些毒性作用，是在一大群病人接受藥物治療後，才被觀察出來。Dykens & Will(2007)指出，證據顯示粒線體功能異常在許多從市場被撤銷且在嚴格限至下再引入之藥物的毒性上扮演一個角色。
再者，近幾年粒線體功能受到許多關注，且一般相信粒線體功能異常係為許多疾病(如肌肉病症、神經病變、心肌病變、腦病變、敗血症引發多重器官衰竭)的發病過程之一個造成因子。
目前候選藥物的粒線體毒性大都在動物及細胞培養物中評估，試驗結果很難轉化到未來人類的使用。
因此，需要開發一種粒線體毒性的測試方法，其是靈敏的、具再現性的、可靠及簡易的，且其可被應用在藥物開發試驗上。
本發明是有關涉及含粒線體之人類血液成分的方法，所開發方法的優點是在活體外、活的人類粒線體測試藥物毒性(或有益作用)，但其係在儘可能的接近活體內之環境中。探討在血漿(其提供一個非常接近活體內的環境)中含有粒線體之人類血液成分(白血球及/或血小板)。因此，當在測定時，所有緩衝能力、血清白蛋白、電解質、水解酵素等都存在。
本新穎的方法將直接獲致人體真實的毒性血液濃度之評估，這在現行所用方法(細胞培養物或動物研究)中是不可能的。因此，較使用現行方法，能在更早期測試或篩選候選藥物對人類的毒性。因而，將可在更早期排除具毒性的候選藥物，故可減少更多的動物實驗及未來人類所受的傷害。其將可促進早期篩選候選藥物物質，因而減少藥物開發整體的時程及費用。
依本發明方法的目的，本方法可用於具有設定變化之不同 環境中。
因此，不是限制本發明之範圍，根據本發明之方法可用於：
1.在來自健康個體血液或俗稱膚色血球層(buffy coat)之細胞中，早期或後期篩選及選擇候選藥物，該膚色血球層是血小板及白血球細胞之濃縮液。
2.測試病人對已知粒線體毒物之敏感性。
3.在臨床試驗中，分析藥物的粒線體毒性。
4.分析欲改善粒線體功能藥物之有益作用。
一種篩選及選擇具潛力候選藥物、或測試受試者對影響粒線體的物質敏感性之適當方法(即前述項次1及2)為一種方法，其包括i)將含有分離自人類血液活粒線體之細胞樣本，置入高解析呼吸測量儀，ii)將細胞樣本與可增加粒線體內膜對質子通透性之物質接觸，iii)加入測試樣本，其含有溶於媒劑之受試物質，iv)比較測試樣本加入前、後氧氣的消耗量，及比較測試樣本之氧氣消耗量與媒劑對照樣本之氧氣消耗量，其中氧氣消耗量降低顯示對粒線體的負向作用，v)將得自iii)之樣本與粒線體複合體I-功能抑制劑，如魚藤酮接觸，以證明細胞呼吸作用是依賴複合體II-受質之氧化作用， 及vi)將得自v)之樣本與粒線體複合體III-功能抑制劑，如抗黴素A接觸，以測定任何非-粒線體氧氣消耗活性，例如該樣本之自發氧化作用。
另一種替代的篩選及選擇具潛力候選藥物或測試受試者對影響粒線體物質之敏感性的方法(即前述項次1及2)，係在探討這些受試物質在複合體II篩選分析之作用。該方法係例示在圖11，及包括i)將含有分離自人類血液活粒線體之細胞樣本，置入高解析呼吸測量儀，ii)將細胞樣本與抑制複合體I呼吸作用之物質接觸，iii)加入測試樣本，其含有溶於媒劑之受試物質，iv)加入可增加漿膜通透之物質，v)將參考物質加入得自iv)之樣本，及vi)加入抑制複合體III呼吸作用之物質。
將試驗結果與依本方法得到之結果比較，其中所用受試物質與參考物質相同。典型結果如圖11所示，其顯示候選藥物某程度可穿透漿膜(即增加呼吸作用)。添加毛地黃皂苷(其可使漿膜具通透性)不會導致進一步增加呼吸作用，即沒有進一步作用來自測試物質。當加入參考物質(一種複合體II-連結受質，如琥珀酸鹽)，其是一種典型地內生性受質例如琥珀酸鹽，可觀察到呼吸作用增加，且達到最大量。而後加入複合體III，例如抗黴素A，來測定非-粒線體氧氣消耗活性，例如樣本之自發氧化作用。
與得自參考物質之結果比較，其是一種內生性受質，如琥珀酸鹽，可看到參考物質不會穿透漿膜。只有當膜是可通透的，例如以毛地黃皂苷處理，呼吸作用才增加。額外加入內生性受質不會改變呼吸作用，而加入複合體III抑制劑則停止粒線體呼吸作用。
明顯地，以受試物質所觀察到之型式可能不同於圖11所示。本方法提供有價值的資訊，其有關受試物質是否能穿透漿膜、且以正向方式影響粒線體氧氣消耗活性(即增加複合體II粒線體呼吸作用)。因此，最理想的受試物質將具有程度a，其高於a’，且程度a是等於或趨近於程度b’，更詳細資料如本發明實施例所示。
其他方法係研究受試物質對複合體I、複合體II及/或複合體IV呼吸作用之影響。經由研究複合體I、II及/或IV呼吸作用，可得到關於特定物質對粒線體呼吸作用影響更詳細的資料，及評估對粒線體功能正向或負向的作用。圖14顯示，增加二甲雙胍(metformin)濃度對複合體I、II及IV粒線體呼吸作用之影響。圖中顯示，增加二甲雙胍濃度產生複合體I呼吸作用之特異性的功能異常，但對複合體II及IV呼吸作用似乎沒有影響。
依序加入ADP、而後加入複合體I受質麩胺酸鹽(見圖3)，而後加入漸增量之受試物質(如二甲雙胍)，會刺激複合體I呼吸作用(OXPHOSCI)。
複合體II呼吸作用，可在細胞樣本中加入複合體I抑制劑(如魚藤酮)，而後加入劑量漸增之受試物質而測得。
複合體IV呼吸作用可藉由加入N,N,N’,N’-四甲基-對-苯二胺(TMPD,0.5mM)(一種複合體IV之電子供應者)而測得。由於TMPD之高度自發氧化作用，加入疊氮化鈉(10mM)(一種複合體IV抑制劑)，所得二者程度之差異性係計算為特定複合體IV的活性。
一種探討在臨床試驗或治療計畫中候選藥物對粒線體影響之適當方法，包括i)將含有分離自人類血液樣本的活粒線體之細胞樣本，置入高解析呼吸測量儀，其中細胞樣本是來自參與臨床試驗或治療計畫的受試者，且其中受試物質已在臨床試驗或治療計畫期間投與受試者，ii)將細胞樣本與可增加粒線體內膜對質子通透性之物質接觸，iii)比較得自參與臨床試驗或治療計畫的受試者之樣本之氧氣消耗量與對照組樣本之氧氣消耗量，其中氧氣消耗量降低顯示對粒線體的負向作用，iv)將得自iii)之樣本與粒線體複合體I-功能抑制劑，如魚藤酮(rotenone)接觸，以證明細胞呼吸作用是依賴複合體II-受質之氧化作用，及v)將得自iv)之樣本與粒線體複合體III-功能抑制劑，如抗黴素A接觸，以測定任何非-粒線體氧消耗活性，如樣本之自發氧化作用。
如前所示，方法幾乎是相同的，其差異僅在有關測試那些 樣本，即是受試物質，或進行臨床試驗或治療計畫受試者之細胞樣本。臨床試驗或治療計畫受試者，依臨床試驗或治療計畫，接受受試物質、藥物物質或具潛力之藥物物質。此意味著，粒線體是分離自已經接受藥物物質或具潛力藥物受試者之血液樣本。因此，可依本發明揭示方法，觀察這些物質對粒線體呼吸作用的任何影響。
粒線體呼吸作用是利用呼吸測量儀測定。適當的條件揭示在本發明實施例，但如果需要或使用其他儀器，習於此技藝者，知道如何改變或調整實驗條件。
血液樣本可為靜脈血液樣本，並由其中可分離出並使用血小板或白血球，或其混合物。
可增加粒線體內膜對質子通透性物質之合適範例是，羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)、羰基氰化間-氯苯腙(CCCP)、2,4-二硝基酚(DNP)，或其他質子載體。
在本發明實施例及所附申請專利範圍，進一步詳細說明本發明之方法。
有關前述方法之詳細說明如下
1.在來自健康個體血液或俗稱膚色血球層之細胞中，早期或後期篩選及選擇候選藥物，其中膚色血球層是血小板及白血球細胞之濃縮液
其方法包括
i)將分離自人類靜脈血液樣本之含有活粒線體之細胞樣本，在37℃恆溫、400-25μM O2氧氣濃度下置入高解析呼吸測量儀，
ii)將細胞樣本與可增加粒線體內膜對質子通透性之物質接觸，如羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)、羰基氰化間-氯苯腙(CCCP)、2,4-二硝基酚(DNP)或其他質子載體，以得到存在血小板中粒線體電子傳遞系統之最大能量，
