CN1335892A - 植物组学;应用于草药组合物的以基因组为依据的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为指导草药组合物标准化,确定草药组合物中与任何特定生物活性相应的成分,预测某特定草药组合物的生物活性,以及开发改进的草药治疗方案提供了必要的工具和方法学。本发明提供了创建、维持、改进和使用草药生物反应阵列(HBR Arrays)的工具和方法学,其中HBR阵列由与特定草药组合物相关的数据集组成。本发明的HBR阵列可包括草药成分的植物相关数据,施用草药组合物于生物系统后收集的标记信息,以及施用草药组合物于生物系统后收集的生物反应信息。
Description
发明领域
本发明涉及草药组合物。更具体点,本发明提供改进筛选、检测、质控和生产草药组合物的工具和方法,以帮助引导新草药组合物的开发并鉴定已存在的草药组合物的全新用途。
发明背景
此处所有出版物和专利申请由文献同等程度被引入作为参考文献,就象每一个单独的出版物或专利申请被特定地单独地指明被引入作为参考文献一样。
亚洲和欧洲人已经使用了草药好几个世纪。在美国(US),草药已在膳食补充剂工业和整体医学中变得具有商业价值。大约美国人群的1/3已试过某种形式的可替代的医疗至少一次。(Eisenberg等,1993,N.Eng.J.Med.328:246-252)。
植物,包括草药,也成为鉴定用于治疗疾病的新型活性剂的焦点。植物提取物来源的活性化合物,一直是药物工业所感兴趣的。例如,红豆杉醇是从西部紫杉醇树树皮获得的抗肿瘤药物。预计当今普遍使用和须开处方的成千上万的药品的约百分之五十来源于植物或包含植物化合物的化学模拟物。(Mindell,E.R.,1992,EarlMindell’s Herb Bible,A Fireside book)。
当前,许多药物剂型、食品添加剂、膳食补充剂及其类似物中包含草药成分或草药提取物。在许多不同的国家,草药用于治疗人类和动物的各种疾病已有很长时间(见,如,I.A.Ross,1999,MedicinalPlants of the World,Chemical Constituents,Traditional andModern medicinal Uses,Humana Press;D.Molony,1998,TheAmerican Association of Oriental Medicine’s Complete Guide toChinese Herbal Medicine,Berkley Books;Kessler etal,1996,The Doctor’s Complere Guide to Healing Medicines,Betkley Health/Reference Books);Mindell,Supra)。
草药医学 世界上有许多草药医学的分支,比如印度草药医学,Unani,Sida和传统中医学(TCM)。现代西方医学通常包含服用一种能干扰特定生化途径的单一化学实体,而TCM的每种处方通常包含来自几种草药的成千上百种化学实体,它们被设计为以一种协同的方式同体内多个靶点作用。尽管经验实践给这些古老的草药医学的草药组合物和处方做出了重要贡献,一套完全不同于现代西方医学关于解剖学、药理学、病理学、诊断治疗等等方面的理论在不同程度上支持这些古老的草药医学。在各种草药医学领域中,TCM已在好几个世纪中发展了一套较完整的理论,并且在大中国及包括韩国和日本在内的东亚地区由当地医生详细记录,并在大量人群中进行实践。(>13亿人)。
西方医学一般使用纯化的化合物,或天然的或合成的,主要直接针对一个单独的生理靶点。而TCM所用的组合物通常由多种草药和化合物组成,是根据独特的整体观念针对体内多个靶点。TCM主要运用炮制过的天然产物粗品,以不同组合和剂型,来处理引起较少副作用的各种疾病。世界上绝大多数人都已认识到TCM的巨大潜力。
经典TCM处方中的草药分为主药和次药,次药包括辅药、佐药及引药。主药在治疗一种疾病的病因或主要症状时起主导作用。辅药帮助加强主药的作用并在治疗伴随症状时起主导作用。有三种佐药:1)用于提高主药和辅药的疗效或治疗三级症状的草药2)用于减小或消除主药和辅药的毒性和其他副作用的草药及3)作用于不受主药特定作用的补充性靶组织的草药。引药在处方或剂型中引导其他草药对靶点的作用和/或协调和介导其他草药的作用。与大部分由一种植物的一个或多个部分组成的草药或添加剂相反,TCM的预期作用是针对多个组织。
例如,著名的TCM处方,用于治疗哮喘的“麻黄汤”由麻黄、桂枝、苦杏仁和甘草组成。麻黄是主药,祛塞发汗、宣畅肺气以缓解最主要的症状哮喘。桂枝,作为辅药,促进麻黄的祛寒发汗的作用。温通经脉、助阳化气,以减轻头痛和身痛。苦杏仁,作为佐药,降肺气,并增强麻黄的平喘之功。甘草作为引药缓和麻黄和桂枝的作用以保证真气的平衡。尽管这四种草药的每一种都清楚地表现了其各自的作用,当他们合用时,互相完善并且补充。事实上,可根据病人表现的症状主药可与一种或多种次药配方。(传统中医处方,第一章,pp10-16,E.Zhang主编,上海中医药大学出版社,1998)。
指导中药和其他方式如针灸治疗疾病的TCM主要理论是1)阴阳理论,2)五行理论,3)脏腑理论,4)气、血津液理论以及5)经络理论。
在TCM中,作正确诊断的首要方面是确定疾病属阴还是属阳。例如,发烧、口渴、便秘或脉数的那些病人具有阳的特征。恶寒、不渴、腹泻以及脉迟的那些病人具有阴的特征。也可根据阴阳理论划分草药的性、味和功能。例如,寒性和凉性的草药属于阴,而温性和热性的草药属于阳。酸、苦及咸味的草药属于阴,而辛、甘和淡味的草药属于阳。具有收敛和沉降作用的草药属于阴,而具有发散、升浮作用的草药属于阳。在TCM中,根据阴阳的强或弱确定治疗原则,根据草药的阴阳性质及其恢复阴阳失调的作用开处方。这样,可达到治疗的效果。
根据五行理论,组成物质世界的有五种基本物质(即,木、火、土、金和水)。在TCM中,该理论用于解释人体的生理学和病理学并指导临床诊断和治疗。
中医运用五行的相生、相乘、相克、相侮规则制定出许多有效独特的治疗处方,如土生金(脾气散精于肺),水生木(肾精可以化生肝血),水克火(肾水上济于心,抑制心火上亢)。特别要提的是,为了指导开TCM处方,将一些草药的性质分类至五行中的一种。
在TCM中,人体内脏分成三组:五脏(心、肝、脾、肺、肾),六腑(胆、胃、大肠、小肠、膀胱、三焦),奇恒之腑(脑、髓、骨、脉、胆和女子胞)。在TCM中,脏和腑不仅仅是解剖学单元,而且是生理学和病理学关于各种器官之间相互作用关系的概念。例如,心也指大脑功能,并影响血液、毛发、舌和皮肤的功能。阴阳和五行影响这些五脏、六腑、奇恒之腑的相互作用。如下面讨论的,运用这些学说相互作用的复杂性来解释草药处方所针对的疾病的病理。
TCM中草药的处方是从诊断开始的,诊断有四个主要部分:问诊、望诊、闻诊、切诊。在问诊阶段,收集许多信息,包括主要症状的特征。例如,如果主要症状特征为腹部钝痛,得温热和按压可缓解,表明脾阳不足。腰膝酸软,恶寒发冷,说明肾阳虚。望诊时,望神,望面色以及舌质和舌苔。例如,色淡白与秋肺相关,其气干燥。这可能在阳气不足和气血运行受阻时发生,或寒在经络时得病。
在TCM中,脏腑、经络以及行使生理功能的组织和其他器官所需能量是来自气、血、津液,并依赖气、血、津液的形成和化生。TCM的处方考虑草药对气血的作用来治疗。
TCM认为全身遍布了经络及其分支。草药就是通过它们对病理靶标发生作用,并达到改善病症的效果。例如,麻黄作用于肺经和膀胱经以发汗来缓解哮喘并利尿。如上所述,针灸的临床应用也是根据经络学说。
总的来说,在TCM中当将每种草药的性质分类成阴或阳,并划分为五行中一种时,它们通过经络作用,并通过气、血、津液对靶标如脏腑产生治疗作用。病理因素通过同样的经络系统被伪装成诱饵从负面影响脏腑功能导致疾病。
从前述讨论清楚地知道TCM的专业术语既是解剖学概念也是哲学概念。例如心在TCM中代表身体的组织、器官或系统的主宰者。所以,心的概念需要一个多位数据集来描述TCM每个概念。
美国规范程序 在美国,根据1994年膳食补充剂健康教育条例(DSHE条例)规范膳食补充剂(如植物产品、维生素和矿物质,氨基酸和组织提取物)。根据联邦食品、药物及化妆品条例,从中去除了膳食补充物的成分如食品添加剂。另外,DSHE条例要求食品和药品管理局(FDA)承担责任证明商品化膳食补充剂在根据标签使用或作一般使用时显出严重的或超平常情的风险。因此,如今还没有联邦管理规范为膳食补充剂制定的纯化、鉴定和生产程序的特定标准。另外,从1992年议会建立可替代医学办公室以来,有关草药质量方面的文章出版很少。(Angell等,1998,N.Engl.J.Med.339:839-841)。
现在,FDA必须批准药物组合物或鸡尾酒中每一种化合物,然后进行临床试验为商品化该药物获取单独的FDA批准。该程序极为冗长昂贵。分子整体医疗可能需要较少的艰巨的评估,因为作为植物药的特定草药组合物以前的用途允许在开始时进行多种化合物的临床实验(即,使用草药组合物或该草药组合物的特定成分的临床实验)。最近,FDA批准了在临床试验中将一些草药作为植物药品来检测。(FDA植物药品指南,4月,1997)。这些例子总体上代表了保健方面的积极的发展,同时在草药和膳食补充剂,包括传统中药的剂型、生产和质控方面也引起了重要的问题。
由草药中多种化合物引起的众多有关的生物反应,目前尚未清楚,而这对于支持FDA批准其市场化越来越重要。
在为改进其现行业务而不断增加的压力下,以草药为基础的工业正在形成(见如,Angell等,supra)。近期由于摄取草药配方引起的几起毒性报告更突出了需要对草药和食品补充剂的制备和服用方法采取科学的试验。例如,服用以草药为基础的膳食补充剂的一名病人遭受了洋地黄毒性(Slifman等,1998,N.Engl.J.Med.339:806-811)。后来证明在补充剂中标作车前草的草药成分确实被毛洋地黄污染了,已知毛洋地黄是一种包含至少60种强心甙的草药。另一例子,发现一种草药制剂引起一例病人慢性铅中毒。(Beigel等,1998,N.Engl.J.Med.339:827-830)。这不是一起完全出乎意料的偶发事件因为亚洲草药的铅污染和其他重金属污染有完整的纪录。)Woolf等,1994,Ann.Intern.Med.121:729-735)。
植物药材的性质 已清楚地知道基因特性(如属、种、品系、品种、克隆)、草药生长年龄、时间、使用的特定的植物部位、加工方法、产地、土壤种类、气候类型、施肥的类型和频率、以及其他生长因素对于从任何特殊区域采集的任何特殊草药的特殊化学组合物有重要影响。
为确保用于医学和作为膳食补充剂的草药的持续质量,已制定了越来越多的各种类型测试;包括宏观和微观水平的检测和各种化学分析。最近,草药提取物中标记分子的高效液相色谱(HPLC)图成为一种文献标准。不过,这种方法也存在问题,包括一些生物活性分子不吸收以便HPLC检测的紫外或可见光,而且化合物的量与其生物学效力未必成比例。鉴于这些原因,草药生产厂家求诸于混合不同来源的生药以使化合物的变化最小。
质谱(MS)是一种分析手段,用以测定相对质量和一束离子化分子成分的相对丰度或在高真空情况下由样品产生的分子片段的相对丰度。MS,不象HPLC,不取决于光密度。实际情况下,将其与HPLC联用或与毛细管电泳(CE)联用:HPLC分离化合物,MS接着对它们进行鉴定。已经有用于生物学用途的联合MS和HPLC的商业系统。质谱局限于气态或低压下易挥发的物质,或衍生化后为气态或低压下易挥发的物质。
这些措施已远远不够。最近发表的文章报道了在特定供应商供应的草药质量方面有更大的变化以及提供生物学等价的草药提取物的难度。而且,在大部分情况下并没有清楚地限定安全性、有效性及草药化学成分之间的相关性。最近,针对消费人群和管理机构,(联邦注册,2月6日,1997,62卷,No.25,记事表NO.96M-0417,关于生产,包装或贮存膳食补充剂的cGMP,提议条例)一些草药生产厂商已开始实施药品生产管理规范(GMP),其要求在所有水平有严密的控制。
应用化学方法和谱学方法描述草药和食品补充剂的成分。例如,应用这两种方法从Gliricidia Sepium的果实里提取出三种全新的以常春藤甙为基础的乙酰皂甙(Kojima等,1998,Phytochemistry 48(5):885-888)。通过比较由高效液相色谱(HPLC)或毛细管电泳(CE)分析的某些特征组成成分的含量来推断许多商业样品中中草药的植物来源。(Shuenn-Jyi Sheu,1997,Journal of Food and DrugAnalysis 5(4):285-294)。例如用麻黄碱/伪麻黄碱的比例作为一种标记把中麻黄和其他麻黄品种区分开。用总生物碱含量来区分黄檗种类;用人参皂甙含量区分人参的种类。不过,这些方法并不提供在用草药治疗病人后,各种草药对分子、生理学的或形态学反应作用的直接量度。
加州健康科学系,食品与药品部,近来运用气相色谱-质谱和原于吸收法测试了购自草药商店的亚洲药品的污染杂质。(R.J.KO,1998,N.Engl.J.Med.339:847)在他们测试的260种产品中,至少83(32%)种含有未声明的药物或重金属,23种有不止一种杂质。运用高效液相色谱、气相色谱、及质谱,发现一种商品化的8种草药混合物(PC-SPES)含有雌激素的有机化合物(Dipaola等,1998,N.Engl.J.Med.339:785-791)。研究者总结PC-SPES具有有效的雌激素活性,而服用PC-SPES的前列腺癌病人可能会破坏标准治疗的结果并且会发生严重的临床副作用。为传统中药“Wei LingXian”的不同样品收集气相色谱数据,并对比其与样品的抗炎活性的关系。(Wei等,应用于传统中药“Wei Ling Xian”的质量评估的化学模拟研究,药学学报26(10):772-772(1991))该研究既未提供相关的HBR阵列数据,如时程,量效关系,以证实生物标记差异效力的对照样品,也未应用重复型数据构建程序以建立一个全面的数据库来鉴定草药组合物的作用。
蛋白质水平的改变也被用来描述草药组合物或草药的特定成分的作用。例如,由外周血单核细胞产生的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)随着加入培养基的特定中草药而变化。(Yamashiki等,1992,J.Clin.Lab.Immunol.37(2):83-90)。用在日本应用最普遍的草药小柴胡汤处理培养的人表皮角质形成细胞中白介素-1α受体的表达明显上调。(Matsumoto等,1997,Jpn.J.Pharmacol.73(4):333-336)。用Toki-Shakuyakusan(TSS)处理会增加巨噬细胞的Fcγ11/111受体和补体3的表达。(J.C.Cyong,1997,Nippon YakurigakuZasshi 110(Suppl.1):87-92)。粉防己碱,一种由天然的中草药提取而得的生物碱,抑制大鼠肺泡巨噬细胞中信号诱导的NF-κB的活化。(Chen等,1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.231(1):99-102)。草药Sairei-to,泽泻(日文又名“Takusha”)和茯苓(日文又名“Bukuryou”)抑制患有抗肾小球基底膜肾炎大鼠的内皮肽-1的合成和表达。(Hattori等,1997,Nippon Iinzo Gakkai Shi 39(2):121-128)。
mRNA水平的增加或减少也作为各种草药和草药成分作用的指标。腹膜内注射QingYang Shen(QYS)一种具有抗癫痫特性的传统中药和苯妥英钠减少在海人草酸诱导的大鼠慢性癫痫发作期α-和β-微管蛋白mRNAs和海马C-fos mRNA的诱导。(Guo等,1993,J.Tradit.Chin.Med.13(4):281-286:Guo等,1995,J.Tradit.Chin.Med.15(4):292-296;Guo等,1996,J.Tradit.Chin.Med.16(1)48-51)。用从黄芪(Astragalusmembranaceus)纯化而得的一种成分紫云英皂甙IV处理培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),减少了I型胞浆素原激活因子抑制剂特异mRNA的表达,并且增加了组织型胞浆素原激活因子(t-PA)特异性mRNA(Zhang等,1997,T.Vasc.Res.34(4):273-280)。发现从人参根中提取的一种成分能有效诱导人单核细胞和人单核细胞系THP-1产生白细胞介素-8(IL-8),并伴随IL-8 mRNA表达的增加。(Sonoda等,1998,Immunopharmacology 38:287-294)。
近期在cDNA微阵列技术方面的进展能进行有关基因表达信息的大量平行筛选。这一程序用于研究细胞周期、生化途径、酵母genome-wide表达、细胞生长、细胞分化、对单一化合物的细胞反应以及遗传性疾病,包括这些疾病的发病和发展。(M.Schena等,1998,TIBTECH 16:301)。到目前为止,还没有研究者尝试应用这些新方法来研究整个草药治疗和补充剂的分子学水平的作用。
一些研究者已尝试研究从所选草药中提取的主要活性成分的作用。例如,用纯化自三七(Panaxnaotginseng)的香豆人参皂甙R1(NR1)处理HUVECs,引起有剂量-时间相关性的TPA合成的增加。(Zhang等,1994,Arteriosclerosis and Thromobosis 14(7):1040-1046)。用NR1处理既不改变尿激素型胞浆素原激活因子和PAI-1抗原的合成,也不影响PAI-1在细胞间质中的沉积。当用NR1处理HUVECs时,TPA mRNA提高两倍,相反NR1并不显著影响PAI-1特异性mRNA的表达。因为大部分对三七的研究涉及其与其他草药的混合物,研究者发现很难评价其结果与用于治疗人类时的体内情况的相关性。(Id.,at1045,第二专栏,第一章)。另外,因为研究者仅研究草药的一种主要成分,所以不可能从该研究中确定整个草药的分子效应或草药各成分的相互作用。
Dobashi等(1995),Neuroscience Letters.1997:235-238)研究saiko试剂的两种主要成分的作用,一种用于治疗肾病综合症、支气管哮喘和慢性风湿性关节炎的中草药。服用ss-d增加了血浆肾上腺皮质激素(ACTH)水平,垂体前叶mRNA水平及大鼠下丘脑中CRFmRNA水平,并有量效关系。相反,用ss-a处理没有影响这些分子标记的水平。尽管该研究表明服用ss-d可能在Saiko试剂诱导大鼠下丘脑CRF释放和CRF基因表达中起重要作用,但没有阐明作为整体的草药的分子作用。
Kojima等(1998,Biol.Pharm.bull.4:426-428)描述了运用各种mRNA分离和鉴定在小鼠肝中被小柴胡汤在翻译水平调节的基因,小柴胡汤在日本是用于治疗各种炎症疾病的草药。这些研究者将他们的研究局限在运用mRNA差异显示技术探索草药的分子机理。它也没有阐明对受试动物的多种器官的作用,也没有提供质量控制,新用途及效应标准的指标。另外,该研究没有分析草药的各个成分或对整体用药的结果与单独用药的各自的结果进行比较。
MaJi等(1998),Chinese Medical Joural 111(1):17-23)研究草药黄芪对aortocava1-fistula引起的实验性充血性心衰大鼠的钠水潴留的治疗作用。对用或未用经黄芪处理慢性心力衰竭大鼠在各种形态特征的变化(例如,体重、血清钠浓度);生理学特征变化(如,平均动脉压,心率,血球容积及血浆溶质度);mRNA表达水平的变化(例如下丘脑精氨酸增压素(AVP),AVPV1a受体,肾AVPV2受体,aquaporin-2(AXP2))以及蛋白质分泌的变化(例如血浆心房单磷酸肽(ANP)和尿环鸟嘌呤单磷酸(cGMP))等方面进行了比较。研究者发现用黄芪治疗改善了心脏和肾脏功能,部分纠正了AVP系统和AQP2的非正常mRNA表达,并且改善了肾脏对ANP的反应。该研究未阐明运用收集的数据来指导新配方的开发或用来弄清一个处方中不同草药之间协同作用或其他反应,也未证实用于质量控制的作用差异强度。
如上述相关科学文献综述所示,以分子为基础的技术还未用于探索和证实同时由各种化合物如草药TCM处理或考验的生物系统的细胞反应和分子反应。而且,最近的这些进展也并未与其他技术和方法结合以产生一种系统探索草药和TCM生物作用的程序。
