WO2020054824A1 - ミトコンドリア呼吸系複合体活性を測定する方法 - Google Patents

ミトコンドリア呼吸系複合体活性を測定する方法 Download PDF

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WO2020054824A1
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respiratory chain
complex
mitochondria
chain complex
electron donor
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PCT/JP2019/035985
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Inventor
善浩 太田
広子 柏木
後藤　雄一
Original Assignee
ルカ・サイエンス株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology, and more specifically, to a method for measuring mitochondrial respiratory chain complex activity in a single cell, and further to a method for measuring single mitochondrial respiratory chain complex activity.
  • the mitochondrial respiratory chain consists of four multisubunit complexes (complexes I-IV) and two electron carriers, ubiquinone and cytochrome c.
  • Oxidative phosphorylation (OXPHOS) begins with the entry of electrons into the respiratory chain via complex I or II.
  • Complex III carries electrons from reduced ubiquinone to cytochrome c, and complex IV transfers electrons from cytochrome c to oxygen to complete the sequence.
  • Electron transfer couples with the transfer of protons across the inner membrane to the transmembrane space, creating a transmembrane proton gradient that provides the driving force for ATP production by complex V (ATP synthase).
  • Dependence on OXPHOS and human energy expenditure were reported to be more than 65 kg ATP / day per person. Given that such energy is dependent on OXPHOS, it is not surprising that defects in the OXPOS system cause disease (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 There is a study in which cells are solubilized with digitonin, and succinic acid is added to detect mitochondrial membrane potential.
  • the present invention provides a method for measuring mitochondrial respiratory chain complex activity in a single cell.
  • the invention also provides a method for measuring mitochondrial respiratory chain complex activity in a single mitochondria (eg, an isolated single mitochondria).
  • the present invention also provides a method for continuously detecting mitochondria in a single cell or the activity of a respiratory chain complex in a single mitochondria.
  • the present invention provides methods for staining permeable cells with a mitochondrial membrane potential sensitive fluorescent dye (mitochondrial membrane potential indicator).
  • the fluorescent dye may be a fluorescent dye that accumulates in mitochondria depending on the membrane potential (TMRE, TMRM, DiOC6, rhodamine 123, JC-1, etc.).
  • the time-dependent fluorescence intensity of each cell can be measured using a fluorescence microscope.
  • an electron donor and an inhibitor can be used for detecting the activity of each complex.
  • the electron donor is an electron donor to complex I, such as malic acid
  • the inhibitor can be an inhibitor of complex I, such as rotenone.
  • the electron donor is succinic acid and the inhibitor can be an inhibitor of complex III, such as antimycin A.
  • the inhibitor may be a combination of ascorbate and tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD), or an inhibitor of complex IV such as KCN, azide, or carbon monoxide.
  • the inhibitor may also be an inhibitor of ATP or complex V, such as oligomycin and carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP).
  • multiple cells can be measured simultaneously.
  • the number of cells that can be measured simultaneously can be increased by reducing the magnification of the objective lens.
  • the total fluorescence intensity of the cells is determined relative to the fluorescence intensity of the cells excluding the fluorescence intensity of the solution.
  • cells may be stained simultaneously with calcein and TMRE.
  • the total fluorescence intensity of TMRE is normalized by the fluorescence intensity of calcein.
  • the methods described herein can be performed using cultured cell lines. In some embodiments, the methods described herein can be performed using cells isolated from a tissue. In some embodiments, the cells can be human cells. In some embodiments, the cells can be myocardial progenitor cells. In a specific embodiment, the cell line may be a C6 glioma cell. In another specific embodiment, the cell line may be a Hela cell or a human fibroblast.
  • a method for detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex Contacting mitochondria with an inhibitor of complex V; Measuring the mitochondrial membrane potential before and after contact with the inhibitor, Changes in membrane potential before and after contact with the inhibitor indicate the activity of complex V, Method.
  • the method of the above-mentioned [1] or [2], wherein measuring the mitochondrial membrane potential includes contacting mitochondria with a voltage-dependent mitochondrial stain.
  • step (a) indicates the sum of the activities of the complexes I, III, and IV
  • step (b) indicates the sum of the activities of the complexes III and IV
  • step (c) indicates the activity of complex IV
  • the change in membrane potential in (d) indicates the activity of complex V.
  • step (A) is rotenone
  • step (B) is myxothiazole
  • step (C) is KCN
  • a method for detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex (B) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex III, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex III with the electron donor; And (c) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex IV, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex IV with the electron donor.
  • a method for detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex (A) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex I, detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact with the electron donor of respiratory chain complex I, Contacting mitochondria with an inhibitor of respiratory chain complex I; (B) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex III, detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact with the electron donor of respiratory chain complex III, Contacting mitochondria with an inhibitor of respiratory chain complex III; and (C) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex IV; Detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contacting the IV with the electron donor, and then contacting the mitochondria with an inhibitor of respiratory chain complex IV; Performing one or more steps selected from the group consisting of: afterwards, (A) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex I, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex I with the electron donor;
  • a method comprising performing any one step selected from the group consisting of: (a) when (A) is performed, (a) can not be performed, and when (B) is performed, Can not perform (b), and can perform (c) if (C) is performed.
  • FIG. 1 shows a method for measuring respiratory chain complex activity by sequentially treating cells with malic acid and rotenone, succinic acid and then antimycin A, ascorbic acid and TMPD and then KCN, and ATP, and the results.
  • I + III + IV”, “III + IV”, and “IV” are complexes that transport protons from the inside to the outside when the electron donor is brought into contact with mitochondria, respectively. Indicates the number.
  • V indicates the number of the complex that transports protons from the inside to the outside of the inner membrane by the addition of ATP.
  • the lower part of FIG. 1 shows a fluorescence microscope image of the cells at the corresponding time.
  • FIG. 2 shows a method of sequentially treating cells with malic acid and rotenone, succinic acid and subsequent myxothiazole, ascorbic acid and TMPD, and then oligomycin to measure respiratory chain complex activity and the results.
  • the double-headed arrow and the Roman numeral below it in FIG. 2 indicate the concentration gradient of the proton formed by the complex and the complex involved in the gradient.
  • FIG. 3 shows an example of an analysis method when a mitochondrial membrane potential is measured for each cell using a fluorescent indicator.
  • FIG. 4 shows an example in which cells were treated with ATP, the activity of complex V was measured, and then the activity of another complex was measured.
  • FIG. 5 shows an example of a test for measuring the activity of a respiratory chain complex using normal mitochondria and mitochondria having a mutation in complex V.
  • FIG. 6 shows an example of an activity measurement test of a respiratory chain complex using mitochondria before and after hydrogen peroxide treatment (before: control, after: hydrogen peroxide).
  • FIG. 7 shows the action of respiratory chain complexes I, II, III, IV and V in the inner mitochondrial membrane and the movement of electrons (e ⁇ ) to them.
  • Respiratory chain complexes I, III, and IV upon receiving electrons, transport protons (H + ) from the matrix to the inner membrane space, forming a proton concentration gradient.
  • Complex V synthesizes ATP from ADP using the concentration gradient of the formed protons.
  • the present invention provides a method for measuring the activity of a mitochondrial complex having a proton pump activity (complexes I, III, IV, V).
  • measurement means to measure and determine the amount of an object, and is used to include finding out the presence of an object by inspection.
  • detecting means finding at least the presence of a subject by testing. In the present invention, after detecting the target, the amount of the target can be measured and obtained.
  • the permeabilized cells can be stained with a mitochondrial membrane potential sensitive fluorescent dye, such as TMRE.
  • the time-dependent fluorescence intensity of each cell can be measured using, for example, a fluorescence microscope.
  • the fluorescent dye can be a fluorescent dye that accumulates in mitochondria at a particular membrane potential.
  • the fluorescent dye can include TMRM, DiOC6, Rhodamine 123, or JC-1.
  • inhibitors can be used for detecting the activity of each complex as described below.
  • Detecting the activity of complex I can include the use of malic acid, or rotenone as an inhibitor.
  • Detection of complex III activity can include succinic acid or antimycin A.
  • the detection of complex IV can include ascorbate and TMPD, or KCN.
  • Complex V detection can include ATP, or oligomycin and CCCP. As described in the examples, the use of these inhibitors in cells may allow the activity of each complex to be measured successfully.
  • this technology allows the measurement of the activity of four mitochondrial complexes in individual cells.
  • cells can be stained with other fluorescent dyes.
  • the measured cells can be characterized at an individual level.
  • Cells can be measured using a device that measures fluorescence.
  • cells can be measured using a fluorescence microscope.
  • a fluorescence microscope can accurately measure individual cells within the microscope field.
  • large numbers of cells can be measured simultaneously using the methods of the invention.
  • the number of cells that can be measured simultaneously can be adjusted by increasing or decreasing the magnification of the objective lens on the microscope.
  • the number of cells can be increased by reducing the magnification of the objective lens. It is understood that the magnification can be adjusted according to the needs of the user.
  • the objective lens is 10-20x and the measurable cell count is about 5-20 cells.
  • the total fluorescence of each cell is measured according to the method of Hirusaki et al. (Hirusaki et al., 2017, Sci. Rep. 7, 16044) to avoid the effects of cell deformation during the measurement. .
  • the objective lens can be adjusted according to the needs of the user.
  • the user can adjust the numerical aperture to avoid the effects of focus position drift during measurements on fluorescence intensity for long periods of time, eg, one hour or more.
  • the objective has a numerical aperture of 0.4. From the viewpoint of avoiding the influence of the drift of the focal position on the fluorescence intensity for 70 minutes or more, a numerical aperture of 0.9 or less can be used.
  • cells can measure fluorescence as total fluorescence intensity.
  • Total fluorescence intensity is highly dependent on cell size.
  • the total fluorescence intensity of a cell is expressed as a value relative to the total fluorescence intensity of that cell in a particular state. Thereby, it is possible to analyze a result with little fluctuation.
  • this analysis allows for a study of how the relative activity of one or more respiratory chain complexes in a cell differs from their relative activity in control cells.
  • the methods described herein allow for the detection of complexes having relatively higher or lower activity in one cell as compared to other complexes. Also, the methods described herein allow for the detection of cells containing a complex having relatively higher or lower activity, comparing one cell to another.
  • mitochondrial activity is detected in more than one cell. For example, detection of a decrease in activity in one or more or all of the complexes can be performed. This can be accomplished, for example, by infiltrating cells with calcein and TMRE and simultaneously staining the cells. Thus, in some embodiments, the total fluorescence intensity of TMRE in cells is normalized by the total fluorescence intensity of calcein.This correction method corrects for differences in TMRE fluorescence due to differences in cell size and mitochondrial content. Allow the user to explain. In some embodiments, differences in mitochondrial quality between cells can be calculated using the methods provided herein.
  • the methods described herein can be performed using a cultured cell line.
  • the cell line may be a C6 glioma cell.
  • the cell line may be a Hela cell.
