CN1283118A - 药用级人参 - Google Patents
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Abstract
本发明一般性涉及人参材料和用于制备该材料(医学有用,并且具有药学可接受的剂型)的方法。更具体地,本发明涉及组合物和在将人参材料制备成药物的加工过程中的活性指纹的应用,其中限定为药用级组合物,其中适合于临床或兽医应用,以治疗和/或改善疾病、病症或症状。
Description
本申请是1997年10月23日申请的共同待审的美国申请号为08/956616的部分继续申请,其完整公开文本以参考的方式引入本文,后者是1997年4月15日申请的共同待审的美国申请号为08/838198的部分继续申请,08/838198又是1996年4月15日申请的共同待审的美国申请号为08/632273的部分继续申请,08/632273又是1995年4月14日申请的美国申请号为08/421993的部分继续申请,08/421993号申请为了利于1997年2月4日申请的美国申请号为08/774550号申请而放弃。
1.发明领域
本发明总的来水涉及植物药材以及将所述药材转化成医学有用且药学可接受形式的方法。更具体地说,本发明涉及组成指纹和活性指纹在将人参加工成适于临床治疗和/或改善疾病、紊乱和/或病情的具备药用级组合物水平的植物药过程中的应用。
2.发明背景
药物生产是在对各生产批次的组成和生物活性的控制下进行的。这种标准化和控制在对患者的可预期性治疗和一致性治疗中提供了可重现的材料。由植物药材制备的植物药给生产者提出了特殊的问题,即期望实现药物需要的有控制、可重现、和标准化。由于植物药含有多种成分,并且由于原料的生长、收获和加工条件所致的组成和含量的巨大差异,导致上述问题成为首要问题。
植物曾是并还将是大量药物化合物的来源。几个世纪以来,各种形式的植物来源材料被用于治疗无数种不同疾病。植物药材的形式通常是来源于一种或多种植物或植物部分的粉末,或者来源于整体植物或选择的植物部分的提取物。这些粉末或提取物大多数是生物活性和非生物活性成分的复杂混合物。
虽然植物粉末和提取物已经广泛地在医学中应用,但仍然存在很多与这类药物应用有关的问题。例如,植物药材的复杂化学性质使其难于以任何形式的控制和预期方式应用。由收获方式不同的植物得到的不同批次的药材其化学组成的潜在差异导致该药材不适于临床应用。
在积极的方面,植物药材中典型存在的生物活性成分的复杂组合提供了协同或增加生物活性范围的可能。然而,由于这些复合药材的未知特征,其药效的潜在改进还不能预测。
上述与植物药固有的化学复杂性有关的问题导致,在从大量具有药用价值的植物材料中分离提取生物活性成分方面需付出巨大的努力。该研究领域随着化学分离和分析技术的改进得以迅速发展。分离纯化后,各种活性成分可以应用于临床,确定具体成分的药效。从植物药材中分离和纯化个体成分是这类药物发展过程的基础。纯化后,通常将可能的活性成分与药物可接受载体混合,然后进行进一步的试验动物研究以及最终的对人的临床实验。证明临床有效性后,这类药物被认为是药用级的,因为它们含有单一的或至多少数几个含量已知、特征明确的成分。
药用级药物的优点在于可以在治疗方案中精确地跟踪各个成分的作用。而且,可以准确控制药物剂量,提供相对可预测的药物作用。所述相对纯的药用级药物的缺点在于由于将药物从天然环境中分离出来,降低了天然形成植物材料提供的复合潜能和协同生物活性。分离产物的研究也可以称为通过分解敏感的生物/植物复合体制备的人工制品。一些行业专家认为由这种协同活性提供的潜在优势,其价值超过了与特征不明确或临床应用不能控制的复合植物材料应用有关的临床风险。
虽然从植物材料中分离和纯化单一成分成为药物研究和发展的普遍方式,研究复合植物提取物,鉴定其药物质量仍然得到关注。一些复合植物药材和提取物存在有效但相对不可预测的药学特性。由于用未曾建立批次稳定性和组成上差异较大的特征不明的药材治疗患者可能引起的固有风险,使这些药材中的大多数不能应用于临床。因此,需要提供标准化上述复合植物材料的方法,以使它们可以更有效地用于临床研究和治疗患者。
2.1人参的背景知识
人参是人参家族两个成员——亚洲人参或美洲人参的干燥根。人参也被称为高丽参。野生人参十分罕见,但中国和朝鲜已经大面积栽培。人参被称为“世界最好的抗压力滋补品”(Mowrey,1990,下一代植物药,Keats Publishing,New Canaan,CT),在中国几百年来一直被用作壮阳药。虽然应用人参的适应症众多,但一般认为人参增加元气,包括生理和心理机能。已知人参没有禁忌症、副作用、或与其它药物的相互作用。推荐剂量为每日1-2g根;可以用1.75g药物浸剂,每日饮一到两次。或者,可以服用含250mg根的胶囊(Tyler,1994,草药的选择,Haworth Press,NY)。
人参应用的主要适应症是其对神经系统和心血管系统的作用。看起来人参能够有效地增强精神活动和智力行为。特别是增强生殖能力和精确性(Fulder,1984,关于人参,Thorsens Publishers,New York)。据认为它也可以增强学习能力。据报道,人参有助于转移压力产生的生理影响,例如保护胃免受压力诱生的溃疡。令人感兴趣的是,动物研究表明,除去肾上腺后人参引起的生理反应消失(Mowrey,1990,下一代植物药,Keats Publishing,New Canaan,CT)。也曾报道人参降低心率和血压(Chen,1982,Chung Hua Hsin Hsueh Kuan Ping Tsa Chih,10(2):182-187)以及增加血管弹性。
曾报道人参对大量其它适应症有效,包括增加耐力,减少疲劳和衰弱的次数,加速蛋白质和脂类的合成,刺激免疫系统,增强生殖力,作为抗毒素,促进对辐射的抗性,对氮气和芥子气毒害的保护,促进抗体产生,作为抗炎药,作为退热药,作为止痛药,延长寿命和抵抗自然衰老过程,以及加速康复。还报道人参表现抗癌活性,以及治疗其它病情例如糖尿病、哮喘、头痛、贫血、消化不良、阳痿、抑郁、和月经不调有效(Mowrey,1990,下一代植物药,Keats Publishing,NewCanaan,CT)。
3.发明概述
本发明提供了制备药用级人参的方法。该方法是PharmaPrintingTM的过程。在一个实施方案中,该方法包括以下步骤:提供植物药材,例如人参,其含有大量具有特定生物活性的成分;从植物药材中取出有代表性的部分;将该部分分成若干标记组分,其中每种标记组分含有至少一种活性成分;确定给定标记组分的特定生物活性的程度,以提供该部分的生物活性指纹;将该部分的生物活性指纹与已建立的药用级人参的生物活性指纹标准相比较,提供生物活性指纹比值,根据生物活性指纹比值确定该植物药材是否是药用级人参。
本发明还提供了一种方法,包括以下步骤:提供植物药材,例如人参,其具有特定的生物活性,所述植物药材含有多种成分;将植物药材的代表性部分分成若干标记组分,其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分;确定各标记组分的特定生物活性的程度,以提供该代表性部分的生物活性指纹;将该代表性部分的生物活性指纹与已建立的药用级人参的生物活性指纹标准相比较,确定该植物药材是否是药用级人参。
在一个实施方案中,一种或多种标记组分含有一种活性成分。
本方法还包括其它步骤:确定各标记组分中活性成分的含量,提供该部分的定量组成指纹,将该定量组成指纹和生物活性指纹与定量组成指纹和生物活性指纹标准相比较,确定是否该植物药材是药用级人参。该方法还包括其它步骤:确定植物材料所述部分的总生物活性,将该部分的总生物活性与已建立的药用级人参的总生物活性标准相比较。
本发明还提供了制备药用级人参的方法,所述方法包括以下步骤:提供含有多种具有特定生物活性成分的人参药材,其中各活性成分具有标准化的生物活性谱;从该植物药材中取出有代表性的部分;将该部分分成若干标记组分,其中每种标记组分含有至少一种活性成分;测定每种标记组分中存在的各活性成分的量;基于各活性成分的存在量以及标准化的成分的生物活性谱计算各标记组分的生物活性,提供该部分的计算生物活性指纹;将该部分的计算生物活性指纹与已建立的药用级人参的生物活性指纹标准相比较,提供生物活性指纹比值,根据生物活性指纹比值得以确定是否该植物药材是药用级人参。
本发明的方法可用于从具有特定或所需生物活性的合适植物药材中制备药用级人参。植物药材优选由植物材料提取到的提取物,例如水提物或有机提取物(例如醇提物或超临界二氧化碳提取物)或可以进行进一步处理的有机溶剂提取物。或者,植物药材是植物材料粉末、种子油、香精油、或水蒸汽蒸馏产物。在一个实施方案中,植物药材是单一物理状态的均匀材料,例如油或溶液。植物药材可以是单独地来源于目的植物的纯化材料。
