CN111537594B - 李斯特菌在筛选细胞呼吸链抑制药物上的应用 - Google Patents

李斯特菌在筛选细胞呼吸链抑制药物上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了李斯特菌在筛选细胞呼吸链抑制药物上的应用。本发明采用李斯特菌作为细胞线粒体的替代，利用电化学方法能够快速、有效的完成细胞呼吸链抑制药物的筛选。

Description

李斯特菌在筛选细胞呼吸链抑制药物上的应用
技术领域
本发明涉及一种用于细胞呼吸链抑制药物的筛选平台。
背景技术
呼吸链是由一系列的递氢反应和递电子反应按一定的顺序排列所组成的连续反应体系，它将代谢物脱下的成对氢原子交给氧生成水，同时有ATP生成。实际上呼吸链的作用代表着线粒体最基本的功能，呼吸链中的递氢体和递电子体就是能传递氢原子或电子的载体，由于氢原子可以看作是由质子和核外电子组成的，所以递氢体也是递电子体，递氢体和递电子体的本质是酶、辅酶、辅基或辅因子。
细胞呼吸链抑制对解决肿瘤乏氧，提高抗肿瘤效果具有重要的意义。呼吸链抑制后能够快速降低肿瘤细胞对氧气的消耗，同时降低对肿瘤的能量供应。但细胞呼吸链抑制药物的筛选比较麻烦，目前尚无简单有效的筛选方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种简单有效的细胞呼吸链抑制药物筛选方法。
为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：
李斯特菌在筛选细胞呼吸链抑制药物上的应用。
具体的，李斯特菌在筛选细胞呼吸链电子传递抑制药物上的应用。
本发明还提供了一种细胞呼吸链抑制药物筛选方法，该细胞呼吸链抑制药物筛选方法通过监测药物对李斯特菌于导电基质中氧化还原电流的大小变化，判断药物对李斯特菌呼吸链抑制效果，从而筛选具有细胞呼吸链抑制作用的药物。
其中，导电基质采用DM溶液；并在进行药物对李斯特菌于细菌培养液中氧化还原电流的大小变化监测前，先将李斯特菌置于DM溶液中浸泡消除细菌原本存储的还原能力，再向其中通N2除去溶解氧。
上述氧化还原电流大小变化的监测是通过采用电化学分析方法监测含李斯特菌的DM溶液的电子信号。
该电化学分析方法采用循环伏安法、电化学交流阻抗等方法。
本发明细胞呼吸链抑制药物筛选方法通过将不同浓度的药物加入含李斯特菌的DM溶液中，利用电化学三电极体系监测工作电极表面氧化还原反应，通过氧化还原电流的变化进行细胞呼吸链抑制效果的筛选：当氧化还原反应增加，则表明该药物对细胞呼吸链具有一定的抑制作用。
本发明还提供了一种细胞呼吸链抑制药物筛选平台，该细胞呼吸链抑制药物筛选平台包括电解杯、三电极体系和电化学工作站；所述电解杯通过三电极体系与电化学工作站相连；所述电解杯内置有李斯特菌的导电基质溶液。
其中，导电基质溶液采用DM溶液；三电极体系中工作电极采用玻碳电极/ITO电极，参比电极采用饱和甘汞电极，对电极采用铂丝电极。
DM溶液中每升含有：NaHCO3 2.5g，CaCl2·2H2O 0.09g，NH4Cl 1.0g，MgCl2·6H2O0.2g，NaCl 10g，HEPES 7.2g，K2HPO4 36mg，Na2SO4 0.71mg，以及10ml微量矿物溶液；