  • the cells can be primary cells such as cardiomyocytes, skeletal muscle cells, fibroblasts, or blood cells.
  • the cells can be cells from a mitochondrial disease patient.
  • the cells can be measured after treatment with the therapeutic compound.
  • a method for detecting the activity of mitochondrial respiratory chain complex V Respiratory chain complexes I, III, and IV form proton concentration gradients inside and outside the inner mitochondrial membrane by using their electron donors to eject protons from inside the inner mitochondrial membrane and out of the inner mitochondrial membrane I do.
  • the respiratory chain complex V synthesizes ATP from ADP using the energy of the concentration gradient of the proton formed as described above.
  • protons are taken into the inner membrane from outside the mitochondrial inner membrane, and ATP is synthesized from ADP in exchange for this.
  • the activity of respiratory chain complex V is to produce ATP while eliminating the proton concentration gradient.
  • the activity of respiratory chain complex V can be determined by stopping respiratory chain complex V with an inhibitor. That is, when the activity of the respiratory chain complex V is completely inhibited, the concentration gradient of the proton formed by the respiratory chain complexes I, III, and IV is eliminated, and ATP is not synthesized. Is stronger. This increased portion was consumed by respiratory chain complex V due to its ATP synthesis activity. Therefore, an increase in the concentration gradient of protons when the respiratory chain complex V is inhibited by the inhibitor of the respiratory chain complex V can be detected as the activity of the respiratory chain complex V.
  • a method for detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex Contacting mitochondria with an inhibitor of complex V; Measuring the mitochondrial membrane potential before and after contact with the inhibitor, Changes in membrane potential before and after contact with the inhibitor indicate the activity of complex V, A method is provided.
  • Complex V activity can also be measured by contacting ATP with mitochondria. In the presence of ATP, complex V undergoes a reverse reaction, producing ADP and phosphate from ATP and forming a proton concentration gradient inside and outside the inner mitochondrial membrane. The formation of a concentration gradient of protons in the presence of ATP can be detected as the activity of complex V. In the case where the ability of the complex V to form a concentration gradient of protons in the presence of ATP is detected as the activity of the complex V, the activity of the other complex may be stopped by an inhibitor. V activity can be detected more accurately.
  • the activity of the mitochondrial respiratory chain complex can be detected.
  • the method for detecting the activity of the mitochondrial respiratory chain complex comprises, when detecting the activity of the mitochondrial respiratory chain complex V using an inhibitor of the complex V, mitochondria, a respiratory chain complex.
  • a concentration gradient of protons may be formed before and after the inner membrane of mitochondria.
  • the respiratory chain complex III can also receive electrons and form a proton concentration gradient by giving an electron donor to the respiratory chain complex II. Therefore, in this specification, the term “electron donor of the respiratory chain complex III” is used to include the electron donor of the respiratory chain complex II.
  • the respiratory chain complex V synthesizes ATP while eliminating the concentration gradient of the formed protons. Therefore, if the activity of the respiratory chain complex V is inhibited by using an inhibitor so that the proton concentration gradient is not eliminated, the proton concentration gradient is enhanced. According to the present invention, the increase in the concentration gradient of the proton can be detected as the activity of the respiratory chain complex V.
  • a method for detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex Contacting the mitochondria with one or more electron donors of a respiratory chain complex selected from the group consisting of respiratory chain complexes I, III, and IV; Thereafter, contacting mitochondria with an inhibitor of complex V, Measuring the mitochondrial membrane potential before and after contact with the inhibitor, Changes in membrane potential before and after contact with the inhibitor indicate the activity of complex V, A method is provided.
  • the electron donor to be brought into contact with mitochondria may be only the electron donor of respiratory chain complex I, may be only the electron donor of respiratory chain complex III, or may be the electron donor of respiratory chain complex IV. Only may be.
  • the electron donor that is brought into contact with mitochondria may be two or more of the electron donors of the respiratory chain complex selected from the group consisting of respiratory chain complexes I, III, and IV.
  • electron donors of respiratory chain complex I include, for example, NADH and a substrate that produces NADH (eg, malic acid, pyruvate, glutamic acid, 2-oxoglutarate, and isocitrate, and the like). It can be used in the invention.
  • the electron donor of respiratory chain complex III includes reduced coenzyme Q and succinic acid, which can be used in the present invention.
  • examples of the electron donor of the respiratory chain complex IV include tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) and ascorbic acid, which can be used in the present invention.
  • electron donors for respiratory chain complex IV include reduced cytochrome c and TMPD, which can be used in the present invention. As the electron donor of the respiratory chain complex IV, both TMPD and ascorbic acid can be preferably used.
  • a mitochondrial membrane potential indicator can be used as the voltage-dependent mitochondrial stain.
  • mitochondrial membrane potential indicators include tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE), 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC 6 ), and 6-amino-9- (2 -Methoxycarbonylphenyl) xanthen-3-ylidene) azanium chloride (rhodamine 123) and 5,5 ′, 6,6′-tetrachloro-1,1 ′, 3,3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1), which can be used in the present invention.
  • TMRM tetramethylrhodamine methyl ester
  • TMRE tetramethylrhodamine ethyl ester
  • DIOC 6 3,3′-dihe
  • JC-1 accumulates in mitochondria in a membrane potential-dependent manner and forms an aggregate at high concentrations, changing from green to red.
  • TMRM and TMRE accumulate in mitochondria in a membrane potential-dependent manner, and the fluorescence intensity increases at high concentrations.
  • TMRE can be used. Therefore, when a mitochondrial membrane potential indicator is used, its fluorescence intensity reflects the magnitude of the mitochondrial membrane potential. The relationship between the fluorescence intensity and the membrane potential can be determined by a calibration curve created in advance.
  • mitochondria can be brought into contact with an inhibitor of respiratory chain complex V.
  • An inhibitor of respiratory chain complex V can be, for example, an inhibitor of ATP synthesis activity of respiratory chain complex V.
  • Inhibitors of ATP synthesis activity of respiratory chain complex V include oligomycin and ATP.
  • Inhibitors of respiratory chain complex V also include, for example, inhibitors of the ADP / ATP exchange transporter. This is because the inhibitor of the ADP / ATP exchange transporter indirectly inhibits respiratory chain complex V.
  • Inhibitors of the ADP / ATP exchange transporter include atractyloside and boncrequinic acid.
  • the change in mitochondrial membrane potential before and after contact of mitochondria with an inhibitor of respiratory chain complex V indicates the activity of respiratory chain complex V. Therefore, according to the present invention, when a change in the mitochondrial membrane potential is detected, the activity of the respiratory chain complex V is detected. Accordingly, the present invention provides a method for detecting the respiratory chain complex V from the change in mitochondrial membrane potential (for example, the magnitude of the changed potential) before and after contact of the mitochondria with the inhibitor of the respiratory chain complex V detected as described above. It may further include estimating the activity. Therefore, in the present invention, the activity of the involved complex is detected by detecting the change in the membrane potential.
  • the membrane potential formed in the inner membrane of mitochondria is detected, estimated, or measured by a voltage-dependent mitochondrial staining agent such as a mitochondrial membrane potential indicator. Therefore, in the method of the present invention, the activity of mitochondrial respiratory chain complex V in each cell can be detected. According to the method of the present invention, the activity of respiratory chain complex V can be detected for each mitochondria. Thus, according to the present invention, the measurement of the mitochondrial membrane potential before and after contact with the inhibitor can be performed for each cell or for each mitochondria.
  • the method of detecting the activity of the mitochondrial respiratory chain complex of the present invention may be performed in a cell, or may be performed using an isolated mitochondria after isolating the mitochondria outside the cell.
  • the cells can be pretreated to increase the permeability of the cell membrane.
  • the pretreatment include a surfactant treatment having a concentration lower than the critical micelle concentration.
  • the surfactant for example, digitonin and saponin can be used.
  • mitochondria can be isolated from cells using mitochondrial isolation methods known to those skilled in the art.
  • the method further includes comparing the activity of the complex between different cells or mitochondria, whereby the high activity of the test cell or the complex of mitochondria can be evaluated.
  • the control cell or mitochondria can be a cell having normal mitochondria or normal mitochondria.
  • the control cell or mitochondria can also be a cell with mitochondria or any such mitochondria having any one or more of the complexes that have lost activity.
  • part 1 Prior to detecting the activity of respiratory chain complex V, one or more respiratory chains selected from the group consisting of other respiratory chain complexes, ie, respiratory chain complexes I, III, and IV.
  • the activity of the chain complex can be detected.
  • the present invention Any one step selected from the group consisting of the following (a) to (c): (A) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex I, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex I with the electron donor; ; (B) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex III, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex III with the electron donor; And (c) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex IV, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex IV with the electron donor.
  • steps (a) to (c) the electron donor is as described above.
  • the change in the membrane potential of mitochondria before and after the contact of each respiratory chain complex with the electron donor can be detected as described above.
  • step (a) when the electron donor of respiratory chain complex I contacts mitochondria, the entire oxidative phosphorylation pathway moves. As a result, respiratory chain complexes I, III, and IV form a proton concentration gradient across and inside the mitochondrial inner membrane (ie, a membrane potential is formed in the inner membrane). Thus, the change in the membrane potential of the inner mitochondrial membrane before and after contact with the electron donor is due to the sum of the activities of respiratory chain complexes I, III and IV. However, in this case, when the activity of the respiratory chain complex V is not inhibited, the membrane potential is reduced by the activity of the respiratory chain complex V.
  • the change in the membrane potential due to the activity of the respiratory chain complex V is added to the change in the membrane potential obtained above to obtain the respiratory chain complex V. It can be the sum of the activities of bodies I, III and IV.
  • the addition of an inhibitor to respiratory chain complex V alone further polarizes the inner mitochondrial membrane.
  • the membrane potential at this time may be due to the sum of the activities of respiratory chain complexes I, III and IV, excluding the effect of complex V.
  • step (b) when the electron donor of the respiratory chain complex III contacts the mitochondria, as a result, the respiratory chain complexes III and IV form a proton concentration gradient inside and outside the inner mitochondrial membrane ( That is, a membrane potential is formed on the inner membrane).
  • a membrane potential is formed on the inner membrane.
  • the change in the membrane potential of the inner mitochondrial membrane before and after contact with the electron donor is due to the sum of the activities of respiratory chain complexes III and IV.
  • the membrane potential is reduced by the activity of the respiratory chain complex V.
  • the change in the membrane potential due to the activity of the respiratory chain complex V is added to the change in the membrane potential obtained above to obtain the respiratory chain complex V. It can be the sum of the activities of bodies III and IV.
  • the addition of an inhibitor for respiratory chain complex V alone results in greater polarization of the inner mitochondrial membrane.
  • the membrane potential at this time may be due to the sum of the activities of the respiratory chain complexes III and IV, excluding the effect of the complex V.
  • step (c) the contact of the electron donor of the respiratory chain complex IV with mitochondria results in the formation of a proton concentration gradient across the inner mitochondrial membrane by the respiratory chain complex IV (i. A membrane potential is formed on the membrane).