发明概述
该发明为创建、维持、改进及使用草药生物反应阵列(HBRArrays)提供了工具和方法。其中HBR阵列由具有特定草药组合物的数据集组成。本发明的HBR阵列可包括草药组分的植物相关数据信息,施用草药组合物于生物系统后收集的标记信息和生物反应信息。
本发明为建立特定草药组合物的标准化HBR阵列提供了必要的工具和方法学,其中标准化HBR阵列用作评价相近或不同批次草药组合物的基准。本发明还提供更新和维持标准化HBR阵列必要的工具和方法学。本发明的具体应用包含重复程序,附加批次的草药组合物数据、附加的植物相关数据、附加的标记信息、和/或附加的生物反应信息以此周期性加入标准化HBR阵列。因此,本发明为在一个不断进步的基础上创建、维持、更新和使用HBR阵列提供了工具和方法学。
本发明提供了必要的工具和方法学以指导草药组合物的标准化,确定与特定生物活性相应的草药组合物具体成分,预测草药组合物的生物活性,开发改良的草药治疗,调整或修饰草药组合物;在成批草药组合物中鉴定具有预想生物活性的特定分子;确定当保持或改进已知草药组合物的预想的生物活性时哪些草药成分可从中除去;鉴定批草药组合物的新用途和前所未知的生物活性;以及运用预测的成批草药组合物的生物活性来帮助设计包括草药组合物和合成化学药品的治疗方案,包括应用组合物化学方法设计治疗方案。
更具体点,本发明为草药组合物提供建立标准化草药生物反应阵列(HBR Arrays)的方法,其中方法包含:
1)选择有至少一种已知生物反应的草药组合物
2)施用成批草药组合物于生物系统,并且收集两种或更多种标记物的数据。
3)贮存步骤2)的标记物数据作为一个HBR阵列
4)为一批或更多附加批次草药组合物重复步骤2)和3),应用两种或比步骤2)中更多种的相同或不同标记物。
5)合并从步骤3)和4)中得到的HBR阵列;以及
6)分析步骤5)中合并的HBR阵列以产生该草药组合物的标准化HBR阵列,其中标准化HBR阵列具有与草药组合物的至少一种已知生物反应相关的两种标记物或更多种标记物的数据。本发明进一步提供了这样的方法,其中包含施用一批或更多批草药组合物于生物系统,收集一种或更多种标记物反应的数据并且向该草药组合物的标准化HBR阵列中添加收集的生物反应数据。
本发明提供了评价草药组合物的方法,其中该方法包含施用一批草药组合物于生物系统及收集两种或更多种标记物的数据;以及同与该批草药组合物相同或基本相同的草药组合物的标准化HBR阵列比较收集的标准数据。
本发明提供了预测一种草药组合物的生物活性的系统包含:
1)包含一种或多种不同类型的细胞、组织、器官或体外分析的生物系统。
2)一批草药组合物
3)两种或多种分子标记物
4)一种施用该批草药组合物于生物系统及测量分子标记物的不同反应的手段
5)一个计算机处理器,包括存储器,用于分析和贮存分子标记物的各种反应的量度来建立一个该批草药组合物的草药生物反应阵列((HBR Arrays)数据集。
6)一个计算机处理器,包括存储器,用于比较该批草药组合物的HBR阵列和一种或多种以前贮存的HBR阵列,来预测该批草药组合物的生物活性,其中用于建立这一个或多个以前贮存的HBR阵列的该草药组合物的生物活性是已知的。
附图简述
图1图1提供了为任何所选草药组合物构建标准化草药生物反应阵列(HBR Arrays)的基本方法步骤图。该图为理解方便以其最基本的形式表示。如此处讨论的,图的每条途径均可重复。而且,每个盒子中包含的任何信息均可用作指导作有关收集任何其他盒子的信息的决定。这样,许多反馈环也可能贯穿整个图。
图2图2提供为每一批草药组合物构建一个草药生物反应阵列(HBR Arrays)和比较该批HBR阵列与选自标准化HBR阵列的信息子集的基本方法步骤图。该图为理解方便以其最基本的形式表示。如此处讨论的,该图的每条途径均可重复。而且,每个盒子中包含的任何信息均可用作指导作有关收集任何其他合子的信息的决定。这样,许多反馈环也可能贯穿整个图。
图3图3提供建立和使用主要数据集的基本方法的步骤图。该图为理解方便以其最基本的形式表示。如此处讨论的,该图的每条途径均可重复。而且,每个盒子中包含的任何信息均可用作指导作有关收集任何其他合子的信息的决定。这样,许多反馈环也可能贯穿整个图。
图4各种草药组合物的蛋白质印记。
A 无草药组合物
B 黄芩汤A(HQTA)(0.2mg/ml)
C HQTA(4mg/ml)
D HQTB(0.2mg/ml)
E HQTB(4mg/ml)
F 黄芩(0.2mg/ml)
G 黄芩(4mg/ml)
图5芍药(Paeonie lactiflora Pallus)的HPLC
图6 Ziziphi fructus的HPLC
发明详述
除了有不同的定义,所有用于此处的技术性和科学性定义均与该发明所属的领域中每一个普通技术人员平常理解的意思一样。尽管任何相似或等同此处描述的方法和材料均可用于实施或检测本发明,但还是描述了优选的方法和材料。
发明总论
如上所述,本发明是针对用于预测草药组合物生物反应的工具和方法。更具体点,本发明提供创建草药生物反应阵列(HBR Arrays)数据库的方法和应用此数据库来改善以草药为基础的有效治疗的设计的方法。本发明的目的是全面设计、创建、改善和使用HBR阵列用于制备、测试和服用草药组合物,并指导新的草药组合物的开发和已有草药组合物的全新用途。
植物组学 如此处所应用的,根据其被应用的上下文,“植物组学”(“phytomics”)指应用生物信息学和统计学手段阐明草药组合物成分的质量和数量方面或开发用于阐明这些方面内容的真实数据库。
草药生物反应阵列 如此处所应用的,一个HBR阵列是由与草药组合物相关的两个或多个观察结果或量度的数据构成的。HBR阵列可包括该组合物与植物相关的定性的和定量的数据(植物相关的数据),施用草药组合物于生物系统后得到的标记物信息包括剂量相关研究,以及将草药组合物施用于生物系统后得到的生物反应数据。任何特定HBR阵列中的数据均可按2维或3维空间进行统计分析。
HBR阵列被命名为批HBR阵列和标准化HBR阵列。批HBR阵列是与特定批的一种草药组合物相关的数据阵列。标准化HBR阵列是与一种标准化草药组合物相关的数据阵列。
主要数据集 如此处所应用的,术语“主要数据集”指用作与相同或不同草药组合物的其他各种数据集比较或分析的基线数据集。一般地,主要数据集是应用生物工程技术建立以确证草药组合物的一些基因或蛋白质。因此,主要数据集通常,但并不总是,建立在基因组或蛋白质组数据集基础之上。例如,DNA微阵列结果可以是用于比较其他隶属或次级数据集的主要数据集。
次级或隶属的数据集 如此处所应用的,“次级数据集”或“隶属数据集”指用于比较主要数据集的一个或多个数据集。一般情况下,但并不总是,次级数据集是由通过多种传统方法收集的一种草药组合物的信息组成。例如,次级或隶属数据集可以由通过多种传统手段收集的植物相关数据组成。植物相关的数据的例子包括,但不局限于,草药组合物中草药的属/种,该组合物中草药的具体植物部位,以及草药所在的地理位置。次级数据集的另一个例子可以由在用一种或多种不同量的草药组合物处理后细胞、组织、器官或生物体的一组生物反应组成。这些生物学数据或整个生物体的例子包括,但不局限于,细胞毒性研究,酶处理研究,生长速率,增重或失重,运动能力的改变以及智力能力的改变。
草药 技术上讲草药是一种小巧的非木质的(即肉质茎的)一年生或多年生产种的植物,其所有地上部分在每个生长季节的尽头会枯萎。草药因其药用、调味或芳香的品质而有价值。如该词平常所用,也如该词在此处所用,草药指任何具有食品补充剂、药用、治疗或改善生活作用的植物或植物部位。因此,如此处所用,草药不局限于草药的植物学定义而是任何用于这些目的的植物性药材、植物或植物部位,包括Metaphyta王国的任何植物种类或亚种的任何植物或植物部位,包括草、灌木、半灌木和树木。用于草药组合物的植物部位包括,但不局限于,种子、叶、茎、嫩枝、枝、芽、花、鳞茎、球茎、块茎、地下茎、长葡茎、根、果实、球果、浆果、形成层和树皮。
草药组合物 如此处所用,“草药组合物”指任何包括草药、草药植物或草药植物部位的组合物。因此,如此处所用,草药组合物是任何草药制剂,包括草药食品补充剂,草药药剂、草药药品和医疗食品。草药组合物的例子包括,但不局限于,下列成分:一种单一植物的整个植物或植物部位;多种植物的整个植物或植物部位;来自一种植物的多种成分;来自多种植物的多种成分;或这些不同成分的任何组合。至于各种草药组合物的全面综述,请见,例如,Kee ChangHuang,The Pharmacology of Chinese Herbs,CRC Press(1993)此处完整收录。在以下段落提供各种草药组合物的代表实例。
在英国自十八世纪中叶以来就使用含有杨柳树树皮的草药组合物来治疗发热。杨柳树树皮中的活性成分是一种称作水杨甙的苦味甙,其水解产生葡萄糖和水杨醇。阿斯匹林(乙酰水杨酸)和类阿斯匹林药物(如,布洛芬),常被称作非甾体抗炎药物(NSAIDS),常用来治疗疼痛、发热和炎症。绣线菊是另一种含有水杨酸盐的草药。用杨柳树皮或绣线菊治疗关节炎和类是关节炎的症状需要消耗大量制自这些植物的草药浸剂。整个杨树种类(即杨树树木和灌木)也含有水杨酸盐前体,而杨树芽已用于消炎解热镇痛药。
美国专利局已公布了用于治疗各种疾病和解决其他困扰人类和动物的与健康有关的问题的草药组合物。例如,美国专利号第5,417,979公布了一种含有草药混合物的组合物,包括千金藤和甘草以及它们的提取物,用作味口刺激剂和治疗疼痛。发现包含甘草的草药组合物对治疗湿疹、牛皮癣、瘙痒和皮炎有用。(美国专利号第5,466,452)。美国专利号第5,595,743公开了用于治疗各种哺乳类动物的疾病,包括炎症和风湿性关节炎的各种草药组合物,包括甘草提取物(甘草)、豕希莶、苦豆子、百部以及汉防己草药。可用含有植物生物碱汉防己碱的药物组合物来治疗眼炎(美国专利号第5,627,195)。美国专利号第5,683,697揭示了一种具有抗炎、解热、祛痰或止咳作用的药物组合物,其中该组合物包括楝树、Angepica、石斛、风仙花、柑、桑寄生、青葙、鹅绒藤及北沙参的植物部位。已发现一种包含山姜、菝葜、青牛胆、蒺藜、Withania及姜的根、根茎和/或植被提取物的草药组合物,可减少或缓解类风湿性关节炎、骨关节炎、活动性关节炎的症状,并且减少促炎症细胞因子的产生。(美国专利号第5,683,698)。
草药组合物由许多种剂型,包括胶囊、片剂或糖衣片剂;丸剂;提取物或酊剂;粉剂;新鲜或干燥的植物或植物部位;制备浸剂;汁;乳剂或软膏剂;香精油;或任何这些剂型的组合。可通过各种方法服用草药,包括口服、直肠给药,非经肠胃道给药,肠道给药,透皮给药,静脉给药,喂饲管给药以及局部给药。
本发明所涵盖的草药组合物包括也含非草药成分的草药组合物。这样的非草药成分实例包括,但不局限于,昆虫个体或昆虫部位,蠕虫,动物或昆虫粪便,天然油或石油,胺的碳酸盐,酒石酸盐、酒、水、甘油、类固醇、成药、维生素、营养提取物、乳清、盐以及明胶。
对口服来说,公布的草药组合物可采用例如片剂或胶囊的剂型,通过传统手段混合制备,其中有普遍认可的赋形剂如粘合剂(例如:玉蜀黍淀粉明胶,聚乙烯吡咯酮,羟丙基甲基纤维素),填充剂(如乳糖,微晶纤维素或磷酸钙);润滑剂(如硬脂酸镁,滑石粉或硅);崩解剂(如,马铃薯淀粉或淀粉二乙醇酸钠);或润湿剂(如月桂醇硫酸钠);助流剂;人造或天然调味剂以及甜味剂;人造或天然色素及染料;以及助溶剂。草药组合物也可另行配方以本领域已知的并在美国专利号第4,690,825和第5,055,300所讨论的按时释放方式释放活性剂。按本领域熟知的方法给片剂加糖衣。
对于口服的液体剂型可采用例如溶液、糖浆、悬浮液、或淤浆(例如Mulchandani等在1992美国专利号第5,108,767中描述的液体营养补充剂),或以干品方式提供,在使用前用水或其它适当的载体恢复液态。叶酸及其它维生素矿物质的液体制剂是专为ESRD病人设计的一种液体营养补充剂。这样的液体制剂可通过传统手段加药物可接受的添加剂制备,如悬浮剂(例如,山梨醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂肪);乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶);非水载体(如,杏仁油,油性酯或乙醇);防腐剂(如对羟基苯甲酸酯或对羟基苯丙酸酯或山梨酸);以及人造或天然色素和/或甜味剂。
对于局部给药,草药组合物可与至少一种组成可接受载体、稀释剂或赋形剂的成分混合以提供一种适合局部给药的组合物,如膏剂、凝胶、固体、糊剂、油膏剂、粉剂、洗剂、液体、气雾剂以及类似物。单独的灭菌蒸馏水及单纯膏剂,软膏剂及凝胶基质可用作草药成分的载体。也可加入防腐剂和缓冲液。该制剂可采用灭菌衣膜、生物可降解、可吸收胶布或衣膜以用于局部给药,或采用缓释植入系统,从大量的初始释放衰减至缓释。至于更完全的以草药为基础的组合物的综述和讨论请参见Earl Mindell,Earl Mindell’s HerbBible,Simo&Schuster(1992);Culpper’s Complete Herbal,W.Foulsham&Co.Ltd.(17世纪中叶首次报道);以及Rodale’sIllustrated Encvdopedia of Herbs,Rodale,Press(1987)。
标准化草药组合物 如此处所用,“标准化草药组合物”指为评价具有相同、相近或不同成分的批草药组合物选作标准草药组合物的一种特定的草药组合物。有时候此处也称为“主草药组合物”。标准化草药组合物一般是已清楚鉴定并证实在特定生物系统中具有预想生物反应的的草药组合物。标准化草药组合物通常应用本领域专业人员熟知的化学试验标准化并且妥善贮存以备长期使用和参考。用标准化草药组合物来建立以植物(如植物相关数据),标记物和生物反应的观察结果和量度为基础的标准化HBR阵列以鉴定草药组合物。
成批草药组合物 如此处所用,“成批草药组合物”指任何受试草药组合物,用来建立以植物和标记的观察结果和量度为基础的HBR阵列以鉴定草药组合物。有时候此处也称作“受试”或“成批”草药组合物。可包括也可不包括生物反应的观察结果和量度。用于建立标准化草药组合物的草药组合物也可称为“成批草药组合物”直至其被命名为“标准化草药组合物”。
批 如此处所用,“批”指以某些特定属性识别可以将其与其它任何特定量的同种草药组合物区分开的一种特定量草药组合物。例如,一批草药组合物区别于另一批是因为其中一批是在与另一批不同时间或不同地理位置采集的。区分特定批的其它不同点可包括,但不局限于,以下几方面:1)所用的特定植物部位(例如,一批中用草药的根而另一批中用同样草药的叶;2)各个草药或草药组合物收获后处理(例如,一批可以用蒸馏水处理而另一批可以用盐酸处理以模拟人胃的酸度)以及3)一种草药组合物中各个草药的相对比例(例如,一批中以重量或体积含有三份等量不同草药而另一批则一种草药的比例多于其他两种)。
生物系统 如此处所用,“生物系统”指用于观察或测量生物反应的任何生物实体。因此,一个生物系统包括,但不局限于,任何细胞、组织、器官、整个生物体或体外分析。
生物活性 如此处所用,一种草药的“生物活性”指一种草药组合物对于一个给定的生物系统的独有的特定生物效应。
植物相关数据 如此处所用,“植物相关数据”指收集的关于该草药组合物的数据,包括,但不局限于,关于植物的数据,其生长条件以及在植物采集时和采集后的处理。植物相关数据也包括一种草药组合物中成分的相对比例,其中成分可以是不同植物部位,不同植物种类,其它非植物成分(例如,昆虫部位,化学药品)或这些变量的任何一种组合。
为一种草药组合物收集的植物相关数据包括,但不局限于,以下几方面:1)植物种类(和,如可知,具体的植物品种,栽培品系,克隆,系等)和用于该组合物的具体的植物部位;2)草药的地理来源,包括经度/纬度和海拔;3)草药的生长条件 包括肥料类型和数量,降雨和灌溉的数量和时间,每天接受的平均microEinsteins,农药用法,包括除草剂,杀虫剂,杀螨剂及杀真菌剂,以及耕作方法。4)加工草药的方法和条件,包括草药的年龄/成熟度,浸泡时间,干燥时间,提取方法以及研磨方法;以及5)草药成分和最终的草药组合物的贮存方法和条件。
另外,标准化草药组合物可用化学方法分析。化学鉴定一般通过本领域专业人员通常知晓的任何化学分析方法来完成。可采用的化学分析的实例,包括,但不局限于,HPLC,TLC,化学指纹分析,质谱分析以及气相色谱。
生物信息学 如此处所用,“生物信息学”指具有生物学意义的信息的使用和组织。在其他情况中,生物信息学包含以下几个方面:1)数据获取和分析;2)数据库开发;3)整合和联接;以及4)终数据库的进一步分析。直至20世纪九十年代初期,几乎所有生物信息学费源才发展成功众领域免费软件,并且许多可通过因特网免费获得。一些公司已开发了专利数据库或分析软件。
基因组或基因组学 如此处所用,属于“基因组学”指对基因及其功能的研究。基因组学强调在比较基因图谱、分子克隆、大规模限制图以及DNA测序和计算机分析方面的基础研究和应用研究的统一。遗传信息是应用基本技术来获取的,如DNA测序、蛋白质测序和PCR。
基因功能通过以下几点来确定1)分析正常发育健康的细胞、组织、器官或生物体基因中DNA突变的作用;2)分析DNA序列中编码的各种信号;以及3)研究由一个基因或一个相关基因系统产生的蛋白质。
蛋白质组或蛋白质组学 如此处所用,术语“蛋白质组学”,也称作“蛋白质组研究”或“非增殖部”,指在规定条件下基因组定量蛋白质表达模式。如通常所用,蛋白质组学指运用蛋白质生物化学高通量自动分析的方法。
有很多原因说明除了基因组研究外进行蛋白质组研究是必要的。首先,基因表达水平未必代表一个细胞中活性蛋白质的量。其次,基因顺序并不说明翻译后修饰,而后者对于一个蛋白质的功能和活性是必不可少的。再次,基因组本身并不说明上调或下调蛋白质水平的动态细胞过程。
蛋白质组课题是为鉴定一个细胞中的所有的蛋白质,起码确定分离出的蛋白质的部分氨基酸序列。总的来说,蛋白质先用2D凝胶或HPLC分离,然后用高通量质谱给肽或蛋白质测序。运用计算机分析质谱结果来联接一个基因与其编码的特定蛋白质。这整个过程有时称作“功能性基因组学”。许多商业风险公司现在提供蛋白质组学业务(例如,Pharmaceutical ProteomicsTM,The ProteinchipTM SystemfromCiphergen Biosystem;PerSeptive Biosystems)。
关于蛋白质组研究的综合信息,请参见,例如J.S.Fruton 1999,Proteins,Enzymes,Genes;The Interplay of Chemistry andBiology,Yale Univ.Pr.;Wilkins等1997,Proteome Research;New Frontier in Functional Genomics(Principles andPractice),Springer Verlag;A.J.Link,2-D Proteome AnalysisProtocals(Methodin Molecular Biology.112,Humana Pr.;Kamp等,1999,Proteome and Protein Analysis,Springer Verlag。
信号传导 如此处所用,“信号传导”,也称作“细胞信号传导”,指细胞接受外来信号,并在细胞内传递放大及指导它们的途径。信号途径需要蛋白质互通链以逐步的方式传递信号。蛋白激酶常参与这种级联反应,因为许多信号传递涉及接收胞外化学信号,其引发胞浆蛋白质磷酸化以放大该信号。
翻译后修饰 如此处所用,“翻译后修饰”是一个概括的术语用于涵盖当蛋白质作为初始多肽合成后所发生的改变。这些翻译后修饰包括,但不局限于,糖基化、去除N端甲硫氨酸(或N-甲酰甲硫氨酸),去除信号肽、乙酰化、甲酰化、氨基酸修饰、肽链内切以释放更小的蛋白质或多肽、磷酸化、以及甲硫氨酸修饰。
阵列或微阵列 如此处所用,“阵列”或“微阵列”指一种网格系统,其每一个位置或探针细胞为一个规定的核酸片段所占据。阵列本身也有时被称作“芯片”、“生物芯片”、“DNA芯片”或“基因芯片”。高密度DNA微阵列常在各种网格类型中含有成千上万的探针细胞。