iii)加入測試樣本，其含有溶於媒劑之受試物質；正常地，當與媒劑相較，是以逐步增加劑量方式加入。
iv)比較測試樣本加入前、後氧氣的消耗量，及比較測試樣本與媒劑之氧氣消耗量，其中氧氣消耗量降低顯示對粒線體的負向作用，
iv)將得自iii)之樣本與粒線體複合體I-功能抑制劑，如魚藤酮接觸，以證明細胞呼吸是依賴複合體II-受質之氧化作用，及
v)將得自v)之樣本與粒線體複合體III-功能抑制劑，如抗黴素A接觸，以測定任何非-粒線體氧氣消耗活性，如樣本之自發氧化作用。
降低可能是顯著的或劑量-依賴的。
如前所述，人血液樣本是來自健康的個體，正常地，樣本是來自如本發明實施例所揭示者。細胞通常是白血球細胞、血小板或其混合物。
細胞可懸浮在人類血漿中(在一些案例是受試者自己的血將)或可懸浮在含有如蔗糖、HEPES、K-乳醣醛酸鹽、氯化鎂、二氫磷酸鉀、EGTA及BSA之水緩衝液或其他適當之緩衝液。 調整pH值介於7.0及7.5，尤其是7.1。對完整的血小板或白血球細胞，較佳的是溶於血漿中，以模擬活體內之狀況。然而在某些情形下，可以含5mM葡萄糖之磷酸緩衝之生理食鹽水(可被用來與血漿測試時之比較)作為血漿-溶解之互補物；或在使用可通透的血小板或白血球時，使用含克氏循環中間物質之細胞內型式緩衝液。在可通透的血小板(及WBCs)使用細胞內型式，且其中粒線體呼吸作用受質可以過量形式存在(在飽和量)，以使電子傳遞最大化，及增加分析之解析度。
得自人類血液樣本之細胞，可在完整或可通透的狀態下分析。
可視所使用完整或可通透的血小板或白血球，而使用不同的實驗方法(SUIT方法-受質-去偶合劑-抑制劑滴定法)。一般是使用完整的血小板或白血球。在使用具通透的血小板或白血球，儘可能在一個實驗中收集不同呼吸複合體之能量。血小板的通透，是將細胞導入毛地黃皂苷或其他可使細胞之漿膜通過受質及ADP之其他物質中。其他物質可為皂素或triton-X。如實施例所示，發現毛地黃皂苷最佳劑量是1微克/1x 106血小板。
細胞一般是懸浮在儀器之玻璃腔中，濃度自200 x 106/毫升至400 x 106/毫升。
測試樣本可以濃度漸增方式多次加入，以確定對粒線體負向作用(即毒性作用)之最低濃度。受試物質之起始及最終濃度，是視受試物質之強度，但一般是自亞微莫耳濃度至毫莫耳濃度。
因此，本發明方法可用來測定，在那些劑量下是安全、那些是不安全的且因而可加以避免。
本發明方法可用來相互比較二或多種藥物物質或候選藥物物質，以確認具最安全態樣(profile)之藥物。因此，本發明方法可以研究中之其他物質重複執行，並比較所得之結果。相對於正常量對呼吸作用降低最少者物質，在對粒線體毒性作用上，是最安全的物質。
圖7-9顯示這些比較的結果。圖7顯示得自降血糖藥物的二個試驗結果；一個是使用藥物物質曲格列酮(troglitazone)滴定及另一個試驗是使用羅格列酮(rosiglitazone)。
圖7明確顯示在粒線體毒性上，羅格列酮是一個較曲格列酮安全的藥物物質。曲格列酮因其毒性，已不存在市場上。
圖8顯示得自使用米諾環素(minocycline)及多西環素(doxycycline)二個試驗的結果，其顯示多西環素較米諾環素安全。
圖9顯示得自使用色伐他汀(cerivastatin)及辛伐他汀(simvastatin)二個試驗的結果，其顯示辛伐他汀較色伐他汀安全。事實上，色伐他汀已經自市場上撤回，而辛伐他汀還留在市場上。
在血小板中加入羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)或其他可增加粒線體內膜對質子通透性之物質，以得到粒線體電子傳遞系統最大能量。由本發明實施例可見，濃度自約5至約100μM可得到適當的反應。當使用血漿溶解血小板顆粒，發現最佳的濃度是約100μM，適當的範圍是約50至約200μM， 且當使用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)，較低的濃度是最佳的，即約6μM，範圍自約2至約20μM。
在受試物質加入後，適當的時間點(如自1至10分鐘)，依序加入複合體I(CI)抑制劑如魚藤酮及複合體III(CIII)抑制劑如抗黴素-A，以抑制電子傳遞系統(ETS)所提供殘餘的、非粒線體的氧消耗量，在後續的分析中，自不同呼吸作用參數中扣除。此步驟可評估專一的粒線體呼吸作用，亦可顯示受試化合物之自發氧化作用。
魚藤酮加入的量，相對於在樣本最終濃度是約2μM，範圍自約1至約5μM。如果使用其他複合體I抑制劑，其最終濃度是與使用魚藤酮可產生相同作用的量。
抗黴素-A加入的量，相對於在樣本最終濃度是約1微克/毫升，範圍自約0.1至約10微克/毫升。如果使用其他複合體III抑制劑，其最終濃度是與使用抗黴素-A可產生相同作用的量。
抗黴素-A總是在魚藤酮加入後加入，以測定複合體I抑制後，複合體II之活性。
試驗之詳細說明，顯示於本發明實施例及申請專利範圍。
2.試驗病人對已知粒線體毒物之敏感性
今天許多已知之粒線體毒物被核准註冊及使用。然而，如果病人對這些藥物敏感，醫師會想在藥物治療開始前知道。一個實例是廣泛使用之抗癲癇藥物丙戊酸，當給予錯誤的病人，會造成嚴重的腦部或肝臟傷害。
本質上，這些方法如前項次1)下所揭示，方法包括
i)將分離自人類靜脈血液樣本之含有活粒線體之細胞樣本，在37℃恆溫、400-25μM O2氧氣濃度下置入高解析呼吸測量儀，
ii)將細胞樣本與羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)或其他可增加粒線體內膜對質子通透性之物質接觸，以得到存在血小板中粒線體電子傳遞系統之最大能量，
iii)當與加入媒劑時相較，以逐步增加劑量方式，加入包含所述物質之測試樣本。
iv)比較測試樣本加入前、後氧氣的消耗量，其中氧氣消耗量降低顯示對粒線體的負向作用，
v)將得自iv)之樣本與粒線體複合體I-功能抑制劑，如魚藤酮接觸，以證明細胞呼吸作用是依賴複合體II-受質之氧化作用，及
vi)將得自v)之樣本與粒線體複合體III-功能抑制劑，如抗黴素A接觸，以測定任何非-粒線體氧氣消耗活性，如所述樣本之自發氧化作用。
在此，人類血液樣本是取自，以特定藥物物質或候選藥物物質進行特定療法之病人，且測試樣本包含特定藥物物質或候選藥物物質。
如前述1)所揭示，測試樣本可以濃度漸增方式多次加入，以確定對粒線體負向作用(即毒性作用)之最低濃度。受試物質之起始及最終濃度，是視受試物質之強度，但一般是高達經過 或穩定狀態濃度之10倍，以說明藥物蓄積在組織內的情形。
因此，本發明方法可用來測定，在那些劑量下是安全、那些是不安全的，依此，以加以避免。
本方法亦可用來決定，一系列可能的藥物物質中，那些藥物物質可被選擇用於特殊病人。因此，本發明方法可用來相互比較二或多種藥物物質或候選藥物物質，以確認在探討中的病人，具有最安全圖像之藥物。因此，本發明方法可以其他物質重複執行，並比較所得之結果。在特殊考慮病人中，物質對呼吸作用，相對於正常量，降低最少者，在有關對粒線體毒性作用上，是最安全的物質。
所有有關本方法各別部分之詳細說明，如前面所揭示，並請參照。
3.在臨床試驗中分析粒線體毒性
臨床試驗可為任何試驗，如劑量-探討研究、人體安全試驗等，且方法是利用簡單的採血。可評估短期、急性及長期、慢性二種作用。一個顯著的例子是HIV用藥，其在長期使用後會產生粒線體衰竭的症狀(由於粒線體DNA-耗盡)。為了這個目的，本方法最大的優點是，在病人血漿中測定藥物及其循環代謝物的合併毒性。
這個方法本質上與前面揭示的相同，但人體血液樣本是取自參與研究的受試者及作為對照組之健康者。依此，受試者在抽血前，接受藥物物質或具潛力之藥物物質。在整個治療計畫或臨床試驗期間，規律地由探討中的受試者抽取血液樣本，並 追蹤粒線體呼吸作用。