  • a membrane potential is formed on the membrane.
  • the change in the membrane potential of the inner mitochondrial membrane before and after contact with the electron donor is due to the activity of respiratory chain complex IV.
  • the membrane potential is reduced by the activity of the respiratory chain complex V. Therefore, according to the method of the present invention, when the activity of the respiratory chain complex V is determined, the change in the membrane potential due to the activity of the respiratory chain complex V is added to the change in the membrane potential obtained above to obtain the respiratory chain complex V.
  • step (c) it can be the sum of the activities of body IV.
  • step (c) the addition of an inhibitor to respiratory chain complex V alone results in greater polarization of the inner mitochondrial membrane.
  • the membrane potential at this time may be due to the activity of the respiratory chain complex IV in which the influence of the complex V has been eliminated.
  • the activity of the complex V is detected by bringing the mitochondria into contact with the inhibitor of the complex V
  • the other complex For example, no inhibitor for the complex measured immediately before
  • the complex activated in the immediately preceding step is interposed between step (d) and the immediately preceding measurement step. May be treated with mitochondria.
  • the complex V The post-inhibition mitochondrial membrane potential may be due to the sum of the activities of respiratory chain complexes I, III, and IV, excluding the effects of complex V; Mitochondrial membrane potential after inhibition of complex V could be due to the sum of the activities of respiratory chain complexes III and IV, excluding the effect of complex V; performing step (c) In some cases, the mitochondrial membrane potential following inhibition of complex V may be due to the activity of respiratory chain complex IV, where the effects of complex V have been eliminated.
  • the activity of complex V can be determined by subtracting the change in membrane potential before and after contact with the electron donor detected in each step from the membrane potential of mitochondria after contact with the inhibitor of complex V. .
  • the activity of the respiratory chain complex can be continuously detected in a specific cell or mitochondria.
  • the mitochondria and the inhibitor for the complex are contacted to return the mitochondrial membrane potential to the ground state, and then the next electron
  • the donor and mitochondria can be contacted.
  • a method including performing one or more steps selected from the group consisting of the following (A) to (C): (A) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex I, detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact with the electron donor of respiratory chain complex I, Contacting mitochondria with an inhibitor of respiratory chain complex I; (B) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex III, detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact with the electron donor of respiratory chain complex III, Contacting mitochondria with an inhibitor of respiratory chain complex III; and (C) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex IV; A step is provided that includes detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contacting the IV with an electron donor, and then contacting the mitochondria with an inhibitor of respiratory chain complex IV.
  • examples of the electron donor of the respiratory chain complex I include malic acid. Contact between mitochondria and the electron donor of respiratory chain complex I activates the mitochondrial oxidative phosphorylation pathway. As a result, the respiratory chain complex I moves protons from the inside to the outside of the inner mitochondrial membrane, forming a proton concentration gradient (and a membrane potential). The electrons travel through ubiquinone to respiratory chain complex III, which causes protons to move from inside the mitochondrial inner membrane to the outside, forming a proton concentration gradient (and membrane potential) ( That is, the inner membrane of the mitochondria is more polarized). This also causes the membrane potential to show a stronger (or lower) negative value.
  • the electrons then travel through cytochrome c to respiratory chain complex IV, which in turn relocates protons from inside the mitochondrial inner membrane to a proton concentration gradient (and membrane potential). Form.
  • the proton concentration gradient drives the respiratory chain complex V to synthesize ATP from ADP. Therefore, the mitochondrial membrane potential detected in (A) above reflects the activity of respiratory chain complexes I, III, and IV minus the activity of respiratory chain complex V.
  • the inhibitor of the respiratory chain complex may be, for example, rotenone.
  • examples of the electron donor of the respiratory chain complex III include succinic acid.
  • Succinic acid activates respiratory chain complex III, which causes protons to move from inside to outside the inner mitochondrial membrane, forming a proton concentration gradient (and membrane potential).
  • the electrons then travel through cytochrome c to respiratory chain complex IV, which in turn relocates protons from inside the mitochondrial inner membrane to a proton concentration gradient (and membrane potential).
  • the proton concentration gradient drives the respiratory chain complex V to synthesize ATP from ADP.
  • the mitochondrial membrane potential detected in the above (B) reflects the activity of respiratory chain complexes III and IV minus the activity of respiratory chain complex V.
  • the inhibitor of the respiratory chain complex may be, for example, malonic acid, antimycin A or myxothiazole, preferably myxothiazole.
  • examples of the electron donor of the respiratory chain complex IV include TMPD and ascorbic acid.
  • TMPD and ascorbic acid activate respiratory chain complex IV, which causes protons to move from inside the mitochondrial inner membrane to the outside, forming a proton concentration gradient (and membrane potential).
  • the proton concentration gradient drives the respiratory chain complex V to synthesize ATP from ADP. Therefore, the mitochondrial membrane potential detected in the above (C) reflects the activity of the respiratory chain complex IV minus the activity of the respiratory chain complex V.
  • the inhibitor of the respiratory chain complex may be KCN.
  • any one of the above (A) to (C) can be carried out.
  • (A) and (B) can be performed.
  • (A) can be performed.
  • the above (a) may not be performed.
  • the above (B) is performed, the above (b) can not be performed.
  • the above (c) can not be performed.
  • the method of detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex of the present invention may further include detecting the activity of complex V and then detecting the activity of another respiratory chain complex. Therefore, one embodiment of the present invention may further include any one step selected from the group consisting of the above (a) to (c) after detecting the activity of the complex V. In one embodiment of the present invention, after detecting the activity of the complex V, it can be carried out by one or more steps selected from the group consisting of the above (A) to (C).
  • the method in the method for detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex of the present invention, after detecting the activity of complex V, the method is selected from the group consisting of the above (A) to (C).
  • the method may further include one or more steps, and may further include any one step selected from the group consisting of the above (a) to (c).
  • the invention provides a method of detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex, comprising: One step selected from the group consisting of the following (a) to (c): (A) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex I, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex I with the electron donor; ; (B) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex III, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex III with the electron donor; And (c) contacting mitochondria with an electron donor of respiratory chain complex IV, and detecting a change in mitochondrial membrane potential before and after contact of the respiratory chain complex IV with the electron donor.
  • the method for detecting the activity of the mitochondrial respiratory chain complex of the present invention comprises the steps (A) to (C) before performing one step selected from the group consisting of (a) to (c) below.
  • the method may further include one or more steps selected from the group consisting of (C).
  • the method for detecting the activity of a mitochondrial respiratory chain complex of the present invention further comprises one or more steps selected from the group consisting of the above (A) to (C). After that, the method may further include any one of the steps selected from the group consisting of the above (a) to (c).
  • the method for detecting the activity of the mitochondrial respiratory chain complex of the present invention further comprises two steps selected from the group consisting of the above (A) to (C), and thereafter, a) changing the mitochondrial membrane potential by mitochondria and each of the electron donors of respiratory chain complexes I, III and IV. (Difference) is detected.
  • the activity of complex V is not detected.
  • the activity of the mitochondrial complex measured can be compared to the activity of the corresponding complex of standard mitochondria.
  • Standard mitochondria include healthy mitochondria, mitochondria with abnormalities in complex I (eg, mitochondria with reduced or lost activity of complex I), and mitochondria with abnormalities in complex II (eg, mitochondria with complex II).
  • Mitochondria with reduced or lost activity mitochondria with abnormalities in complex III (eg, mitochondria with reduced or lost activity of complex III, mitochondria with abnormalities in complex IV (eg, reduced activity of complex IV) Or mitochondria that have an abnormality in complex V (e.g., mitochondria having reduced or lost activity of complex V) and mitochondria that have an abnormality in complex V.
  • Mitochondria can be mitochondria. Abnormality in any two or more of complexes I to V
  • the mitochondria in which the activity of each of the complexes having a constant state is reduced or lost may be mitochondria, and the abnormality may be due to an abnormality in a mitochondrial genomic gene, an abnormality in a nuclear gene genome, or a patient with a mitochondrial disease. And those depending on the drug or environment.
  • the mitochondria to be measured may be mitochondria in an intracellular environment, or may be mitochondria extracted outside the cell.
  • the measurement can be performed on a cell-by-cell basis. In some embodiments, the measurement may be performed on a per mitochondrial basis. In some embodiments, the measurement is performed on a mitochondrial population. When the measurement is performed for each cell, the measurement is performed by measuring the fluorescence of each cell with a mitochondrial membrane potential-dependent indicator and obtaining the sum of the fluorescence amount of one cell. In some embodiments, the measurement is performed on a cell population.
  • the cells or mitochondria when detecting the activity of the respiratory chain complex for each cell or each mitochondria, the cells or mitochondria are observed on a solid support.
  • a solid support for example, a transparent solid support (for example, a cover glass and a slide glass) can be used.
  • the present invention can measure the activity of a mitochondrial respiratory chain complex present in a cell.
  • the cells can be subjected to a membrane permeation treatment by a conventional method.
  • the membrane permeation treatment include a treatment with a surfactant having a concentration less than the critical micelle concentration.
  • the present invention may further include examining the effect of the membrane permeation treatment on the cells on mitochondria.
  • the present invention may further comprise observing mitochondria under a microscope in addition to detecting the activity of the respiratory chain complex. In some embodiments, the present invention may further comprise, in addition to detecting the activity of the respiratory chain complex, observing under a cell microscope having mitochondria. Observations can provide information on, for example, mitochondrial or cell morphology (eg, size and shape).
  • Example 1 Respiratory complex activity can be measured on specific cells
  • Cell solubilization C6 glioma cells can be treated with hydrogen peroxide. Cells were treated with 30 ⁇ M digitonin for 2 minutes and then rinsed with buffer. By this operation, the permeability of the cell membrane was increased in almost all cells.
  • the buffer was 10 mM Tris-HCl, 250 mM sucrose, 0.5 mM EGTA, pH 7.4. When streptolysin O was used instead of digitonin, cells without increased permeability were observed.
  • Permeabilized cells are maintained at 10 mM Tris-HCl, 110 mM sucrose, 70 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 0.03% BSA, pH 7.4, and the permeabilized cells are maintained at room temperature for 70 minutes. However, mitochondria were stable and ATP synthesis activity did not decrease.
  • 10 mM Tris-HCl, 110 mM sucrose, 70 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 0.5 mM ADP, 1 mM KH 2 PO 4 , and 20 nM TMRE are included. The measurement solution maintained at pH 7.4 was used.
  • ⁇ Respiratory complex activity of specific cells can be measured.
  • the effect of the drug candidate compound on the complex can be confirmed.
  • each mitochondrial complex can be measured using an electron donor and an inhibitor for a particular complex.
  • complex I can be measured by first adding malic acid. Then, about 10 minutes later, rotenone can be added to the cells. Further, complex III activity can be measured by treating the cells with succinic acid and treating the cells with antimycin A approximately 10 minutes later.
  • complex IV can be measured by adding ascorbate and TMPD, followed by KCN.