在本发明中,活性成分可以包括但不限于一种或多种下列化学种类:人参皂甙、多聚乙酰、生物碱、碳水化合物、类胡罗卜素、肉桂酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、类黄酮、糖甙、异戊二烯类、脂类、大环抗生素、核酸、青霉素、多肽、酚类、聚乙炔、多聚乙酰、多酚、多糖、蛋白质、前列腺素、甾类和萜类。
在一个实施方案中,本发明提供了制备药用级人参的方法,其中一种或多种标记组分含有两种活性成分。在另一个实施方案中,本发明提供了制备药用级人参的方法,其中至少一种标记组分含有至少一种选自人参皂甙Rb1、人参皂甙Rg1、γ-氨基丁酸、谷氨酸、和谷氨酰胺的标记成分。在另一个实施方案中,本发明提供了制备药用级人参的方法,其中活性成分选自人参皂甙Rb1、人参皂甙Rg1、和γ-氨基丁酸。
人参的生物活性/临床适应症与人或其它动物的疾病、功能失调或病症有关。因此该方法可用于制备用于治疗和/或改善和/或预防人和/或兽类疾病、功能紊乱或病症的药用级人参。适应症的例子包括但不限于,肾上腺功能紊乱、过敏症、心血管疾病、癌症或中枢神经系统紊乱、内分泌失调、胃肠道疾病、炎症、代谢性疾病、恶心或微生物或病毒诱生的疾病、以及压力疾病。
在这些实施方案中,所述部分可以分成生物活性成分和非生物活性成分。而且,标记组分可以含有一组相关成分。
本发明还提供了制备药用级人参的PharmaPrint的方法。并且本发明提供了通过上述方法制备的药用级人参。
在一个替换实施方案中,人参(亚洲或西伯利亚变种)可以与一种或多种选自下述的植物药材组合:芦荟、紫云英、越桔、牛蒡、甘菊、栗子、coriolus versicolor、茅草、crampbark、蒲公英根、dong quai、土木香、月见草、小米草、false unicorm root、小白菊、大蒜、姜、银杏、goldenseal、gota kola、葡萄子提取物、绿茶、guggulipid、山楂、蛇麻子、常春藤、kava、甘草、水飞雉、槲寄生(美洲、亚洲和欧洲变种)、益母草、燕麦、osha、粉色西番莲、南瓜、pygeum、红三叶草、迷迭香、撒尔沙植物、saw palmetto、黄芩、St.John’s wort、小荨麻、V.agnus-castus、wild indigo、wils yam、和yerba mansa。本发明的制备药物的方法包括PharmaPrintingTM人参加一种或多种上面所列植物的方法,以及含人参和一种或多种上面所列植物的药用级药物。在该实施方案的一个方式中,人参可以与紫云英、甘草、和/或撒尔沙植物组合。以举例说明的方式而不是限制的方式,药用级人参可以与药用级植物药材混合,例如echinacea、缬草和/或black cohosh。参见1997年10月23日申请的,发明名称为“药用级echinacea”,美国申请号为08/956603(代理人档案号为9117-015)的美国专利申请(其全文作为参考插入本文);还参见1997年10月23日申请的,发明名称为“药用级缬草”,美国申请号为08/956615(代理人档案号9117-016)的美国专利申请(其全文作为参考插入本文);还参见1997年10月23日申请的,发明名称为“药用级black cohosh”,美国申请号为08/956611(代理人档案号为9117-018)的美国专利申请(其全文作为参考插入本文)。
3.1定义
术语“药用级”,在本说明书中应用的含义是,植物药中的某些特定生物活性成分和/或非生物活性成分必需在明确规定的绝对和/或相对浓度范围内,和/或这些成分经疾病、失调或病症特异性生物活性检测测定必须表现一定活性水平。所述疾病、失调或病症可以是人或动物患有的。
就象本领域技术人员理解的,术语“药用级”不意味着暗示该植物药只适用于受控制的产品,例如处方列出的药,即“处方药”,或柜台提供的药,即“非处方药”。该术语同样适用于处方列出的药物、非处方药、或者作为饮食添加的成分,即“食品添加剂”。
本文提到的“成分”指分开的化合物(即化学物质),其天然存在于植物药中,或者加入植物药,从而制备具有规定生物活性范围和/或组成范围的成分的药用级植物药。
本文提到的“活性成分”指一种或多种成分,其在疾病特异性生物检测中得到的各个成分活性总和,它占该植物药材观察到的生物活性的实质性部分。优选活性成分的活性总和占观察到的生物活性的大部分或超过50%。
本文提到的“组分”一般指具有规定参数例如溶解度、分子量范围、极性范围、吸附系数、结合特性、化学反应性、或选择性溶解度的一组成分或一类结构类似的成分。组分更经常为选择性溶剂溶解技术和分离技术(即液-液萃取)的产物,包括pH依赖性分离、色谱分离技术即闪光色谱、制备型高效液相色谱(HPLC)、制备型气相色谱、分配色谱、制备型薄层色谱、亲合色谱、尺寸排阻色谱、液-液色谱例如逆流色谱或向心色谱或离心色谱。
通过参考下面部分以及附图中对本发明的详细描述和具体实施方案的例子可以更充分地理解本发明。
4.附图简述
图1是按照本发明用于建立标准化学和/或生物活性指纹的程序的示意图,所述标准指纹用于在制备药用级药物过程中,将随后处理的植物药材与之相比较。
图2是按照本发明用于将植物药材加工成为药用级药物的程序的示意图。
图3是分离不同类生物活性组分的程序的示意图。
图4是人参商业产品的比较,其中列出了为六种商业产品(即品种A-F)确定的所示的特定物质(化合物)的百分数(%w/w)。简称:Rg1,人参皂甙Rg1;Re,人参皂甙Re;Rb1,人参皂甙Rb1;Rc,人参皂甙Rc;Rb2,人参皂甙Rb2;Rd,人参皂甙Rd;Rf,人参皂甙Rf(未显示)。
5.发明详述
5.1 PharmaPrintingTM法
本发明提供了制备可以被分类为药用级植物药的方法。该方法被命名为PharmaPrintingTM。用本发明方法生产的药用级植物药尤其适合应用于临床研究,更重要是用于治疗患者。该方法确保特定方案中应用的药物质量稳定,始终适于用作人和兽类预防或治疗剂。
本发明提供了密切控制植物提取物和其它植物药材(例如植物提取物和来源于生物制品的哺乳动物组织)的质量、剂量和临床效果的可能。本发明的一方面涉及为各种植物药材建立化学和/或生物活性指纹标准。一旦该标准建立后,其被用于药物生产程序,以确保植物材料符合药用级要求。本发明进一步提供了为多种植物药材建立的具体定量指纹和生物指纹。这些指纹用于确定是否具体植物药材符合特定治疗方案中药物活性要求和药物组成要求的水平。该确定对于保证用植物药材进行的临床研究和患者治疗是基于一致的和可证明的提取组合物参数是重要的。
本发明可用于提供充分表征,批次间组成一致的植物药材,以便可以精确地确定它们的给药剂量,并有效地应用于临床。本文所述的方法提供了临床实验结果可重现的保证。
首先,得到目的植物药材的样品。一些植物药材可以原料的形式或以加工过的提取物的形式通过商业途径获得。通常它们是植物提取物或其它的意欲被用作药物的组合物。加工后的药材可以包括表现特定生物活性的多种活性成分和不直接表现相关生物活性的多种非活性成分。在一个实施方案中,从植物药材中取出一部分,将其用于质量保证程序或标准化程序。优选该部分为均匀植物药材的代表性部分。该程序涉及将植物药材部分分成若干标记组分,其中每种标记组分包括至少一种活性成分或者有时含有一种非活性成分。确定各标记组分中的活性成分或非活性成分的量,以便提供该部分的定量指纹。同时确定各标记组分的生物活性的程度,以提供该部分的生物活性指纹。然后将该部分的化学和/或生物活性指纹与为药用级药物建立的相应指纹相比较。如果该植物的指纹与标准指纹相当,那么该植物被鉴定为药用级植物药。如果不能,那么可以改良该植物药材以便使其与标准指纹相当,或者不使用该植物药材。
5.1.1形成PharmaPrint的方法
当一些药材的推定活性成分已知,则其PharmaPrint方法的形成始于文献综述。这涉及综述化学文献、生物学文献、已出版的药材的生物检测方法和临床数据。尤其有用的信息资源是由Norman Farnswroth博士为伊利诺斯州大学(Chicago)药学合作研究负责程序管理的NAPRALERT计算机数据库;Leung和Foster,食品、药品和化妆品中应用的常见天然成分大全(Encyclopedia of Common Natural IngredientsUsed in Food,Drug and Cosmetics),第二次编辑,John Wiley & Sons:New York,NY,1996;草药和植物药(Herbal Drugs andPhytopharmaceuticals),N.G.Bisset编,CRC出版社:Boca Raton,FL,1994;Duke,生物活性植物药及其活性手册(Handbook of Biologically ActivePhytochemicals and Their Activities),CRC出版社:Boca Raton,FL,1992;Tyler和Foster”草药和植物药产品(Herbs and Phytomedicinal Products)”,非处方药手册(Handbook of Nonprescription Drugs),Berardi等编,UnitedBook Press,Inc.:Washington,DC,1996。对于一种特定适应症,必须研究文献确定推定的活性成分确实与那种疾病状况有关。另外,如果公开了推定活性成分和适应症的任何生物检测法,生物检测必须与适应症和推定活性成分一致。适当的生物检测应与临床相关端点结合。生物检测应在一段较宽的浓度范围内定量。通常,制作IC50曲线(半数抑制浓度)、EC50(半数有效浓度)、或者适当的Ki或Kd(酶离解常数和其抑制物的离解常数)曲线。然后对植物药材的推定活性成分和色谱组分进行彻底的化学和生物学分析。分析结果,确定样品中各化学成分的生物活性定量分析。然后,将样品的生物活性作为一个整体与单独成分的生物活性比较。在这一点上,个体化学成分可以与临床相关端点相关。同样的方法可以应用于测定刺激或抑制效果的生物检测。