一旦装配好的阵列,加入批(草药组合物),在批和阵列之间会发生某种形式化学过程,显示出对该阵列和批所特有的识别模式。放射性同位素标记批的放射自显影是一种传统的检测手段,但也可有其它选择,包括电子信号传导。
标记如 此处所用,术语“标记”,指施用某一特定批草药组合物于某一特定生物系统后,对该特定草药组合物进行的该特定生物系统所特有的任何以生物学为基础的测量和观察。术语“标记”包含对生物系统定量和定性的测量和观察。标记数据库由描述对草药治疗应答的基因表达模式的数据集组成,其中模式显示应答特定草药组合物时哪些基因开启、关闭、上调或下调。因此,“标记”指任何以生物学为基础的测量或观察,生物系统中上调、下调或临时调控、或表达水平的定性或定量改变用于描述生物系统对一种草药组合物的特异的生物反应。
施用于该生物系统的特定批草药组合物可以是未知的草药组合物、已知草药组合物或标准化草药组合物。用于完成本发明的标记的实例包括,但不局限于,分子标记、细胞遗传标记、生化标记或大分子标记。大分子标记包括,但不局限于,酶、多肽、肽类糖、抗体、DNA、RNA、蛋白质(翻译蛋白质和翻译后蛋白质)、核酸、多糖。
任何满足此处“标记”定义的标记对实施本发明适用。术语“标记”包括相关其它术语,例如“生物标记”或“遗传标记”或“基因标记”。为达到增加HBR阵列分辨力的目的,一个或多个一级标记可带有二级标记或一系列等级的标记。因此,所选分子标记可与其它各种分子标记、细胞遗传标记、生化标记或大分子标记结合以使HBR阵列更准确扩展。
一种分子标记包括一种或多种分子化合物的一种或多种微观分子,如DNA、RNA、cDNA、核酸片段、蛋白质、蛋白质片段、脂质体、脂肪酸、糖类和糖蛋白。
合适的分子标记的建立、形成及使用是本领域专业人员所熟知的。对分子标记鉴定特别有用的技术包括特异显示,逆转录聚合酶链式反应(PCR),表达的序列标志的大规模测序(ESTs),基因表达的连续分析(SAGE),蛋白质免疫印迹或蛋白质的二维、三维结构研究以及微阵列技术。分子标记技术领域的专业人员应熟悉这些技术的方法和用途(参见如,Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak,Molecular Biotechnology,Principles and Applications ofRecombinant DNA,Second Edition,ASM Press(1998);MathewR.Walker and Ralph Rapley,Route Maps in Gene Technology,Blackwell Science(1997);Roe等,DNA Isolation andSequenceing,John Wiley&Sons(1996);James D.Watson等,Recombinant DNA,Second Edition,Scientific Amerian Books(1992)。
DNA,RNA及蛋白质分离和测序的方法是本领域专业人员所熟知的。这些熟知的技术的实例可在以下书中找到:Molecular Cloning;A Laboratory Manual 2nd Edition,Sambrood等,Cold SpringHarbor,N.J(1989);Hanspeter Saluz and J.P.Jost,ALaboratoryGuide to Genomic Sequencing;The Direct Sequencing of NativeUncloned DNA(Biomethods Vol.1),Birkhauser(1998);and B.Roe等,DNA Isolation and Seauencing,Wiley(1996)。经典分子生物学技术的实例包括,但不局限于,体外连接,限制性核酸内切酶消化,聚合酶链反应,细胞转化,杂交,电泳,DNA测序,细胞培养等等。可购买的用于本发明的具体试剂盒和工具包括,但不局限于,用于RNA分离,PCR cDNA文库构建,逆转录病毒表达文库,载体,基因表达分析,蛋白质抗体纯化,细胞毒性测定,蛋白质表达和纯化,高通量质粒纯化的试剂盒和工具。(参见,例如,CLONTECHniquesProduct catalog,XIII(3),1-32(1998)or www.clontech.com;AtlasTM cDNA Expression Assays Product catalog(1998);SIGMAProduct catalog(1997)。
至于核苷酸阵列、微阵列、DNA芯片或生物芯片的讨论,方法学及应用,请参见,例如,英国专利号5,445,934,5,605,662,5,631,134,5,736,257,5,741,644,5,744,305,5,795,714;Schena等,平行人基因组分析:以微阵列为基础的1000个基因的表达监控,Proc.Natl.Acad.SCI.USA 93,10614-10619(1996);Derisi等,探索基因组规模的基因表达的代谢和遗传控制,Science 278,680-686(1997);Wodicka,等,Genome-wide在啤酒酵母中的表达监控Nature Biotechnology 15,1359-1367(1997);Pardee,全面的基因组表达监控:人类,NatureBiotechnology 15,1343-1344(1997);Schafer等,DNA变化及人类遗传学的未来,Nature Biotechnology 16,33-39(1998);DeRisi等,运用cDNA微阵列分析人类癌症的基因表达模式,NatureGenetics 14,457-460(1996);Heller等,用cDNA微阵列发现和分析炎症疾病相关的基因,Proc.Natl.Acad.SCI.USA 94,2150-2155(1997);Marshall等,DNA芯片:可能性的阵列,NatureBiotechnology 16,27-31(1998);Schena等,微阵列:功能基因组学的生物工程发现平台,Tibtech 16,301-306(1998);Ramsay,DNA芯片:本领域现状,Nature Biotechnology 16,40-44(1998);用高密度DNA阵列获取基因组信息Chee等,Science 274,610-614(1996);Chen等,应用带比色仪检测的cDNA微阵列系统描绘表达模式并分离特异表达基因,Genomics 50,1-12(1998);P.AndrewOutinen等,同型半胱氨酸应激诱导作用的鉴定,Biochem.J.332,213-221(1998);以及Gelbert等,遗传学真的将使药物发现过程发生革命性变化吗,Curr 0pin Biotechmol 8(6),669-674(1997)。
另外,运用于本发明的更具体的文献包括,但不局限于,那些阐明表达技术如ESTs的文献(参见,如,Mechael R.Fannon,在正常和疾病状态下的基因表达-治疗目标的鉴定,TIBTECH 14,294-298(1996);蛋白质形成图(见,如,Robinson等,前列腺癌酪氨酸激酶图谱,Proc.Natl.Acad.SCI.USA 93,5958-5962(1996);鉴定草药组合物成分的化学方法和光谱方法(Kojima等,来自Gliricidia Sepium的皂甙,Phytochemistry 48(5),885-888(1998));功能性抗原的确定(见,如抗原学,Nature Biotechnology16,305-307)1998);HPLCs(见,如,Milton T.W.Hearn(Editor),蛋白质,肽和聚核苷酸的HPLC:当代主题和应用(临床化学和试验手册中的分析技术),VCH Pub.(1991);电泳(见,如,Westermeier等,实践中的电泳:DNA和蛋白质分离方法及应用指南,John Wiley&Sons(1997);以及交叉反应标记测试(见,如,Irving Millman等,土拨鼠肝炎病毒:试验性感染和自然发生,Hepatology 4(5):817-823(1984)。结构基因组学:驾驶座上的生物信息学,NatureBiotechnology 16,625-627 Terry Gaasterland中讨论了应用结构基因组学解决完整的基因组编码的所有蛋白质的结构,其中方法学包括高通量直接结构确定和计算机方法。至于生物信息学方法学,请参见,例如,Andreas Baxevanis(Editor),生物信息学:基因和蛋白质分析实用指南,John Wiley&Sons(1998)和Luke Alphey,DNA测序:从实验方法到生物信息学(生物工程系列引言),SpringerVerlag(1997)。
细胞遗传参数包括,但不局限于,核型分析(例如,染色体相对长度,着丝粒位置,存在或不存在次级压缩),象征图(即,生物体核型的图解表示),有丝分裂和减数分裂时染色体行为,染色体的着色和带型,DNA-蛋白质相互作用(也称为核酸酶保护测试),中子散射研究,滚环(A.M.Diegelman and E.T.Kool,Nucleic Acids Res26(13):3235-3241(1998);Backert等,Mol.Cell.Biol.16(11):6285-6294(1996);Skaliter等,J.Viol.70(2):1132-1136(1996);A.Fire and S.Q.Xu.Proc.Natl.Acad.SCI.USA 92(10):4641-4645(1995),以及用放射性同位素标记核糖核苷酸培养后的整个细胞核的放射自显影。
生物化学的参数包括,但不局限于,具体途径分析,例如信号传导,蛋白质合成和运输,RNA转录,胆固醇合成和降解,糖生成以及糖酵解。
指纹分析 如此处所用,这里使用的术语“指纹分析”指制作一种物质的,尤其是草药的特征分布图用以鉴定它的一种手段。这里使用的“指纹图谱”指用于指纹分析的特定方法的结果的显示。
多种类型的指纹分析方法的例子包括,但不只限于,DNA指纹分析、蛋白质指纹分析、化学制剂指纹分析和足迹法。
DNA指纹分析,或特征分布图描绘,指制作来自特定生物学来源的(例如,特定的植物、植物的种、植物的属、植物部位或植物组织)DNA的独特模式的途径。DNA指纹图谱,或特征分布图,可用于区分特定生物学来源和不同生物学来源。通过使用微阵列、寡聚核苷酸阵列、DNA芯片或生物芯片分析批所获得的模式也称作“指纹图谱”。
蛋白质指纹分析指产生细胞、组织、器官或有机体,例如植物中的蛋白质的一种模式,这种模式在那时提供那种细胞、组织、器官或有机体的完全特征性指纹图谱。
化学制剂指纹分析指在细胞中的低分子量化学制品的分析和用于鉴定细胞、组织、器官或有机体,例如植物的结果模式。通常使用气相色谱(GC)、HPLC或质谱来进行分析。
足迹法指发现两个分子如何粘在一起的方法。就DNA来说,蛋白质结合在被标记的DNA片段上,接着DNA通过酶或化学药品攻击而降解。这一过程产生了各种大小的“梯形分布”的片断。DNA在被结合蛋白质保护的部位降解较少,因此“梯形分布”看起来较模糊。足迹法是用于定位调控基因活性的蛋白质实际结合在DNA上的部位的一种普通技术。
用于完成每项指纹分析的手段或方法在这里的别的地方详细描述。
生物反应 如此处所用,“生物反应”指在施用草药组合物之后对生物系统的生物学反应的任何观察或测量。有时这里也称作“生物学效应”。生物反应是指特定草药组合物的生物学活性的定性或定量数据。生物反应数据包括剂量和时间信息,其中这样的信息为生物系统之于多种处理的测量反应的领域的技术人员所熟知。因此,生物反应数据包括关于在特定时期以特殊的方式施用草药组合物的特定剂量于特定生物系统的特定的生物学反应的信息。
生物反应包括,但不只限于,生理学反应、形态学反应、认知反应、动机反应、自主反应和转录后修饰,例如信号转导的测定。许多草药组合物显示了多于一种的生物反应(例如,见,Kee Chang Huang,中药药理学,CRC出版社(1993)。一些特殊的生物反应可以包含在多于一种的被描绘的组中或具有包括多于一个组的反应的方面或成分。适用于本发明的生物反应为本领域技术人员所熟知。下面的参考文献是本领域技术状况的代表:Kee Chang Huang,中药药理学,CRC出版社(1993);Earl Mindell.Earl mindell’s Herb Bile,Simon&Schuster(1992);Goodman&Gilman’s治疗学的药理学基础,第九版,Joel G.Hardman,等(eds),McGraw Hill,Health ProfessionsDivision(1996);P.J.Bentley,药物作用的药理学入门要素,剑桥大学出版社(1981);P.T.Marshall and G.M.Hughes,哺乳动物和其它脊椎动物生理学,第二版,剑桥大学出版社(1980);传染性疾病委员会报告,American Academy of Pediatrics(1991);Knut Schmidt-Nielsen,动物生理学:适应和环境,第五版,剑桥大学出版社(1997);ElainN.Marieb,人体解剖学和生理学,Addisib-WessleyPub.Co.(1997);William F.Ganong,医学生理学综述(第18版),Appleton & Lange(1997);Arthur C.Guyton and John E.Hall,医学生理学教科书,W.B.Saunders Co.(1995)。
“生理学反应”指与生物系统的生理学,或功能相关的任何特性。细胞、组织或器官水平的生理学反应包括,但不只限于,温度,血液流速、脉率、氧浓度、生物电位、pH值、胆固醇水平、感染状况(例如,病毒的、细菌的)和离子流。整个有机体基础的生理学反应包括肠胃功能(例如,溃疡、胃疼、消化不良、胃灼热),生殖道功能(例如,基于生理学的阳痿、子宫痉挛、痛经),排泄功能(例如,泌尿道问题、肾疾病、腹泻、便秘),血液循环(例如,高血压、心脏紊乱),耗氧,骨骼健康(例如,骨质疏松),软骨和结缔组织情况(例如,关节疼痛和关节炎),运动,视力(例如,近视、视觉缺失),肌肉紧张(例如,消瘦综合症、肌肉劳损),疼痛的存在和消失,表皮和真皮的健康(例如,皮肤刺激、瘙痒、皮肤创伤),内分泌系统功能,心脏功能,神经协调,头部相关的健康(例如,头疼、头晕),年龄(例如,寿命、长寿),呼吸(例如,充血、呼吸疾病)。
“形态学反应”指在施用草药组合物之后生物系统的任何关于形态学或形态和结构的特性。形态学反应,无论生物系统的类型,包括,但不只限于,规模、重量、高度、宽度、颜色、发炎程度、一般外观(例如,不透明性,透明性,苍白)、干湿程度、有无癌性生长的存在和有无寄生虫和害虫(如,老鼠、虱、跳蚤)的存在。以整个有机体为基础的形态学反应包括,但不只限于,毛发生长的量和部位(例如,多毛症,脱发),是否有皱纹存在,指甲和皮肤生长的类型和程度,污溃凝固程度,是否有溃疡和伤口存在和是否有痔疮存在。
认知反应指在施用草药组合物之后生物系统的任何关于认知的,或意识状态的特性。认知反应包括,但不只限于,感觉、识别、构思、判断、记忆、推理和想象。
“动机反应”指在施用草药组合物之后生物系统的任何关于促动,或诱导作用的特性。动机反应包括,但不只限于,情绪、(例如,高兴),欲望,学习动力,特殊的生理需求(例如,食欲、性欲)或相似的作为刺激去行动的冲动(例如,精力,性欲)。
“自主反应”指在施用草药组合物之后生物系统的任何关于自主反应的特性。自主反应涉及生物系统的自主神经系统。自主神经反应的例子包括,但不只限于,无意识的功能,(例如,神经过敏,恐慌发作),或生理需求(例如,呼吸、心律,激素释放,免疫反应,失眠,发作性催眠)。
用多种草药组合物或草药成分处理的细胞、组织、器官和整个有机体的生物反应为草药领域技术人员所熟知。例如,草药组合物Sairei-to(TJ-114),alismatis根茎(日本名字为‘Takusha’)和hoelen((日本名字为‘Bukuryou’)每一个都已发现具有抑制大鼠的内皮素-1的合成和表达(Hattori等,Sairei-to可以抑制内皮素-1在肾小球中的的合成,Nippon Jinzo Gakkai Shi 39(2),121-128(1997))。用草药药物小柴胡汤处理培养的人表皮角质细胞显著地促进了白细胞介素(IL)-1α产生(Matsumoto等,用小柴胡汤培养的人角质细胞的白细胞介素-1调节的自分泌生长增强,JpnJ.Pharmacol 73(4),333-336(1997)。小柴胡汤加入到从健康自愿者获得的外周血的单核细胞培养物中导致了剂量依赖的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)产生的增加(Yamashiki等,草药药物“小柴胡汤”在体外诱导外周血单核细胞的粒细胞集落刺激因子的产生,J ClinLab Immunol37(2),83-90(1992))。这些研究者推断小柴胡汤对治疗与G-CSF有关的慢性肝病、恶性疾病和急性感染疾病可能有用。在用从中草药黄芪中纯化的皂甙astragaloside IV(AS-IV)处理脐静脉内皮细胞(HUVECs)之后I型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)-特有mRNA表达降低,而组织型纤溶酶原激活剂(t-PA-1)特有mRNA表达升高(Zhang等,培养的人脐静脉内皮细胞调节纤维蛋白分解潜力:astragaloside IV下调I型纤溶酶原激活物抑制剂和上调组织型纤溶酶原激活剂的表达,J Vasc Res 34(4),273-280(1997))。发现一种从人参的根中分离出的四种成分之一的成分是人单核细胞和THP-1细胞产生IL-8的有效的诱导物,这一诱导伴随着IL-8mRNA表达的增加(Sonoda等,来自人参根的酸性多糖对白细胞介素-8产生的刺激,Immunopharmacology 38(3),287-294(1998))。通过流式细胞分析,发现用Kampo-草药药物-Toki-shakuyakusan(TSS)处理增加了巨噬细胞Fcγ11/111受体和补体受体3(CR3)的表达(Cyong,来自Kampo-草药药物的BRM,NipponYakurigaku Zasshi110 Suppl 1,87P-92P(1997))。使用计算机图像分析,Chen等,(在MRI/1pr鼠中细胞粘连分子-1表达的图像分析:中草药的作用,Chung Hua I Hsueh Tsa Chih 75(4),204-206(1995))发现在用中草药stragalin处理后,在MRI/1pr鼠中细胞粘连分子-1(ICAM-1)、免疫球蛋白和C3的分布强度显著降低。Western印迹分析表明从自然中草药药物中分离的汉防己碱抑制在鼠的肺泡巨噬细胞中信号诱导的NF-κB的活化(Chen等,汉防己碱抑制在大鼠的肺泡巨噬细胞中信号诱导的NF-κB的活化,Biochem Biophys Res Commun 231(1),99-102(1997))。