  • Complex V can be measured by adding ATP and adding oligomycin and CCCP.
  • the above measurement principle can be modified.
  • a verification example based on the modified measurement will be described.
  • the cells were stained with 20 nM TMRE. Thereafter, as shown in FIG. 2, an electron donor and an inhibitor were added.
  • the luminance change of TMRE at that time was analyzed.
  • the analysis was performed by obtaining the total brightness of the cells for each cell. Specifically, a large area and a small area are set for each cell as shown in FIG. Where I 1 is the sum of the fluorescence intensities in the smaller area, S 1 is the area of the smaller area, I 2 is the sum of the fluorescence intensities in the larger area, and S 2 is the greater of the This is the area of the region. ⁇ Asked by.
  • an electron donor for generating NADH in mitochondria was first added, electrons were passed to complex I, and the proton pump was driven. .
  • the fluorescence intensity measured at this time indicates the formation of the membrane potential by the complexes I, III and IV.
  • an inhibitor of complex I rotenone was added to inhibit the proton pump by electron transfer from complex I.
  • succinic acid was added, electrons flowed through the complex III, and the proton pumps of the complex III and the complex IV were measured.
  • a complex III inhibitor (mixisothiazole or antimycin A) was added to inhibit the proton pump by electron transfer from complex III.
  • TMPD and ascorbic acid were further added to drive the proton pump by the complex IV, and the proton pump by the complex IV was measured.
  • oligomycin was added to stop the complex V from ATP synthesis and the accompanying decrease in the degree of mitochondrial inner membrane polarization, and the magnitude of the decrease in the degree of inner membrane polarization due to ATP synthesis (complex V proton pump Activity). The results were as shown in FIG.
  • the activity of complex V could be measured not only by depolarization by oligomycin (reduction in the degree of polarization of the inner membrane), but also by polarization by the addition of ATP.
  • the order of measuring the complexes was not particularly limited, and the activities of the respiratory chain complexes could be measured in various orders.
  • the activity of the complex was similarly measured using human skin fibroblasts.
  • the order of the measurement was different from that of the above example, first, succinic acid as an electron donor of the complex III was added, and the membrane potential of the complexes III and IV was observed. As shown in FIG. 5, the mitochondrial membrane potential changed before and after the addition of succinic acid. Next, malic acid, an electron donor of the complex I, was added, and the activity of the respiratory chain complex driven by the complex I was confirmed. Thereafter, in FIG. 5, the electron donor of the complex IV was added, and then the inhibitor of the complex V was added, and the change in the membrane potential before and after each addition was detected.
  • the activity of the respiratory chain complex in mitochondria can be measured using human skin fibroblasts as shown in FIG.
  • the activity of complex V which is detected as a change in relative fluorescence intensity before and after the addition of oligomycin, is greater in mitochondria having an abnormality in complex V (m.9185T> C). It was confirmed that it had decreased.
  • the activities of other complexes of mitochondria having an abnormality in complex V were equivalent to those of healthy mitochondria.
  • the activity of the mitochondrial respiratory chain complex can be measured for each complex and continuously, and the activity of each of the complexes I, III, IV and V can be measured. Size and presence or absence can be obtained.
  • the activity of the mitochondrial respiratory chain complex can also be measured in isolated mitochondria.
  • the isolated mitochondria are adsorbed on a cover glass.
  • an electron donor and an inhibitor to the adsorbed mitochondria as described above, the magnitude and presence or absence of the activity of each respiratory chain complex of each mitochondria can be clarified.

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Abstract

本発明は、単一細胞内のミトコンドリア、または単一ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法を提供する。本発明は、例えば、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Vの活性を検出する方法であって、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体I、III、およびIVからなる群から選択される呼吸鎖複合体の電子供与体の１つ以上と接触させることと、その後、ミトコンドリアと複合体Vのアデノシン三リン酸（ATP）合成活性の阻害剤とを接触させることと、前記阻害剤との接触の前後でミトコンドリアの膜電位を測定することを含み、前記阻害剤との接触の前後における膜電位の変化が、複合体Vの活性を示す、方法を提供する。

Description

ミトコンドリア呼吸系複合体活性を測定する方法
　本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的には、単一細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体活性の測定方法、さらには単一ミトコンドリアの呼吸鎖複合体活性の測定方法に関する。
　ほとんどの真核生物では、ミトコンドリアの呼吸鎖は4つの多サブユニット複合体(複合体I～IV)と2つの電子伝達体、ユビキノンとシトクロムcからなる。酸化的リン酸化(OXPHOS)は、複合体IまたはIIを介して呼吸鎖に電子が入ることで始まる。複合体IIIは還元型ユビキノンからシトクロムcへ電子を運び、複合体IVはシトクロムcから酸素へ電子を渡して順序を完成させる。電子伝達は内膜を横切って膜間腔へプロトンを移動させると共役し、複合体V(ATPシンターゼ)によるATP産生の駆動力を供給する膜内外のプロトン勾配をつくる。OXPHOSへの依存とヒトのエネルギー消費は一人当たり65kg ATP/日以上になると報告された。このようなエネルギーをOXPHOSに依存していることを考えると、OXPOS系における欠陥が疾患を引き起こすことは驚くにあたらない(非特許文献１)。
　電子伝達活性の測定は細胞傷害のメカニズムの解明に重要である。ミトコンドリアの酸化的リン酸化には、3個のプロトンポンプと1個のH+-ATPアーゼが含まれる。これらの蛋白質の活性低下は細胞機能に有害な影響を及ぼすため、これらの蛋白質の活性は広範囲に検討されている。しかし、ほとんどの測定は多くの細胞の平均で行われている（非特許文献２）。これに対して、細胞をジギトニンで可溶化し、コハク酸を加えてミトコンドリアの膜電位を検出した研究が存在する（非特許文献３）。
McKenzie M et al., Anal Biochem., 2007, 364(2):128-37 Vercesi et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 14431-14434 Uechi Y et al., BBRC, 2006, 344:1094-1101
　本発明は、単一細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体活性を測定するための方法を提供する。本発明はまた、単一ミトコンドリア（例えば、単離された単一ミトコンドリア）におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体活性を測定するための方法を提供する。本発明はまた、単一細胞におけるミトコンドリアまたは単一ミトコンドリアにおける呼吸鎖複合体の活性を連続的に検出する方法を提供する。
　いくつかの態様において、本発明は、ミトコンドリア膜電位感受性蛍光色素（ミトコンドリア膜電位インジケータ）で透過性細胞を染色する方法を提供する。蛍光色素は、膜電位(TMRE、TMRM、DiOC6、ローダミン123、JC-1など)に依存してミトコンドリアに蓄積する蛍光色素であり得る。
　ある態様において、各細胞の時間依存性蛍光強度は、蛍光顕微鏡を用いて測定することができる。
　具体的には、電子供与体および阻害剤を各複合体の活性の検出に用いることができる。
　ある局面において、電子供与体は、複合体Iへの電子供与体、例えば、リンゴ酸であり、インヒビターは複合体Iのインヒビター、例えばロテノンであり得る。他の局面において、電子供与体はコハク酸であり、阻害剤はアンチマイシンAのような複合体IIIのインヒビターであり得る。さらに別の態様では、該阻害剤は、アスコルビン酸塩とテトラメチル－ｐ－フェニレンジアミン（TMPD）の組合せ、またはKCN、アジ化合物、若しくは一酸化炭素のような複合体IVの阻害剤であり得る。インヒビターはまた、ATPまたはオリゴマイシンおよびカルボニルシアニド－ｍ－クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）のような複合体Vのインヒビターであり得る。