基于个体成分的活性和已知的总活性,如果混合这些成分,它们应当占生物活性的基本部分。通常,混合活性至少占总活性的25%。
优选个体活性成分的活性总和占观察生物活性的大多数或超过50%。更优选,分离的个体成分代表超过70%的活性。更优选分离的个体成分代表超过80%的生物活性。
另一个考虑是尽可能选择较少的活性成分作为PharmaPrint的部分。较少的活性成分对于在原料的接受和加工方面的实际考虑是重要的。本发明建立了有关化学成分和生物活性之间的相关性。一旦满意的相关性建立后,就可以不必对每个样品的生物指纹进行操作。目的植物药材各样品的适当成分和/或标记组分的化学分析足以代表大多数生物活性,然后确定某种给定植物药材样品为药用级。
在一个实施方案中,本发明可以涉及下列程序之一。一个程序(如图1所示)涉及为一种特定的药用级植物药建立组成和生物活性指纹标准。指纹标准建立后,可以如图2所示将植物药材实际加工成药用级药物。
为特定植物药材建立化学和/或生物活性指纹的开始步骤涉及将提取物或粉末分成一组或多组(如图1步骤1所示)。基于这些组作为指纹标记(可以含或不含活性成分)的潜力分离并鉴定这些组,所述指纹是为加工的植物药材而建立。经选择和鉴定作为潜在标记的推定成分或推定成分组根据被加工的植物药材和药物用途变化较大。每种植物药材至少应当选择两种推定标记。潜在标记的数目可以超过五个,对于复杂的植物药材提取物或粉末可以多达15-20或者更多。潜在标记的鉴定和选择大部分基于它们的潜在生物活性或对特定药物应用的生物活性的贡献。对于不同的适应症,可以用不同的提取方法对同样的植物药材制备提取物,以便优化特定的生物活性组成。自身无明显生物活性的标记可以被分离,可以被包括作为指纹中应用的标记。当这些标记的存在能够指示提供观察到的植物药整体生物活性的基本部分的其它活性成分的存在时,这些“代理”标记可以作为理想的内标。它们还有助于确定药物的正确植物学名称(即chemotoxonomy)。
将植物药材分成各种推定标记组的最初分离步骤可以通过简单的萃取分离到复杂的亲和色谱技术等常规分离技术实现,包括凝胶过滤色谱、发光硅胶色谱和反相色谱。一旦鉴定到特定植物药材的推定标记后,则如图1步骤2所述测定各标记的生物活性。用于测定植物药材生物活性的特定生物检测法基于植物药材的预期用途进行选择。优选生物检测将能够反映推定标记的关于用植物药材治疗的疾病或适应症的生物活性。
步骤2中得到的生物检测结果被用于鉴定具有所需生物活性的成分(步骤3)和较少活性或基本上无活性的成分(步骤4)。然后定量分析步骤3和4中鉴定的各组,确定各组中存在的各鉴定组分的量。然后如图1步骤5所述用生物检测和定量组成分析的结果制作植物药材的生物检测指纹和/或化学指纹。确定生物活性和/或化学组成的可接受范围,作为建立植物药材指纹的一部分。此步操作主要基于建立各标记的生物活性和定量的可接受范围,这能够提供加工材料所需的整体药理活性。
另外,可以评价活性和非活性标记的各种组合,以确定由活性和非活性成分组合导致的所需生物活性的潜在增加。
步骤5建立的生物检测和定量指纹可以准确鉴定植物药材,这可以用于建立临床应用所需的剂量疗法和治疗方案。利用任何新药研究中通常应用的常规临床方法建立剂量疗程和治疗方案。用于确定剂量和治疗方案的加工材料必须与步骤5建立的指纹的要求匹配或相符。该方法能够确保剂量和治疗方案有效并可重复,因为用于研究剂量和方案的加工材料都具有同样的本发明的指纹。
通过如图1所示的一般程序确定的生物检测和定量指纹作为制备药用级植物药的部分生产程序。该指纹被作为定性确认或标准化程序的一部分,以确保特定植物药材含有适当的化合物,可以被正确加工,以提供与已经被标准化并按照如图1所示的程序测试的材料发挥相同临床作用的植物药。
制备本发明的药用级植物药的实例程序如图2所示。首先通过萃取、粉末化或其它生产方法加工目的植物药材21,以制备加工的植物材料22。然后分析加工材料22的样品,确定其是否与图1标准化程序中建立的指纹要求相匹配。该定性确认或标准化程序如图2步骤23所示。如果加工材料符合前面建立的特定材料的指纹要求,则其如步骤24所示可以被认为是药用级的。如果该材料接近但不十分符合标准指纹,则按照需要对其改进,以符合指纹标准(步骤25)。使加工材料符合指纹标准的改进可以通过很多方法进行。进一步加工植物药材的方法可以包括对植物药材的进一步萃取、选择性萃取、选择性加工、批次重组(例如,将高剂量和低剂量的批次混合,以制备药用级药材)或者按照需要添加各种化合物。如果植物药材基本上落在生物活性标记和定量标记的指纹范围之外,则抛弃该批次(步骤26)。
在一个实施方案中,用于确定特定植物药材是否属于药用级的定性确认标准化步骤23包括取得均匀样品,优选均一样品,或者待测植物药材的一部分。样品应当包括活性成分,其为药材提供观察生物活性并产生前面确定的标准品的生物活性和/或化学指纹。样品还将包括一种或多种非活性成分。非活性成分是那些不具有直接可测量的生物活性的成分。非活性成分包括下列种类:活性非常低以至于不能占活性的基本部分的成分;其存在表明其它活性成分的存在,可以作为其它成分的代理标记的成分;在相关检测中不表现化学或生物学活性的非活性成分。优选样品仅是待测植物药材的一小部分。因此,取得代表药材全部批次的均匀样品优选均一样品是重要的。
图3显示了一个更详细的方案,表明存在于植物药材水提取物中的不同成分的最初分离步骤。随后采用萃取和沉淀分离水或有机相中的活性成分。图3的方案尤其很好地适用于从植物药材例如槲寄生中分离水溶性活性成分类型。
图3显示了一个分离植物主要化学成分类型的实例性通用方法。主要应当使用新鲜植物(包括叶、根、花、浆果和茎),虽然也可以使用干药材。如果需要可以使用植物的特殊部分,例如叶、花、茎或根。
在该方法中,可以在液氮温度下冷冻植物的特殊部分或整体植物。这有助于粉碎,并保证活性成分的完整性和效力。
用蒸馏水反复提取磨碎的粉末。如果需要,用热水、乙醇、其它有机溶剂、水醇溶液、稀释乙酸或它们的任意组合进行提取。选择的实际温度优选接近或为水的沸腾温度。优选首先确定提取物的总生物活性。混合的提取物用于进行特定生物检测,例如,如果药物被用作抗菌药,则在有盖培养皿中进行抑制细菌生长的试验。或者,如果药物预期用作抗癌药,则优选进行抑制癌细胞细胞培养的试验。从这些数据计算每毫升提取物中含有的生物活性单位(生物活性单位被定义为在试验系统中该提取物抑制50%的细菌或癌细胞生长的稀释倍数)。可以用于计算刺激效果例如免疫激活等的类似生物活性单位。
为了建立本发明的药物指纹(PharmaPrint),按照图3所示的程序提取植物,将其分为主要成分(例如皂甙、萜类、脂类、生物碱、核酸、蛋白质和碳水化合物)。各成分的分离组分按照需要测试生物活性。这可以指活性(例如槲寄生群的蛋白质和生物碱组分)。进一步用亲和色谱、高效液相色谱、气相色谱或其它色谱将活性成分组分成个体成分。以重量和特定生物活性单位为基础量化提供主要生物活性的成分。这些成分能够为最初的草药提取物提供建立药物要求的指纹。每毫升药用级提取物的生物活性单位为临床研究提供了建立准确剂量的方式。
一旦样品分离成个体标记组分,其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分,对每个组分进行分析,以测定其活性成分的量,并提供样品的定量指纹。每个成分的定量可以通过应用任何已知的定量分析方法获得。示范性的定量方法包括重量分析、光谱分析或应用定量检测器,如使用气相色谱或高效液相色谱和其它分离系统。其它适合的定量方法包括通过酶、放射性、比色、元素分析分光光度法、荧光或磷光和抗体检测(如酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射性免疫测定(RIA))进行分析。
在一个实施方案中,每个组分定量分析的结果用于制备样品的定量指纹。指纹由成分在每个标记组分中的量和该成分的身份组成。然后将该定量指纹和已建立的已知标准指纹相比较(图1),以确定该材料是否为药用级。如果样品的定量指纹落在药用级指纹要求的定量范围内,该材料可以被鉴定为达到药用级。