因此，這個方法更特別地包含i)將分離自人類靜脈血液樣本之含有活粒線體之細胞樣本，在37℃恆溫，400-25μM O2氧氣濃度下置入高解析呼吸測量儀，其中人體血液樣本是取自參與臨床試驗或治療計畫者，且受試物質在臨床試驗或治療計畫期間已投與受試者，ii)將細胞樣本與羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)或其他可增加粒線體內膜對質子通透性之物質接觸，以得到在血小板中，粒線體電子傳遞系統之最大能量，iii)比較取自參與臨床試驗或治療計畫者之人體血液樣本之氧氣消耗量與取自對照組之人體血液樣本之氧氣消耗量，其中與對照組比較，氧氣消耗量減低顯示對粒線體具負向作用，v)將得自ii)之樣本與粒線體複合體I-功能抑制劑，如魚藤酮接觸，以證明細胞呼吸作用是依賴複合體II-受質之氧化作用，及vi)將得自iv)之樣本與粒線體複合體III-功能抑制劑，如抗黴素A接觸，以測定任何非-粒線體氧氣消耗活性，如所述樣本之自發氧化作用。
在本發明背景下，臨床試驗可以是任何試驗，包括前臨床試驗及長期安全試驗。如前所見，受試者可是受疾病或身體異常之苦的病人，且投入治療計畫，使用一或多種藥物物質或候 選藥物物質。
樣本可來自單一個體或來自多個個體經合併之樣本。在某些情形下，收集參與臨床試驗或其他計畫，並投與藥物的病人血漿。血漿必須是離心過的，且可冷凍及保存，直到進行分析。血漿含有原型藥物及其代謝物(其對粒線體可能是與原型藥物具相同毒性或更甚)。將血漿溶解，並加入健康的血小板或白血球細胞(WBC)，來看是否會影響粒線體功能。此方法這有許多優點，包括不需為了分析，而緊急由臨床試驗時運送血液。
所有有關本方法各別部分之詳細說明係如本文中所述且於其中供參考。
4.分析欲用於改善粒線體功能藥物之有益作用
在臨床試驗前，可先在取自健康者血液或膚色血球層進行大型篩選計畫。分析亦可在治療前及治療期間，及改變劑量後病人(通常是孩童)之血液進行。
這個方法是與揭示在項次3之方法相同，但人體血液樣本是取自病人在治療前及治療期間，或改變劑量、或投藥途徑或劑型之後。分析樣本並比較結果。因此，第一個血液樣本是在治療前(或任何治療改變前)抽取及第二個血液樣本是在治療期間或任何治療改變後抽取。治療效果可在治療期間，測定樣本來追蹤。
因此，這個方法包括i)將分離自人類靜脈血液樣本之含有活粒線體之細胞樣本，在37℃恆溫，400-25μM O2氧氣濃度下置入高 解析呼吸測量儀，其中在抽血前，已將受試物質投與受試者，ii)將細胞樣本與羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)或其他可增加粒線體內膜對質子通透性之物質接觸，以得到在血小板中，粒線體電子傳遞系統之最大能量，及iii)比較第一個人體血液樣本之氧氣消耗量與第二個人體血液樣本之氧氣消耗量，其中氧氣消耗量降低顯示對粒線體的負向作用，及氧氣消耗量增加顯示對粒線體的正向作用，iv)將得自ii)之樣本與粒線體複合體I-功能抑制劑，如魚藤酮接觸，以證明細胞呼吸作用是依賴複合體II-受質之氧化作用，及v)將得自iv)之樣本與粒線體複合體III-功能抑制劑，如抗黴素A接觸，以測定任何非-粒線體氧氣消耗活性，如所述樣本之自發氧化作用。
所得結果與對照組及參考組之結果比較。
步驟i)至v)可以第三、第四、第五等樣本重複測定，以探討樣本依賴的變化態樣。
第一樣本可為對照組樣本，即在任何治療開始前所抽的血液樣本。替代地，第一及第二樣本代表在治療計畫期間，不同時間點抽取之血液樣本。例如，如果治療計畫為期一週，第一樣本可在第一天抽取(參考樣本)，及第二樣本在第二天抽取(其他樣本依序在次日抽取)。當投藥計畫改變，第一樣本在改變 劑量前抽取，第二樣本在改變劑量後抽取。
圖10顯示，當與對照組比較，具潛力的候選藥物對粒線體呼吸作用之有益與毒性作用的實驗結果。
所有有關本方法各別部分之詳細說明係如本文中所述且於其中供參考。
粒線體的功能
粒線體功能異常表現在原發性呼吸鏈疾病，其是因細胞核或粒線體DNA突變，及與一些異常疾病有關聯，如杭亭頓氏症、阿茲海默氏症及帕金森氏症，及因過度發炎導致之疾病如敗血症。(Brealey et al.,2002；Ferreira et al.,2010；Kones,2010；Rosenstock et al.,2010).
研究粒線體功能，在粒線體生理及病理機轉二者之基礎研究，及粒線體疾病之診斷是必要的。一般研究粒線體功能的方法，是在破裂的粒線體以分光技術，測定電子傳遞系統(ETS)中，各別複合體之最大酵素活性。此方法的優點，對高分析工作量之核心實驗室，是易於儲存及運輸，因為樣本可以冷凍(Haas et al.,2008)。然而，粒線體及其組成無法以分離的單元運作。在ETS中，呼吸鏈複合體是彼此連結的，依序集合成多-酵素-及超級複合體(Lenaz and Genova,2009)。粒線體會進行融合與分裂，生成網絡，並與其他次細胞組成交叉對話(Picard et al.,2011)。此明確凸顯，需求一種在不破壞或至少最小破壞細胞，及儘可能接近生理環境之條件下，分析粒線體功能。此可利用極譜分析法，分析細胞之粒線體呼吸作用(Kitchens and Newcomb,1968)。分析呼吸作用可在完整細胞及自然環境介質， 如血漿，使用內生性受質來分析。再者，可利用細胞膜的通透化，達成使外源性受質及抑制劑直接進入粒線體，同時在不必破壞細胞及純化粒線體下，研究ETS之各個複合體(Hutter et al.,2006)。
當在選擇何種組織用來探討粒線體功能異常時，最佳的是，在特定病人最容易受病程影響的組織。然而這是很不可能的，此乃歸因於自內臟器官，如腦、肝及心臟切片的風險及侵襲性。因此使用其他組織，最常用的是肌肉細胞及皮膚的纖維母細胞(Haas et al.,2008)。
血小板是一種活粒線體容易取得的來源，且取樣較肌肉或皮膚組織切片不具侵襲性。血小板粒線體的改變已顯示在多種疾病，主要地影響其他器官系統(Hauptmann et al.,2006；Krige et al.,1992)及老化過程(Merlo Pich et al.,1996；Xu et al.,2007)，因此曾經被提出作為全身性粒線體功能障礙之潛在指標(Sjövall et al.,2010；Xu et al.,2007)。同時血小板適合用於極譜分析(Kitchens and Newcomb,1968；Sjövall et al.,2010)。
依本發明方法之開發
在實驗部分所述本研究之目的，在建立一個方法學及在活體外之完整活細胞，深度評估正常血小板呼吸作用功能，及運用高解析呼吸測量儀在可通透的細胞測定各個複合體的功能。再者，探討儲存在低溫及室溫環境之衝擊，及性別與年齡之影響。第三，本方法應用於不同參考族群的一致性。
有關實驗條件之詳細說明，參照實驗部分。
所示數據反應一些不同參考族群之正常血小板的粒線體呼吸作用功能。氧化磷酸化反應在靜止血小板，約佔能量產生之85%(Kilkson et al.,1984)，除此，糖解作用、脂肪酸β-氧化反應亦提供受質(Cesar et al.,1987)。完整血小板之備用呼吸能量(即在常規狀態，去偶合劑FCCP能增加多少呼吸作用)，當血小板懸浮於血漿時，高於懸浮在PBS，如以ETS/常規呼吸之差異顯示(表2)。此可能反應在不同介質所供應受質之種類與量的不同。當時試驗在PBS中進行並以葡萄糖作為唯一外源性受質，完整血小板之備用呼吸能量是約64%，而當細胞在其自己的血漿中培養及分析，其中供應有生理性受質，備用呼吸能量是約88%。當暴露在寡黴素下，通常備用呼吸能量減低，在PBS-葡萄糖是約28%，在血漿中約25%，此可能反應在細胞ATP合成受抑制下，影響細胞中葡萄糖或其他受質之能量依賴氧化作用路徑。