　ある態様において、複数の細胞を同時に測定することができる。同時に測定できるセル数は、対物レンズの倍率を下げることによって増やすことができる。
　いくつかの態様において、細胞の全蛍光強度は、溶液の蛍光強度を除いた細胞の蛍光強度に対して決定される。
　いくつかの具体例において、細胞はカルセインおよびTMREと同時に染色され得る。具体的な実施形態では、TMREの全蛍光強度は、カルセインの蛍光強度で正規化される。
　いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法は、培養細胞系を用いて行うことができる。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法は、組織から単離された細胞を用いて行うことができる。ある態様において、細胞は、ヒト細胞であり得る。ある態様において、細胞は、心筋前駆細胞であり得る。具体的な実施態様において、細胞系は、C6グリオーマ細胞であり得る。他の特定の実施態様において、細胞系はHela細胞やヒト線維芽細胞であり得る。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
　ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることと、
　前記阻害剤との接触の前後でミトコンドリアの膜電位を測定することを含み、
　前記阻害剤との接触の前後における膜電位の変化が、複合体Vの活性を示す、
方法。
［２］前記阻害剤が、オリゴマイシンである、上記［１］に記載の方法。
［３］ミトコンドリア膜電位を測定することが、ミトコンドリアと、電位依存的ミトコンドリア染色剤とを接触させることを含むものである、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記電位依存的ミトコンドリア染色剤が、テトラメチルローダミンエチルエステル（TMRE）である、上記［３］に記載の方法。
［５］上記［１］に記載の方法であって、
以下（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程：
（ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
（ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；および
（ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
と、その後、
　（ｄ）ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることと、前記阻害剤との接触後のミトコンドリアの膜電位の変化を検出することとを含む工程と
を含み、
　工程（ａ）における膜電位の変化は、複合体I、III、およびIVの活性の合計を示し、工程（ｂ）における膜電位の変化は、複合体IIIおよびIVの活性の合計を示し、工程（ｃ）における膜電位の変化は、複合体IVの活性を示し、（ｄ）における膜電位の変化が、複合体Vの活性を示す、
方法。
［６］上記［５］に記載の方法であって、
工程（ａ）および工程（ｄ）を含む、方法。
［７］上記［５］に記載の方法であって、
　（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程を実施する前に、以下（A）～（C）からなる群から選択される１つ以上の工程を実施することを含む、方法：
（Ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤とを接触させることを含む工程；
（Ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの阻害剤とを接触させることを含む工程を含む工程；および
（Ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの阻害剤とを接触させることを含む工程。
［８］上記［６］に記載の方法であって、
工程（A）、工程（B）、工程（ｃ）および工程（ｄ）をこの順番に実施することを含む、方法。
［９］
　工程（Ａ）の阻害剤が、ロテノンであり、
　工程（Ｂ）の阻害剤が、ミクソチアゾールであり、および／または
　工程（Ｃ）の阻害剤が、ＫＣＮである、
上記［７］または［８］に記載の方法。
［１０］ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
（ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；および
（ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
からなる群から選択されるいずれか１つの工程を実施することを含む、方法。
［１１］ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
（Ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤とを接触させることを含む工程；
（Ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの阻害剤とを接触させることを含む工程を含む工程；および
（Ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの阻害剤とを接触させることを含む工程；
からなる群から選択される１つ以上の工程を実施すること含み、かつ、
　その後、
（ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
（ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；および
（ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
からなる群から選択されるいずれか１つの工程を実施することを含む、方法｛但し、（Ａ）を実施した場合には（ａ）を実施しないことができ、（Ｂ）を実施した場合には（ｂ）を実施しないことができ、（Ｃ）を実施した場合には（ｃ）を実施しないことができる｝。
図1は、細胞をリンゴ酸とロテノン、コハク酸とそれに続くアンチマイシンA、アスコルビン酸とTMPDとそれに続くKCN、およびATPで順次処理して呼吸鎖複合体活性を測定する方法とその結果を示す。図１中、「I+III+IV」、「III+IV」および「IV」は、それぞれ電子供与体をミトコンドリアに接触させたときにプロトンを内膜の内から外に輸送している複合体の番号を示す。図１中、「V」は、ATP添加によってプロトンを内膜の内から外に輸送している複合体の番号を示す。図１の下には、対応する時間における細胞の蛍光顕微鏡画像が示されている。 図２は、細胞をリンゴ酸とロテノン、コハク酸とそれに続くミクソチアゾール、アスコルビン酸とＴＭＰＤと、それに続くオリゴマイシンで順次処理して呼吸鎖複合体活性を測定する方法とその結果を示す。図２中の両矢印およびその下のローマ数字は、複合体により形成されたプロトンの濃度勾配と当該勾配に関与している複合体を示す。 図３は、細胞毎にミトコンドリアの膜電位を蛍光インジケータを用いて測定したときの解析方法の一例を示す。 図４は、細胞をATPで処理し、複合体Vの活性を測定した後で、他の複合体の活性を測定した例を示す。 図５は、正常なミトコンドリアと複合体Ｖに変異があるミトコンドリアとを用いた呼吸鎖複合体の活性測定試験の一例を示す。図５では、ＴＭＰＤとアスコルビン酸を添加して複合体ＩＶの活性を測定したのちに、オリゴマイシンで複合体Ｖの活性を阻害することにより、複合体Ｖの膜電位への寄与を検出したものである。正常なミトコンドリア（control (Normal)）では、オリゴマイシンの添加によりミトコンドリアの相対的蛍光強度が飛躍的に上昇したが、複合体Ｖに異常（m.9185T>C）を有するミトコンドリアでは、オリゴマイシンの添加前後での相対的蛍光強度の変化がとても小さかった。このようにして、正常なミトコンドリアと比較することによって、異常なミトコンドリアは、いずれの複合体に異常を有するのかを特定することができる。 図６は、過酸化水素処理前後（前：コントロール、後：過酸化水素）のミトコンドリアを用いた呼吸鎖複合体の活性測定試験の一例を示す。過酸化水素処理によって、複合体Iの活性および複合体Vの活性が大きく損なわれている様子が観察される。 図７は、ミトコンドリア内膜における呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVの働きとこれらに対する電子（ｅ－）の動きを示す。呼吸鎖複合体I、III、およびIVは、電子を受け取るとマトリックスから内膜スペースへプロトン（Ｈ＋）を輸送し、プロトンの濃度勾配を形成する。複合体Ｖは、形成されたプロトンの濃度勾配を利用してＡＤＰからＡＴＰを合成する。
発明の詳細な説明
　本発明は、プロトンポンプ活性を有するミトコンドリア複合体(複合体I、III、IV、V)の活性を測定する方法を提供する。本明細書では、「測定」は、対象の量を測って求めることを意味し、対象の存在を検査によって見つけ出すことも包含する意味で用いられる。本明細書では、「検出」は、対象の少なくとも存在を検査によって見つけ出すことを意味する。本発明では、対象を検出した後に、対象の量を量って求めることができる。
　ある態様において、透過処理された細胞は、ミトコンドリア膜電位感受性蛍光色素、例えば、TMREで染色され得る。各細胞の時間依存性蛍光強度は、例えば、蛍光顕微鏡を用いて測定することができる。特定の態様において、蛍光色素は、特定の膜電位でミトコンドリアに蓄積する蛍光色素であり得る。本明細書中に提供されるように、蛍光色素は、TMRM、DiOC6、ローダミン123、またはJC-1を含むことができる。
　ある態様において、阻害剤は、各複合体の活性の検出のために、以下に示すように用いることができる。複合体Iの活性の検出には、リンゴ酸、または阻害剤としてのロテノンの使用を含むことができる。複合体III活性の検出にはコハク酸またはアンチマイシンＡを含むことができる。複合体IVの検出は、アスコルビン酸塩およびTMPD、またはKCNを含むことができる。複合体Vの検出は、ATP、またはオリゴマイシンおよびCCCPを含むことができる。実施例に記載したように、細胞におけるこれらの阻害剤の使用は、各複合体の活性を首尾よく測定することを可能にし得る。
　本明細書中に開示されるように、本技術は、個々の細胞における4つのミトコンドリア複合体の活性の測定を可能にする。ある態様において、細胞は、他の蛍光色素と共に染色され得る。特定の態様において、測定された細胞は、個々のレベルで特徴付けることができる。
　細胞は、蛍光を測定する装置を用いて測定することができる。ある態様において、細胞は、蛍光顕微鏡を用いて測定することができる。特定の態様において、蛍光顕微鏡は、顕微鏡視野内の個々の細胞を正確に測定することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、試料中の複数の細胞の平均ではなく、個々の細胞におけるミトコンドリア活性の測定を可能にする。
　本明細書中に開示されるように、多数の細胞は、本発明の方法を用いて同時に測定することができる。同時に測定可能な細胞数は、顕微鏡上の対物レンズの倍率を増加または減少させることによって調整することができる。例えば、対物レンズの倍率を下げることによって細胞数を増やすことができる。拡大は、ユーザのニーズに応じて調整され得ることが理解される。特定の実施形態では、対物レンズは10～20倍であり、測定可能な細胞数は約５～20細胞である。
　細胞の蛍光強度を分析するために種々の方法を用いることができる。
いくつかの態様において、各細胞の全蛍光は、測定中の細胞の変形の影響を回避するために、蛭崎ら(Hirusakiら、2017,Sci.Rep.7,16044)の方法に従って測定される。
　本明細書に開示されるように、対物レンズは、ユーザのニーズに応じて調整され得る。例えば、ユーザは、長時間の間、例えば、1時間以上、蛍光強度に対する測定の間、焦点位置のドリフトの影響を回避するために、開口数を調整することができる。いくつかの実施態様において、対物レンズは、開口数0.4を有する。焦点位置のドリフトが蛍光強度に及ぼす影響を70分間以上にわたって避ける観点では、開口数0.9以下を用いることができる。
　本明細書中に開示されるように、細胞は、全蛍光強度として蛍光を測定することができる。全蛍光強度は細胞の大きさに大きく依存する。従って、いくつかの態様において、細胞の全蛍光強度は、特定の状態におけるその細胞の全蛍光強度に対する値として表される。これにより、変動の少ない結果の解析が可能になる。いくつかの態様において、この分析は、ある細胞における1つまたは複数の呼吸鎖複合体の相対的活性が、対照細胞におけるそれらの相対的活性とどのように異なるのかの研究を可能とする。結果として、本明細書中に記載された方法は、1つの細胞において他の複合体と比較して相対的に高いもしくは低い活性を有する複合体の検出を可能にする。また、本明細書中に記載された方法は、1つの細胞と他の細胞とを比較して、相対的に高いもしくは低い活性を有する複合体を含む細胞の検出を可能にする。
　いくつかの態様において、ミトコンドリア活性は、2つ以上の細胞において検出される。例えば、１以上、または全ての複合体における活性の減少の検出を行うことができる。これは、例えば、カルセインおよびTMREを細胞に浸透させ、細胞を同時に染色することによって達成することができる。従って、いくつかの態様において、細胞内のTMREの全蛍光強度は、カルセインの全蛍光強度によって正規化されるこの補正方法は、細胞の大きさおよびミトコンドリア含量の差に起因するTMRE蛍光の差をユーザが説明することを可能にする。いくつかの態様において、細胞間のミトコンドリア品質の差異は、本明細書に提供される方法を用いて計算され得る。