作为进一步的质量保证分析,对个体标记组分可以进行生物学检测。用于不同组分检测的生物学检测和用于标准指纹的相同,也依赖于该材料特定的临床应用倾向。
从该材料获得的生物活性和已建立的标准生物活性进行比较,以确定该材料是否为药用级。如果样品的生物活性指纹落在药用级指纹要求的生物活性范围内,该材料可以被鉴定和证明为达到药用级。
5.1.2.可选的形成PharmaPrint的方法
当推定的植物药材活性成分未知时,其形成PharmaPrint的方法也始于文献综述。这涉及综述该植物药材,或相关植物药材,或由相关活性的植物药材可获得的任何化学文献、生物学文献、已出版的生物检测方法和临床数据。根据疾病状况,选择一系列相关的生物检测法。应用生物检测法分析样品或提取物的总体活性。然后将该显示活性的生物检测法用于推定的活性成分未知的植物药材的组分分析。这种分离是根据通常的方法进行的,例如,通过介电常数、生物亲合性、极性、大小、溶解度或吸附粉末分离。然后分析组分,以确定哪一个组分有活性。假定发现活性,再分馏每个活性组分,以分离单个的推定的活性成分,即,化学成分单一的化合物。根据已知的单体化学化合物和它们定量的生物活性,可以绘出定量效能曲线,并可以测定出每个单体化学化合物的半数抑制浓度(IC50)。如果推定活性成分是激动剂,可能需要其它的参数(结合、活化、应答)。在通常情况下,生物检测由以下组成:对成分、组分或整个提取物的刺激或抑制作用的进行适当检测,然后对这些影响进行适当定量评价。对于最可能的(或典型的)检测(其中标准(或放射标记的)激动剂或拮抗剂产生可以测定的作用),可以对该材料的抑制和/或刺激进行评价,并典型地通过IC50、EC50等或其它适当的参数(Ki、Kd、Km等)进行表示。然后将单个推定活性成分的活性相加,和未分馏的植物药材样品进行比较。如果这些成分是主要活性成分,那么它就具有植物药材(其中活性成分未知)“活性成分”的一个最初指纹。
5.1.3.形成PharmaPrint方法的其它改变
如果在检测过程中出现复杂情况,从上述假定活性成分未知的植物药材PharmaPrint概括的普通方法具有几种改变。一种改变发生在个体成分的活性总和不占植物药材生物活性的主要部分的情况。在这一点,有几种减少个体成分活性的可能原因,第一,活性成分的分解或降解,或,第二,协同作用。另一种可能的情况,从任何组分都没有发现明显的或大量减少的活性,但是植物药材或提取物在生物检测中显示出活性。和标准相比,非特异性基质作用也可能减少总体提取物的活性。
如果活性成分在分析过程中分解,测定相对简单。仅是组分再结合时,再结合组分的活性和原材料的活性进行比较。如果活性损失较大,那么问题可能在于分解。为了确定哪一个活性成分分解,将植物药材原药的色谱分析和再结合组分进行对比。峰消失或峰面积减小表明该成分可能分解。为了克服许多方法存在的分解,典型地,可以使用温和的提取/分馏方法,如液-液色谱(反相流动色谱)或超临界二氧化碳提取或色谱。
对于个体组分的活性不占植物药材生物活性总和的主要部分的另一个解释,是一个或更多活性成分之间或和非活性成分之间的协同作用。为了确定协同作用的发生,需要对成对的(pair-wise)再结合组分进行分析。如果结合成分比个体组分显示更高的活性,组分中两个或更多的个体成分可以产生协同。例如,一个药材可能含有3个组分,每一个单独具有10%的活性(即,它们未结合的生物活性总和为30%),但是结合后具有100%的活性。在这种情况下,组分间协同作用。通过重复对组分成对(pair-wise)再结合或观察更大的组分,任何协同活性都会发现。一旦两个组分表现出协同,像上面那样进行再分馏,研究成对的个体组分或成对的分离成分,以发现产生协同的个体成分。也可以研究个体成分或组分三种方式的比较。
为什么当植物药材显示出活性,而组分在生物检测中无活性?这里,解释包括分解、协同、或许多活性成分而没有个体组分显示活性。第一步是分馏每一个最初的组分,看生物检测中是否有活性成分。如果没有,组分应该再结合,分析确定是否有活性的分解发生。如果发生分解,应该按照上面所述进行适当的测定。如果没有分解,应该尝试可选的分馏方法。最终,足够大量或适当大小或选择的组分显示出活性。如果怀疑协同,按照上面描述的协同部分进行实验。
5.2.加工和提取植物药材材料的方法
植物药材材料可以加工形成整个植物或植物的选择部位的水或有机提取物。整个植物或部分的植物药材材料还可以加工形成粉末。许多感兴趣的植物药材商业可以购买到粉末、水提取物、有机提取物或油。在一个实施方案中,优选植物材料提取物,因为它们易于溶解在液体药物载体中。但是,粉末植物材料非常适合许多以固体剂型(例如片剂或胶囊)给药的应用。这些都是本领域熟练技术人员已知的方法。并且,许多植物材料和/或提取物可以商业购买。作为植物药材的加工和提取实例,下文提供了实施例。另外对提供的实施例进行了详细的描述。
对于有代表性的根部,可以切片、冷冻或研磨成粉末。如果是粉末状的,用适当的溶剂振摇,过滤(Tanabe等,1991,Shoyakugaku Zassi,45(4):316-320)。或者,可以采用以下方法:使根均质化,丙酮提取过滤;可以对植物药材进行蒸汽蒸馏,以获得必要的油,馏出液溶解于丙酮-水或适当的溶液;或者切片的根茎冷冻和/或冷冻干燥,得到的粉末用丙酮-水提取(Tanabe等,1991,Shoyakugaku Zassi,45(4):321-326)。另一个加工植物药材的方法是用100℃水溶液提取(Yamahara等,1985,J.Ethnopharmacology 13:217-225)。从上述方法提取的最初溶液,可以用适当的溶剂应用液/液提取进一步提取。植物药材可以分别使用极性或非极性溶剂进行两步提取。然后蒸发溶剂,合并组分(Nagabhusan等,1987,Cancer Let.36:221-233)。植物药材还可以加工成可以蒸煮的糊状物或粉末(Zhang等,1994,食品科学杂志(J.Of FoodScience)59(6):1338-1343)。
提取干燥的植物药材可以使用许多溶剂,例如丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、己烷、异丙醇、甲醇、其它的醇、和超临界二氧化碳(Sipro等,1990,国际食品科学和技术杂志(Int.J.Of FoodScience and Technology),25:566-575,和其中的参考文献)。
对于其它的植物药材如saw palmetto,医药产品为种子油或浆果。再一个有代表性的制备中,制备采用己烷或超临界二氧化碳提取。许多saw palmetto制剂可以商业购买,例如PermixonTM或TalsoTM。对于临界二氧化碳提取植物药材的一个实例,参见Indena,欧洲专利No.0 250953 B1。或者,可以将植物药材碾碎,在索氏萃取器中用适当的溶剂(90%)提取(Elghamry等,1969,Experientia 25(8):828-829)。还可以用乙醇提取植物药材(Weisser等,1996,前列腺(The Prostate),28:300-306)。
可以用多种方法制备干燥材料,包括冷冻干燥、微波干燥、液氮冷却和研磨成粉末70℃真空干燥10小时;或阴凉处空气干燥,或热空气干燥(List和Schmidt,Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis,Springer-Verlag:纽约,1933,1973-1979;Araya等,1981,比较病理学杂志(Journal of comparative Pathology,135-141)。浸剂、稀释的水溶液提取物、还已知浸剂,可以用60-100C水制备(Nosel和Schilcher,1990)。还可以使用煎剂。当粒子大小小于0.25mm时,提取更有效率(List和Schmidt,植物药学技术,CRC Press:Boca Raton,FL,1989)。
对于制备植物药材的油提取物,有许多指导原则。植物药材可以在油中45℃下消化(浸渍)10天,同时还推荐70℃下12-24小时(Hobbs,1989,HerbalGram 18/19:24-33;Smith等,实验室中药药学定量确认:Williams,OR,1996)。在St.John’s Wort中,例如,据报道提取中将制品暴露于太阳光下,导致黄酮类含量提高40%(以四羟黄酮计算)(Maisenbacher和Kovar,1992)。另外,据报道对于St.John’s Wort,油制品中的金丝桃素(hypericin)增加20%,其中材料经乙醇进一步提取,和油混合(Georgiev等,1983,Nauchni Tr.-Vissh Inst.Plovid.30:175-183)。