在可通透的細胞，提供飽和量之受質至檸檬酸循環，糖解作用及β-氧化反應會被跳過。結果是在受質不作為速率決定下，可評估ETS及質子流。當與完整細胞相比，不論ADP-(偶合)或FCCP-刺激(去偶合)，在可通透的細胞之最大氧消耗量可額外的增加~50%。此顯示在經刺激的細胞，受質供應的速率決定步驟，在靜止狀態下並不存在，因為無論懸浮介質為何，常規呼吸作用是一樣的。完整血小板利用NADH且電子輸入幾乎完全經由複合體I，因為在以魚藤酮抑制複合體I後，測不到複合體II驅動之呼吸作用。此發現到，完整細胞之ETS呼吸值與可通透的細胞之OXPHOSCI在相同範圍，可支持這個 見解。此亦強調在可通透的細胞，由複合體I及複合體II提供ETS電子進入Q-連接點以建立最大的電子傳遞是重要的。當未限制受質的供應，在匯集電子輸入時，複合體I貢獻總呼吸量約2/3及複合體II貢獻1/3。當最大ADP-與FCCP-刺激呼吸作用能量相似，OXPHOSCI+II/ETSCI+II比值趨近1時，未發現到ATP合成酶成為任何的速率限制。再者，在有關最大呼吸能量，血小板呼吸顯示緊密偶合至氧化磷酸化反應，如顯示低LEAK呼吸作用，且在完整與可通透的細胞有高ETS/LEAK比值。我們觀察到，與完整細胞相較，在可通透的細胞具較高的LEAK狀態。雖然以毛地黃皂苷使漿膜通透性化，能影響粒線體膜的通透性，但在我們的觀察並不支持此觀點，因在毛地黃皂苷滴定試驗可看到，毛地黃皂苷濃度存在一個很大的安全區間。再者，外源性細胞色素C對呼吸作用並沒有影響，因此粒線體外膜仍然保持完整。更可能的解釋是，飽和的受質提供一個較高的質子梯度穿過內膜，而增加LEAK呼吸作用，因為基礎呼吸速率與質子-驅動力成比例(Nicholls,1977)。
粒線體功能隨著年齡減低，已被廣泛揭示過(Lesnefsky and Hoppel,2006；Vendelbo and Nair,2011)。在血小板我們觀察到，複合體II呼吸作用隨著年齡減低，而不會影響整體呼吸功能，此影響大都與小兒和成人族群間之差異有關。呼吸作用的降低似乎是複合體II特異的，因為更下游影響複合體III、複合體IV或ATP-合成酶，也會影響最大OXPHOS或ETS活性。
常規呼吸作用與LEAK呼吸作用間之差異，通常歸因於靜止時ATP的合成，因為經研究在整個年齡週期LEAK狀態保 持不變，在此所看到常規呼吸作用的增加，一般認為是隨著年齡加而增加基礎ATP合成。一般靜止代謝率隨著年齡而下降(Johannsen and Ravussin,2010)，但它如何影響不同組織尚未被證明。為何血小板隨著年齡，需要增加基礎的ATP合成，由目前研究顯示還不清楚。與瑞典成人相較，日本自願者顯示LEAK呼吸作用約高27%。此導致在複合體II受質驅動呼吸作用，顯著地增加ETSCII/LEAK，但顯著地減少OXPHOSCI/LEAK及OXPHOSCI+II/LEAK。曾報告日本人和白人在疾病態樣顯示差異(Benfante,1992)。這曾經被解釋為二者在遺傳上的差異，但也歸因於食物及生活型態因子，因為此很大的程度之差異性在移民族群上消失了(Yamori,2006)。日本食物在傳統上較多魚類及其他海產製品，其含有高量、具去偶合性質之游離脂肪酸(FFA)(Cha et al.,2001；Davis et al.,2008)。曾指出，輕微的去偶合作用在老化過程是有益的，由於可以減少質子驅動力，因此產生較少的活性氧分子(ROS)(Brand,2000)。相較下，日本人粒線體DNA較多的是單倍群D，歐洲人則是單倍群H最多。由於樣本數較小，在我們研究所見差異，可能是遺傳或生活型態，或二者兼有。需要進一步研究以釐清這些問題。
臍帶樣本的呼吸作用程度，與其他族群相較是較高的，此可能反應在子宮內外生活不同的需求，然而，在胎兒生命中，粒線體功能的數據則是稀少(Yanicostas et al.,2011)。
本發明方法可作為目前評估疑似粒線體疾病標準方法(其通常涉及肌肉組織切片)的輔助方法。目前由許多不同族群收集資料，如罹患退化性神經異常的病人及疑似粒線體異常之新 生兒。因此我們希望評估，因儲存及樣本體積量少所引發限制的問題。即使儲存在EDTA小瓶中，對血小板並不是最佳的環境，當在血液中儲存24小時後，呼吸功能似乎僅輕微改變。為了診斷目的，樣本可能需要經過長距離運送至核心實驗室，而其需要維持在活的血小板中測定呼吸能量的可能性。在非常小的小孩有一些限制，是可抽多少血來供不同的分析，因此，我們評估可使用多低濃度的血小板，仍可得到可靠的數據。對一整個實驗，在50 x 106血小板/毫升之絕對氧氣消耗量，僅約25微毫莫耳/毫升。在不同濃度下評估呼吸狀態，除了ETSCI+II外，通常不會受到影響(其在50 x 106血小板/毫升會有些微的減少)。其原因並不十分清楚，但使用減量細胞數，即使在十分小心滴定下，可能會改變FCCP之最大效應及其非特異結合至其他細胞膜之衝擊。
本發明方法之優點是，可結合完整及可通透血小板二者分析之能力。分析懸浮在受試者自己血漿中之完整細胞，是一個與生理條件非常相似的實驗環境。此不僅可研究遺傳性基因缺損，亦可研究因外來因子，如毒素或藥物所引起之粒線體缺損。由可通透的細胞可獲得更多的資訊，其可使用不同的分析方法(SUIT)，將流動控制移轉至呼吸系統不同的部分，以證明病變之所在。
雖然呼吸測量儀在評估粒線體能量產生功能，被認為是較佳方法的一種(Brand and Nicholls,2011)，且血小板粒線體似乎是活的人類粒線體好的來源，但此方法有一些限制。疾病影響粒線體可能或多或少是組織特異，且及粒線體DNA之突變已 知在不同組織以不同比率表現，此現象稱之為異質性(heteroplasmy)。因此，如果未存在被分析的組織上，變異可能無法被確認出來。細胞有能力為ATP降低的量進行代償，且通常顯示一個閾值，該值永遠不會發生代償，接著發生器官衰竭(Rossignol et al.,2003)。因此，很困難預測，粒線體呼吸作用要降低到何種程度，才會被視為病變。然而，前述所有的限制，不是本發明方法所特有的，不論是使用那個組織或技術都存在。本發明滴定方法不包括複合體IV之特定測定方法，其通常是利用人造電子供應劑TMPD，一般與抗壞血酸鹽一起，以維持TMPD在還原狀態。TMPD/抗壞血酸鹽會受到各種含金屬蛋白(如細胞色素C)之催化而發生自發氧化作用，同時也是氧氣濃度依賴的。由於我們樣本製備的本質，未特定的細胞材料及血漿的量不同，因此無法對TMPD/抗壞血酸鹽之自發氧化作用，做背景值的校正。
結論：
在活體外之生理條件下，血小板的呼吸測量方法適合用於研究人體粒線體。其證實可以極少量之樣本且在儲存高達24小時後，使用高解析呼吸測量儀得到可信賴的結果。利用不同SUIT方法，可得到細胞呼吸能量的詳細資料及不同族群間之差異，且我們揭示如何評估這些結果。這個方法可能適合用來評估外因性所引發及內因性之粒線體異常，且我們正為、這些目的評估此方法。
圖1.毛地黃皂苷滴定的代表性紀錄。濃度100 x 106/毫升之血小板懸浮在起始含有琥珀酸鹽5mM及ADP 1mM之MiR05緩衝液中，在常規呼吸穩定化後，複合體I以魚藤酮抑制，而後逐步(20微克)以毛地黃皂苷滴定，直到偵測呼吸作用不再增加。
圖2.完整血小板之實驗方法。內生性(常規)呼吸作用，隨之而後的是以寡黴素(1微克/毫升)誘發之複合體V-非依賴(LEAK)呼吸作用。以質子載體羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP，在PBS中平均濃度6μM；在血漿中平均濃度100μM)滴定，以達成最大呼吸作用，而後依序加入魚藤酮(2μM)及抗黴素-A(1微克/毫升)，分別是複合體I及III之抑制劑，而後測量殘餘氧氣消耗量。誘發的呼吸狀態及所用呼吸受質，如圖上所示。ETS=電子傳遞系統。
圖3.可通透的血小板之實驗方法。由實驗紀錄顯示，使用受質、去偶合劑、抑制劑滴定方法所得之氧氣消耗速率。誘發的呼吸狀態及經活化的呼吸作用複合體，定義如圖上所示。血小板以毛地黃皂苷通透化，同時加入複合體I(CI)受質蘋果酸鹽及丙酮酸鹽(分別5mM)。依序加入ADP(1mM)及複合體I(CI)受質麩胺酸鹽(5mM)來刺激氧化磷酸化反應(OXPHOS)。加入複合體II(CII)-連結受質琥珀酸鹽(10mM)，使得經由複合體I及複合體II匯集電子輸入。以寡黴素(1微克/毫升)抑制OXPHOS，以顯示複合體V-非依賴(LEAK)呼吸作用。以質子載體羰基氰化對-(三氟甲 氧基)苯腙(FCCP，平均濃度6μM)滴定，誘發電子傳遞系統之最大呼吸能量。以魚藤酮(2μM)抑制複合體I，可顯示複合體II-支持之呼吸作用。加入複合體III抑制劑抗黴素-A(1微克/毫升)，來顯示殘餘非粒線體的氧氣消耗量。未顯示加入TMPD(0.5mM)及疊化氮(10mM)。誘發的呼吸狀態及所用呼吸作用受質，如圖上所示。