算法 如此处所用,“算法”指逐步地问题解决程序,尤其是具有有限步数的确定的、递归计算的程序。用于植物相关的、标记和生物反应的数据的二维和三维分析的适当的算法为在计算领域的技术人员所熟知。这样的算法对于构建本发明的草药生物反应阵列是有用的。对于一般的关于算法的信息,见,例如,Jerrod H.Zar,生物统计学分析,第二版,Prentice Hall(1984);Robert A。Schowengerdt,Techniques for image processing and classification in remotesensing,Academic Press(1983);Steven Gold等,用于2-维和3-维点匹配的新算法:姿态估定和相符,Pattern Recognition,31(8):1019-1031(1998);Berc Rustem,Algorithms for NonlinearProgramming and Multiple-Objective Decisions,Wiley-Interscience Series in Systems and Optimization,JohnWiley&Sons(1998);Jeffrey H.Kingston,Algorithms and dataStructures:Design.Correctness.Analvsis.InternationalComputer Science Series,Addison-Wesley Pub.Co.(1997);StevenS.Skiena,The Algorithm Design Manual,SpringerVerlag(1997);and Marcel F.Neuts,Algorithm Probability:ACollection of Problems(Stochastic Modeling),Chapman&Hall(1995)。对于应用于以遗传为基础的数据的算法的更具体的信息,见,例如,Dan Gusfield,Algorithms on Strings,Trees,andSequences:Computer Science and Computational Biology,Cambridge University Press(1997);Melanie Mitchell,AnIntroduction to Genetic Algorithms(Complex AdaptireSystems),MIT Press(1996);David E.Goldberg,GeneticAlgorithms in Search,Optimization and Machine Learning,Addison-Wessley Pub. Co.(1989);Zbigniew Michalewicz,Genetic Algorithms+Data Structures=Evolution Programs,Springer Verlag(1996);Andre g. Uitterlinden and Jan Vijg,Two-Dimensiomal DNA Typing:A Parallel Approach to GenomeAnalysis,Ellis Horwood Seres in Molecular Biology,EllisHorwood Ltd.(1994);and Pierre Baldi and Soren Brunak,Bioinformatics:The Machine Learning Approach(AdaptiveComputation and Machine Learning),MIT Press(1998)。
组合化学。如此处所用,“组合化学”指用于创造成百上千个化合物的数目众多的技术,其中,每个化合物具有一个或多个不同的特征,例如,它们的形状、电荷、和/或疏水特性。组合化学可用来产生草药或草药组合物的化学变异体的化合物。这样的化合物可用本发明的方法评价。
基本的组合化学的概念为化学领域的普通技术人员所熟知并且也可在Nicholas K.Terrett,Combinatorial Chemistrv(OxfordChemistry,Masters),Oxford Univ.Press(1998);AnthonyW.Czarnic and Sheila Hobbs Dewitt(Editors),APractical Guideto Combinatorial Chemistry,Amer.Chemical Society(1997);Stephen R.Wilson(Editor)and Anthony W.Czarnik(Contributor),Combinatorial Chemistry:Synthesis andApplication,John Wiley&Sons(1997);Eric M.Gordon and JamesF.Kerwin(Editors),Combinatorial Chemistry and MolecularDiversity in Drug Discovery,Wiley-Liss(1998);Shmuel Cabilly(editor),Combinatorial Peptide Library Protocols)Methodsin Molecular Biology),Human Press(1997);John P.Devlin,High Throughput Screening,Marcel Dekker(1998);Larry Goldand Joseph Alper,通过组合化学跟上基因组学的步伐,NatureBiotechnology 15,297(1997);Aris Persidis,组合化学,NatureBiotechnology 16.691-693(1998)中找到。
实施例
实施例1.建立一个选定草药组合物的标准化HBR阵列。
图1提供了建立一个标准的HBR阵列的基本方案。图解的每个成分的定义由上述文字提供。
在选择了目的草药组合物之后,收集与草药组合物多种特性相关的数据,包括但不只限于植物相关特性、标记和生物反应信息。
植物相关数据包括,但不只限于,植物的种,特定的植物部位,草药组合物中植物的地理产地,植物的生长条件,用于制备草药组合物的加工方法,贮藏方法和条件,草药组合物的各种化学分析。标记信息包括施用草药堆肥于一个生物系统之后收集的标记的定性和定量数据。适用的标记包括,但不只限于分子标记,细胞遗传学标记,生物化学标记和大分子标记。生物反应信息包括施用草药组合物于一个生物系统之后收集的生物反应的定性和定量数据。
每种类型的数据(例如,化学,标记,生物反应)都可以使用一种或多种对相同的,相似的,基本上相似的,或不同批的感兴趣的草药组合物的分析来获得。这样不同的分析可以在相同的或不同的时间进行。另外,可以在相同的或不同的时间收集相同或不同的标记的数据。类似地,可以在相同的或不同的时间收集相同或不同的生物反应的生物反应数据。这样HBR阵列数据的收集或者是在一个时间收集或者是在连续发展的基础上收集。给生物系统施用草药组合物以便于收集数据,根据草药组合物的施用剂量和处理时间记录信息。生物反应数据也可以包括转录后修饰,如信号转导的测量。
在收集了一种或多种类型的数据之后(例如二种或多种的标记的和生物反应的数据;植物相关特性的数据和生物反应数据),使用算法分析数据以便产生2-和/或3-维草药生物反应阵列。
各种统计学参数可以被计算用于HBR阵列并且可以成为HBR阵列数据集的一部分。这些统计学参数可以包括,但不只限于,平均值,标准偏差,相关或相配(或不相配)矩阵,比率,回归系数,和变换值(即原始数据的反正弦百分率变换)。这样,HBR阵列可以包括原始数据和某些计算出来的结果,分布,图解描述和与原始数据相关的其他数据的操作。这种信息的特定的例子包括,但不只限于,数字图像,散射图,集束分析和标记数据的大规模基因表达图。
全部积累的数据和组合分析构成了用于建立HBR阵列数据集的特定的草药组合物的标准化HBR阵列。由于用于建立和维持草药组合物HBR阵列过程的可重复性,因此这种分析即可被看作在一段时间内的任一个时间点上时静态的也可被看作在经过的一段时间中是动态的。
结果分析能鉴定与任何特定草药组合物的一种或多种特定的生物学活性相关的(正的或负的)或有联系的(即,显示总的趋势)标准化的HBR阵列的子集。
实施例2.建立批草药组合物的批HBR阵列
图2提供了建立批草药组合物的HBR阵列的基本方案。图解的每个成分的定义由上文提供。建立这样一个阵列的过程与紧接着的上文对标准化的HBR阵列的阐述相同。
通常,批HBR阵列需收集的数据量将少于建立标准化的HBR阵列需收集的数据量。但是,收集的批草药组合物的数据可以被添加到已建立的HBR阵列中或用于建立一个新的标准化的阵列。
通常,已经收集到的与被测试的草药组合物所期望的生物学活性高度相关或相联系的数据是收集的批草药组合物最好的数据。例如,如果已确定植物相关的特定的子集和标记数据与特定的草药组合物(基于标准化的HBR阵列数据和上述讨论的分析)所期望的生物学活性高度相关,那么为了确定这批是否具有期望的生物学活性,只需要测试那种特性子集的批草药组合物。通过比较从批中获得的那种特性的子集的数据(即,批HBR阵列)和那个特定草药组合物的标准化的HBR阵列,本领域技术人员能确定特定的批是否具有期望的生物学活性。
实施例3.建立和使用主要数据集。
图3提供了建立和使用草药组合物主要数据集的基本方案。图解的每个成分的定义由上文提供。
第一步是建立选定的草药组合物或批草药组合物的主要数据集。这可通过施用草药组合物于生物系统并收集将构成主要数据集的相应的标记信息来完成。通常,但不是偶然,主要数据集将包括阵列形式的基因组学和/或蛋白质组学数据,例如用DNA芯片获得的阵列。
下一步,分析主要数据集来看一看是否已经获得了被测草药组合物的特异表达/结果。特异表达/结果对于在下一步产生有意义的算法是必须的。这种特异表达/结果的例子包括,但不只限于,在对施用的草药组合物做出反应时某种基因是上调还是下调或在对施用做出反应时某种蛋白质的水平是已经得到升高或是已经得到降低的指标。
如果没有获得有意义的或有用的特异表达/结果,那么重复施用和标记收集步骤是必须的。如果确信实验误差导致了第一次缺乏足够的结果,就用与第一次相同的所有变量(例如,相同的生物系统,相同的标记集,相同的实验方法等)来重复施用/数据收集步骤。但是,为了获得特异的表达/结果必须改变生物系统取样(例如,使用的细胞类型,细胞生长的阶段),使用不同的标记集和/或改变实验方法。
实施例4.使用HBR阵列信息
这里讨论的HBR阵列信息能用于包括,但不只限于,下面内容的许多不同的目的:1)评价草药组合物的成分;2)预测草药组合物的生物反应;3)确定哪种标记信息与草药组合物的特定生物反应的相关性最强;3)确定什么样的信息数据集(即,植物相关数据,标记数据,和生物反应数据)与草药组合物的特定的生物反应最相关;4)确定那种生物系统最适于评价草药组合物的生物学活性;5)调整或改变草药组合物的成分使得那种草药组合物的HBR阵列符合相同的或基本上相同的草药组合物的标准化的HBR阵列;6)调整或改变草药组合物的成分使得草药组合物具有期望的生物学活性;7)产生和更新标准化的HBR阵列;8)鉴定具有草药组合物期望的生物学活性的特定的成分(例如,植物部位,蛋白质,分子);9)当维持或改善草药组合物期望的生物学活性的时候,确定那种草药组合物的成分可以被去除;10)鉴定草药组合物的一种或多种以前未知的生物学活性;11)帮助设计包括草药和非草药成分的治疗,例如化学合成药物或制剂并且12)利用HBR阵列信息来补充设计治疗的组合化学方法。本发明的每个实施方案可由本领域技术人员使用这里提供的方法和工具来完成。
实施例5.质量控制。
本发明的HBR阵列技术可用于使草药组合物(单一草药或配方中的多种草药)的特定批与标准化的、或主要的、相同或基本相似的草药组合物的批相互关联或确定其基本上相等。在此过程中使用的HBR阵列包括每个生物效应(即,生物反应)量变可接受的范围,和包括由分配给每个生物效应的加权值组成的可能的综合比数,其可以包括来自生物系统的多种生物化学途径的标记。
“数据甄选”指用于确定或选择哪个生物效应的子集是在任一特定HBR阵列中所需要的生物效应的最小量的过程。数据甄选的信息得自于以剂量依赖的方式施用标准化的草药组合物于生物系统(例如,一种细胞系)以建立标准化的HBR阵列。接着这一标准化的HBR阵列可与为测试草药组合物而建立的多种HBR阵列相比较。这些被测试的草药组合物包括,但不只限于,在不同时期制备的不同的批;从在不同时间收集的未经加工的草药中制备的不同的批;和从在不同地点收集的生药中制备的不同的批。
实施例6.改善草药组合物或鉴定草药组合物的新用途。
HBR阵列是通过将一个配方的单个草药的提取物或者整个配方的提取物施用于生物系统,并且检测提取物的生物学效应而产生的。观察到的生物学效应可以来自生物系统的多个生物化学途径和/或来自一个动物的多个组织,其中评价了多种标记的相应的质和/或量的改变。得到的HBR阵列可与新的HBR阵列或与来自不同草药组合物或来自由不同的加工方法制备的草药组合物的相似的HBR阵列相比较。这一过程对于选择生物学效应给定的集和预测给定的批草药组合物具有生物学效应的给定的集所需要的最小量的标记是有用的。
为了构建HBR阵列,本领域技术人员使用包括,但不只限于,统计分析、人工智能、和关于神经行为数据库研究的多种数据甄选工具。所选的统计方法包括,但不只限于,基本探索性数据分析(EDA),图解的EDA(例如bushing)和多元探索性技术(例如,簇分析、差别因素分析、依据非线性回归的逐步线性、分类树)(见,例如,STATISTICATM,来自StatSoft的软件包,Tulsa,OK 74104;Tel:918-749-1119;Fax:918-749-2217;www.statsoft.com)。
使用数据甄选工具来探索大量的HBR阵列数据在多种HBR阵列之内、之间或之中寻求构建HBR阵列和寻找一致的模式。此过程包括探索、HBR阵列构建,和证实。这一程序一般是迭代重复直到鉴定了一个有说服力的HBR阵列、或标准化的HBR阵列。
因为修饰对本领域技术人员将是明显的,因而先前已给出的详述只是为了理解清楚,并且其中没有应该被理解的非必须的限制。
虽然我们在描述此发明时总是与具体的实施方案联系在一起,但是并不是说我们不能对它有进一步的改进。一般来说,只要遵守此发明的原理,考虑到此发明与当前已知和惯常的使用间的区别,我们就可以使之有多种用途,适用于不同变化。同时,此发明除了具有先前提及的各种功用,亦可在接下来附加权利要求书的范围内使用。
实施例7.建立人参配方的标准化的HBR阵列
为了这一实施例的目的,选择的标准人参是人参G115(PanaxGinseng C.A.Meyer G115)生长在满洲或者是在朝鲜。生长的气候是在-10至+10℃之间,具有50-100cm的年降雨量(见Huangd的中草药药理学(The pharmacology of Chinese Herbs),(1993)pp21-45,CRC出版社,Boca Raton,FL,全文完全引用作为参考)。首先通过地理产地、种、植物部位(例如,根茎、根、叶皮、种子、芽和花);生长条件、加工方法和在加工前和加工后的贮藏条件来描绘人参批的特性。将通过定性HPLC分析进行这些批的化学成分的核实以确定人参皂甙(例如,Ro、Ra1、Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rg1、Rg2、Rd、Re、Rf、Rh1、Rh2、NG-R2和Z-R1),包括亲脂性成分的TLC定性分析(见,Elkin等,Chumg Kuo Yao Li Hsueh Pao(1993)14:97-100和Yoshikawa等,Yakugaku Zasshi(1993)113:460-467)。不同草药的皂甙含量依据种应在2.1和20.6%(依据重量)之间(见表1)。接着将这些数据贮存在优选计算机处理器的存储器中,以备进一步操作。
表1.不同人参草药的皂甙含量*。
*选自Huang的中草药药理学,(1993)pp21-45,CRC出版社,BocaRaton,FL
种 | 总皂甙(%以重量) |
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)西洋参(Panax quiquefolius)三七和竹节参(Panax notoginseng andPanax japonica)Panax japonica var.major | 2.1-4.4%4.9%13.6-20.6%9.34% |
标准人参(即,G115)的表达的生物标记包括下面内容:IL-8、IL-2、GM-CSF、NfiB、ICAM-1、γ-干扰素、乙酰胆碱转移酶、trk A、神经生长因子(Kim等,植物药(Planta Med)(1998)64:110-115;Sonoda等,免疫药理学(Immunopharmacology)(1998)38:287-294;Baum等,欧洲应用生理学杂志(Eur J Appl Physiol)(1997)76:165-169;Iwangawa等,自由基生物药物(FreeRadic Biol Med)(1998)24:1256-1268;Rhind等,欧洲应用生理学杂志(1996)74:348-360)。可供选择地,对于更大的批规模,可使用Affimatrix的400,000个寡聚核苷酸组/cm2的芯片(U.S.Pat.NO.5,556,752)。通过使用或者光刻法、机械显微加点法或者墨汁喷射法的cDNA微阵列技术来制备标准人参的表达生物标记(见,Schena等,TIBTECH(1998)16:301-306)。在不同的时期不同的条件下施用标准人参于被选定的细胞的集以产生多个微阵列集。接着运用以杂交为基础的,通过从在微阵列上的每个位置上的荧光强度中扣除定态的mRNA水平的生化提取物的表达监控来分析微阵列集(Schena等,科学(Science)(1995)270:467-470;Schena等Proc Natl Acad SciUSA(1996)93:10614-10619;Lockhart等,Nat Biotechnol(1996)14:1675-1680;DeRisi等,Nat Genet(1996)14:475-460;Heller等,Proc Natl Acad Sci USA(1997)94:2150-2155)。然后将阵列数据输入到算法中以产生标准人参的统计学的表达生物标记值。标准人参的生物化学的生物标记包括定量分析放线菌酮敏感的[3H]-亮氨酸按比例掺入到蛋白质合成的增加和有丝分裂反映的[3H]-胸腺嘧啶掺入的增加。(见Yamamoto等,Arzneimittelforschumg(1997)27:1169-1173)。对于生物化学的生物标记,在[3H]-胸腺嘧啶存在时(对于DNA合成)或在放线菌酮存在和[3H]-亮氨酸不存在时(对于蛋白质合成)在不同时期不同条件下施用标准人参于骨髓细胞来进行生物化学的生物标记的多种定量分析(即,BBM集)。然后把BBM集输入到算法中以产生标准人参的统计学的生物化学的生物标记值。接着将统计学数据贮藏在优选计算机处理器的存储器,以备进一步操作。
使用细胞或整体动物来确定生物系统的生物化学反应(即,生物反应)。对于细胞而言,将以0.5mg/ml-100mg/ml的浓度施用人参批于特定的细胞型,包括,但不只限于,成纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞、PMNL、LAK细胞、B16-F10黑素瘤细胞、THP-1细胞和海马神经元。对于动物治疗,以0.5-100mg/kg的浓度经口服、腹腔注射或皮下注射施用人参提取物。
为确定生物系统对标准化的人参的生物化学反应,将人卵巢癌细胞接种到裸鼠中,其导致可触知肿瘤的形成。在肿瘤形成后一起施用顺铂和标准人参来治疗小鼠。根据血细胞比容值和体重检查鼠的肿瘤生长抑制、存活时间的延长和降低的副作用(Nakata等,日本癌症研究杂志(Jpn J Cancer Res)(1998)89:733-740)。使用多种浓度的标准人参来重复分析以产生每个变量的集中趋势、分散作用和变异性的方法。
然后将所收集的数据进行多维分析以产生多元正态分布集作为确定生物活性和标准人参之间基线相关性的方法。(见Zar,J.H.,的生物统计分析(Biostatistical Analysis),第二版(1984),pp328-360,Prentice Hall,Englewood Cliffs,NJ)。生物系统对标准人参生物反应的第二个独立的测定是在运动锻炼期间标准人参对体育行为的作用。用标准人参以不同的浓度(0.5-100mg/kg/天)治疗大鼠4天,并且检测动物增加的血浆自由脂肪酸水平和在大约以70%V02max的锻炼期间葡萄糖水平的维持(见Wang等,植物药(1998)64:130-133)。收集产生的数据,接着进行多维分析来产生多元正态分布集作为确定生物活性和标准人参之间基线相关性的方法(见Zar,J.H.,的生物统计分析(Biostatistical Analysis),第二版(1984),pp328-360,Prentice Hall,Englewood Cliffs,NJ,这里,全文完全引用作为参考)。然后将每个生物反应的分布集输入到算法来产生标准人参的统计学值。接着贮存统计学数据,优选计算机处理器的存储器,以备进一步操作。