或者,可以制备植物药材的乙醇-水制品(Dyukova,1985,Farmitsiya34:71-72;Georgiev等,1983,Nauchni Tr.-Vissh Inst.Plovid.32:257-263;Wagner和Bladt,1994,Kowalewski等,1981,Herba Pol.27:295-302)。按照Hagers Handbuch植物药材的酊剂,如St.John’s Wort,可以通过应用药物或冷冻乙醇浸泡植物药材,过滤,在深色瓶中保存(List和Horhammer,1993)。
一些植物药材,如St.John’s Wort,对温度和光都敏感。对于该类植物药材,应该干燥和制冷剂一起包装,或冷藏运输,并闭光和空气保存。在St.John’s Wort中,当在60℃-140℃保存6周以上,粉末提取物、片剂和糖浆制剂中的金丝桃素(hypericin)含量明显减少。干燥提取物在20℃下保存,至少1年保持稳定(Adamski等,1971,Farm.Pol.27:237-241;Benigni等,Hypericum.Plante Medicinali:Chimica.Farmacologia e Terapia,Milano:Inverni & della beffa;1971)。St.John’sWort的其它成分,发现油制剂中的hyperforin和adhyperforin非常不稳定,特别是暴露于光线下,和14日降解的一样多(meisenbacher等,1992,Planta Med.,351-354)。乙醇提取的制剂稳定性(在空气中)提高至6个月。同样地,检测到四个呫吨酮和几种黄酮类化合物(包括四羟黄酮和13’,Ⅱ 8-biapigenlin),认为它们可能是外用制剂的活性成分(Bystrov等,1975,四面体通讯(Tetrahedron Letters)32:2791-2794)。
5.2.1.植物材料和粉末植物材料的液体提取物
有代表性地,人参以植物药材材料(其为粉末状根的水或醇提取物)或原料中药材的形式提供。植物药材通常的液体提取物剂型为“浸剂”。浸剂的制备可以通过浸渍或煎煮加工。浸剂通常是从干燥或新鲜的植物药材中提起水溶性成分有效的方式。
另一个通常的液体植物药材提取物为酊剂。有代表性地,植物药材酊剂为从新鲜或干燥的植物药材的醇或水醇提取物。它通常通过渗透或浸渍加工制备。
植物药材浓的酊剂,和酊剂母液中,100ml酊剂可以代表10g植物药材(干燥重量)。通常的植物药材,100ml酊剂可以代表20g植物药材。在这些制剂中,干燥植物药材和溶剂的比例分别为1∶10和1∶5。这些浓度已经被美国国家药典官方认可,通常制备1∶4和其它浓度的酊剂。
和植物药材粗提取物相比,酊剂的微生物量减少,保存期更长。这主要是由于提取液中含有20%或更大浓度的醇。有时液体提取物由甘油和水作为溶剂进行制备。该甘油溶液通常需要含有至少50%的甘油,以抑制微生物的污染。甘油溶液还可以通过酊剂蒸干乙醇,“后加入”甘油进行制备。
另一种类型的液体提取物为“流体提取液”。流体提取液为植物药材的液体制剂,其药物性质为1ml提取液代表1g干燥植物药材。官方的解释是按照官方的标准(其中使用的溶剂已确定)浸透加工进行制备。
通常通过溶剂蒸发的浓缩液体提取物,可以形成油状、半固体或固体的提取物。
干燥的液体提取物在除去溶剂前,通过液体提取物、油或半固体在适当的载体上吸附进行制备。或者,干燥的粉末状提取物可以按如下制备:从液体提取物中除去溶剂,得到粉末状的固体提取物。
5.3组分的分离
一旦制备出样品提取物和/或可选地商业购买提取物,就需要进行组分分析。如果已经建立指纹,样品或等分试样分成许多相同的具有标准指纹的标记组分。每一个标记组分包括一个或更多的活性或非活性成分。分别根据每一个待测植物药材,建立标记组分。对于一些药材,只需要很少几个标记组分。对于其它更复杂的药材,可能有许多标记组分。例如,槲寄生Viscum album L.蛋白质提取物,优选的蛋白质标记组分为根据组分与糖结合的亲和性分离的组分。但是,根据植物药材中成分的类型,可以建立鉴定和将材料分成标定组分的不同参数。将样品分离成标记组分可根据常规技术中的任何一种来进行,例如液相色谱和抽提方法。应该使用与用于建立标准指纹相同的程序。因为需要测定许多组分的生物活性,因此优选应用非破坏性的分离技术。液柱色谱是一种有用的分离技术,它使用了根据具体所使用的化合物的特定亲和能力的亲和色谱(例如,碳水化合物和靶向酶)。
分馏后,除去溶剂,材料溶解于适当的介质中,用于生物检测。适当的介质的例子包括DEMO、乙醇、不同的洗涤剂、水和适当的缓冲液。溶剂的选择依赖于待测成分的化学性质和与测定系统的相容性。
5.4适当的生物检测方法的建立
示范性的生物检测可以包括任何细胞增殖检测,如L 1210细胞抑制的测定,和特定疾病相关的免疫活性或关键酶的抑制。可用于生物检测的其它转化细胞系的实例包括HDLM-3Hodgkin’s淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤,肝细胞瘤细胞系,携带特定细胞受体或酶的人/动物细胞系的初级或已建立的培养物。
生物检测的结果用于制备药材的生物活性指纹。指纹可以像两个选择标定组分的检测一样简单。相反,指纹可以包括对许多不同组分进行的大量不同的生物检测。可以对不同的标定组分进行相同的检测。也可以对相同的标定组分进行不同的检测。生物检测的结合依赖于特定的植物药材和它可能的临床应用的复杂性。生物检测要和标准药材建立生物活性指纹的方法相同。
5.4.1.酶和基于受体的检测
本发明实际应用中优选酶和基于受体的检测。检测的选择或是根据临床疾病可接受的酶检测,或是从特定临床疾病相关的检测中选择。选择适当、有效的生物检测非常重要。理想地,生物检测应该是稳定的,即经时具有重现性,并在一个较宽的浓度范围内显示出定量的剂量反应。对于活性成分未知的植物药材,选择相关的生物检测。根据可能的活性机理,以人的治疗应用作为指导,选择本领域已知的检测。活性机理应该和临床相关应用相一致。根据酶活性、受体结合活性、细胞培养物活性、抗组织活性和整个动物体内活性,存在大量的临床相关检测。
这部分涉及酶和受体结合检测。有许多关于酶和受体结合检测的书,例如,酶学方法,科学出版社,或Boyers,酶。天然生物活性制品,检测、分离和结构确定,S.M.Colegate和R.J.Molyneux,CRC Press(1993)。也讨论了特定的生物。细胞免疫学方法,R.Rafael Fernadez-Botran和V.Vetvicka,CRC Press(1995)中描述了免疫细胞活化检测和细胞因子受体检测。“筛选微生物代谢物中新药理论和实际的考虑”描述了发现药学相关生物检测的其它方法(Yarbrough等,(1993),抗生素杂志(J.Antibiotics),46(4):536-544)。还有许多商业合同研究供应商,包括Panlabs,Paracelsian和NovaScreen。
例如,对于用于治疗神经学疾病的植物药材,生物检测的集合可以包括肾上腺素受体、胆碱能受体、多巴胺受体、GABA受体、谷氨酸受体、单胺氧化酶、氧化氮合成酶、阿片受体或5-羟色胺受体。对于心血管疾病,检测的集合可以包括腺苷A1激动;肾上腺素能α1、α2、β1,激动和拮抗;血管紧缩素Ⅰ抑制;血小板凝集;钙通道阻滞;回肠收缩反应;心律失常;心肌收缩;血压;心律;变时性;收缩性;缺氧;低密度;KCN缺氧;门静脉钾去极化;门静脉自发激活;血栓烷血小板凝集。对于代谢疾病,可以使用下列生物检测:胆固醇,血清HDL,全血清;血清HDL/胆固醇比率,HDL/LDL比率;葡萄糖,血清葡萄糖含量;或肾功能,尿钾排泄、尿盐排泄和尿溶剂变化。对于过敏/炎症疾病,可以使用下列生物检测:变态Arthurs反应,被动皮肤过敏反应;缓激肽B2;气管收缩;组胺H1拮抗;炎症,角叉菜胶对巨噬细胞移动的影响;白细胞三烯D4拮抗;神经激肽NK1拮抗;或血小板激活因子,血小板凝集或重要的炎症介质的生物合成的诱导(例如,白细胞介素IL-1,IL-6,肿瘤坏死因子或花生四烯酸)。对于胃肠道疾病,可以使用下列生物检测:缩胆囊素CCKA拮抗;外周胆碱能抑制;胃酸,五肽促胃酸激素;胃溃疡,乙醇;回肠电刺激调节;回肠电刺激痉挛或5-羟色胺5-HT3抑制。对于抗菌、抗真菌、或抗滴虫疾病,可以使用下列:白色念珠菌;大肠杆菌;肺炎克氏杆菌;蛙分支杆菌;普通变形杆菌;绿脓杆菌;耐性金黄色葡萄球菌;胎儿毛滴虫;或须发癣菌。对于其它的疾病,本领域技术人员可以选择相关的生物检测。