圖4.血小板粒線體呼吸作用與年齡及性別之關聯。A，常規呼吸作用與年齡之關聯性，各個點是兩個數值之平均。B,ETSCII與年齡之關聯性，C,OXPHOSCI+II呼吸作用與年齡之關聯性，D,ETSCI+II呼吸作用與性別間之比較。呼吸狀態之定義參見圖3。
圖5.在可通透的血小板，其濃度對不同呼吸狀態之影響。於濃度50至400 x 106血小板/毫升，在不同狀態之受質、抑制劑滴定方法下氧氣的消耗量。呼吸狀態之定義參見圖3。N=5，每個試驗進行二次，*=p<0.05。
圖6.在可通透的血小板，儲存對不同呼吸狀態之影響。血液儲存在K2EDTA真空採血管，並置於傾斜板上，儲存在室溫或4℃。在72小時，除了LEAK呼吸作用外，與時間0點相較，所有參數均顯著下降。呼吸狀態之定義參見圖3。N=4，每個試驗進行二次，*=p<0.05。
圖7.曲格列酮及羅格列酮粒線體毒性分析之實驗紀錄。濃度200 x 106細胞/毫升之人類血小板懸浮在含有110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/ 升、pH 7.1之緩衝液。曲格列酮顯示粒線體毒性，在較高濃度下，減少氧氣流動。如所示加入FCCP(2μM)、魚藤酮(2μM)及抗黴素A(1微克/毫升)。FCCP=羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙。
圖8.顯示米諾環素及多西環素粒線體毒性分析之實驗紀錄。濃度200 x 106細胞/毫升之人類血小板懸浮在含有110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/升、pH 7.1之緩衝液。米諾環素顯示粒線體毒性，在較高濃度下，減少氧氣流動。多西環素亦顯示毒性，但與米諾環素相較，顯示較低的粒線體毒性。如所示加入FCCP(2μM)、魚藤酮(2μM)及抗黴素A(1微克/毫升)。FCCP=羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙。
圖9.顯示色伐他汀及辛伐他汀粒線體毒性分析之實驗紀錄。濃度200 x 106細胞/毫升之人類血小板懸浮在含有110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/升、pH 7.1之緩衝液。色伐他汀顯示粒線體毒性，在較高濃度下，減少氧氣流動。如所示加入FCCP(2μM)、魚藤酮(2μM)及抗黴素A(1微克/毫升)。FCCP=羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙。
圖10. 顯示新穎候選藥物與對照組比較，對粒線體呼吸作用有益或毒性作用之實驗紀錄。濃度200 x 106細胞/毫升之人類血小板懸浮在含有110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛 磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/公升、pH 7.1之緩衝液。加入所示FCCP(2μM)、魚藤酮(2μM)及抗黴素-A(1微克/毫升)。每一滴定步驟加入的劑量如紀錄上所示。推薦藥物在累積劑量達2mM時，可增加粒線體呼吸作用，如再繼續滴定，呼吸作用會下降，其顯示粒線體毒性。FCCP=羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙。
圖11是粒線體複合體II篩選分析之簡圖。其揭示評估新穎細胞-可通透的粒線體受質之方法。在分析中，在完整細胞粒線體的功能，以呼吸作用複合體I抑制劑魚藤酮來抑制。在漿膜通透化之前與之後，比較候選藥物與內生性受質，以評估是促進或抑制能量的生成。
圖12是粒線體匯集呼吸作用篩選分析之簡圖。其揭示評估新穎細胞-可通透的粒線體受質強度之方法。在分析中，以質子載體FCCP去偶合粒線體，來刺激粒線體的活性。滴定候選藥物，以得到最大匯集(複合體I及複合體II-衍生的)的呼吸作用。加入魚藤酮後，得到複合體II-依賴的刺激作用。加入複合體III-抑制劑抗黴素，以評估非粒線體的氧氣消耗量。
圖13顯示在完整人類血小板，當與對照組比較(琥珀酸二鈉鹽)，藥物以逐步方式滴定，可增加呼吸作用(每單位氧氣的流動)(分析法如圖12所描述)。
圖14顯示分別依賴粒線體複合體I、II及IV之氧氣消耗量。測量溶於緩衝液中不同濃度二甲雙胍之氧消耗量，其方法 如前所示。當與媒劑相較(0mM二甲雙胍)，增加二甲雙胍濃度，可見到複合體I呼吸作用顯著降低。數據是以平均及標準偏差表示。*p<0.05,***：p<0.001。濃度200 x 106細胞/毫升之人類血小板，存在於含有110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/公升、pH 7.1之緩衝液中。
1.1人體樣本的取得
本研究獲得瑞典Lund區域倫理人體試驗委員會(成人：113/2008及644/2009，孩童：59/2009)及日本東京醫學大學倫理委員會(同意書編號1514)之核准。在瑞典成人，血液樣本是由Lund之Skåne大學醫院捐血中心之健康捐血者取得，且健康的成人是膝部受傷後在接受復健。日本族群包括健康的成年自願者。樣本的取得是需要簽屬書面同意書，在二個研究地點，實驗都是由相同的研究者，依照相同的計畫書及步驟來進行。小兒的對照樣本是自進行輕微特定手術病人取得，從父母或監護人取得書面同意書。血液是在麻醉誘導前抽取。臍帶血是由健康者，經過正常懷孕在生產後取得的，樣本的獲得需要書面同意書。
如果未特別陳述，所有化學試劑是購自Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)。
1.2血小板的製備
對於捐血者們，血樣本是在有計畫的捐血時，同一時間由收集管中取得。在其他成人族群及小孩，是經由靜脈抽取。臍帶血是在孩子出生後直接取得，可為自然產或剖腹產。自成人取21毫升，小孩取6至12毫升，臍帶取3至6毫升，抽取至含K2EDTA之試管(Vacuette®,Greiner Bio-One GmbH,Kremmünster,Austria)。在先導研究顯示，當與肝素、檸檬酸鹽及檸檬酸葡萄糖(ACD)作為抗凝血劑比較(數據未顯示)，K2EDTA得到最佳的產率，且可抑制血小板活化。血液樣本是新鮮製備，且在3至5小時內分析。試管在室溫、300 x g下離心15分鐘，得到血小板-豐富血漿(PRP)。取出PRP，在室溫、4600 x g下離心5分鐘，產生幾乎不含細胞之血漿及血小板顆粒。將顆粒輕輕吸出，溶於1至3毫升對照受試者自己的血漿中，可得到平均最終濃度1864 x 106/毫升(範圍941-2498)高度豐富的PRP。
1.3高解析呼吸測量儀