每升所述微量矿物溶液包含：FeCl2·4H2O 0.2g，Na2WO4·2H2O 0.02g，MnCl2·4H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.1g，ZnCl2 0.05g，CuCl2·2H2O 0.002g，H3BO3 0.005g，Na2MoO4·2H2O 0.01g，Na2SeO3 0.017g，NiCl2·6H2O 0.024g，C6H9NO6 1.5g。
其中，李斯特菌在DM溶液中的浓度优选为2×109～4×109cfu/ml。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明采用李斯特菌作为细胞线粒体的替代，利用电化学方法能够快速、有效的完成细胞呼吸链抑制药物的筛选。
2、本发明通过电化学工作站、三电极体系构建药物筛选平台，采用循环伏安法、电化学交流阻抗等方法来监测工作电极表面氧化还原反应，通过氧化还原电流的大小变化能够快速、有效判断药物对细胞呼吸链是否有抑制效果，筛选过程快速、高效，且大大压缩了生物医学领域药物筛选的成本。
3、通过本发明筛选具有细胞呼吸链抑制效果的药物，通过试剂盒监测ATP含量和线粒体膜电位等，对其效果进行了有效验证，采用本发明进行细胞呼吸链电子传递抑制药物筛选结论精确、高效。
附图说明
图1为本发明细胞呼吸链抑制药物筛选平台的结构示意图；
图1中，1-电解杯，2-三电极体系，3-电化学工作站；
图2为本发明进行细胞呼吸链抑制药物筛选的原理示意图；
图3为本发明实施例1中阿托伐醌不同浓度下李斯特菌的循环伏安图；
图3中，a-f表示不同的阿托伐醌浓度，a为对照组(阿托伐醌浓度0μmol/L)；b为0.5μmol/L的阿托伐醌；c为1.0μmol/L的阿托伐醌；d为1.5μmol/L的阿托伐醌；e为2.0μmol/L的阿托伐醌；f为2.5μmol/L的阿托伐醌；
图4为本发明实施例1中阿托伐醌不同浓度下HeLa细胞线粒体膜电位检测荧光图；
图5为本发明实施例1中阿托伐醌不同浓度下HeLa细胞线粒体膜干扰效率图(红色/绿色)；
图6为本发明实施例1中阿托伐醌不同浓度下对李斯特菌的生长抑制作用效果图；
图7为本发明实施例1中阿托伐醌不同浓度下对HeLa细胞生长抑制作用效果图；
图8为本发明实施例1中阿托伐醌不同浓度下李斯特菌ATP含量检测对比图；
图9为本发明实施例1中阿托伐醌不同浓度下HeLa细胞ATP含量检测对比图；
图10为本发明实施例1中阿托伐醌对李斯特菌的作用效果图；
图10中，a为空白对照组，b为1.5μmol/L阿托伐醌，c为2.0μmol/L阿托伐醌；
图11为本发明实施例2中对甲双胍对李斯特菌的作用效果图；
图11中，a为空白对照组，b为10mmol/L二甲双胍，c为20mmol/L二甲双胍；
图12为本发明实施例3中顺铂对李斯特菌的作用效果图；
图12中，a为空白对照组，b为3μmol/L顺铂，c为5μmol/L顺铂。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细说明。
以下实施例中采用的试剂、仪器及检测方法如下：
1、DM溶液
每升DM溶液包含：NaHCO3 2.5g；CaCl2·2H2O，0.09g；NH4Cl，1.0g；MgCl2·6H2O，0.2g；NaCl，10g；HEPES，7.2g；K2HPO4，36mg；Na2SO4，0.71mg，以及10ml微量矿物溶液；