反复重作这些步骤中的每一步(即,化学分析、生物标记信息的产生和生物系统生物反应的测定)以产生大规模的统计学值的数据库。编辑这些数值并输入到算法中以产生2-和3-维标准化的人参的草药反应阵列(HBR阵列)。通过反复重做,获得的阵列(即,标准化的阵列)显示了在组合物(包括生长条件)、生物标记信息和标准化的人参的生物反应之间的最高相关性。通过在用于测试的批HBR阵列中的显示数据,运用确定组合物二个或多个已知相关的变量和生物标记信息值,通过比较相对于标准化人参的标准化HBR阵列值的测试值可预测测试的批生物学反应的变量值。获得的预测可用于评价给定的人参批的质量而不必使用观察到的生物系统的生物学反应(见实施例2)。
实施例8.使用与特定生物学反应相关的变量的子集来评价被选定的人参草药组合物
为了评价测试的批草药组合物的质量,首先收集在选定的草药组合物中关于草药的植物相关参数的数据(例如,植物的种,植物的部位,地理产地,生长条件,加工方法,贮藏条件)。然后处理被选定的草药组合物以便能进行化学分析来测定草药的化学含量(见Elkin等,中国药理学报(Chumg Kuo Yao Li Hsueh Bao)(1993)14:97-100和Yoshikawa等,Yakugaku Zasshi(1993)113:460-467)。先前获得的人参的数据已显示了在需氧运动行为期间的耗氧和皂甙组合物,尤其是Rg1和Rb1的子集之间存在的强相关性(Wang等,植物药(1998)64:130-133)。
接着以0.5mg/ml至100mg/ml的浓度将测试批施用于测试的细胞,其包括,但不只限于,成纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞、PMNL、LAK细胞、B16-F10黑素瘤细胞、THP-1细胞和海马神经元以确定表达生物标记值。mRNA从被施用后的细胞中分离,随后其被操作作为基于杂交的生物化学提取物表达监控的底物,其使用包括IL-8、IL-2和γ-干扰素cDNA的微阵列。(Schena等,科学(1995)270:467-470;Schena等,Proc Natl Acad Sci USA(1996)93:10614-10619;Lockhart等,Nat Biotechnol(1996)14:1675-1680;DeRisi等Nat Genet(1996)14:457-460;Heller等,Proc Natl Acad SciUSA(1997)94:2150-2155)。先前获得的人参数据已经显示了在有氧运动行为期间的耗氧和在测试的细胞中表达生物标记IL-8、IL-2和γ-干扰素的诱导之间的强相关性(Venkatraman等,Med Sci SportsExerc(1997)29:333-344和Wang等,植物药(1998)64:130-133)。对于生物化学的生物标记,接着施用测试的批于大鼠骨髓细胞并且分析反映有丝分裂的[3H]胸腺嘧啶的掺入。先前获得的人参的数据已经表明Rb1和Rg1与在大鼠骨髓细胞中的DNA的合成显示了强相关性(Yamamoto等,Arzneimittelforschung(1978)28:2238-2241)。
在反复重做分析之后,将来自每个分析的数据输入到算法中,在列举的包括化学分析、和涉及生物标记子集的数据的植物相关数据的基础之上以产生被选定的草药组合物的测试HBR阵列。通过比较测试的HBR和指导上述观察资料和子集分析的标准人参的标准化HBR阵列的变量来确定测试批的质量。其中在体外IL-2、IL-8和γ-INF的mRNA诱导的证明和掺入到鼠骨髓细胞中的[3H]-胸腺嘧啶增加(包括收集的关于生长条件、产地,和皂甙Rg1和Rb1的证实的数据)预示了象标准人参显示的那样的关于耗氧的测试批的等价生物反应效应。基于这一过程可确定测试的批与给定的生物学反应或目的生物学反应的标准相比是否具有相似的或不同的特性。
实施例9.建立Huang Ling(HL)配方的标准化的HBR阵列。
为了这一实施例的目的,被选择的标准huang ling(HL)是产自西南亚的黄连,其中生长条件为本领域技术人员所熟知(见Huang的中草药药理学,(1993)pp69和287-288,CRC出版社,BocaRaton,FL)。通过定量化学分析确定黄连干根茎的化学含量如砷、小檗碱、蛙皮素酸、非洲防己碱、copsine、黄连次碱、coptiside-I、coptiside-II、黄连碱、考雷明、表小檗碱、阿魏酸、greenlandicine、异黄连碱、光暗酸、木兰花碱、oxybererine、thalifendine、伞花碱、urbenine、worenine、巴马亭、药根碱和colubamine(又见ZhuM.,中药通报(Chung Yao Tung Pao)(1984)9:63-64)。不同草药的生物碱berberine应在7-9%之间(依据重量)。将这些数据贮存,优选计算机处理器的存储器,以备进一步操作。
标准HL的表达标记包括如下内容:NfκB;bc1-2类似物、A1;锌指蛋白、A20;IL-2受体;细胞周期探针;c-Ki-ras2;生长调节子探针和依赖凋亡探针的糖皮质激素受体(见Chi等,生命科学(1994)54:2099-2107;Yang等Naunyn Schmiedebergs ArchPharmacol(1996)354:102-108;Miura等,生化药理学(BiochemPharmacol)(1997)53;Chang K.S.,J Formos Med Assoc(1991)90:10-14)。可供选择地,对于更大的批规模,可使用Affimatrix的400,000个寡聚核苷酸组/1.6cm2的芯片(U.S.Pat.No.5,556,752)。通过如实施例1所描述的微阵列技术来制备标准HL的表达标记,包括分析和统计学数据的产生。
标准的HL的生物化学的生物标记包括糖皮质激素的增加和在施用了HL的HepG2细胞中α-feto蛋白质分泌的抑制(见Chi等,生命科学(1994)54:2099-2107)。按实施例1中所述的那样产生和分析BBM集。接着贮存统计学数据,优选计算机处理器的存储器,以备进一步的操作。使用细胞和整体动物来确定生物系统的生物学反应。将被选定的草药组合物的批以0.1-100mg/ml的浓度施用于特定的细胞型,包括,但不只限于,人HepG2肝癌细胞、人胚胎性癌细胞和胸腺细胞。经口、腹膜内注射或皮下注射施用0.1mg-2g/kg的科普特人的草药组合物(即,HL)用于动物治疗。为了确定生物系统对于标准化HL的生物学反应,施用各种浓度的标准HL给人胚胎性癌克隆、NT2/D1并且检查分化成具有神经元样细胞形态细胞的细胞(ChangK.S.,J Formos Med Assoc(1991)90:10-14)。重复分析以产生度量标准并且按实施例1中所描述的人参那样进行分析。生物系统对于标准HL的生物学反应的第二个独立的测定将是标准HL的对于由有肠毒素的大肠杆菌(ETEC)引起的腹泻的效应。用各种浓度的HL(例如,2g/kg)治疗患有由于ETEC的活性腹泻的患者并且测定粪便的体积(见,例如,Rabbani G.H.,Dan Med Bull(1996)43:173-185)。重复分析以产生度量标准并且按实施例1中所描述的人参那样进行分析。然后将每个生物学系统的分布集输入到算法中以产生标准HL的统计学值。接着贮存统计学数据,优选计算机处理器的存储器,以备进一步的操作。
最后,按实施例1中所述,反复重做这些步骤以产生标准化的HL的HBR阵列。其中获得的HBR阵列接着将被用于预测生物学活性和评价批特性。使用这一方法,可产生标准化的HBR阵列并定期更新。
实施例10.使用与特定生物学反应相关的变量的子集评价被选定的Huang Ling草药组合物
为了评价被选定的Huang Ling草药组合物测试批特性,首先收集关于植物相关特征(例如,植物的种、植物部位、地理产地、生长条件、加工方法和贮藏条件)的数据。接着处理草药组合物以便能进行化学分析来确定组合物的化学含量(也见Zhu M.,中药通报(1984)9:63-63)。
先前获得的HL数据已经表明人胚胎性癌克隆末端分化成神经元样细胞与小檗碱的存在具有强相关性(见Chang K.S.,JFormos MedAssoc(1991)90:10-14)。然后将测试的批以非毒性浓度(其可由普通技术人员来确定)的起始浓度施用于包括人胚胎性癌克隆、NT2/D1的测试细胞。mRNA从被施用的细胞中分离,其随后经过操作来作为使用包括IL-2受体和NfκB的微阵列的生物化学提取物的基于杂交的表达监控底物(见Chi等,生命科学(1994)54:2099-2107;Yang等Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol(1996)354:102-108;Miura等,生化药理学(Biochem Pharmacol)(1997)53;Chang K.S.,J Formos Med Assoc(1991)90:10-14;U.S.Pat.No.5,556,752),并且其可用于确定上述细胞的c-Ki-ras2基因表达的下调。先前获得的HL的数据已经表明了人胚胎性癌克隆末端分化成神经元样细胞与促细胞分裂剂探针的诱导和c-Ki-ras2基因表达下调高度相关(见Chang K.S.,J Formos Med Assoc(1991)90:10-14)。
对于生物化学标记,给HepG2细胞施用测试组合物并且分析细胞的糖皮质激素受体的增加和α-feto蛋白质分泌的抑制(见Chi等,生命科学(1994)54:2099-2107)。先前获得的HL数据已经表明糖皮质激素诱导凋亡的抑制与小檗碱型生物碱高度相关(Miura等,生化药理学(Biochem Pharmacol)(1997)53:1315-1322)。在反复重做分析后,将来自每个阵列的数据输入算法来产生建立在列举的观察数据、化学数据和关于生物标记子集的数据基础上的测试HBR阵列。
通过比较测试HBR阵列和指导上述观察和子集的分析的标准HLHBR阵列的变量将能确定测试批特性,其中IL-2受体和NfκB的诱导、c-Ki-ras2基因表达的下调、糖皮质激素受体的增加和HepG2细胞的α-feto蛋白质分泌的抑制的证明(包括收集的关于生长条件、产地、和berberine生物碱的验证的数据)预示了测试批的等价生物反应的效应,其是关于如标准HL显示的那样的人胚胎性癌克隆末端分化成神经元样细胞和地塞米松诱导的凋亡的抑制。基于这一过程可以确定测试批是否具有相似的或不同于标准的特性。
实施例11.使用两种生物分析评价小柴胡汤。
为了评价三种来源的小柴胡汤的质量,使用了两种生物分析:1)细胞生长抑制和2)从感染的细胞中乙型肝炎病毒的分泌作用。小柴胡汤组合物从6-7种草药植物(柴胡、半夏,干姜,黄芩,大枣,党参、人参和甘草,相对量见表2,依据重量)的混合物中制备。
表2.小柴胡汤组合物
产地 | 植物的种 | |||||||
柴胡 | 半夏 | 干姜 | 黄芩 | 大枣 | 党参 | 人参 | 甘草 | |
依据重量的相对量 | ||||||||
新加坡 | 1 | 1 | 0.375 | 0.375 | 0.375 | ---- | 0.375 | 0.375 |
朝鲜 | 1 | 0.717 | 0.571 | 0.492 | ---- | 0.429 | ---- | 0.288 |
台湾 | 1 | 0.25 | 0.375 | 0.375 | 0.25 | ---- | 0.375 | 0.375 |
三种“配方”产于新加坡、朝鲜或者是产于台湾。如通过DNA定量或检查乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)进行检查的那样来评价批的毒性和抑制B型肝炎病毒的能力(见Dong等,Proc Natl Acad SciUSA(1991)88:8495-8499)。
扼要地,将1克制品加到10ml水中。煮沸混合物30分钟。离心后收集上清液并通过0.22μM的滤器过滤。使用两种细胞型:a)分泌乙型肝炎病毒的2.2.15细胞(由G.Ace教授友情提供;见Ace等,Proc Natl Acad Sci USA(1987)84:1005-1009)和b)HepG2细胞(ATCCCat#HB-8065)。每个分析使用1比50的稀释度。细胞生长抑制分析进行72小时。所有其它过程都按Dong等,Proc Natl AcadSci USA(1991)88:8495-8499描述的那样进行。使用三个批的分析结果列于表3中。基于这些数据,由于台湾产地的低毒性再加上它的减少超过一半的HbsAG的分泌(其与病毒释放成比例),所以将选定台湾产地的作为标准草药组合物。
表3.小柴胡汤
产地 | 细胞生长抑制(%) | 乙型肝炎细胞(分泌的)%的抑制 | ||
HepG2 | 2.2.15 | DNA | HbsAG | |
新加坡 | 73 | 100 | 65 | 38 |
朝鲜 | 13 | 60 | 20 | 42 |
台湾 | 0 | 42 | 0 | 47 |
表2和表3中给出的台湾草药组合物的数据组成了这一草药组合物的标准化NBR阵列的原始数据。因此,最初这一数据集将包括草药组合物的来源、植物的种和每种草药组合物的相对量、和两种生物反应(即,细胞生长抑制和从感染细胞中分泌乙型肝炎病毒)。
使用在图1的图解中和在实施例1和3中阐明的过程,收集标准草药组合物的关于植物相关的数据、标记和生物反应的附加的数据。将这一额外数据加入原始的标准化的HBR阵列中以产生可扩充的标准化的HBR阵列。为了确定与目的生物反应高度相关或相联系的变量的子集,可按在详述和实施例中所阐明的那样对获得的数据库进行适当的分析。可以使用在图2中和在实施例2和4的步骤中所描述的方法来确定批HBR阵列。
获得的批HBR阵列可以与标准化的HBR阵列比较来预测批草药组合物的生物反应。
实施例12.草药制备。
标准化的草药提取物制备的方案如下:将具有适当比例的草药原料的成分放入有夹套的反应器中并且使用搅拌在提高的恒定温度下用水提取。用120目的筛子将固体从液体中分离。收集获得的滤液,然后通过减压蒸发进行浓缩。浓缩的溶液在提高的温度下喷雾干燥以产生颗粒状粉末。然后将这一体积的物质配制成想要的剂型。
实施例13.评价黄芩汤
黄芩汤(HQT)是一种古代中国植物性药材配方,其包括四种不同的草药:Scutellariae(黄芩),Glycyrrhizae(甘草),Paeonielactiflora pallus(白芍),和Fructus zizipho(大枣)。(表4)。自公元300年以来这一草药处方在亚洲已经使用了很长时间用来治疗各种胃肠疾病。
表4.TCM处方HQT的草药成分
生物和酶分析
学名 | 常用名 | 传统用途 |
Scutellariae Radix | 黄芩根 | 用于减小毛细血管渗透性:减轻炎症:治疗肠炎和痢疾:增加胆汁分泌以治疗黄疸:缓解肌肉痉挛以治疗咳嗽:驱虫。 |
Glycyrrhizae Radix | 甘草根 | 用于润肺和止咳:松弛痉挛和止痛:缓和草药作用;泻火排毒。 |
Fructus Ziziphi | 大枣 | 具有利尿和强化的功能 |
Paeonie lactiflorapallus radix | 白芍药根 | 用于抑制和消除疼痛;松弛韧带和净化血液 |
表5.批属性(HQT)
属性 | 批A | 批B | 批C |
产地 | 台湾,Sun-ten | 台湾,Sun-ten | 台湾,Sun-ten |
制备方法 | 标准 | 标准 | 煮沸30分钟 |
植物部位 | 根 | 根 |
扼要地,取每一批黄芩汤(HQT)1克加入到10ml水中(1mg/ml)。象在表5中扼要地描述的那样处理混合物。离心后收集上清液并且通过0.22μm的滤器过滤。使用了两种类型的细胞来测试每一批HQT的生物学效应:a)Jurkat T细胞(ATCC cat#TIB-152)和b)HepG2细胞(ATCC cat#HB-8065)。每个分析都是用1∶50的稀释度。在37℃的水浴中迅速融化冷冻的细胞(107个/ml)。接着细胞用10ml的预暖的介质稀释(见生命技术公司(Life Technologies Inc),目录和索引指南,1998-1999,细胞培养部分)紧接着1500转离心5分钟。然后舍弃上清液并将细胞培养在100ml的37℃、5%CO2的介质中。两天后,进行细胞计数(大约8×105个细胞/ml。总共100ml)。
按照通过DNA进行定量检测同样地也评价了批的抑制乙型肝炎病毒的能力(见Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499)。扼要地,将1克制品加入到10ml水中。煮沸混合物30分钟。在离心后收集上清液并通过0.22μm的滤器过滤。在这一分析中使用了分泌B型肝炎病毒颗粒的2.2.15细胞(由G.Ace教授友情提供;见Ace等,Proc Natl Acad Sci USA(1987)84:1005-1009)。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞生长抑制分析进行了72小时。所有其它过程都如Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499描述的那样进行。
由于HQT已知具有抗腹泻的特性因而进行了β-葡萄糖醛酸酶的分析。将不同的HQT提取物加入到三层壁的96孔板中,其含有终体积为80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸盐、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析过的β-葡萄糖醛酸酶(产自大肠杆菌,购于SigmaTM)。37℃孵育2小时后,反应用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2MNaCl(pH10.4)的终止液终止,并且用活动的微板阅读器在540nm下监控OD值。
三个批的分析结果列于表6中。基于这些数据,HQT来源的A和B具有相对低的毒性和相对于批HQTC的较高的抑制活性(即,对HepG2细胞的大约5倍大的毒性和比HQTA或者B少3.3倍的抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性,见表6)。
表6.三种HQT制品的生物学分析*
大肠杆菌 HepG2 Jurkat HBV
β-葡萄糖醛酸酶 DNAHQT A 0.6 1.50 0.76 NoneHQT B 0.7 1.6 0.81 NDHQT C 2.2 0.32 ND ND*值代表IC50值 对照的%ND,没有检测评价HQT对蛋白质表达的作用
在加药前24小时将HepG2细胞(1×106)接种于含有3.0ml的RPMI-1640培养基的25cm2的瓶中(见生命技术公司(LifeTechnologies Inc),目录和索引指南,1998-1999,细胞培养部分)。细胞用或者不用草药药物处理,其中前者分别以0.2mg/ml或者4mg/ml的两种终浓度加入,并且37℃孵育24小时。移去培养基并且用冷PBS洗细胞两次。将细胞收集到1ml的PBS中并且在10,000转离心2分钟,在三次冻融循环后用含有50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.2mM PMSF和10%甘油的缓冲液在冰上提取。在离心前将氯化钾以0.15M的终浓度加入到细胞裂解液中。确定蛋白质的浓度并且按照Laemmli的方法(自然(Nature)(1970)227:680-685)将细胞提取物进行电泳。使用本领域技术人员所知的标准技术进行Western印迹,例如见Sambrook,等(1989)。使用的抗体对应于下列蛋白质:Topo I;Stat(20707);Cyclin B1;MAPK(Ab2)和Nm 23 H1。
图4表明较高浓度的HQTA或HQT B有差别地影响Cycl in B1多肽的表达。
HPLC分析
用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米颗粒,4.6mm×25cm)的HPLC来分析草药的批并且用紫外分光光度计(Perkin Elmer)来检测。紫外检测监控的波长是280nm和340nm。用泵以1ml/min输送流动相并且流动相含有溶剂A:水和溶剂B:20%甲醇的如下梯度:1)最初的5分钟溶剂为100%的溶剂A;2)在接下来的10分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B;和3)在下个40分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B。之后加100%的溶剂A 5分钟。HPLC的标准品是黄芩甙和黄芩甙元。