呼吸作用以高解析液相氧電極儀(Oxygraph-2k Oroboros Instruments,Innsbruck,Austria(Gnaiger et al.,2000))，在恆溫37℃，2毫升玻璃容器，以750rpm速度攪拌下測定。數據以DatLab software 4.3.(Oroboros Instruments,Innsbruck,Austria)記錄，採集樣本的速度設定在2秒。所有試驗在210至50μM O2氧氣濃度範圍下進行。如果需要，可部分提高容器的塞子，做短暫空氣平衡，以達到重新充氧作用。在後續的試驗，依製 造廠操作說明，在各個試驗中測量儀器背景之氧氣流量，並自動校正。為測量在可通透細胞之呼吸作用，將血小板懸浮在粒線體呼吸介質(MiR05)中，其中包含110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/公升、pH 7.1之緩衝液(Gnaiger et al.,2000)。在完整細胞的試驗，血小板是懸浮在磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)，其中加入5mM葡萄糖，或控制受試者自己的血漿中。每天在試驗前，在空氣飽和下執行校正，其是將Millipore水或呼吸介質，在氧電極儀容器中，以空氣攪拌直至平衡，且得到一穩定的訊號。氧的濃度自動由大氣壓力計算出，溶解度因子在水設定為1.0，在MiR05及PBS葡萄糖是0.92，在血漿是0.89(Baumgärtl and Lübbers,1983)。
1.3.1完整血小板之試驗方法
運用二種不同滴定方法，來評估完整細胞使用內生性粒線體受質之整體呼吸作用。將血小板懸浮在PBS-葡萄糖或對照受試者自己的血漿中。首先，讓樣本靜置，使其穩定在常規呼吸作用狀態下，此顯示靜止細胞能量的需求來自氧化磷酸化反應(OXPHOS)。要評估非依賴ADP磷酸化反應所貢獻的呼吸作用，是加入寡黴素(1微克/毫升，ATP合成酶抑制劑)來誘發LEAK呼吸狀態(亦稱之為寡黴素-誘發狀態4呼吸作用)。以質子載體羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)小心滴定，直到偵測呼吸作用不再繼續增加，可測得ETS的最大能量(在PBS平均濃度6μM，在血漿中平均濃度100μM)。而後依序加入魚 藤酮(2μM，複合體I【CI】抑制劑)及抗黴素-A(1微克/毫升，複合體III【CIII】抑制劑)抑制ETS，可得到殘餘氧氣消耗量，其在後續分析中，要自不同呼吸參數中扣除。
為了評估抑制ATP合成酶對最大呼吸能量之影響，進行第二個試驗，在常規呼作用穩定後，以FCCP直接滴定，來評估ETS能量，而後同前，以相同抑制劑測定。對照比率得自FCCP-刺激之最大呼吸作用，除以LEAK呼吸作用(ETS/LEAK)及常規呼吸作用(ETS/常規)。
1.3.2可通透的血小板之試驗方法
以飽和的外源性受質及抑制劑來測定ETS，漿膜利用清潔劑毛地黃皂苷使其通透化。進行一系列試驗以建立毛地黃皂苷在不影響粒線體外膜或內膜下，誘發漿膜最大通透化之最佳濃度。將血小板(200 x 106/毫升)懸浮在MiR05，並與ADP1 mM、琥珀酸鹽5mM及魚藤酮1μM預培養。以毛地黃皂苷10微克/微升滴定，直到得到呼吸作用之最大反應(Gnaiger et al.,1998)。滴定試驗之代表圖如圖1，發現最佳劑量是1微克/1 x 106血小板。外源性細胞色素C不會誘發呼吸作用任何顯著的作用，顯示粒線體外膜仍然保持完整(數據未顯示)。
受質、去偶合劑、抑制劑滴定(SUIT)方法，被用來建立呼吸能量，其中電子流是分別透過複合體I及複合體II(CII)，並經由Q-連接點(CI+II)匯集電子輸入(Gnaiger,2009)。常規呼吸作用建立後，以經毛地黃皂苷通透之漿膜開始滴定，並同時加入蘋果酸鹽(5mM)及丙酮酸鹽(5mM)。NADH-相關受質驅 動複合體I之OXPHOS能量(OXPHOSCI,or狀態3CI)，是以加入ADP(1mM)，而後加入麩氨酸鹽(5mM)來評估。繼續地，加入10mM琥珀酸鹽，以誘發經由複合體I及複合體II二者(OXPHOSCI+II或state 3CI+II)匯集輸入之最大OXPHOS能量。使用寡黴素(1μg/毫升)抑制ATP合成酶，並誘發LEAK呼吸作用。而後以FCCP滴定，得到ETS之最大匯集呼吸能量(ETSCI+II，平均濃度6μM)。以魚藤酮(2μM)抑制複合體I，以測得僅經由複合體II(ETSCII)，琥珀酸鹽支持的ETS能量。最後，加入抗黴素-A(1微克/毫升)抑制電子流過ETS，以得到與ETS無關之殘餘氧氣消耗量。對照比率得自最大氧化呼吸作用或最大FCCP-刺激呼吸作用，除以LEAK呼吸作用(OXPHOSCI+II/LEAK及ETSCI+II/LEAK，分別地)。將分析過的樣本，儲存在-80℃。
1.4數據分析
使用Graph Pad PRISM(GraphPad Software version 5.01,La Jolla,CA,USA)進行統計分析，數據以平均±SEM或個別數據表示。來自不同族群之所有數據，除了臍帶及完整細胞之對照比率(ETS/LEAK,ETS/常規)，利用D’Agostino and Pearson omnibus常態分配試驗分析，發現是常態分布。多組間之比較，是使用單向ANOVA併事後分析；組間之比較，在參數資料，是使用Tukey’s多重比較分析，及對非參數資料，是使用Kruskal-Wallis t分析併Dunn’s多重比較分析。在與年齡關聯性，是運用線性迴歸，p-值<0.05，被認為是具統計上顯著意 義的。
2.結果
血液樣本取自46位健康成年的自願者(24未來自瑞典，22位來自日本)，28位男性及18位女性，平均年齡37歲(範圍19至65歲)；及25位孩童，18位男性及7位女性，平均年齡4歲(範圍1個月至12歲)；及22條臍帶(13條來自剖腹產，9條來自自然產)。
2.1產率、存活率及血小板粒線體之完整性
由全血中測量血小板濃度，並在製備高豐富的血小板-豐富血漿後，計算產率平均是92%(±8%,n=16)。在製備後為評估血小板的存活率，將血小板在300 x g離心一次15分鐘，並利用呼吸測定法測定，與顆粒化後的呼吸作用比較，未發現有顯著的差異，結論是，經由此分離過程，血小板得到好的安定性及存活率(樣本數=16，數據未顯示)。
2.2完整血小板的粒線體呼吸作用
在完整細胞試驗之代表圖如圖2，及呼吸作用參數值顯示於表1。在完整細胞其呼吸作用僅由內生性受質來驅動，細胞培養在PBS-葡萄糖或血漿中，其常規呼吸作用是相似的。LEAK呼吸作用十分低，低於1pmol O2/s/108血小板。高對照比率ETS/LEAK，顯示非常緊密的偶合呼吸作用。在寡黴素不存在的實驗中，以FCCP處理，ETS的最大刺激反應顯著的高。在非寡黴素處理下，血小板懸浮在血漿中與懸浮在PBS- 葡萄糖中相較，備用呼吸能量(以對照比率ETS/常規表示)顯著的較高。以魚藤酮抑制複合體I，抑制約99%呼吸作用，且加入抗黴素-A後，未見繼續抑制(表1)。在日本對照組相對於臍帶血組，不同族群間最大FCCP-刺激呼吸作用(ETS)，有顯著的差異(15±1.3 vs 23±2.3pmol O2/s/1 x 106血小板)，其他部分則沒有看到有顯著的差異。
2.2.1具通透性血小板的粒線體呼吸作用
SUIT法是開發用來從單一試驗，儘可能得到有關不同呼吸複合體能量的資訊。一個加入受質及抑制劑的代表紀錄，及不同狀態的定義如圖3所示。細胞在MiR05之常規呼吸作用，與完整血小板培養在PBS-葡萄糖或血漿中，具相同的範圍。加入毛地黃皂苷後，當細胞質內的受質及腺嘌呤核苷酸擴散至周圍的介質後，可以看到呼吸作用穩定的降低。在作為複合體I受質之蘋果酸鹽及丙酮酸鹽存在下，當與常規呼吸作用相較，ADP刺激下的呼吸作用約增加80%。為增加NADH產生及複合體I電子輸入，加入麩胺酸鹽，呼吸作用又額外增加10%(表2)。加入琥珀酸鹽後，促使匯集的電子流，由複合體I及複合體II二者輸入到ETS，並導致呼吸速率3倍於常規呼吸，如僅用複合體I受質，呼吸作用增加約50%。LEAK呼吸作用，約是最大偶合呼吸作用OXPHOSCI+II的約15%。OXPHOSCI+II/LEAK的比率約7.0，顯示電子傳遞良好的偶合至ATP的合成，且與其他組織相當(Kuznetsov et al.,2002)(表2)。以質子載體FCCP誘發之最大呼吸能量ETSCI+II，與 OXPHOSCI+II相較約高5%。OXPHOS/ETS比率接近1，顯示在飽和的外源性受質存在下，磷酸化系統幾乎不會發生流動上的限制。以魚藤酮抑制複合體I後，測量ETSCII活性，約是複合體I與複合體II(ETSCI+II)總和活性的35%。在日本參考材料，以複合體I受質之最大呼吸作用及匯集輸入，與瑞典對照組相似。然而，LEAK呼吸作用及複合體II刺激的呼吸作用二者，與瑞典及小兒族群所得數據相較約高25%，導致ETSCI+II/LEAK比率下降(表2)。由臍帶血所得數據不同，其在OXCPHOS及ETS二者，呈現較高的最大呼吸作用值。LEAK呼吸作用，在絕對值及比率上，二者都顯著的提高，因為結果的比率是較低的。