　異なる種類の細胞を用いることができる。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法は、培養細胞系を用いて行うことができる。具体的な実施態様において、細胞系は、C6グリオーマ細胞であり得る。他の特定の実施態様において、細胞系はHela細胞であり得る。他の態様において、細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、線維芽細胞、または血液細胞のような一次細胞であり得る。さらなる態様において、細胞は、ミトコンドリア疾患患者由来の細胞であり得る。さらにもう1つの態様において、細胞は、治療化合物での処理後に測定することができる。
（本発明の方法の実施態様）
　本発明によれば、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Vの活性を検出する方法が提供される。
呼吸鎖複合体I、III、およびIVがそれらの電子供与体を用いてミトコンドリア内膜の内からミトコンドリア内膜の外にプロトンを排出することによって、ミトコンドリア内膜の内外にプロトンの濃度勾配を形成する。呼吸鎖複合体Vは、上記のようにして形成されたプロトンの濃度勾配のエネルギーを用いて、ADPからATPを合成する。呼吸鎖複合体Vが活性を有する状況下においては、ミトコンドリア内膜の外からプロトンを内膜内に取り込み、これと引き換えにADPからATPを合成することとなる。呼吸鎖複合体Vの活性は、プロトン濃度勾配を解消しながらATPを産生することにある。そして呼吸鎖複合体Vの活性は、呼吸鎖複合体Vを阻害剤によって停止させることにより求めることができる。すなわち、呼吸鎖複合体Vの活性を完全に阻害した場合には、呼吸鎖複合体I、III、およびIVにより形成されるプロトンの濃度勾配が解消されてATPが合成されなくなるため、プロトン濃度勾配がより強まる。この強まった分は、呼吸鎖複合体VがそのATP合成活性により消費していた分である。従って、呼吸鎖複合体Vの阻害剤により、呼吸鎖複合体Vを阻害したときのプロトンの濃度勾配の増加は、呼吸鎖複合体Vの活性として検出され得る。従って、本発明によれば、
　ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
　ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることと、
　前記阻害剤との接触の前後でミトコンドリアの膜電位を測定することを含み、
　前記阻害剤との接触の前後における膜電位の変化が、複合体Vの活性を示す、
方法
が提供される。
　複合体Vの活性はまた、ATPをミトコンドリアに接触させることによっても測定することができる。複合体Vは、ATP存在下では、逆反応を起こし、ATPからADPとリン酸を生じると共にミトコンドリアの内膜の内外にプロトンの濃度勾配を形成させる。ATP存在下におけるプロトンの濃度勾配形成は、複合体Vの活性として検出され得る。ATP存在下における複合体Vによるプロトンの濃度勾配形成能を複合体Vの活性として検出する場合には、他の複合体の活性を阻害剤によって停止させておいてもよく、これにより、複合体Vの活性をより精度よく検出し得る。
　このようにして、本発明によれば、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出することができる。
　ある態様では、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Vの活性を複合体Vの阻害剤を用いて検出する場合には、ミトコンドリアと、呼吸鎖複合体I、III、およびIVからなる群から選択される１以上の呼吸鎖複合体の電子供与体の１つ以上とを接触させることを含む。本発明によれば、これによって、ミトコンドリアの内膜の内外にプロトンの濃度勾配を予め形成させておいてもよい。ここで、呼吸鎖複合体IIIは、呼吸鎖複合体IIに対して電子供与体を与えることによっても、電子を受け取り、プロトンの濃度勾配を形成させることができる。従って、本明細書において呼吸鎖複合体IIIの電子供与体と述べる場合には、呼吸鎖複合体IIの電子供与体を含む意味で用いられる。本発明によれば、この段階では、呼吸鎖複合体Vは、形成されたプロトンの濃度勾配を解消しながらATPを合成している。従って、ここで呼吸鎖複合体Vの活性を、阻害剤を用いて阻害することによって、プロトンの濃度勾配が解消されなくすると、プロトン濃度勾配が増強される。本発明によれば、このプロトンの濃度勾配の増強分を、呼吸鎖複合体Vの活性として検出することができる。
　従って、本発明によれば、
　ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
　ミトコンドリアと呼吸鎖複合体I、III、およびIVからなる群から選択される呼吸鎖複合体の電子供与体の１つ以上と接触させることと、
　その後、ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることと、
　前記阻害剤との接触の前後でミトコンドリアの膜電位を測定することを含み、
　前記阻害剤との接触の前後における膜電位の変化が、複合体Vの活性を示す、
方法
が提供される。
　ある態様では、ミトコンドリアと接触させる電子供与体は、呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体のみでもよいし、呼吸鎖複合体IIIの電子供与体のみでもよいし、呼吸鎖複合体IVの電子供与体のみでもよい。ミトコンドリアと接触させる電子供与体は、呼吸鎖複合体I、III、およびIVからなる群から選択される呼吸鎖複合体の電子供与体の２つ以上としてもよい。
　ある態様では、呼吸鎖複合体Iの電子供与体としては、例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＨを生成させる基質（例えば、リンゴ酸、ピルビン酸、グルタミン酸、2オキソグルタル酸、およびイソクエン酸など）が挙げられ、本発明において用いることができる。また、ある態様では、呼吸鎖複合体IIIの電子供与体としては、還元型コエンザイムＱおよびコハク酸が挙げられ、本発明において用いることができる。さらに、ある態様では、呼吸鎖複合体IVの電子供与体としては、例えば、テトラメチル－ｐ－フェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）とアスコルビン酸が挙げられ、本発明において用いることができる。ある態様では、呼吸鎖複合体IVの電子供与体としては、還元型シトクロムｃおよびTMPDが挙げられ、本発明において用いることができる。呼吸鎖複合体IVの電子供与体としては、好ましくはTMPDおよびアスコルビン酸の両方を用いることができる。
　上記のように、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体の電子供与体とを接触させることによって、ミトコンドリアの内膜の内外にプロトンの濃度勾配が形成される。プロトンの濃度勾配は、電位依存性のミトコンドリア染色剤によって、調べることができる。
　電位依存性のミトコンドリア染色剤としては、ミトコンドリアの膜電位インジケータを用いることができる。ミトコンドリアの膜電位インジケータとしては、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）、３，３’－ジヘキシルオキサカルボシアニンイオダイド（ＤｉＯＣ６）、６－アミノ－９－（２－メトキシカルボニルフェニル）キサンテン－３－イリデン）アザニウムクロライド（ローダミン１２３）、および５，５’，６，６’－テトラクロロ－１，１’，３，３’－テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンイオダイド（ＪＣ－１）が挙げられ、本発明で用いることができる。ＪＣ－１は、膜電位依存的にミトコンドリアに蓄積し、高濃度では会合体を形成して緑色から赤色に変化する。ＴＭＲＭおよびＴＭＲＥは、膜電位依存的にミトコンドリアに蓄積し、高濃度では蛍光強度が大きくなる。本発明では、例えば、ＴＭＲＥを用いることができる。従って、ミトコンドリアの膜電位インジケータを用いる場合は、その蛍光強度がミトコンドリアの膜電位の大きさを反映する。蛍光強度と膜電位との関係は、予め作成した検量線によって決定することができる。
　ミトコンドリアの内膜に膜電位が形成されているときに、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Vの阻害剤とを接触させることができる。呼吸鎖複合体Vの阻害剤は、例えば、呼吸鎖複合体VのATP合成活性の阻害剤であり得る。呼吸鎖複合体VのATP合成活性の阻害剤としては、オリゴマイシンおよびATPが挙げられる。呼吸鎖複合体Vの阻害剤としてはまた、例えば、ＡＤＰ／ＡＴＰ交換輸送体の阻害剤が挙げられる。ＡＤＰ／ＡＴＰ交換輸送体の阻害剤は、呼吸鎖複合体Ｖを間接的に阻害するためである。ＡＤＰ／ＡＴＰ交換輸送体の阻害剤としては、アトラクチロシドおよびボンクレキン酸が挙げられる。ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Vの阻害剤とを接触させると、ミトコンドリアの内膜はさらに大きく分極する。本発明によれば、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Vの阻害剤との接触前後のミトコンドリアの膜電位の変化分が、呼吸鎖複合体Vの活性を示す。従って、本発明によれば、ミトコンドリアの膜電位に変化が検出された場合には、呼吸鎖複合体Vの活性が検出されたこととなる。従って、本発明は、上記によって検出されたミトコンドリアと呼吸鎖複合体Vの阻害剤との接触前後のミトコンドリアの膜電位の変化（例えば、変化した電位の大きさ）から、呼吸鎖複合体Vの活性を推定することをさらに含み得る。従って、本発明では、膜電位の変化を検出することによって、関与する複合体の活性を検出したこととなる。
　本発明の方法では、ミトコンドリアの内膜に形成される膜電位を、ミトコンドリアの膜電位インジケータなどの電位依存性のミトコンドリア染色剤により検出する、推定する、または測定する。従って、本発明の方法では、細胞毎に細胞内のミトコンドリアの呼吸鎖複合体Vの活性を検出することができる。本発明の方法ではミトコンドリア毎に呼吸鎖複合体Vの活性を検出することができる。このように本発明によれば、前記阻害剤との接触の前後でのミトコンドリアの膜電位の測定は、細胞毎にまたはミトコンドリア毎に行うことができる。
　本発明のミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法は、細胞内で行ってもよいし、ミトコンドリアを細胞外に単離した後に、単離ミトコンドリアを用いて行ってもよい。本発明の方法を細胞内で行う場合には、細胞は、前処理によって細胞膜の膜透過性を向上させておくことができる。前処理としては、臨界ミセル濃度未満の界面活性剤処理が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ジギトニンやサポニンを用いることができる。本発明の方法を単離したミトコンドリアを用いておこなう場合には、ミトコンドリアは、当業者に知られるミトコンドリアの単離方法を用いて細胞から単離することができる。
　本発明のある態様では、異なる細胞間またはミトコンドリア間の複合体の活性を比較することをさらに含み、これにより試験対象である細胞またはミトコンドリアの複合体の活性の高さを評価することができる。比較対照となる細胞またはミトコンドリアは、正常なミトコンドリアを有する細胞または正常なミトコンドリアとすることができる。比較対照となる細胞またはミトコンドリアはまた、活性が喪失した複合体のいずれか１以上を有するミトコンドリアを有する細胞またはそのようなミトコンドリアとすることができる。試験対象である細胞またはミトコンドリアは、比較対照となる細胞またはミトコンドリアとそれぞれ同じ処理に供されることにより、試験対象と比較対照とのより適切な比較が可能となる。
（本発明の方法のさらなる実施態様、その１）
　本発明によれば、呼吸鎖複合体Ｖの活性を検出する前に、他の呼吸鎖複合体、すなわち、呼吸鎖複合体I、III、およびIVからなる群から選択される１つ以上の呼吸鎖複合体の活性を検出することができる。例えば、本発明は、
以下（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程：
（ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
（ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；および
（ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
をさらに含み得る。以下、工程毎に説明する。
　工程（ａ）～（ｃ）においては、電子供与体は上述の通りである。また、工程（ａ）～（ｃ）においては、それぞれの呼吸鎖複合体の電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することも上述の通り実施できる。
　工程（ａ）では、呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体がミトコンドリアに接触すると、酸化的リン酸化経路全体が動く。その結果として、呼吸鎖複合体I、III、およびIVによりミトコンドリアの内膜の内外でプロトンの濃度勾配が形成される（すなわち、内膜に膜電位が形成される）。従って、電子供与体の接触の前後におけるミトコンドリアの内膜の膜電位の変化は、呼吸鎖複合体I、III、およびIVの活性の合計によるものとなる。但し、この場合において、呼吸鎖複合体Vの活性を阻害していない場合には、上記膜電位は、呼吸鎖複合体Vの活性の分だけ低下している。従って、本発明の方法によれば、呼吸鎖複合体Vの活性を求めたら、上記で得られた膜電位の変化に呼吸鎖複合体Vの活性による膜電位の変化を足して、呼吸鎖複合体I、III、およびIVの活性の合計とすることができる。あるいは、工程（ａ）の後で、呼吸鎖複合体Ｖのみに対する阻害剤を加えると、ミトコンドリアの内膜がさらに分極する。このときの膜電位は、複合体Ｖの影響が排除された、呼吸鎖複合体I、III、およびIVの活性の合計によるものとなり得る。上記のように、各複合体の活性をより正確に評価する場合には、比較対照となる細胞またはミトコンドリアにおける測定値と比較することが望ましい。