质谱
使用购自PE生物系统公司的MarinerTM ESI-TOF质谱(MS)分析草药提取物。使用两种已知的的HQT中的活性成分黄芩甙元和黄芩甙来产生对照示踪。
通过HPLC和质谱分析了用水和用酸处理过的批HQT样品。水处理的HQT批A和B具有明显不同的HPLC和MS示踪,而酸处理的批具有几乎完全相同的模式(数据没有给出)。
算法
被收集的数据形成了用于产生多元正态分布集的多维分析的一部分,其作为确定在生物学活性和标准HQT化学制剂(HPLC和质谱),和产地/生长之间基线相关性的手段。
实施例14.单个成分
A.甘草。
评价Glycyrrhizae Radix(甘草)
甘草用于润肺和镇咳,帮助缓解痉挛和疼痛。在这一实施例中所使用的甘草批的特性由表7给出。
表7.批性质(甘草)
性质 | 批A | 批B | 批C | 批D |
植物名 | GlycyrrhizaeRadix | GlycyrrhizaeRadix | GlycyrrhizaeRadix | GlycyrrhizaeRadix |
产地 | 内蒙古 | 内蒙古 | 美国Kin Man草药中心 | 美国Kin Man草药中心 |
制备方法 | 标准 | 标准 | 煮沸30分钟 | 温水,30分钟 |
植物部位 | 根 | 根 | - | - |
生物学和酶分析
为了分析草药来源的质量,分析了每一种草药提取物的上清液并且将分析重复了三次。对于一个给定的要被分析的样品,将1克草药粉末溶于10ml的80℃的在聚丙烯管中的去离子水中(自然pH)。然后将管如表7中扼要描述的那样孵育,接着离心以获得上清液。用或者是HepG2细胞(ATCCcat#HB-8065)或者是Jurkat T细胞(ATCCcat #TIB-152)或者是两者都用来测试甘草的批。细胞如上所述培养24小时。
同样地按照通过DNA定量来检测的那样评价了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(见Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499)。扼要地,将1克制品加入到10ml水中。煮沸混合物30分钟。在离心后收集上清液并通过0.22μM的滤器过滤。在这一分析中使用了分泌乙型肝炎病毒颗粒的2.2.15细胞(由G.Ace教授友情提供;见Ace等,Proc Natl Acad Sci USA(1987)84:1005-1009)。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞生长抑制分析进行了72小时。所有其它过程都如Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499描述的那样进行。
再一次分析了β-葡萄糖醛酸酶。将不同的甘草提取物加入到三层壁的96孔板中,其含有终体积为80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸盐、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析过的β-葡萄糖醛酸酶(产自大肠杆菌,购于Sigma),如上所述进行分析。
使用两个批的分析结果列于表8中。以这些数据为基础,甘草批A比批B对于Jurkat细胞具有更大的毒性(大约9倍)并且是β-葡萄糖醛酸酶更有效的抑制剂(见表8)
表8.四种甘草制剂的生物学分析*
大肠杆菌 HepG2 Jurkat HBV
β-葡萄糖醛酸酶 DNA甘草A 1.1 1.07 0.41 None甘草B ND ND 3.6 ND甘草C 2.1 ND ND ND甘草D ND ND >2.0 53.8*值代表IC50值 ,对照的%。ND,没有检测
表达分析
为了分析基因表达,用草药提取物处理了Jurkat T细胞如下:在37℃的水浴中迅速融化JurkatT细胞(107个/ml)。接着细胞用10ml的预暖的介质稀释(见生命技术公司(Life TechnologiesInc),目录和索引指南,1998-1999,细胞培养部分),紧接着1500转离心5分钟。然后舍弃上清液并将细胞培养在100ml的37℃、5%CO2的介质中。两天后,计数细胞(大约8×105个细胞/ml。总共100ml)。
如上面扼要描述的那样(例如,2g草药粉末获得20ml的无菌溶液(0.1g/ml))制备草药提取物溶液。将细胞以2.5×105个/ml的密度分成三瓶,100ml每瓶。将对照(没有提取物),和10mg/ml的10ml的提取物,和1mg/ml的10ml提取物进行分析。再一次地,使用毒性结果来确定任一给定的提取物的“高”和“低”浓度。加入提取物之后,在上述条件下孵育细胞培养物24小时。将细胞计数并随后收集于50ml的离心管中。获得的细胞沉淀用RNA分离方法处理来提取mRNA(例如,见,Sambrook等,1989在7.3-7.39页)。
微阵列
微阵列印迹按如下内容进行:
通过研究遗传学(Huntsville,从)从IMAGE联合文库获得基因克隆并且包括来自多种组织的基因。大部分克隆已经被部分地测序,并且作为形成GeneBank的dbEst数据库的可表达序列标志是通用的。分别培养包括pBluescript质粒的克隆并且在施用到尼龙膜上之前使用可购买得到的引物扩增(Chen等,基因组学(Genomics)(1998)51:313-324)。使用PC(个人电脑)控制的阵列系统施用大约10ng的每一种扩增的目的物到带正电荷的尼龙膜上。使用24-pin的阵列工具可在35mm×55mm大小的尼龙膜上粗略地安放85,000个点。
cDNA探针和膜杂交
使用随机引发的逆转录用生物素和/或地高辛标记1μg的每一种mRNA样品(mRNA如上所述被分离)。被标记的样品用碱处理并且在获得的标记核酸用于杂交前将其沉淀。如Chen等(1998)所发表的那样使用标记的探针进行膜杂交并漂洗。为了用双色模式(即,既有生物素又有地高辛)来检测膜上的点,应用了β-半乳糖苷酶偶合的抗生蛋白链菌素(strept-Gal)和碱性磷酸酶偶合的地高辛抗体(anti-Dig-AP)。在显色后,使用成像工具进行图像的数字转换(例如,扁平床扫描仪或数码相机)。使用可测量每个点的原色成分的综合密度,进行综合密度数据回归分析和定位作为有差别地表达基因的统计学异常值的一种程序,由计算机分析确定定量的测量结果。
样品1、2和甘草(ST117)的基因表达数据
通过下列方法将分别对应于冬虫夏草、茯苓(ST027)和甘草提取物的提取物1、2和6进行分析:使用Jurkat T细胞评价批的毒性。
按在实施例6中所述制备提取物。通过加1ml密度为5×105个/ml的Jurkat细胞把细胞分到24孔培养板上。用对照(没有提取物),和上述的5种浓度的提取物(见表9)来进行分析。用于细胞培养分析的高和低浓度依据提取物对细胞的毒性在10mg/ml和0.05mg/ml之间变化(即,每毫升草药提取物的毫克干重)。对于某种样品在10mg/ml的毒性较高那么就将“高”和“低”浓度下调。然而,在最大和最小值之间至少要维持一个阶数的数量。例如,对于甘草(ST117)“高”是0.5mg/ml和“低”是0.05mg/ml(见表9)。在加入提取物之后,细胞培养物在如实施例中所述的条件下孵育24小时。将细胞进行计数并且将获得的数据列表以表明提取物的毒性。获得的数据列于表9中。
表9.在不同浓度的草药提取物溶液下存活的细胞数
注意:起始细胞数是5×105个/ml并且在24小时孵育后数目达到10×105个/ml。“-”描述所有死细胞。方法:1.加入1ml 5×105个/ml的Jurkat细胞到24孔培养板上。2.制备12种草药提取物溶液并灭菌。3.每个样品测试5种浓度。10mg/ml、5mg/ml、2 mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml4.在37℃下具有5%CO2的培养箱中培养细胞24小时。
实验浓度 | ||
no.×103ml | 10mg/ml 5mg/ml 2mg/ml 1mg/ml 0.5mg/ml 无药 | 高浓度 低浓度 |
1 冬虫夏草2 ST0273 ST0-444 ST0515 ST0936 ST1177 3T1238 ST1289 ST13410 ST237 | 8.4 11.9 11.5 9.2 9.0 12.44.2 8.7 10 7.5 10 10- 5.9 8.4 9.9 9.4- - - 1.7 5.4- - 1.9 3.8 4.4- 1.6 3.6 4.6 5.83.4 6.4 8 9.3 7.83.5 7.7 7.9 7.7 8.32.9 6.1 11.2 9.6 9.8- - 2.5 6.6 8.7 | 10 110 15 0.50.5 0.050.5 0.050.5 0.055 0.55 0.55 0.51 0.1 |
在每一个分析中,分析了144×96个基因(即,13,824个基因)(数据没有给出)并且约有100个基因与对照的基因相比显示了明显的不同(表10)。这些基因中的一部分被上调了而其他的被下调了。与对照差别的大小有时依赖于施用到特定细胞上的草药组合物的相对量。在C1(对照处理)和H或L(草药)下的数字代表减去背景之后的mRNA表达的强度(表10)。在阵列AD中基因名称被编码,其可以追溯到特定的GeneBank的克隆。通过由C划分的H或L来确定表达水平。在每一种草药处理的样品中,13,828个基因中只有一部分显示了明显的改变,即,上调、下调或未改变(见表10)。
表10标记 相对于未处理的细胞(CI)K,L,M,N,O,P栏表示1,2,6号草药处理的mRNA表达水平的比例(H,L指高浓度和低浓度)标题 Cl 1H 1L 2h 2L 6H 6L 1H 1L 2h 2L 6H 6LAmayAD 类转导素增强子蛋白I Sg-Bk Sg-Bk Sg-Bk Sg-Bk Sg-Bk Sg-Bk Sg-Bk COMPARE TOCONTROL CloneID<94,030>腺苔酸琥珀酸裂合酶 55.29 8.55 7.15 46.74 38.07 29.21 30.82 0.154639 0.129318 0.845361 0.688551 0.528305 0.557424 504540<91,097>神经营养酪氨酸激酶,受体,I型 89.55 98.29 70.26 84.83 93.83 36.02 89.63 1.097599 0.78459 0.947292 1.047795 0.402233 1.000893 1013392<89,083>主要组织相容性复合体I类蛋白质HLA-A(HLA28,-B40,Cw3) 80.68 61.91 46.13 59.86 29.64 46.16 32.35 0.767353 0.571765 0.741943 0.367377 0.572137 0.400967 510048<87,83> 85.33 50.96 37.75 53.25 25.54 37.5 49.82 0.597211 0.4424 0.624048 0.299309 0.43947 0.583851 1188706<86,131>高度类似于螺旋-环-螺旋蛋白质 99.48 109.46 105.62 56.68 67.54 35.65 75.78 1.100322 1.061721 0.569763 0.67893 0.358363 0.761761 72215<85,129>整合膜蛋白E16 90.64 72.12 92.75 37.97 70.08 48.47 59.36 0.795675 1.023279 0.41891 0.773169 0.534753 0.654898 118588<85,112> 35.23 60.82 48.87 44.04 29.71 28.25 59.33 1.72637 1.38717 1.250071 0.843315 0.801873 1.684076 115134<84,075> 89.56 77.54 77.9 66.1 59.44 43.37 42.97 0.865788 0.869808 0.738053 0.663689 0.484256 0.47979 172767<83,129> 118.83 108.15 118.05 75.84 64.09 55.8 66.27 0.910124 0.993436 0.638223 0.539342 0.469578 0.557687 1184183<82,082>人雄性激素受体相关蛋白 60.23 47.87 34.96 37.41 9.84 44.8 46.5 0.794787 0.580442 0.621119 0.163374 0.743815 0.772041 118235<82,027> 65.11 90.01 66.74 66.3 64.44 39.3 78.37 1.38243 1.025035 1.018277 0.98971 0.603594 1.203655 171864<80,129> 96.27 99.96 109.3 81.88 87.66 48.32 53.87 1.03833 1.135348 0.850525 0.910564 0.501922 0.559572 1172135<80,035>人小GTP结合蛋白Rab7mRNA,完全的cds 44.91 46.23 23.19 78.21 40.75 37.48 42.49 1.029392 0.5609 1.741483 0.90737 0.834558 0.946114 1172266<74,108> 65.2 77.25 64.09 60.2 66.21 51.52 70.19 1.184816 1.044325 0.923313 1.015691 0.790184 1.076534 37502<74,012> 34.68 60.92 57.73 24.61 48.93 42.34 65.02 1.756632 1.664648 0.709631 1.4109 1.220877 1.874856 45672<73,132>KIAA0078基因的人mRNA,完全的cds 109.86 103.38 82.35 85.97 69.15 61.91 32.44 0.941016 0.74959 0.782541 0.629437 0.563535 0.295285 79342<72,101>人高尔基体外测p230mRNA,完整的cds 46.96 25.76 18.35 10.54 17.87 1.27 17.51 0.548552 0.390758 0.224446 0.380537 0.027044 0.372871 563992<72,014>Chlordecone reductase 4.37 15.08 13.31 42.87 22.76 20.64 30.11 3.450801 3.045767 9.0810069 5.208238 4.723112 6.89016 21759<70,101> 60.86 13.55 35.23 33.39 40.65 16.36 18.7 0.222642 0.57887 0.548636 0.667926 0.268814 0.307263 564469<69,107> 37.92 31.41 26.12 82.82 28.64 36.95 50.55 0.828323 0.688819 2.184072 0.755274 0.97442 1.33307 29009<68,064>KIAA0034基因的人mRNA,完全的cds 2.24 1.27 5.31 0.21 2.5 4.2 41.64 0.566964 2.370536 0.09375 1.116071 1.875 18.58929 51927<62,117> 106.71 94.67 83.98 81.39 61.45 77 41.8 0.887171 0.786993 0.762721 0.57586 0.721582 0.391716 241351<62,084>NA 1.13 0 0 13.55 0.58 32.81 17.71 0 0 11.99115 0.513274 29.0354 15.67257 28012<62,001>不均一核核糖体蛋白A1 97.11 71.92 73.16 42.01 78.94 83.94 96.87 0.740603 0.753372 0.432602 0.812893 0.864381 0.997529 236388<61,118>NA 89.52 59.97 54.11 66.86 43.05 65.65 34.92 0.669906 0.604446 0.746872 0.480898 0.733356 0.39008 240018<59,142>ATP酶,Na+/K+转运,αI多肽 13.03 15.48 47.75 27.71 27.86 23.22 16.58 1.188028 3.66462 2.126631 2.138143 1.782041 1.272448 121270<59,135> 60.85 90.23 39.83 93.01 38.17 86.39 31.2 1.482827 0.65456 1.528513 0.62728 1.419721 0.512736 510863<58,087>EsTs,很少与KIAA0063类似[人] 77.72 46.86 76.33 64.43 22.52 56.78 63.4 0.602934 0.982115 0.8229002 0.289758 0.730571 0.815749 645239<57,016>成纤维细胞瘤RAS病毒癌基因同系物 71.71 16.47 44.61 39.51 66.89 50.43 35.52 0.229675 0.622089 0.550969 0.932785 0.703249 0.495328 47526<56,088>3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A 56.77 52.66 59.53 59.6 16.89 72.87 60.28 0.927603 1.048617 1.04985 0.297516 1.2836 1.061828 509520<56,060>翻译延伸因子1-α-1 81.26 92.28 92.08 36.86 79.09 71.74 70.47 1.135614 1.133153 0.453606 0.973296 0.882845 0.867216 31027<55,040> 0 43.58 39.47 53.67 46.42 40 65.93 328351<54,134>碳酸酐酶III 0 0 4.38 43.47 8.23 32.61 9.74 287006<53,048>人干扰素调节因子3mRNA 0.25 0 0 33.47 0 0 0.53 0 0 133.88 0 0 2.12 116915<53,023>人蛋白酶前体亚单位HsC7-1mRNA 67.76 14.98 42.33 38.48 66.52 27.24 37.24 0.221074 0.624705 0.567887 0.9817 0.402007 0.549587 221285<52,135> 49.26 46.81 44.4 72.95 55.5 63.21 30.35 0.950264 0.90134 1.480918 1.126675 1.283191 0.616119 286222<51,131>ATP柠檬酸裂合酶 2.02 0 52.06 39.33 6.03 22.36 5.6 0 25.77228 19.4703 2.985149 11.06931 2.772277 624420<51,101>多聚腺苷酸结合蛋白 8.65 0.17 0.45 38.99 14.31 38.25 11.64 0.019653 0.052023 4.507514 1.654335 4.421965 1.345665 529138