2.3年齡及性別的關連性
二個呼吸狀態與年齡，都顯示顯著的關連性。如圖4A、B顯示，隨著年齡增加(不包括臍帶資料)常規呼吸作用增加(r2=0.15,p<0.05)，ETSCII則些微降低(r2=0.14,p<0.05)。在所有其他呼吸參數間，沒有顯著的變化，如圖4C OXPHOSCI+II所例示。在完整或可通透的血小板，都未見呼吸參數與性別間的關連性(圖4D)。
2.4在不同血小板濃度下呼吸作用的線性關係
評估在不同血小板濃度的呼吸作用。在範圍100-400 x 106血小板/毫升，在所有的狀態，呼吸作用保持線性。在濃度50 x 106血小板/毫升，最大FCCP刺激作用，減少20至25%(圖 5)。在後續大多數的試驗，以血小板濃度200 x 106/毫升進行。當在相同受試者、不同天評估所進行之試驗，本方法顯示好的再現性。在不同呼吸參數，變異係數是6-13%(表3)。
2.5延長血液儲存對呼吸參數之影響
評估全血儲存對粒線體呼吸作用的影響。將新鮮抽取的血液儲存在EDTA小瓶中，於室溫或4℃，置於傾斜板上達72小時。24小時後，呼作用保持穩定；48小時後，在經受質刺激的呼吸狀態之呼吸能量即OXPHOSCI,OXPHOSCI+II及ETSCI+II，有明確降低的傾向；72小時後，除了LEAK呼吸作用外，所有的參數均顯著地降低(圖6)。
3.白血球細胞(WBC)的試驗方法 3.1樣本的製備
病人由既存的動脈導管，抽取最大體積40毫升之血液至含K2EDTA試管中(Vacuette®,Greiner Bio-One GmbH,Kremmünster,Austria)。對照組之血液樣本由靜脈穿刺抽取至含K2EDTA試管中。使用Ficoll梯度(Böyum REF)離心，分離出白血球，以生理食鹽水沖洗後，視產率將細胞懸浮在200-400微升之生理食鹽水中，與50-100微升受試者自己的血漿混合。在取樣後5小時內，以呼吸測定法測量。分析後的內容物由呼吸測量儀腔室取出，冷凍儲存，以供進一步使用。
3.2高解析呼吸測量儀
將最終濃度2.5-5 x 106細胞/毫升之白血球，置於2毫升之液相氧電極儀腔室中，在完整細胞之呼吸介質中，包含受試者自己的血漿；在可通透細胞之呼吸介質中，含有110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/升、pH 7.1(MiR05)(Gnaiger et al.,2000)。在恆溫37℃，高解析液相氧電極儀(Oxygraph-2k Oroboros Instruments,Innsbruck,Austria)進行測定。並以DatLab software 4.3.(Oroboros Instruments,Innsbruck,Austria)記錄氧濃度(μM)及氧氣流量(反面時間衍生之氧濃度；pmol O2 * s-1 * 10-6細胞)。所有試驗在210至50μM氧氣濃度範圍下進行。每天在空氣飽和下校正，在後續的試驗，依製造廠操作說明，在各個試驗中測量儀器背景之氧氣流量，並自動校正。
氧氣濃度自動由大氣壓力計算出，溶解度因子在水設定為1.0，在MiR05是0.92，在血漿是0.89。
使用三個受質-去偶合劑-抑制劑-滴定(SUIT)方法，一個在完整的細胞，二個在可通透的細胞[Pesta and Gnaiger,2012]。在完整的細胞，以外源性受質刺激，由於對漿膜的通透性不佳，作用是有限的。因此呼吸作用僅靠內生性受質維持。將細胞懸浮在受試者自己的血漿中並靜置，讓常規呼吸穩定。將寡黴素(1微克/毫升)加入呼吸腔室，以誘發擬狀態4呼吸作用(LEAK or State 4u)，其是主要由於質子洩漏至粒線體內膜之呼吸作用。而後以去偶合劑FCCP逐步(20-40μM)滴定，以得到最大氧氣流動量。最後依序加入魚藤酮(2μM)及抗黴素- A(1微克/毫升)抑制複合體I及複合體III。殘餘氧氣流動量由穩定狀態下粒線體呼吸作用值中減掉。第二及第三個SUIT方法在可通透的細胞中進行。第一步驟在二個方法都相同，細胞在常規呼吸作用穩定後，加入毛地黃皂苷以穿透細胞漿膜(3微克/1 x 106細胞，在不同條件試驗下評估最佳濃度，數據未顯示)。同時，將複合體I受質蘋果酸鹽及丙酮酸鹽(各5mM)加入呼吸腔室中，接著加入ADP(1mM)刺激呼吸作用，以顯示在特定、NADH-連結、受質合併之氧化磷酸化能量(OXPHOS or State 3)。在粒線體基質中，丙酮酸鹽被丙酮酸去氫酶轉化成乙醯基-CoA，因此，OXPHOS的能量可能會因工作缺損或酵素受到抑制而受到限制。而後再加入麩胺酸鹽(5mM)，此時丙酮酸去氫酶被繞過，得到最大NADH-連結複合體I呼吸作用OXPHOSCI。而後加入琥珀酸鹽(10mM)刺激OXPHOSCI+II，伴隨著經由複合體I及複合體II二者，透過Q-連接點匯集電子輸入。第二及第三個SUIT方法由此分開，在SUIT-2以魚藤酮(2μM)抑制複合體I-連結呼吸作用，OXPHOSCII能量僅能經由複合體II伴隨電子輸入。而後加入抗黴素-A，在複合體III抑制電子傳遞系統，殘餘氧氣流動量由穩定狀態下之粒線體呼吸作用中減去。
在SUIT-3，在最大OXPHOSCI+II能量之後，以寡黴素(1微克/毫升)抑制ATP-合成酶，以評估LEAKCI+II(狀態4)呼吸作用，其主要是因質子滑過或洩露通過粒線體內膜所造成。最大的電子運輸通過呼吸作用，而不發生氧化磷酸化反應，ETSCI+II，以FCCP逐步(2至4μM)滴定來評估。複合體II-連 結呼吸作用，不偶合至氧化磷酸化反應，ETSCII，以加入魚藤酮來評估，而後以抗黴素-A抑制ETS。在此時進行再充氧作用，在SUIT-2及SUIT-3方法，達到160-180μM O2。加入N,N,N’,N’-四甲基-對-苯二胺(TMPD 0.5mM)，其是複合體IV之電子供應者，來評估複合體IV之活性。由於TMPD的自發氧化作用，加入疊氮化鈉(10mM)，一種複合體IV抑制劑，經過計算，所得二者之差異即為複合體IV活性。
以下揭示更多篩選具潛力後選藥物的特異方法 使用二種篩選方法
(1)第一種篩選方法，複合體II-作用，係以置於含有110mM蔗糖、HEPES 20mM、牛磺酸20mM、K-乳醣醛酸鹽60mM、MgCl2 3mM、KH2PO4 10mM、EGTA 0.5mM、BSA 1克/升、pH 7.1之緩衝液中之經分離的血小板或白血球細胞進行。使用內生性受質建立基礎呼吸作用後，以魚藤酮2mM抑制複合體I。將候選藥物溶於DMSO中，以最終濃度100μM、500μM及5mM之步驟滴定。而後細胞膜以毛地黃皂苷(1毫克/1 x 106血小板)通透，呼吸作用穩定後，加入琥珀酸鹽10mM，呼吸作用穩定後，加入最終濃度1微克/毫升抗黴素中止試驗，並測量殘餘呼吸作用。圖11顯示，一種評估新穎細胞-可穿透的粒線體受質之方法。在分析中，完整細胞之粒線體功能，以呼吸複合體I抑制劑魚藤酮來抑制。在漿膜通透化之前與之後，比較候選藥物與內生性受質，以評估是促進或抑制能量的生成。圖11是粒線體之複合體II篩選分析之簡圖。其揭示評估新穎細胞-可通透的粒線體受質之方法。在分析中，在完整細胞粒 線體的功能，以呼吸作用複合體I抑制劑魚藤酮來抑制。在漿膜通透化之前與之後，比較候選藥物與內生性受質，以評估是促進或抑制能量的生成。