基于酶或受体的检测具体实例包括下列:乙酰胆碱酯酶;3-羟基丁醛还原酶;血管紧张素转化酶(ACE);肾上腺素α、β、大鼠雄激素受体;CNS受体;1或2环加氧酶(Cox1,Cox2);DNA修复酶;多巴胺受体;雌激素受体内分泌生物检测;纤维蛋白原酶;GABA A或GABAB;β-葡萄糖苷酸酶;脂肪氧化酶,例如5-脂肪氧化酶;单胺氧化酶(MAO-A,MAO-B);磷脂酶A2,血小板激活因子(PAF);钾通道检测;前列环素细胞周期蛋白;前列腺素合成酶;5-羟色胺检测,例如,5-HT活性或其它5-羟色胺受体亚型;5-羟色胺再摄取活性;类固醇/甲状腺总科受体;血栓烷合成活性。可以从大量的资源中获得具体的酶检测,包括PanlabsTM INC(Bothell,WA)和NovaScreenTM(Baltimmore,MD)。另外的检测包括:ATP酶抑制,苯并芘羟化酶抑制,HMG-CoA还原酶抑制,磷酸二酯酶抑制,蛋白酶抑制,蛋白质生物合成抑制,酪氨酸羟化酶和激酶抑制,睾酮-5α-还原酶和细胞因子受体检测。
5.4.2.细胞培养物和其它检测
除了酶和受体检测,还有其它生物检测。这些检测优选在细胞培养物中进行,但也可以在整个生物体中进行。细胞培养检测包括培养的肝细胞和肝细胞瘤活性(对胆固醇水平、LDL胆固醇受体水平、HDL/LDL胆固醇比率的影响);对抗L 1210、HeLa或MCF-7细胞抗癌活性;PC12人成神经细胞瘤细胞调控受体水平;初级细胞培养物促黄体生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)或促乳激素的活性调控;肥大细胞Ca2+流入量;对吞噬作用、淋巴细胞活性或TNF释放的细胞培养物检测;血小板凝集活性或对抗HDLM-3 Hodgkin’s淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤活性,抗有丝分裂活性,受感染细胞抗病毒活性,抗菌活性(细菌细胞培养物)和抗真菌活性。可以使用的组织或整个动物检测还包括抗炎小鼠耳皮炎,大鼠脚爪膨胀;肌肉收缩检测;被动皮肤过敏反应;血管舒张检测;或全动物碳粒清除试验。这些检测可以从许多来源获得,包括PanlabsTM Inc.(Bothell,WA)。
5.4.3.抗癌活性
药物的抗癌作用可以通过大量的细胞培养系统进行研究;它们包括小鼠白血球过多、L 1210、P388、L1578Y等。也可以使用人的肿瘤细胞系,像KB和HeLa。在一个有代表性的检测中,肿瘤细胞在适当的细胞培养介质(像含有10%胎牛血清的RPMI-1640)中生长。根据细胞系的细胞周期时间,用不同浓度的测试材料处理对数性生长的细胞14-72小时。在培育期结束时,通过细胞计数器评价处理组和未处理组的细胞生长。通过锥虫兰排除实验和通过线粒体脱氢酶造成的四唑染料减少,测定细胞的生活力。药物抑制培养物中细胞生长的能力可以表明其可能的抗癌作用。这些作用可以通过动物耐受肿瘤(其为人疾病模型)来证实(Khwaja,T.A.等,1986,肿瘤学(Oncology),43(增补1):42-50)。
药物抗癌作用的最经济的评价方法,是研究它对含有10%胎牛血清的最小必需介质(MEM)中肿瘤细胞生长的影响。接触药物的细胞(两组)在潮湿的CO2培养箱中在37℃下培养2-4天(依赖于肿瘤细胞的数量加倍时间)。培养期结束时,统计算细胞数量,计算细胞生长抑制程度,和在同样条件下未处理的对照组细胞生长进行比较。不同的实验室根据个体的需要使用不同类型的细胞系。美国国家癌症研究所(NCI)推荐使用KB细胞(人鼻咽癌)用于抗癌药物的体内评价。细胞生长抑制由药物处理和未处理对照组评价的蛋白质含量(Lowry’s方法)所决定。NCI还推荐使用小鼠白血病P388悬浮培养物用于评价植物提取物和相关天然产物的抗癌潜力。
在微量滴定平板中培养的小鼠白血病L1210细胞,常规用于抗癌活性的体内检测。白血病L1210的细胞数量加倍时间为10-11小时,和药物接触48小时(3-4代的对数生长),用于评价其抗肿瘤活性。对于生长抑制研究,所有的储备液和稀释液用无菌的0.9%NaCl溶液制备。在微量滴定平板(0.18ml/孔)中,对于每个抑制剂浓度以2-5×104细胞/ml的浓度接种细胞培养物两份。在每种情况下,加入0.02ml的抑制剂以获得1∶10的稀释液。加盖的微量滴定平板在空气中含有5%CO2的潮湿的CO2培养箱中培养48小时。在培养期结束时,将每孔等分量的培养物加入到测量体积的等渗盐水中,用电子细胞计数器计数。通过锥虫兰排除测定细胞的生活力。通过绘制细胞生长抑制百分率(和盐处理的对照组细胞浓度相比)对对数药物浓度的曲线,计算结果,表示为引起50%细胞生长抑制的的浓度(IC50)(从图中可测出)。
也可以评价出药物对肿瘤细胞系的细胞毒效应。然而,这些实验需要较长的时间,而且花费更昂贵。在该研究中,洗涤药物处理的细胞,使其不含药物,然后在软琼质或适当的培养基铺板,通过存活细胞增殖和形成微集落能力评价细胞的生活力。某种药物浓度得到的细胞集落数量和未处理的对照组得到的相比较,以评价细胞杀伤和细胞毒活性。在槲寄生提取物研究中,我们使用EMT-6细胞松散的贴壁培养物(小鼠乳腺癌)。该细胞在含有10%的透析的胎牛血清和抗生素的Eagle’s MEM(F14)中生长。旋转细胞悬浮液,悬浮于添加10%的透析胎牛血清的Spinner’s培养基中的小球(70个细胞/ml),在塑料培养皿中铺板,培养2小时,使细胞附着。这时细胞和不同浓度的提取物接触2-24小时。然后,除去培养基,用不含药物的培养基代替,在培养皿中培养5-7天。集落用亚甲兰(0.33%,在0.01%KOH中)染色,用自动集落计数器计数。EMT-6细胞的铺板效率为46%。(Khwaja等,1986,肿瘤学(Oncology),43(增补1):42-50)。
5.4.4.抗病毒活性
不同药物的抗病毒活性可以通过人细胞系(像HeLa或H9淋巴瘤细胞)的细胞培养物确定。将该细胞用病毒感染,病毒在细胞培养物中增殖。病毒产生细胞溶解作用或致细胞病变效应的能力取作终点。例如,H9细胞的HIV感染导致多核细胞的产生。该致细胞病变效应如果通过某一浓度的药物降低或提高,表示了其作为抗HIV药的潜力。结果可以通过细胞培养物中病毒酶的评价验证,例如,通过研究病毒逆转录酶的表达量。病毒酶的表达降低支持了药物治疗的抗病毒作用(Khwaja T.A.美国专利第5,565,200号;J.Levy等,1984,科学,225:840)。
5.5.分析化学成分的分析方法有许多方法用于分离和分析单个的化学成分,包括气相色谱(GC),质谱(MS),GC-MS,高效液相色谱(HPLC),HPLC-MS,薄层色谱(TLC),高效TLC(HPTLC)凝胶色谱和反相色谱(RPC)。这些色谱方法基可以应用分析级的,也可以应用制备级的。为了确定未知成分的化学结构,有代表性地应用核磁共振(NMR)和质谱组分分析。
色谱类型的确定依赖于最有可能具有生物活性的化学成分。例如,其生物活性是由于脂肪酸,就将该脂肪酸酯化,用GC分析它的酯。对于具有醇基团的有机化合物,将其修饰,制备酯、甲硅烷基或其它极性更小的官能团。该衍生物适合于GC分析(Steinke等,1993,Planta Med.59:155-160;Breu等,1992,Arzneim.-Forsch/Drug Res.42(1):547-551)。如果活性最可能是由于类黄酮,可以选择HPLC法。反相HPLC(RP-HPLC)已用于许多植物药材(具体为山楂、粉色西番莲、甘菊、银杏)的类黄酮分析(Pietta等,1989,色谱学(Chromatographia),27(9/10):509-512)。通过TLC(Vanhaelen和Vanhealen-Fastre,1983,色谱杂志,281:263-271)以及MS分析对大蒜的植物成分进行定量检测。CRC色谱手册关于“液体分析”,K.D.Mukherjee,“甾体的分析和特征鉴定”,H.Lamparczyk,J.Sherma,和“肽和蛋白质的高效液相色谱”,C.T.Mant和R.S.Hodges,是可获得的现有文献,其描述了柱和溶剂系统。
5.6.组分的分析
在一个可选择的实施方案中,药物指纹(PharmaPrint)不是根据已知生物活性的个别化学成分,还可以应用限定的组分或化合物的种类建立PharmaPrint。一些植物药材的化学成分形成许多密切相关成分的复杂混合物,以至于,从实际的观点考虑,需要根据组分或化合物的种类,而不是根据单个的化合物,建立PharmaPrint。该类型的成分的实例为外源凝集素(糖结合蛋白质)或醣蛋白以及水飞蓟中的水飞蓟素。有许多组分分析的实例(凝胶过滤原理和方法,Pharmacia Biotech,Rahms i Lund:瑞典,Ulsumi等,1987,生物化学杂志(J.Biochem.),101:1199-1208)。
5.7.应用PHARMAPRINTEDTM材料的方法
在植物药材建立指纹后,分析单个样品,以确定其是否落在可接受的标准范围内。一旦样品得到证实,它适合用于有关人和动物的许多疾病。该材料可用于临床实验,以提供稳定质量的材料和用于实验的ose制剂的准确剂量。PharmaPrintedTM材料还可用于动物的毒理分析,其中质量稳定的材料可用于定量毒理分析。在许多情况下,它可以作为材料分析或生物应用的参考。