表10(续)<50,035>血清白蛋白前体 0.88 0 10.21 44.14 0 0.79 0.01 0 11.60227 50.15909 0 0.897727 0.011364 510245<47,055>ESTs 38.53 31.69 19.45 43.8 56.1 59.36 53.2 0.832476 0.504801 1.136777 1.456008 1.540618 1.380742 26801<46,099> 34.26 35.69 32.49 39.81 63.19 30.86 51.76 1.049329 0.948336 1.161996 1.844425 0.900759 1.5108 511591<45,100>核糖体蛋白L5 26.15 33.6 26.3 55.86 48.59 31.26 43.29 1.284895 1.005736 2.136138 1.858126 1.195411 1.655449 511410<44,103>NA 72.01 54.36 70.27 75.43 91.53 70.5 80.86 0.754895 0.975837 1.047493 1.271073 0.979031 1.1229 26099<43,039> 55.86 18.02 20.83 11.68 17.8 11.82 41.06 0.322592 0.372897 0.209084 0.318654 0.2116 0.735052 592919<43,035>14-3-3PROTEIN TAU 86.86 23.18 36.23 18.14 12.76 12.99 42.28 0.266866 0.417108 0.208842 0.146903 0.149551 0.48676 120011<43,019> 72.48 10.4 23.38 27.59 12.83 3.47 15.99 0.143588 0.322572 0.380657 0.177014 0.047875 0.220613 488154<42,099> 30.25 33.73 36.83 61 51.56 40.36 48.43 1.115041 1.217521 2.016529 1.704463 1.334515 1.600992 86102<40,100>ESTs 0 0 0.2 38.37 12.78 2.59 7.47 84335<39,118>硫氧还蛋白 4.26 0.34 2.83 37.28 8.03 2.25 9.67 0.079812 0.664319 8.751174 1.884977 05281669 2.269953 123764<39,007>前-α(球蛋白)抑制剂H3多肽 9.46 24.06 15.82 26.08 25.48 22.8 44.36 2.54334 1.672304 2.756871 2.693446 2.410148 4.689218 23643<38,097>NA 11.81 6.94 23.82 80.14 16.65 6.13 18.51 0.587638 2.016935 6.785775 1.409822 0.519052 1.567316 81665<38,081>人GP36b糖蛋白mRNA 101.51 82.61 89.86 22.88 71.4 89.93 79.82 0.813811 0.885233 0.225397 0.703379 0.885923 0.786326 1185901<35,096> 47.35 24.52 0 23.2 32.88 37.19 35.29 0.517846 0 0.489968 0.694403 0.785428 0.745301 723779<34,143> 61.23 2.99 25.05 30.61 16.93 27.03 40.4 0.048832 0.409113 0.499918 0.276498 0.44145 0.659807 712549<32,118>ESTs,较弱地相似于酪蛋白激酶同系物 21.98 8.91 14.11 53.54 24.01 17.46 22.99 0.405369 0.641947 2.435851 1.092357 0.794359 1.045951 265480<32,034>Pyruvate kinase,musele 78.41 54.15 79.36 29.56 40.5 28.52 61.59 0.690601 1.012116 0.376993 0.516516 0.363729 0.785487 1170289<30,102>丙酮酸激酶,肌肉 27.3 23.1 16.06 62.35 34.39 16.52 47.49 0.846154 0.588278 2.283883 1.259707 0.605128 1.73956 612365<30,033> 70.49 30.32 65.13 17.18 33.65 49.07 36.52 0.430132 0.923961 0.243723 0.477373 0.696127 0.518088 82236<29,058>NA 25.77 16.66 0 59.85 33.24 27.05 18.54 0.646488 0 2.322468 1.289872 1.04967 0.719441 38798<29,035> 60.19 57.12 86.66 46.47 56.59 61.01 58.47 0.948995 1.439774 0.772055 0.940189 1.013624 0.971424 81491<28,104>核糖体蛋白S13 0 0 0 37.19 1.37 0 5.97 595769<28,035> 71.46 35.93 51.86 11.27 30.75 40.12 36.54 0.502799 0.725721 0.157711 0.430311 0.561433 0.511335 994662<27,119> 0 0 0 48.27 1.66 0 1.1 114662<27,097>EsTs,与Etr-3[人]中等相似 16.06 24.53 9.26 76.01 24.34 24.16 30.01 1.527397 0.576588 4.732877 1.515567 1.504359 1.868618 68744<25,126>ESTs 42.93 22.03 29.88 67.76 40.39 24.86 30.53 0.513161 0.696017 1.578383 0.940834 0.579082 0.711158 427843<25,106> 61.9 48.38 43.41 91.26 58.89 39.88 51.83 0.781583 0.701292 1.474313 0.951373 0.644265 0.837318 42714<24,098>人剪接体蛋白(SAP 61)mRNA,完整的c 24.26 25.43 21.8 56.18 37.28 30.59 46.77 1.048228 0.898599 2.315746 1.536686 1.260923 1.927865 274769<24,071>热体克70KD蛋白I 63.92 58.19 61.1 50.86 66.27 80.57 68.86 0.910357 0.955882 0.795682 1.036765 1.260482 1.077284 255134<23,126> 5.18 1.1 10.08 54.71 12.11 2.9 10.53 0.212355 1.945946 10.56178 2.337838 0.559846 2.032819 416946<23,099>核糖体蛋白S3A 5.13 1.93 1.25 38.99 14.35 4.51 18.73 0.376218 0.243665 7.60039 2.797271 0.879142 3.651072 298187<22,013>真核启动因子4B 61.8 49.95 41.52 22.99 49.11 42.7 20.04 0.808252 0.671845 0.372006 0.79466 0.690939 0.324272 51894<22,006>3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A 83.17 57.84 39.8 40.04 44.33 46.33 35.49 0.695443 0.478538 0.481424 0.533005 0.557052 0.426716 563866<20,126>线粒体应激-70蛋白质前体 27.02 22.19 33.86 56.87 32.97 27.24 33.86 0.821244 1.253146 2.104737 1.220207 1.008142 1.253146 382766<20,104>人真核翻译起始因子(eIF3)mR 22.09 15.17 15.17 74.98 19.17 8.3 35.84 0.686736 0.783518 3.394296 0.867813 0.375736 1.622454 562992<20,103>层粘连蛋白受体(2H5抗原决定基) 1.45 1.26 0 39.66 8.7 0.73 9.03 0.868966 0 27.35172 5.97931 0.503448 6.227586 562928<19,098>人精球蛋白(CD100)mRNA,完整的cds 17.79 14.38 10.79 52.94 28.97 12.5 31.25 0.808319 0.606521 2.975829 1.628443 0.702642 1.756605 248687<18,103>核糖体蛋白L5 31.47 21.13 30.07 78.6 27.18 27.47 43.29 0671433 0.955513 2.497617 0.86368 0.872895 1.375596 549382<18,084>ESTs 54.61 75.17 46.16 79.5 60.01 74.37 56.43 1.376488 0.845266 1.455777 1.098883 1.361838 1.033327 512336<17,103>NA 0 0 0 33.96 2.87 3.64 9.87 549224
表10(续)<17,097>NA 1.52 2.1 1.21 37.77 11.59 3.43 14.35 1.381579 0.796053 24.84868 7.625 2.256579 9.440789 327474<17,062> 92.72 73.27 103.64 69.79 69.35 68.85 83.14 0.790229 1.117774 0.752696 0.747951 0.742558 0.896678 50753<16,103>整合蛋白β-(纤连蛋白受体, β多肽 0 0.92 0 41.3 1.84 6.67 11.18 547624<16,100>人E1B19k/Bc1-2-结合蛋白Nip3 mRNA 0.79 0 0.7 38.06 8.28 0.89 16.63 0 0.886076 48.17722 10.48101 1.126582 21.05063 308754<15,112> 16.47 11.65 11.87 46.52 22.98 28.22 22.43 0.707347 0.720704 2.824529 1.395264 1.713418 1.36187 49967<14,103>NA 27.61 34.26 30.18 55.67 38.45 35.52 50.43 1.240855 1.093082 2.016298 1.392611 1.28649 1.826512 546545<14,011>NA 47.42 34.87 68.28 38.71 53.6 50.03 52.24 0.735344 1.439899 0.816322 1.130325 1.05504 1.101645 32672<13,114>人克隆24689mRNA序列 20.64 13.87 19.2 51.26 32.34 20.27 27.7 0.671996 0.930233 2.483527 1.56686 0.982074 1.342054 144001<12,144>人NADH:辅酶Q氧化还原酶 76.78 67.2 76.11 64.5 50.04 53.7 6.92 0.875228 0.991274 0.840063 0.651732 0.699401 0.090128 325580<12,111> 40.04 55.04 46.34 77.78 46.07 69.51 55.69 1.374625 1.157343 1.942557 1.150599 1.736014 1.390859 49373<11,135> 90.34 114.29 87.88 80.49 87.22 60.79 87.28 1.26511 0.97277 0.890967 0.965464 0.672902 0.966128 510620<11,105>核糖体蛋白L3 8.27 14.41 15.59 36.82 25.87 31.97 47.1 1.742443 1.885127 4.452237 3.128174 3.86578 5.695284 31866<11,053>[雷]钙蛋白酶,大多肽L2 10.48 23.58 14.8 15.69 8.87 47.63 28.91 2.25 1.412214 1.497137 0.846374 4.544847 2.758588 544957<10,136>苹果酸酶2,线粒体 74.34 81.63 90.94 83.18 74.85 54.35 65.41 1.098063 1.223298 1.118913 1.00686 0.311 0.879876 510323<10,101>ESTs 13.65 16.34 13.97 47.57 26.68 36.05 40.14 1.19707 1.023443 3.484982 1.954579 2.641026 2.940659 613442<09,136>NA 59.82 95 87.16 77.34 23.51 69.24 71.68 1.588098 1.457038 1.292879 1.396021 1.157472 1.198261 509836<09,110>ERLUMEN PROTEIN RETAINTNG RECEPTOR I 17.3 41.73 48.92 55.32 35.56 45.73 60.03 2.412139 2.827746 3.197688 2.055491 2.643353 3.469942 47800<09,085>人磷脂转运蛋白mRNA,完全的cd 80.14 88.83 96.22 80.4 77.44 76.05 82.81 1.108435 1.200649 1.003244 0.966309 0.948964 1.033317 613511<08,138> 41.57 60.4 69.53 73.27 81.26 59.49 66.73 1.452971 1.6726 1.762569 1.954775 1.43108 1.605244 632480<08,132> 67.22 102.84 103.65 90.56 88.43 76.85 81.15 1.529902 1.541952 1.347218 1.315531 1.143261 1.20723 66427<08,122>人DRAK1,mRNA,完全的cds 32.01 23.21 47.74 63.02 35.64 32.48 46.85 0.725086 1.491409 1.96876 1.113402 1.014683 1.463605 308580<08,105> 69.58 58.7 84.49 90.5 68.91 89.98 94.96 0.843633 1.214286 1.300661 0.990371 1.293188 1.36476 30607<08,055> 19.5 20.01 22.83 27.87 34.66 48.86 50.43 1.026154 1.170769 1.429231 1.777436 2.505641 2.586154 611114<07,111> 30.8 44.67 48.75 73.84 51.31 59.76 68.29 1.450325 1.582792 2.397403 1.665909 1.94026 2.217208 46880<07,107>ESTs 4.57 3.23 9.01 41.32 8.83 22.9 23.56 0.706783 1.971554 9.041575 1.932166 5.010941 5.155361 29970<06,135> 71.42 112. 68 128.81 102.8 101.48 93.72 94.2 1.577709 1.803556 1.439373 1.420891 1.312237 1.318958 286790<06,102>ESTs 39.82 36.03 32.57 67.74 46.04 59.07 57.13 0.904822 0.817931 1.701155 1.156203 1.483425 1.434706 530700<06,101>细胞间粘附分子2 4.43 2.95 4.21 38.95 16.6 15.85 3.59 0.665914 0.950339 8.792325 3.747178 3.577878 7.356659 530665<06,034>核糖体蛋白L5 0 0 0 0 33.93 0 0 666094<06,006>人脆性X精神发育迟缓综合症相关蛋白 0 31.71 0 0 0 0 0 530672<04,134> 39.03 54.62 46.61 71.8 58.82 64.83 64.43 1.399436 1.19421 1.839611 1.507046 1.66103 1.650781 285979<04,134>铁蛋白,轻的多肽 15.74 23.81 21.94 46.74 21.94 56.63 55.12 1.512706 1.393901 2.969504 1.393901 3.59784 3.501906 31309<03,140> 56.08 88.33 61.29 93.1 74.04 74.42 81.16 1.575071 1.092903 1.660128 1.320257 1.327033 1.447218 624595<03,099>ESTs 22.97 18.57 12.1 52.83 23.48 53.26 41.55 0.808446 0.526774 2.299956 1.022203 2.318677 1.808881 42281<02,111>ESTs,与64.5KD蛋白质高度相似 34.89 23.63 25 77.41 28.84 56.6 60.36 0.677271 0.716538 2.218687 0.826598 1.622241 1.730009 45327<01,136>用于5-aminoimidazole-4-carboxami的人mRNA 21.36 34.84 23.95 53.14 45.66 40.67 51.53 1.631086 1.121255 2.487828 2.13764 1.904026 2.412453 567287<01,058>乙酰辅酶A脱氢酶,C4-C12直链 60.68 53.35 73.26 62.56 56.58 72.81 91.71 0.879202 1.207317 1.030982 0.932432 1.199901 1.511371 30921总共116
以这种方式,我们能够把特定的基因表达和给细胞施用的无、低(L)或高(H)量的草药组合物联系起来。在这一方法中鉴定的许多基因编码在已知的新陈代谢和生物化学途径中的重要的蛋白质。这些蛋白质中的许多对于某种生理学的、形态学的和心理学的参数具有直接的和间接的作用。因此,这一方法使草药组合物的特定遗传的指纹与它的阵列生物学效应相联系成为可能。这样的联系能被用于描绘草药组合物的轮廓和特性以便达到质量控制、质量保证和评价药理学或毒理学性质的目的。在草药配方中主要的和辅助的草药的作用也同样可以用这一方法评定。