(2)第二種篩選方法，匯集的呼吸作用，係使用如前所示相同之呼吸緩衝液及細胞濃度。建立基礎呼吸作用後，加入濃度2mM之粒線體去偶合劑FCCP。將候選藥物溶於DMSO中，以最終濃度100μM、200μM、400μM、600μM、1mM、2mM、5mM及10mM之步驟滴定，測得達到最大匯集呼吸作用所需濃度。加入魚藤酮2μM及抗黴素1微克/毫升中止試驗，並測量殘餘呼吸作用。圖12揭示評估新穎細胞-可通透的粒線體受質強度之方法。在分析中，以質子載體FCCP去偶合粒線體，來刺激粒線體的活性。滴定候選藥物，以得到最大匯集(複合體I及複合體II-衍生的)的呼吸作用。加入魚藤酮後，得到複合體II-依賴的刺激作用。加入複合體III-抑制劑抗黴素，以評估非粒線體的氧氣消耗量。圖12是粒線體之匯集呼吸作用篩選分析之簡圖，其揭示評估新穎細胞-可通透的粒線體受質強度之方法。在分析中，以質子載體FCCP去偶合粒線體，來刺激粒線體的活性。滴定候選藥物，以得到最大匯集(複合體I及複合體II-衍生的)的呼吸作用。加入魚藤酮後，得到複合體II-依賴的刺激作用。加入複合體III-抑制劑抗黴素，以評估非粒線體的氧氣消耗量。
在匯集呼吸作用的篩選分析中，一個理想化合物，在完整細胞未偶合的粒線體，以逐步滴定方式，與對照組比較，顯示較高的呼吸作用。請參見圖12之簡要方法，及在圖13由以編 號3、5及13實例化合物進行實驗之實例圖。圖13顯示，在完整人類血小板，當藥物以逐步方式滴定，與對照組(琥珀酸二鈉)比較，可增加呼吸作用(每單位氧氣的流量)(圖12)。
所欲藥物之性質
(1)理想的化合物在低濃度，完全魚藤酮-抑制下，在CII-篩選方法可刺激呼吸作用，而不會抑制細胞通透化後，琥珀酸鹽所刺激的呼吸作用。以粒線體毒素抑制呼吸作用後，呼吸作用應該完全停止，請參見圖1及下面所列a>b代表a是大於b
a>>b代表a是更大於b
a→b代表a值趨近於b
化合物的所欲性質：
在低的藥物濃度達到a的最大值a>>a'
a→b'
c→c'
d→d'
在分析中，無法通過細胞膜之化合物被鑑定，當：a→a'
候選藥物誘發非粒線體之氧氣消耗被鑑定，當：d>d'

Claims (21)

  1. 一種用於篩選及選擇具潛力候選藥物或測試受試者對影響粒線體的物質敏感性之方法，其包括：i)將含有粒線體之人類血液細胞樣本置入高解析呼吸測量儀，ii)將增加粒線體內膜對質子洩漏之物質加入細胞樣本，iii)將溶於媒劑之受試物質加入得自ii)之樣本，iv)將粒線體複合體I-功能抑制劑加入得自iii)之樣本，v)將粒線體複合體III-功能抑制劑加入得自iv)之樣本，及vi)將受試物質加入之前與之後粒線體氧氣的消耗量與媒劑之粒線體氧氣消耗量比較，其中受試物質的粒線體氧氣消耗量降低顯示對粒線體的負向作用，且其中受試物質的粒線體氧氣消耗量增加顯示對粒線體的正向作用。
  2. 一種用於評估在臨床試驗或治療計畫中候選藥物對粒線體影響之方法，其包括：i)將含有粒線體之人類血液細胞樣本置入高解析呼吸測量儀，其中細胞樣本是來自參與臨床試驗或治療計畫的受試者，且其中受試物質已在臨床試驗或治療計畫期間投與受試者，ii)將增加粒線體內膜對質子洩漏之物質加入細胞樣本，iii)將粒線體複合體I-功能抑制劑加入得自ii)之樣本，iv)將粒線體複合體III-功能抑制劑加入得自iii)之樣本，及v)比較得自參與臨床試驗或治療計畫的受試者之樣本的粒腺體氧氣消耗量與對照組樣本之氧氣消耗量，其中受試物質的粒腺體氧氣消耗量降低顯示對粒線體的負向作用，且其中受試物質的粒線體氧氣消耗量增加顯示對粒線體的正向作用。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中加入增加粒線體內膜對質子洩漏之物質，以得到在樣本中粒線體之電子傳遞系統最大的能量。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中增加粒線體內膜對質子洩漏之物質是選自羰基氰化對-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)、羰基氰化間-氯苯腙(CCCP)及2,4-二硝基酚(DNP)，及其混合物。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中增加粒線體內膜對質子通透性之物質是FCCP。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中含有受試物質之該媒劑是液態形式，且其含有已知濃度之受試物質。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中含有受試物質之該媒劑是以逐步增加濃度方式加入。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中加入粒線體複合體I-功能抑制劑，以證明細胞呼吸作用是依賴複合體II-受質之氧化作用。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中粒線體複合體I-功能抑制劑是魚藤酮(rotenone)。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中加入粒線體複合體III-功能抑制劑，以測定任何非粒線體之氧氣-消耗活性，例如該樣本之自發氧化作用。
  11. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中粒線體複合體III-功能抑制劑是抗黴素A。
  12. 如申請專利範圍第2項之方法，其中對照樣本是來自對照組。
  13. 如申請專利範圍第2項之方法，其中對照樣本是得自任何治療開始前。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其係用於篩選候選藥物。
  15. 如申請專利範圍第1項之方法，其係用於測試受試者對藥物物質或候選藥物的敏感性。
  16. 如申請專利範圍第2項之方法，其係用於在臨床試驗中評估受試物質的粒線體毒性，或用於分析物質對粒線體功能之影響，或用於評估可刺激粒線體呼吸作用及生成ATP之化合物。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中細胞樣本是分離自該受試者。
  18. 一種用於篩選及選擇具潛力候選藥物或測試受試者對影響粒線體的物質敏感性之方法，該方法包括：i)將含有粒線體之人類血液細胞樣本置入高解析呼吸測量儀，ii)將抑制複合體I呼吸作用之物質加入細胞樣本，iii)將溶於媒劑之受試物質加入ii)之樣本，其中呼吸作用的增加顯示漿膜通透性，iv)將通透漿膜之物質加入iii)之樣本，v)將參考物質加入得自iv)之樣本，其中該參考物質為複合體II-連結受質，及vi)將抑制複合體III呼吸作用之物質加入v)之樣本，及將所得氧氣消耗量與得自當在步驟v)中使用參考物質進行方法而未加入受試樣本所得之氧氣消耗量比較，其中在iii)中當該方法使用參考物質進行，若加入受試物質後之氧氣消耗量高於在iii)中加入參考物質後之氧氣消耗量時，該受試物質係穿透漿膜，且其中在v)中當該方法使用參考物質進行，若加入抑制複合體III呼吸作用的物質後之氧氣消耗量高於在v)中之氧氣消耗量時，非粒線體氧氣消耗量係受到該受試物質所誘發。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中穿透漿膜之物質是毛地黃皂苷。
  20. 如申請專利範圍第18至19項中任一項之方法，其中參考物質是琥珀酸鹽。
  21. 如申請專利範圍第18至19項中任一項之方法，其中i)至vi)各別步驟之詳細內容係如申請專利範圍第6、7、8、9、10、11、14及16項中任一項所定義。
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