　工程（ｂ）では、呼吸鎖複合体IIIの電子供与体がミトコンドリアに接触すると、その結果として、呼吸鎖複合体III、およびIVによりミトコンドリアの内膜の内外でプロトンの濃度勾配が形成される（すなわち、内膜に膜電位が形成される）。従って、電子供与体の接触の前後におけるミトコンドリアの内膜の膜電位の変化は、呼吸鎖複合体III、およびIVの活性の合計によるものとなる。但し、この場合において、呼吸鎖複合体Vの活性を阻害していない場合には、上記膜電位は、呼吸鎖複合体Vの活性の分だけ低下している。従って、本発明の方法によれば、呼吸鎖複合体Vの活性を求めたら、上記で得られた膜電位の変化に呼吸鎖複合体Vの活性による膜電位の変化を足して、呼吸鎖複合体III、およびIVの活性の合計とすることができる。あるいは、工程（ｂ）の後で、呼吸鎖複合体Ｖのみに対する阻害剤を加えると、ミトコンドリアの内膜がより大きく分極する。このときの膜電位は、複合体Ｖの影響が排除された、呼吸鎖複合体III、およびIVの活性の合計によるものとなり得る。
　工程（ｃ）では、呼吸鎖複合体IVの電子供与体がミトコンドリアに接触すると、その結果として、呼吸鎖複合体IVによりミトコンドリアの内膜の内外でプロトンの濃度勾配が形成される（すなわち、内膜に膜電位が形成される）。従って、電子供与体の接触の前後におけるミトコンドリアの内膜の膜電位の変化は、呼吸鎖複合体IVの活性によるものとなる。但し、この場合において、呼吸鎖複合体Vの活性を阻害していない場合には、上記膜電位は、呼吸鎖複合体Vの活性の分だけ低下している。従って、本発明の方法によれば、呼吸鎖複合体Vの活性を求めたら、上記で得られた膜電位の変化に呼吸鎖複合体Vの活性による膜電位の変化を足して、呼吸鎖複合体IVの活性の合計とすることができる。あるいは、工程（ｃ）の後で、呼吸鎖複合体Ｖのみに対する阻害剤を加えると、ミトコンドリアの内膜がより大きく分極する。このときの膜電位は、複合体Ｖの影響が排除された、呼吸鎖複合体IVの活性によるものとなり得る。
　本発明では、以下（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程の後で、工程（ｄ）ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることと、前記阻害剤との接触前後のミトコンドリアの膜電位の変化を検出することとを含む工程と
を含む。この際、ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることによって、複合体Vの活性を検出する場合には、工程（ｄ）とその直前の測定工程との間では、他の複合体（例えば、直前に測定した複合体）に対する阻害剤を添加しない。また、ミトコンドリアとATPとを接触させ、接触前後のミトコンドリアの膜電位の変化を検出する場合には、工程（ｄ）とその直前の測定工程との間に、当該直前工程において活性化した複合体の阻害剤でミトコンドリアを処理してもよい。
　上述のように、ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させると複合体Ｖによるプロトン濃度勾配の解消による影響が低減され、工程（ａ）を実施していた場合には、複合体Ｖの阻害後のミトコンドリアの膜電位は、複合体Ｖの影響が排除された、呼吸鎖複合体I、III、およびIVの活性の合計によるものとなり得；工程（ｂ）を実施していた場合には、複合体Ｖの阻害後のミトコンドリアの膜電位は、複合体Ｖの影響が排除された、呼吸鎖複合体III、およびIVの活性の合計によるものとなり得；工程（ｃ）を実施していた場合には、複合体Ｖの阻害後のミトコンドリアの膜電位は、複合体Ｖの影響が排除された、呼吸鎖複合体IVの活性によるものとなり得る。
　複合体Ｖの活性は、複合体Ｖの阻害剤との接触後のミトコンドリアの膜電位から、各工程で検出された電子供与体との接触前後の膜電位の変化を引くことによって求めることができる。
（本発明の方法のさらなる実施態様、その２）
　本発明のある態様では、特定の細胞またはミトコンドリアにおいて、呼吸鎖複合体の活性を連続的に検出することができる。この態様においては、電子供与体とミトコンドリアとを接触させてミトコンドリアの膜電位を検出した後に、ミトコンドリアと複合体に対する阻害剤とを接触させてミトコンドリアの膜電位を基底状態に戻してから次の電子供与体とミトコンドリアとを接触させることができる。具体的には、実施形態（その１）を実施する前に、以下（A）～（C）からなる群から選択される１つ以上の工程を実施することを含む、方法：
（Ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤とを接触させることを含む工程；
（Ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの阻害剤とを接触させることを含む工程を含む工程；および
（Ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの阻害剤とを接触させることを含む工程
が提供される。
　上記（Ａ）において、呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体としては、例えば、リンゴ酸が挙げられる。ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とが接触すると、ミトコンドリアの酸化的リン酸化経路が動く。これにより、呼吸鎖複合体Ｉがプロトンをミトコンドリア内膜の内側から外側へ移動させ、プロトンの濃度勾配（および膜電位）を形成する。電子は、ユビキノンを介して呼吸鎖複合体IIIに移動し、これにより呼吸鎖複合体IIIがプロトンをミトコンドリア内膜の内側から外側へ移動させ、プロトンの濃度勾配（および膜電位）を形成する（すなわち、ミトコンドリアの内膜がより大きく分極する）。またこれにより膜電位はより強い（またはより低い）マイナスの数値を示すようになる。さらにその後、電子はシトクロムcを介して呼吸鎖複合体IVに移動し、これにより呼吸鎖複合体IVがプロトンをミトコンドリア内膜の内側から外側へ移動させ、プロトンの濃度勾配（および膜電位）を形成する。その結果、プロトンと酸素とから水が形成される。また、プロトンの濃度勾配は、呼吸鎖複合体Vを駆動させてADPからATPを合成する。従って、上記（A）において検出されるミトコンドリアの膜電位は、呼吸鎖複合体I、III、およびIVの活性から、呼吸鎖複合体Vの活性を引いたものを反映する。
　上記（Ａ）において、呼吸鎖複合体の阻害剤は、例えば、ロテノンであり得る。
　上記（Ｂ）において、呼吸鎖複合体IIIの電子供与体としては、例えば、コハク酸が挙げられる。コハク酸は、呼吸鎖複合体IIIを活性化して呼吸鎖複合体IIIがプロトンをミトコンドリア内膜の内側から外側へ移動させ、プロトンの濃度勾配（および膜電位）を形成する。さらにその後、電子はシトクロムcを介して呼吸鎖複合体IVに移動し、これにより呼吸鎖複合体IVがプロトンをミトコンドリア内膜の内側から外側へ移動させ、プロトンの濃度勾配（および膜電位）を形成する。その結果、プロトンと酸素とから水が形成される。また、プロトンの濃度勾配は、呼吸鎖複合体Vを駆動させてADPからATPを合成する。従って、上記（Ｂ）において検出されるミトコンドリアの膜電位は、呼吸鎖複合体III、およびIVの活性から、呼吸鎖複合体Vの活性を引いたものを反映する。
　上記（Ｂ）において、呼吸鎖複合体の阻害剤は、例えば、マロン酸、アンチマイシンAまたはミクソチアゾールであり得、好ましくはミクソチアゾールであり得る。
　上記（Ｃ）において、呼吸鎖複合体IVの電子供与体としては、例えば、TMPDおよびアスコルビン酸が挙げられる。TMPDおよびアスコルビン酸は、呼吸鎖複合体IVを活性化させ、これにより呼吸鎖複合体IVがプロトンをミトコンドリア内膜の内側から外側へ移動させ、プロトンの濃度勾配（および膜電位）を形成する。その結果、プロトンと酸素とから水が形成される。また、プロトンの濃度勾配は、呼吸鎖複合体Vを駆動させてADPからATPを合成する。従って、上記（Ｃ）において検出されるミトコンドリアの膜電位は、呼吸鎖複合体IVの活性から、呼吸鎖複合体Vの活性を引いたものを反映する。
　上記（Ｃ）において、呼吸鎖複合体の阻害剤は、ＫＣＮであり得る。
　ある態様では、上記（Ａ）～（Ｃ）は、いずれか１つを実施することができる。ある態様では、（Ａ）および（Ｂ）を実施することができる。ある態様では、（Ａ）を実施することができる。本発明では、上記（Ａ）を実施した後には、上記（ａ）を実施しないことができる。本発明では、上記（Ｂ）を実施した後には、上記（ｂ）を実施しないことができる。本発明では、上記（Ｃ）を実施した後には、上記（ｃ）を実施しないことができる。
（本発明のさらなる実施形態、その３）
　別の態様において本発明のミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法では、複合体Vの活性を検出した後に、他の呼吸鎖複合体の活性を検出することをさらに含んでもよい。従って、本発明のある態様では、複合体Vの活性を検出した後に、上記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程をさらに含んでいてもよい。本発明のある態様では、複合体Vの活性を検出した後に、上記（A）～（C）からなる群から選択される１つ以上の工程により実施することができる。また、本発明のある態様では、本発明のミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法では、複合体Vの活性を検出した後に、上記（A）～（C）からなる群から選択される１つ以上の工程をさらに含んでいてもよく、上記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程をさらに含んでいてもよい。
　（本発明のさらなる実施形態、その４）
　別の態様において、本発明は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
以下（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される１つの工程：
（ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
（ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；および
（ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を検出することを含む工程；
を含む方法が提供される。ある態様では、本発明のミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法は、以下（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される１つの工程を実施する前に、上記（A）～（C）からなる群から選択される１つ以上の工程をさらに含んでいてもよい。また、本発明のある態様では、本発明のミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法は、上記（A）～（C）からなる群から選択される１つ以上の工程をさらに含んでいてもよく、かつ、その後に、上記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程をさらに含んでいてもよい。ある態様では、本発明のミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法では、上記（A）～（C）からなる群から選択される２つの工程をさらに含み、かつ、その後に、上記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程をさらに含み、これにより、ミトコンドリアと、呼吸鎖複合体I、III、およびIVの電子供与体それぞれによるミトコンドリアの膜電位の変化（差）を検出する。これらの態様においては、複合体Ｖの活性を検出しない。いくつかの態様において、測定対象としたミトコンドリア複合体の活性を標準的なミトコンドリアの対応する複合体の活性と比較することができる。標準的なミトコンドリアとしては、健常なミトコンドリア、複合体Ｉに異常を有するミトコンドリア（例えば、複合体Ｉの活性が低減または喪失したミトコンドリア）、複合体IIに異常を有するミトコンドリア（例えば、複合体IIの活性が低減または喪失したミトコンドリア）、複合体IIIに異常を有するミトコンドリア（例えば、複合体IIIの活性が低減または喪失したミトコンドリア、複合体IVに異常を有するミトコンドリア（例えば、複合体IVの活性が低減または喪失したミトコンドリア）、および複合体Vに異常を有するミトコンドリア（例えば、複合体Vの活性が低減または喪失したミトコンドリア）からなる群から選択されるいずれかのミトコンドリアとすることができる。ミトコンドリアは、複合体I~Vのいずれか２以上に異常を有し、異常を有する複合体それぞれの活性が低減または喪失したミトコンドリアであってもよい。また、異常は、ミトコンドリアのゲノム遺伝子の異常によるもの、核遺伝子のゲノムの異常によるもの、ミトコンドリア病の患者に由来するもの、および薬剤や環境によるもののいずれであってもよい。
　本発明の測定原理においては、いずれの実施態様においても、測定の対象となるミトコンドリアは、細胞内環境下におけるミトコンドリアであってもよく、細胞外に取り出されたミトコンドリアであってもよい。本発明の測定原理においては、ある態様では、測定は、細胞毎に行われ得る。ある態様では、測定は、ミトコンドリア毎に行われ得る。ある態様では、測定は、ミトコンドリア集団に対して行われる。測定が細胞毎に行われるときには、１つ１つの細胞をミトコンドリアの膜電位依存的インジケータで蛍光計測し、１つの細胞の蛍光量の総和を得ることにより行われる。ある態様では、測定は、細胞集団に対して行われる。本発明において、細胞毎またはミトコンドリア毎に呼吸鎖複合体の活性を検出する場合には、細胞またはミトコンドリアは、固体支持体上で観察される。固体支持体としては、例えば、透明な固体支持体（例えば、カバーガラス、およびスライドグラス）を用いることができる。