每升微量矿物溶液包含：FeCl2·4H2O，0.2g；Na2WO4·2H2O，0.02g；MnCl2·4H2O，0.1g；CoCl2·6H2O，0.1g；ZnCl2，0.05g；CuCl2·2H2O，0.002g；H3BO3，0.005g；Na2MoO4·2H2O，0.01g；Na2SeO3，0.017g；NiCl2·6H2O，0.024g；C6H9NO6，1.5g。
2、三电极体系及电化学工作站
仪器：CHI660C电化学工作站(上海辰华公司)。
三电极体系：
工作电极—玻碳电极/ITO电极，
参比电极—饱和甘汞电极，
对电极—铂丝电极。
3、循环伏安法(CV法)
该法控制电极电势以不同的速率，随时间以三角波形一次或多次反复扫描，并记录电流-电势曲线，常用来测量电极反应参数，主要用于判断电极表面微观反应过程等。
在DM溶液中，在-0.7V至+0.3V之间进行循环伏安扫描，扫描速度为0.1V·s-1，直到获得稳定的平滑的循环伏安(电流-电势)曲线。
4、电化学交流阻抗(EIS)
当电极系统受到一个正弦波形电压(电流)的交流讯号的扰动时，会产生一个相应的电流(电压)响应讯号，由这些讯号可以得到电极的阻抗或导纳。一系列频率的正弦波讯号产生的阻抗频谱，称为电化学阻抗谱。EIS中半圆的直径表示电子探针的电子转移阻抗(Ret)，决定了氧化还原探针在电极表面的电子转移动力学。
5、ATP含量测定
运用ATP含量测试盒，在636nm处测吸光度，吸光度值越小表明ATP含量越少，表明细胞呼吸链受到了一定程度的影响。
6、线粒体膜电位检测
运用线粒体膜电位JC-1检测试剂盒，在荧光显微镜下对细胞进行观察，红色代表线粒体膜电位正常，绿色表示线粒体膜电位异常。当细胞呼吸链受到药物抑制时，则会相应影响线粒体功能，此时会表现出异常的绿色荧光。
实施例1
本发明细胞呼吸链抑制药物筛选平台包括电解杯1、三电极体系2和电化学工作站3，如图1所示。
将李斯特细菌放置在DM溶液中，浓度为2×109～4×109cfu/ml，浸泡2小时后，放入电解杯1中，并接入三电极体系2，连入电化学工作站3，通入氮气15分钟，而后检测细菌的电子信号，观察氧化还原电流，待氧化还原电流稳定平滑后，再加入所需检测的药物，监测氧化还原电流的变化。若氧化还原反应增加，则表明该药物对细菌的呼吸链具有一定的抑制作用，反之则无抑制作用。如图2所示。
本实施例中加入阿托伐醌进行检测，分别采用循环伏安法及电化学交流阻抗法进行抑制作用筛选。
如图3所示，从循环伏安图中可以看出，随着阿托伐醌浓度的增加，氧化还原电流不断增加，电子信号不断增强，表明阿托伐醌对细菌的呼吸链具有抑制作用且随着阿托伐醌药物浓度的增加抑制作用效果逐渐增强。
如图10所示，运用电化学交流阻抗法研究阿托伐醌对李斯特菌的呼吸链抑制作用，可以看出，在阿托伐醌的浓度为2.0μmol/L(c)时，抑制效果非常良好，与空白对照组a相比较可以明显的抑制细胞呼吸链的作用，表明阿托伐醌是良好的细胞呼吸链抑制剂。
通过线粒体膜电位检测、试剂盒ATP含量检测等进行呼吸链抑制效果验证：
如图4、图5所示，阿托伐醌对HeLa细胞作用后，线粒体膜电位检测结果，红色代表线粒体膜电位正常，绿色代表线粒体膜电位异常，从图中可以看出，阿托伐醌对HeLa细胞的线粒体具有抑制作用，且阿托伐醌的浓度越大，抑制作用越明显。
如图6、图7所示，阿托伐醌对李斯特菌和HeLa细胞的生长均具有抑制作用，并且随着阿托伐醌浓度的增加对李斯特菌和HeLa细胞的生长抑制作用效果也逐渐增强，证明有效抑制与阿托伐醌药物浓度呈正相关关系。