HPLC分析
用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米颗粒,4.6mm×25cm)的HPLC来分析草药的批并且用紫外分光光度计(Perkin Elmer)来检测。紫外检测监控的波长是280nm和340nm。用泵以1ml/min输送流动相并且流动相含有溶剂A:水和溶剂B:20%甲醇的如下梯度:1)最初的5分钟溶剂为100%的溶剂A;2)在接下来的10分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B;和3)在下个40分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B。之后加100%的溶剂A 5分钟。HPLC的标准品是甘草酸。
算法
被收集的数据形成了用于产生多元正态分布集的多维分析的一部分,其作为确定在生物学活性和标准甘草分子、化学制剂(HPLC和质谱),和产地/生长之间基线相关性的手段。
B.黃芩
对Radix Scutellariae(黄芩)的评价
已经发现黄芩可用于具有减轻毛细血管渗透性和炎症,也可以用治疗肠炎和痢疾,增加胆汁的分泌来治疗黄疸;缓解肌肉痉挛;治疗咳嗽和驱虫。在这一实施例中使用的黄芩的批的性质列于表11中。
表11.批性质(黄芩)
性质 | 批A | 批B | 批C | 批D |
植物名 | 黄芩 | 黄芩 | 黄芩 | 黄芩 |
产地 | 山西省 | 美国Kin Man草药中心 | 美国Kin Man草药中心 | 美国,波士顿 |
制备方法 | 标准 | 温水,30分钟 | 煮沸2小时 | |
植物部位 | 根 | - | - | - |
生物学和酶分析
扼要地,将1克的黄芩提取物的每一种制剂加入到10ml的水中(1mg/ml)。如表11所述处理混合物。离心后收集上清液并通过0.22μm的滤器过滤。用HepG2细胞(ATCC cat#HB-8065)或者是Jurkat T细胞(ATCC cat#TIB-152)或者是两者都用来测试黄芩的批。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞如上所述培养24小时。
同样地象通过DNA定量来检测的那样评价了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(见Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499)。扼要地,将1克制品加入到10ml水中。混合物如表11所述处理。在离心后收集上清液并通过0.22μm的滤器过滤。在这一分析中使用了分泌乙型肝炎病毒颗粒的2.2.15细胞(由G.Ace教授友情提供;见Ace等,Proc Natl Acad Sci USA(1987)84:1005-1009)。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞生长抑制分析进行了72小时。所有其它过程都如Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499描述的那样进行。
对于β-葡萄糖醛酸酶,将不同的黄芩提取物加入到三层壁的96孔板中,其含有终体积为80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸盐、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析过的β-葡萄糖醛酸酶(产自大肠杆菌,购于Sigma)。37℃孵育2小时后,反应用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的终止液终止,并且用活动的微板阅读器在540nm下监控OD值。
使用三个批的分析结果列于表12中。
表12.四种黄芩制剂的生物学分析*
大肠杆菌 HepG2 Jurkat HBV
β-葡萄糖醛酸酶 DNA黄芩A 1.5 0.33 0.45 None黄芩B 1.8 ND ND ND黄芩C 0.3 ND ND ND黄芩D ND 0.65 ND 27.5*值代表IC50值 ,对照的%。ND,没有检测评价黄芩对蛋白质表达的作用
在提取物加入前24小时将HepG2细胞(1×106)接种于含有3.0ml的RPMI-1640培养基的25cm2的瓶中(见生命技术公司(LifeTechnologies Inc),目录和索引指南,1998-1999,细胞培养部分)。细胞用或者不用草药药物处理,其中前者分别以0.2mg/ml或者4mg/ml的两种终浓度加入,并且37℃孵育24小时。移去培养基并且用冷PBS洗细胞两次。将细胞收集到1ml的PBS中并且在10,000转离心2分钟,在三次冻融循环后用含有50mM Tris-Cl(pH 7.5)、0.2mM PMSF和10%甘油的缓冲液在冰上提取。在离心前将氯化钾以0.15M的终浓度加入到细胞裂解液中。确定蛋白质的浓度并且按照Laemmli的方法(自然(Nature)(1970)227:680-685)将细胞提取物进行电泳。使用本领域技术人员所知的标准技术进行了Western印迹,例如见Sambrook,等(1989)。使用的抗体对下列蛋白质是特异的:TopoI;Stat(20707);Cyclin B1;MAPK(Ab2)和Nm 23H1。
图4表明黄芩批A或批B无差别地影响Western印迹解析的多肽的表达。HPLC分析
用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米颗粒,4.6mm×25cm)的HPLC来分析草药的批并且用紫外分光光度计(Perkin Elmer)来检测。紫外检测监控的波长是280nm和340nm。用泵以1ml/min输送流动相并且流动相含有溶剂A:水和溶剂B:20%甲醇的如下梯度:1)最初的5分钟溶剂为100%的溶剂A;2)在接下来的10分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B;和3)在下个40分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B。之后加100%的溶剂A5分钟。HPLC的标准品是黄芩甙和黄芩甙元。
通过HPLC分析了在水中的黄芩的批和酸处理的样品。水和酸处理的批基本上无差别。算法
被收集的数据形成了用于产生多元正态分布集的多维分析的一部分,其作为确定在生物学活性和标准黄芩化学制剂(HPLC),和产地/生长之间基线相关性的手段。
C.白芍
对Paeonie lactiflora pallus radix(芍药)的评价
芍药用于抑制和缓解疼痛。其也已知用于松弛韧带和净化血液。在这一实施例中使用的芍药批的性质列于表13中。
表13.批性质(芍药)
生物学和酶分析
性质 | 批A | 批B |
植物名 | Peaonie lactiflora pallus | Peaonie lactiflora pallus |
产地 | 安徽省 | 美国波士顿 |
制备方法 | 标准 | 煮沸2小时 |
植物部位 | 根 | 根 |
扼要地,将1克的芍药提取物的每一种制剂加入到10ml的水中(1mg/ml)。如表13所述处理混合物。离心后收集上清液并通过0.22μm的滤器过滤。用HepG2细胞(ATCC cat#HB-8065)或者是Jurkat T细胞(ATCC cat#TIB-152)或者是两者都用来测试芍药的批。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞如上所述培养24小时。
同样地象通过DNA定量来检测的那样评价了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(见Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499)。
扼要地,将1克制品加入到10ml水中。混合物如表13所述进行处理。在离心后收集上清液并通过0.22μm的滤器过滤。在这一分析中使用了分泌B型肝炎病毒颗粒的2.2.15细胞(由G.Ace教授友情提供;见Ace等,Proc Natl Acad Sci USA(1987)84:1005-1009)。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞生长抑制分析进行了72小时。所有其它过程都如Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499描述的那样进行。
将不同的芍药提取物加入到三层壁的96孔板中,其含有终体积为80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸盐、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析过的β-葡萄糖醛酸酶(产自大肠杆菌,购于Sigma)。37℃孵育2小时后,反应用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的终止液终止,并且用活动的微板阅读器在540nm下监控0D值。结果列于表14中
表14.两种芍药制剂的生物学分析*
大肠杆菌 HepG2 Jurkat HBV
β-葡萄糖醛酸酶芍药A 2.8 >1.5 1.1 None芍药B >2.5 ND ND ND*值代表IC50值 ,对照的%。ND,没有检测HPLC分析
用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米颗粒,4.6mm×25cm)的HPLC来分析草药的批并且用紫外分光光度计(Perkin Elmer)来检测。紫外检测监控的波长是280nm和340nm。用泵以1ml/min输送流动相并且流动相含有溶剂A:水和溶剂B:20%甲醇的如下梯度:1)最初的5分钟溶剂为100%的溶剂A;2)在接下来的10分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B;和3)在下个40分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B。之后加100%的溶剂A5分钟。HPLC的标准品是paeoniflorin。
通过HPLC对芍药批进行的分析如图5中所示。算法
被收集的数据形成了用于产生多元正态分布集的多维分析的一部分,其作为确定在生物学活性和标准芍药化学制剂(HPLC),和产地/生长之间基线相关性的手段。
D.大枣
对Radix Ziziphi Fructus(大枣)的评价
大枣因其利尿性质和扶正作用而已得到使用。在这一实施例中使用的大枣批的性质列于表15中。
表15.批性质(大枣)
生物学和酶分析
性质 | 批A | 批B | 批C |
植物名 | ZiziphiFructus | ZiziphiFructus | ZiziphiFructus |
产地 | 河北省 | 美国Kin Man草药中心 | 美国Kin Man草药中心 |
制备方法 | 标准 | 煮沸,30分钟 | 温水,30分种 |
植物部位 | 果实 | - | - |
扼要地,将1克的每一批的大枣提取物加入到10ml的水中(1mg/ml)。如表15所述处理混合物。离心后收集上清液并通过0.22μM的滤器过滤。用HepG2细胞(ATCC cat#HB-8065)或者是Jurkat T细胞(ATCC cat#TIB-152)或者是两者都用来测试大枣的批。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞如上所述培养24小时。
同样地象通过DNA定量来检测的那样评价了批的抑制乙型肝炎病毒的能力。(见Dong等,Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8495-8499)。扼要地,将1克制品加入到10ml水中。混合物如表15所述进行处理。在离心后收集上清液并通过0.22μm的滤器过滤。在这一分析中使用了分泌B型肝炎病毒颗粒的HepG2.2.15细胞(由G.Ace教授友情提供;见Ace等,Proc Natl Acad Sci USA(1987)84:1005-1009)。每一个分析都使用了1∶50的稀释度。细胞生长抑制分析进行了72小时。所有其它过程都如Dong等,Proc Natl AcadSci USA(1991)88:8495-8499描述的那样进行。
将不同的芍药提取物加入到三层壁的96孔板中,其含有终体积为80μl的0.1mM的酚酞葡萄糖苷酸盐、70mM的Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析过的β-葡萄糖醛酸酶(产自大肠杆菌,购于Sigma)。37℃孵育2小时后,反应用200μl的含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的终止液终止,并且用活动的微板阅读器在540nm下监控OD值。结果列于表16中。
表16.三种大枣制剂的生物学分析*
大肠杆菌 HepG2 Jurkat HBVDNA
β-葡萄糖醛酸酶大枣A 1.2 1.5 5.1 None大枣B ND >2.0 ND 52.3大枣C 2.5 ND ND ND*值代表IC50值 ,对照的%。ND,没有检测HPLC分析
用有Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米颗粒,4.6mm×25cm)的HPLC来分析草药的批并且用紫外分光光度计(Perkin Elmer)来检测。紫外检测监控的波长是280nm和340nm。用泵以1ml/min输送流动相并且流动相含有溶剂A:水和溶剂B:20%甲醇的如下梯度:1)最初的5分钟溶剂为100%的溶剂A;2)在接下来的10分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B;和3)在下个40分钟改变溶剂组成为10%溶剂A/90%溶剂B。之后加100%的溶剂A5分钟。HPLC的标准品是白屈菜酸和cAMP。
如图6所示通过HPLC分析了大枣批样品。
算法
被收集的数据形成了用于产生多元正态分布集的多维分析的一部分,其作为确定在生物学活性和标准芍药化学制剂(HPLC),和产地/生长特性之间基线相关性的手段。
因为修饰对本领域技术人员将是明显的,因而先前已给出的详述只是为了理解清楚的目的,并且其中没有应该被理解的非必须的限制。
虽然我们在描述此发明时总是与具体的实施方案联系在一起,但是并不是说我们不能对它有进一步的改进。一般来说,只要遵守此发明的原理,考虑到此发明与当前已知和惯常的使用间的区别,我们就可以使之有多种用途,适用于不同变化。同时,此发明除了具有先前提及的各种功用,亦可在接下来附加的权利要求的范围内使用。
Claims (23)
1.用于预测草药组合物生物学活性的方法,包括:
a)将生物系统暴露于成批的草药组合物并且测量两种或多种分子标记的差异反应,其中差异反应测量的集合组成了草药生物反应阵列(HBR阵列)的数据集;
b)将该批草药组合物HBR阵列与至少一个先前获得的具有至少一种已知生物学活性的、已知的草药组合物的HBR阵列进行比较;和,
c)基于在步骤b)中所作的HBR阵列的比较来预测该批草药组合物的生物学活性。
2.权利要求1的方法,进一步地包括对于草药组合物的另外的一个或更多个批次重复步骤a)直至c),并且选择具有期望的生物学活性的成批的草药组合物。
3.权利要求1的方法,其中使用其它的先前获得的HBR阵列来与步骤b)的HBR阵列进行比较。
4.权利要求1或3的方法,其中标记选自分子标记、细胞遗传学标记、生物化学标记和大分子标记。
5.权利要求1或3的方法,其中先前贮存的HBR阵列是与该批草药组合物的HBR阵列相同的或基本相似的草药组合物的标准化的HBR阵列。
6.权利要求5的方法,进一步地包括调整或修饰批草药组合物以产生与一个或多个标准化的HBR阵列基本相似的HBR阵列。
7.权利要求1或3的方法,进一步地包括使用HBR阵列的比较结果来鉴定在批草药组合物中的保留了已知草药组合物的期望的生物学活性特定分子。
8.权利要求1或3的方法,进一步地包括使用HBR阵列的比较结果来确定哪种已知草药组合物的草药成分可以从已知的草药组合物中排除仍能维持或改善已知草药组合物的期望的生物学活性。
9.权利要求1或3的方法,其中HBR阵列比较的结果鉴定了一种或多种批草药组合物先前已知的生物学活性。
10.权利要求1或3的方法,进一步地包括使用批草药组合物预测的生物学活性来帮助设计包括草药组合物和合成的化学药物的治疗方法。
11.建立草药组合物的标准化的草药生物反应阵列(HBR阵列)的方法,其中该方法包括:
a)选择至少具有一种已知生物反应的草药组合物;
b)将生物系统暴露于草药组合物并且选择两种或多种标记的数据;
c)贮存步骤(b)的标记数据作为一个HBR阵列;
d)对使用两种或多种与在步骤b)中使用的标记相同或不同的标记的草药组合物的批重复步骤b)和c);
e)组合在步骤c)和d)中获得的HBR阵列;和,
f)分析步骤e)组合的HBR阵列以产生草药组合物的标准化的HBR阵列,其中标准化的HBR阵列具有两种或多种至少与草药组合物的一种已知的生物反应相关的标记的数据。
12.权利要求11的方法,进一步地包括将生物系统暴露于一种或多种草药组合物,选择关于一种或多种生物反应的数据,和将收集的生物反应数据加到那个草药组合物的标准化的HBR阵列中。
13.一种评价草药组合物的方法,包括:
a).将生物系统暴露于草药组合物并且收集两种或多种标记的数据;和
b).把收集到的标记数据和与批草药组合物相同或基本相同的草药组合物的标准化HBR阵列进行比较。
14.权利要求13的方法,进一步地包括预测该批草药组合物的生物反应。
15.权利要求11或13的方法,其中标记选自分子的、细胞遗传学的、生物化学的和大分子的标记。
16.权利要求11或13的方法,其中标准化的HBR阵列进一步地包括关于植物相关数据的信息。
17.建立具有已知生物反应的草药组合物的标准化的草药生物反应阵列(HBR阵列)的方法,其中该方法包括:
a).将生物系统暴露于批草药组合物并且测量结果基因表达的质和量的改变以产生那个批的作为一个数据的HBR阵列;
b).使用不同草药组合物的制剂重复步骤a)以产生数据作为附加的HBR阵列;
c).通过分析在步骤a)和b)中获得的HBR阵列来选择一套不同的遗传标记以建立草药组合物的标准化的HBR阵列。
18.评价草药组合物的方法包括:
a).将生物系统暴露于批草药组合物并且测量结果基因表达的质和量的改变,来作为那个批的草药生物反应阵列(HBR阵列);以及
b).比较在步骤a)中获得的HBR阵列和基本上相等的草药组合物的标准化的HBR阵列。
19.权利要求17和18的方法,其中基因表达在转录水平上发生。
20.权利要求17和18的方法,其中基因表达在翻译水平上发生。
21.权利要求1、11、12、13、17或18的方法,其中生物系统选自细胞、组织、器官、整个生物体和体外分析。
22.权利要求11、14和17的方法,其中生物反应选自生理学反应、形态学反应、认知反应、动机反应和自主反应。
23.预测草药组合物的生物学活性的系统,包括:
a.包括一种或多种不同类型的细胞、组织、器官或体外分析的生物系统;
b.批草药组合物;
c.两种或多种分子标记;
d.施用批草药组合物于生物系统和测量分子标记差异反应的装置;
e.计算机处理器,包括存储器,用于分析和贮存分子标记差异反应的测量结果以便产生批草药组合物的草药生物反应阵列(HBR阵列)的数据集;
f.计算机处理器,包括存储器,用于比较批草药组合物的HBR阵列和一种或两种先前贮存的HBR阵列以便预测批草药组合物的生物学活性,其中用于产生一种或两种先前贮存的HBR阵列的草药组合物的生物学活性是已知的。
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