　ある態様では、本発明では、細胞内に存在するミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を測定することができる。細胞内に存在するミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を測定する場合には、常法によって細胞に対して膜透過処理を行うことができる。膜透過処理としては、例えば、臨界ミセル濃度未満の界面活性剤処理が挙げられる。本発明では、細胞に対する膜透過処理がミトコンドリアに及ぼす影響を調べることをさらに含んでいてもよい。
　ある態様では、本発明は、呼吸鎖複合体の活性の検出に加えて、ミトコンドリアを顕微鏡下で観察することをさらに含んでいてもよい。ある態様では、本発明は、呼吸鎖複合体の活性の検出に加えて、ミトコンドリアを有する細胞顕微鏡下で観察することをさらに含んでいてもよい。観察により、例えば、ミトコンドリアまたは細胞の形態（例えば、サイズおよび形）の情報を得ることができる。
実施例１：呼吸複合体活性は特定の細胞で測定できる
１．細胞の可溶化
　C6グリオーマ細胞は過酸化水素で処理できる。細胞を30μMジギトニンで2分間処理し、次いで緩衝液でリンスした。この操作により、細胞膜の透過性はほぼすべての細胞で増加した。緩衝液は10mM Tris-HCl、250mMスクロース、0.5mM EGTA、pH7.4であった。ジギトニンの代わりにストレプトリジンOを用いたとき、透過性の増加を伴わない細胞が観察された。
２．透過処理後の緩衝液
　透過処理した細胞を10mM Tris-HCl、110mMスクロース、70mM KCl、0.5mM EGTA、0.03% BSA、pH7.4に保持することにより、透過処理した細胞を室温で70分間保持してもミトコンドリアは安定で、ATP合成活性は減少しなかった。以下、断りの無い限り、呼吸鎖複合体の活性を計測する際には、10mM Tris-HCl、110mMスクロース、70mM KCl、0.5mM EGTA、0.5mM ADP、 1mM KH2PO4、および20nM TMREを含み、pH7.4に保持した測定溶液を用いた。
　過酸化水素で処理すると、それぞれのミトコンドリア複合体の全体的な活性が低下する。特に、複合体IとVの活性低下が観察される。
　特定の細胞の呼吸複合体活性を測定することができる。薬物候補化合物が複合体に及ぼす影響を確認できる。
３．呼吸鎖複合体の活性の測定
　それぞれのミトコンドリア複合体の活性は、特定の複合体に対する電子供与体および阻害剤を用いて測定することができる。図1に示すように、複合体Iは最初にリンゴ酸を加えることによって測定することができる。その後、約10分後に、ロテノンを細胞に添加することができる。さらに、コハク酸で細胞を処理し、約10分後にアンチマイシンAで細胞を処理することによって、複合体III活性を測定することができる。同様に、複合体IVは、アスコルビン酸塩およびTMPDを添加し、その後KCNを添加することにより測定することができる。複合体VはATPを添加し、オリゴマイシンとCCCPを添加して測定できる。
　上記の測定原理は、改変することもできる。以下では、改変した測定による実証例を示す。
　まず、細胞の透過処理を行った後、細胞を20nM TMREで染色した。その後、図２に示すように、電子供与体と阻害剤を添加した。その際のTMREの輝度変化を解析した。解析は、細胞の全輝度を細胞毎に取得することによって行った。具体的には、図３に示されるように細胞それぞれに対して、大きな領域および小さな領域を設定し、以下数式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 ｛式中、I1はより小さな領域における蛍光強度の合計であり、S1はそのより小さな領域の面積であり、I2はより大きな領域における蛍光強度の合計であり、S2はそのより大きな領域の面積である。｝
によって求めた。
　次に、ラットグリア腫細胞Ｃ６細胞を用いて、同様の実験を行った。呼吸鎖の電子供与体としては、図２に示されるように、最初に、ミトコンドリア内でNADHを生成させる電子供与体（リンゴ酸）を加え、複合体Iに電子を渡しプロトンポンプを駆動させた。このときに測定される蛍光強度は、複合体I、IIIおよびIVによる膜電位形成を示す。ついで、複合体Iの阻害剤（ロテノン）を加え、複合体Iからの電子伝達によるプロトンポンプを阻害した。次にコハク酸を添加し、複合体IIIに電子を流し、複合体IIIと複合体IVによるプロトンポンプを計測た。その後複合体III阻害剤（ミキソチアゾールやアンチマイシンA）を添加し、複合体IIIからの電子伝達によるプロトンポンプを阻害した。その後さらに、TMPDとアスコルビン酸を加え複合体IVによるプロトンポンプを駆動し、複合体IVによるプロトンポンプを測定した。最後にオリゴマイシンを加えて複合体VによるATP合成とそれに伴うミトコンドリア内膜の分極の度合いの減少をストップさせ、ATP合成による内膜の分極の度合いの減少の大きさ（複合体Vのプロトンポンプ活性に相当）を求めた。結果は、図２に示される通りであった。
　図2に示されるように、複合体Vの活性はオリゴマイシンによる脱分極（内膜の分極の度合いの減少）の他に、ATPの添加による分極によっても計測できた。
　次に、複合体Vの活性を測定した後に、外液を置換して、その後、複合体Iの電子供与体、複合体Iの阻害剤、複合体IIIの電子供与体、複合体IIIの阻害剤、複合体IVの電子供与体および阻害剤の順番で添加し、それぞれによる膜電位の変化を検出した。結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、複合体を測定する順番には特に限定は無く、様々な順番で呼吸鎖複合体の活性を測定することができた。
　さらに、ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、同様に複合体の活性を測定した。測定の順番は、上記実施例とは異なり、まず、複合体IIIの電子供与体であるコハク酸を添加し、複合体IIIとIVによる膜電位を観察した。図５に示されるように、コハク酸の添加前後においてミトコンドリアの膜電位が変化した。次に、複合体Iの電子供与体であるリンゴ酸を添加し、複合体Iにより駆動される呼吸鎖複合体の活性を確認した。その後、図５では、複合体IVの電子供与体が添加され、次いで複合体Vの阻害剤が添加されてそれぞれの添加前後の膜電位の変化が検出された。この結果、図５に示されるようにヒト皮膚線維芽細胞を用いても、ミトコンドリアにおける呼吸鎖複合体の活性を測定することができることが明らかとなった。また、正常な細胞と比較して、複合体Vに異常（m.9185T>C）を有するミトコンドリアでは、オリゴマイシンの添加前後の相対的蛍光強度の変化として検出される複合体Vの活性が大きく低下していることが確認できた。一方で、複合体Vに異常を有するミトコンドリアの他の複合体の活性は、健常なミトコンドリアと同等であった。
　さらにまた、過酸化水素処理した細胞をモデルとして用いて、ミトコンドリアの膜電位の変化を検出した。具体的には、Ｃ６細胞を１ｍＭの過酸化水素存在下において１時間インキュベートし、過酸化水素処理細胞を作製した。この細胞中で測定されたミトコンドリアの膜電位の変化は図６に示される通りであった。図６に示されるように、過酸化水素処理によって、呼吸鎖複合体ＩおよびＶの活性が喪失した様子が確認された。図６では、縦軸は、２０ｎＭのＴＭＲＥで染色した単一細胞の全蛍光強度であり、時刻０における蛍光強度を１として標準化して表されている。
　このようにすることによって、単一細胞において、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を複合体毎に、かつ、連続して測定することができ、複合体I、III、IVおよびVのそれぞれの活性の大きさや有無を求めることができる。
　ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性は、単離したミトコンドリア内でも測定することができる。単離したミトコンドリアをカバーグラスに吸着させる。吸着させたミトコンドリアに対して、上記の通りに電子供与体および阻害剤を添加して、ミトコンドリアそれぞれの呼吸鎖複合体の活性の大きさや有無を明らかにすることができる。

 

Claims (11)

  1. 　ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
    　ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることと、
    　前記阻害剤との接触の前後でミトコンドリアの膜電位を測定することを含み、
    　前記阻害剤との接触の前後における膜電位の変化が、複合体Vの活性を示す、
    方法。
  2. 　前記阻害剤が、オリゴマイシンである、請求項１に記載の方法。
  3. 　ミトコンドリア膜電位を測定することが、ミトコンドリアと、電位依存的ミトコンドリア染色剤とを接触させることを含むものである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記電位依存的ミトコンドリア染色剤が、テトラメチルローダミンエチルエステル（TMRE）である、請求項３に記載の方法。
  5. 　請求項１に記載の方法であって、
    以下（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程：
    （ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；
    （ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；および
    （ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；
    と、その後、
    　（ｄ）ミトコンドリアと複合体Vの阻害剤とを接触させることと、前記阻害剤との接触後のミトコンドリアの膜電位の変化を測定することとを含む工程と
    を含み、
    　工程（ａ）における膜電位の変化は、複合体I、III、およびIVの活性の合計を示し、工程（ｂ）における膜電位の変化は、複合体IIIおよびIVの活性の合計を示し、工程（ｃ）における膜電位の変化は、複合体IVの活性を示し、（ｄ）における膜電位の変化が、複合体Vの活性を示す、
    方法。
  6. 　請求項５に記載の方法であって、
    工程（ａ）および工程（ｄ）を含む、方法。
  7. 　請求項５に記載の方法であって、
    　（ａ）～（ｃ）からなる群から選択されるいずれか１つの工程を実施する前に、以下（A）～（C）からなる群から選択される１つ以上の工程を実施することを含む、方法：
    （Ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤とを接触させることを含む工程；
    （Ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの阻害剤とを接触させることを含む工程を含む工程；および
    （Ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの阻害剤とを接触させることを含む工程。
  8. 　請求項６に記載の方法であって、
    工程（A）、工程（B）、工程（ｃ）および工程（ｄ）をこの順番に実施することを含む、方法。
  9. 　工程（Ａ）の阻害剤が、ロテノンであり、
    　工程（Ｂ）の阻害剤が、ミクソチアゾールであり、および／または
    　工程（Ｃ）の阻害剤が、ＫＣＮである、
    請求項７または８に記載の方法。
  10. 　ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
    （ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；および
    （ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；
    からなる群から選択されるいずれか１つの工程を実施することを含む、方法。
  11. 　ミトコンドリアの呼吸鎖複合体の活性を検出する方法であって、
    （Ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤とを接触させることを含む工程；
    （Ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの阻害剤とを接触させることを含む工程を含む工程；および
    （Ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することと、その後、ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの阻害剤とを接触させることを含む工程；
    からなる群から選択される１つ以上の工程を実施すること含み、かつ、
    　その後、
    （ａ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体Ｉの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；
    （ｂ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IIIの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IIIの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；および
    （ｃ）ミトコンドリアと呼吸鎖複合体IVの電子供与体とを接触させることと、前記呼吸鎖複合体IVの電子供与体との接触の前後におけるミトコンドリアの膜電位の変化を測定することを含む工程；
    からなる群から選択されるいずれか１つの工程を実施することを含む、方法｛但し、（Ａ）を実施した場合には（ａ）を実施しないことができ、（Ｂ）を実施した場合には（ｂ）を実施しないことができ、（Ｃ）を実施した場合には（ｃ）を実施しないことができる｝。

     
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