PharmaPrintedTM植物材料可用于植物药相关的任何疾病。参见例如,Leung和Foster,1996,和中药和植物药学,1994。更具体的病状或治疗适应症包括AIDS、适应原(adaptogen)、轻度至中度抑郁、抗关节炎、抗癌、止泻、抗蠕虫、抗炎、通过GI止恶心、抗风湿、解痉、抗溃疡、绞痛、抗菌、抗诱变、抗氧化、抗病毒、动脉硬化、关节炎、哮喘、血压、前列腺良性增生(BPH)、支气管哮喘、支气管炎、镇静、咳嗽、大脑循环紊乱、胆固醇降低、肝硬化、皮肤病抗炎、糖尿病、利尿、剧泻、痛经、消化不良、肺气肿、环境紧张、祛痰、自由基清除剂、GI损伤、痔疮、肝炎、肝保护、高血压、高血脂、血催乳素过多、免疫调节活性、纤维蛋白溶解增加、对抗细菌感染、炎症、失眠、哺乳、肝保护、长寿、月经循环调节、偏头痛、肌肉痛、骨关节炎、疼痛、外周血管疾病、血小板凝集、PMS、促进月经、前列腺疾病、甘油三酯减少、减轻月经痛、呼吸道感染(RTI)、视网膜病、鼻窦炎、风湿、镇静、催眠药、咽喉痛、刺激头发生长、表面伤口愈合、耳鸣、局部湿疹(皮炎)、泌尿道感染(UTI)、静脉曲张、静脉不足或伤口愈合。
其它的适应症包括止血、抗菌、抗寄生虫、退热、强心、祛风、利胆、镇痛、发汗、催吐、通经、润肤、退烧、催奶、肝的、催眠、通便、镇定、祛痰、发红、兴奋、滋补、医治创伤、溃疡stores、溢脓、牙龈炎、胃炎、溃疡、胆结石、间歇性跛行、感冒、流行性感冒、喉炎、头痛、带状疱疹、膀胱炎、肾结石、特异反应性阴道炎、子宫纤维瘤、骨质疏松、痛风。
PharmaPrintedTM人参药物优选的适应症包括,但不仅限于此:抗压力、催欲、增加活力、神经系统疾病、心血管疾病、提高智能、增加生殖能力、提高精确性、提高学习能力、减轻压力、抗溃疡、肾上腺疾病、降低心律、降低血压、增加血管紧张、增加耐受力、免疫系统刺激、提高生育力、抗毒素、抗炎、退热、镇痛、减慢老化过程、加快康复、抗癌治疗、糖尿病、哮喘、头痛、贫血、消化不良、阳萎、抑郁、和月经疾病。
5.8.人参PHARMAPRINT
在这部分通过应用下表1-10提出的数据,提供了人参的生物和化学PHARMAPRINT的说明性发展。它们的检测和应用参考的详细描述见下面的第6部分。
5.8.1.人参的生物PHARMAPRINT
人参的生物PHARMAPRINT特征在于下面表1-8提出的生物活性谱。指出了提取物、组分和参照化合物的PHARMAPRINT的百分率(%)活性。对于提取物和组分的计算根据平均分子量为200的假定。在所有的表中,测定得到报导的抑制百分率的提取物或参照化合物的浓度如括号中所示。其中,在表的最上栏给出了浓度,下面给出了具体抑制值,适用的浓度以及百分率抑制值;表最上栏给出的浓度只适用于该栏的百分率抑制值,其中它不和具体的百分率抑制值一起出现在表中。表1:对于GABAA和PAF-R检测的人参PharmPtint
表2:对于血栓烷A2受体检测(TXA2)、白细胞三烯B4受体检测(LTB4)、磷脂酶A2受体检测(PLA2)、白细胞介素-8受体检测(IL8R)、和谷氨酸受体AMPA位点检测(AMPA)的人参生物PharmPrint。
表3:在所示的生物检测中人参的生物PharmPrint。
缩写:5-LO为5-脂肪氧合酶表4:在单胺氧化酶A(MAOA)检测和其它指示的生物检测中人参的生物PharmPrint。
表5:在单胺氧化酶B(MAOB)检测和其它指示的生物检测中人参的生物PharmPrint。
表6:在所示的生物检测中人参的生物PharmPrint。
提取物 | GABAA受体(10-4M) | PAF受体(10-4M) |
PG101 | 100±20 | |
PG102 | 100±20 | |
标定组分 | GABAA受体(10-4M) | PAF受体 |
人参组分3 | 100±20 | |
人参组分4 | 100±20 | |
人参组分5 | 85±20 | 25±10 |
人参组分6 | 70±20 | |
人参组分7 | 70±20 | |
人参组分8 | 90±20 | 25±10(10-8M) |
人参组分9 | 95±20 | |
人参组分10 | 80±20 | 30±15(10-8M) |
人参组分11 | 80±20 | |
人参组分12 | 85±20 | 25±10(10-8M) |
人参组分13 | 90±20 | |
人参组分14 | 85±20 | |
人参组分15 | 70±20 | 30±15(10-8M) |
人参组分16 | 70±20 | 20±10 |
人参组分17 | 95±20 | |
人参组分18 | 30±15 |
提取物 | TXA2 | LTB4 | PLA2 | IL8R | AMPA(10-4M) |
PG101 | 90±20 | ||||
PG102 | 90±20 | ||||
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | 55±20(300μm) | ||||
人参皂甙Re G-1027 | 20±10(10μm) | ||||
人参皂甙Rb1 G-0777 | 60±20(300μm) | ||||
人参皂甙Rf | |||||
人参皂甙Rd G-0102 | 65±20(300μm) | 20±10(10μm) | |||
人参皂甙Rb2 G-0104 | 20±10(10μm) | 55±20(300μm) | |||
人参皂甙Rg1 | 20±10 |
提取物 | 谷氨酸NMDA,甘氨酸(10-4M) | 5-LO | 白细胞三烯C4合成酶 | 非选择性腺苷Rec.,(1μm) | Ca2+作用,Voltinsens.KChnl(10-4M) |
PG101 | 50±20 | 40±20(10μm) | 45±20 | ||
PG102 | 60±20 | 20±10(1000μm) | 25±10 | ||
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | 20±10 | 25±10(1000μm) | 55±20 | 100±20 | |
人参皂甙Re G-1027 | 20±10(1000μm) | 85±20 | |||
人参皂甙Rb1 G-0777 | 20±10 | ||||
人参皂甙Rf | |||||
人参皂甙Rd G-0102 | 25±10 | 65±20(1000μm) | |||
人参皂甙Rb2 G-0104 | 30±15 | 40±20(100μm) | |||
人参皂甙Rg1 | 30±15 |
提取物 | 钠位点2(10-4M) | 多巴胺摄取(10-4M) | 血管紧张素Ⅱ,2型中心(10-4M) | 促肾上腺皮质激素释放因子(10-4M) | MAOA(10-4M) |
PG101 | 25±10 | ||||
PG102 | 20±10 | 30±15 | |||
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | 25±10 | 30±15 | 25±10 | 20±10 | 20±10 |
人参皂甙Re G-1027 | 30±15 | ||||
人参皂甙Rb1 G-0777 | 30±15 | 25±10 | |||
人参皂甙Rf | 35±15 | ||||
人参皂甙Rd G-0102 | 25±10 | 40±20 | 50±20 | 30±15 | |
人参皂甙Rb2 G-0104 | 25±10 | 25±10 | 30±15 | 30±15 | |
人参皂甙Rg1 | 25±10 | 25±10 | 20±10(10-5M) |
提取物 | MAOB(10-4M) | 组胺H1(10-4M) | 组胺H2(10-4M) | 非选择性肾上腺素能α-1(10-4M) | 蕈毒碱M1(10-4M) |
PG101 | 40±20 | ||||
PG102 | |||||
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | |||||
人参皂甙Re G-1027 | 20±10 | ||||
人参皂甙Rb1 G-0777 | 30±15 | ||||
人参皂甙Rf | 25±10(10-6M) | 20±10 | |||
人参皂甙Rd G-0102 | 30±15 | 20±10 | |||
人参皂甙Rb2 G-0104 | 25±10 | 25±10 | 35±15 | ||
人参皂甙Rg1 | 20±10 |
提取物 | 非选择性阿片受体(10-4M) | 非选择性肾上腺素能β(10-4M) | CCKB(10-4M) | 谷氨酸NMDA拮抗剂位点(10-4M) | 5-羟色胺摄取(10-4M) |
PG101 | 70±20 | 20±10 | |||
PG102 | 145±20(10-6M) | 90±20 | |||
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | |||||