如图8、图9所示，在阿托伐醌对李斯特菌和HeLa细胞的呼吸链抑制后，对能量代谢产生ATP有影响，可以看出，阿托伐醌浓度越大，产生ATP越少，表明细胞呼吸链的抑制程度与阿托伐醌药物的浓度有关，浓度越大抑制效果越显著。
实施例2
采用实施例1的方法对二甲双胍对细胞呼吸链抑制效果进行检测。
如图11所示，运用电化学交流阻抗法研究二甲双胍对李斯特菌的抑制作用，可以看出，在二甲双胍的浓度为2.0μmol/L时，能够较好抑制细胞呼吸链作用，筛选结果说明二甲双胍对于细胞呼吸链有一定的作用效果，二甲双胍是细胞呼吸链的良好抑制剂，与二甲双胍的实际抑制效果一致。
实施例3
采用实施例1的方法对顺铂对细胞呼吸链抑制效果进行检测。
如图12所示，运用电化学交流阻抗法研究顺铂对李斯特菌的抑制作用，可以看出顺铂不具有细胞呼吸链抑制作用，筛选结果与其实际无抑制效果一致。

Claims (6)

1.一种细胞呼吸链抑制药物筛选方法，其特征在于：所述细胞呼吸链抑制药物筛选方法通过监测药物对李斯特菌在导电基质中氧化还原电流的大小变化，判断药物对李斯特菌呼吸链抑制效果，从而筛选具有细胞呼吸链抑制作用的药物；所述导电基质采用DM溶液；并在进行药物对李斯特菌于DM溶液中氧化还原电流的大小变化监测前，先将李斯特菌置于DM溶液中浸泡消除细菌原本存储的还原能力，再向DM溶液中通N2除去溶解氧；在进行监测时，在DM溶液中，在-0.7V至+0.3 V之间进行循环伏安扫描，扫描速度为0.1 V·s-1，直到获得稳定的平滑的循环伏安曲线，再加入所需检测的药物，利用电化学三电极体系监测工作电极表面氧化还原反应，通过氧化还原电流的变化进行细胞呼吸链抑制效果的筛选：当氧化还原反应增加，则表明该药物对细胞呼吸链具有一定的抑制作用。
2.根据权利要求1所述的细胞呼吸链抑制药物筛选方法，其特征在于：所述氧化还原电流大小变化的监测是通过采用电化学分析方法监测含李斯特菌的DM溶液的电子信号。
3.根据权利要求2所述的细胞呼吸链抑制药物筛选方法，其特征在于：所述电化学分析方法采用循环伏安法、电化学交流阻抗法。
4.一种采用权利要求1至3任一所述细胞呼吸链抑制药物筛选方法的细胞呼吸链抑制药物筛选平台，其特征在于：所述细胞呼吸链抑制药物筛选平台包括电解杯、三电极体系和电化学工作站；所述电解杯通过三电极体系与电化学工作站相连；所述电解杯内置有含李斯特菌的导电基质溶液。
5.根据权利要求4所述的细胞呼吸链抑制药物筛选平台，其特征在于：所述导电基质溶液采用DM溶液；所述三电极体系中工作电极采用玻碳电极/ITO电极，参比电极采用饱和甘汞电极，对电极采用铂丝电极。
6.根据权利要求5所述的细胞呼吸链抑制药物筛选平台，其特征在于：所述DM溶液中每升含有：NaHCO3 2.5g，CaCl2·2H2O 0.09g，NH4Cl 1.0g， MgCl2·6H2O 0.2g，NaCl 10g，HEPES 7.2g，K2HPO4 36mg，Na2SO4 0.71mg，以及10 ml微量矿物溶液；
每升所述微量矿物溶液包含：FeCl2·4H2O 0.2g，Na2WO4·2H2O 0.02g，MnCl2·4H2O0.1g， CoCl2·6H2O 0.1g，ZnCl2 0.05g，CuCl2·2H2O 0.002g，H3BO3 0.005g，Na2MoO4·2H2O0.01g，Na2SeO3 0.017g，NiCl2·6H2O 0.024g，以及C6H9NO6 1.5g。
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