人参皂甙Re G-1027 | |||||
人参皂甙Rb1 G-0777 | |||||
人参皂甙Rf | |||||
人参皂甙Rd G-0102 | 55±20 | 45±20 | 20±10 | ||
人参皂甙Rb2 G-0104 | |||||
人参皂甙Rg1 |
通过实验,应用表1-8中的数据,人参的PharmPrint可以基于组分3、4、13和17的生物活性,和在GABAA受体检测(表1)中的整个提取物的活性,和选自下组的一个或更多的检测:AMPA,PAF-R,非选择性肾上腺素能β,谷氨酸NMDA甘氨酸,和MAOA检测,检测的优选按次序递降。表7:在指示的生物检测中人参的生物PharmPrint。
报导值假定分子量为200NT未测定NA=无活性
样品 | PLA2检测(IC50=mg/ml | GABAA结合检测(IC50=mg/ml) | 谷氨酸AMPA结合检测(IC50=mg/ml) | 5-脂肪氧合酶(%抑制@1mg/ml) |
平均提取 | 0.76±0.21 | 0.022±0.02 | 0.28±0.32 | 45% |
组分 | PLA2检测(IC50=mM) | GABAA(%抑制@0.1mM) | 谷氨酸AMPA(%抑制@0.1 mM) | 5-脂肪氧合酶(%抑制@0.1mM) |
H2O kupchan | 0.943 | 71 | NA | 84 |
DCM kupchan | 0.943 | 56 | NA | 28 |
EtOAc kupchan | NA | 100 | 52 | NA |
1%MeOH | NA | 86 | NA | NA |
2.5%MeOH | NA | 80 | NA | NA |
5%MeOH | 31%@0.1 | 87 | NA | NA |
10%MeOH | 35%@0.1 | 84 | NA | NA |
20%MeOH | 25%@0.1 | 87.5±14.8 | NA | NA |
40%MeOH | NA | 76.5±0.7 | NA | NA |
80%MeOH | NA | 31±29.7 | NA | NA |
100%MeOH | 47%@0.1 | 43.5±13.4 | NA | 34±4.2 |
100%丙酮 | 54%@0.1 | 32.5±21.9 | NA | EC50=315 ng/ml |
参照 | PLA2检测(IC50=mM) | GABAA(IC50=mM) | 谷氨酸AMPA(IC50=mM) | 5-脂肪氧合酶(%抑制) |
GABA | NT | 0.000080 | NA | NT |
人参皂甙Rb1 | 0.024 | NA | NA | 23%@0.03mM |
人参皂甙Rb2 | 0.028 | NA | NA | 20%@0.03mM |
人参皂甙RbC | 0.028 | NA | NA | NA |
人参皂甙RbD | 0.046 | NA | NA | 25%@0.03mM |
人参皂甙RbE | NA | NA | NA | 35%@0.03mM |
人参皂甙RbF | NA | NA | NA | NA |
人参皂甙RbG1 | 32%@0.1 | NA | 21%@0.1mM | NA |
谷氨酸 | NT | NA | 100%@0.1mM | NT |
谷氨酰胺 | NT | NA | 50%@0.1mM | NT |
脯氨酸 | NT | 0.054± | 28%@0.1mM | NT |
在一个供可选择的实施方案中,PharmPrint的形成基于生物活性等于或大于生物活性范围的最小值,如表1-8中所示,作为该实施方案的说明性实例,基于GABAA检测中(100±20)(表1)所有提取物的生物活性的PharmPrint值,在10-4M浓度至少80%抑制。表8:生物药物指纹活性人参的药物指纹范围
生物检测标记物 | 范围(IC50)μg/mL | ||
宽的范围(平均值±3STD) | 中间范围(平均值±2STD) | 优选范围(平均值±1STD) | |
GABAA | 0.50-250 | 5.0-100 | 12.0-50.0 |
谷氨酸,AMP | 2.50-2400 | 25.0-1200 | 100-600 |
磷脂酶A2 | 50.0-2000 | 250-1500 | 530-950 |
5.8.2.人参的化学PHARMAPRIN
通过参照表9和10(其列出了指示特定人参标记成分的值的范围),可以更便利地形成人参的化学PHARMAPRINT。在许多情况下,该特定成分已进行过检测,并在本文提出的特定生物检测中显示出生物活性。表9:用于建立人参化学PHARMAPRINT的人参化学成分:指示人参皂甙的值(%W/W)。
表10:化学药物指纹活性人参的药物指纹范围
人参皂甙 | 范围 |
Rg1 | 0.1-4.0 |
Re | 0.1-7.5 |
Rb1 | 0.1-4.0 |
Rc | 0.1-4.0 |
Rb2 | 0.1-4.0 |
Rd | 0.1-5.0 |
总共人参皂甙 | 1-20 |
化学标记物 | 范围(IC50)μg/mL | ||
宽的范围(平均值±3 STD) | 中间范围(平均值+2 STD) | 优选范围(平均值+1 STD) | |
总共人参皂甙 | 0.20-25.0 | 2.00-20.0 | 7.0-14.0 |
人参皂甙Rb1 | 0.1-21.0 | 1.50-17.0 | 4.50-13.1 |
人参皂甙Rg1 | 0.05-3.25 | 0.10-2.60 | 0.70-2.00 |
GABA | 0.005-2.19 | 0.01-1.72 | 0.02-1.26 |
谷氨酸 | 0.005-0.55 | 0.03-0.44 | 0.13-0.34 |
谷氨酰胺 | 0.005-0.78 | 0.01-0.60 | 0.04-0.41 |
脯氨酸 | 0.05-1.38 | 0.1-1.09 | 0.22-0.80 |
5.8.3.换算率
应用植物药材的干燥粉末提取物得到的PharmPrint值,可以换算成与植物药材原材料干重有关的值,应用的比例在下表13中进行说明。因此,将基于干燥粉末提取物的PharmPrint值换算成与干燥植物材料有关的值,在表11中,通过适当的因素划分。表11:换算率。
换算率 | |
植物药材 | 比率(粉末至提取物) |
Saw Palmetto | 10∶1 |
St.John’s wort | 5∶1 |
缬草根 | 5∶1 |
Echinacea | 5∶1 |
银杏 | 50∶1 |
人参 | 5∶1 |
V.agnus-castus | 10∶1 |
Black Cohosh | 1∶1 |
越桔 | 100∶1 |
水飞蓟 | 40∶10 |
下面的实施例只是为了举例说明,绝不是为了限制本发明。
6.实施例:人参(亚洲)PHARMAPRINTINGTM
6.1.商业可购买的人参
人参是在全世界范围内都可以购买的最常见的植物药材产品。一些产品和供应商为Murdock Madaus Schwabe(Springville,Utah)提供的GinsunTM,Enzymatic Therapy(Green Bay,Wisconsin)提供的GS500TM,和Nutritional Products,Ltd.(Burnaby,british Columbia,Canada)提供的Ginseng SoftgelsTM。粉末状人参提取物可以从Zuelling Botanicals,Inc.(德国)的部门Botanicals International购买。人参干燥提取物IDB可以从Indena s.a.(Milan,Italy)购买,标准为含有7%的人参皂甙。还可以从下列公司购买到人参:Shaklee,Lichtwer,Sunsource,Nature’s Resource,Herbal Choice-Botalia,Nature’s Way,NaturaLife,Herbal harvest,BotaliaGold和PhytoPharmica。
6.2.组分分析
将人参粉末用40ml去离子水溶解,装填入LiChroprep RP-18(40-60μm)的柱中(2.5×92cm,柱体积450ml)。预先装填柱子,用去离子水平衡。如下表12所示,按顺序分批用水/乙醇混合液,最后用乙酸乙酯过柱。从表12所示的22个组分中分别取出等分试样(0.5 ml),进行HPLC检测。然后将剩下的组分蒸发,测定残渣的重量。每个组分的收集体积和残渣重量在表12中列出。回收的柱组分总重量为14.6074g,即,使用材料的97%。表12:LiChroprep RP-18柱组分
洗脱剂 | 组分编号 | 体积(ml) | 残渣重量(g) |
100%H2O | 组分1 | 112.5 | 0.002 |
100%H2O | 组分2 | 112.5 | 样品损失 |
100%H2O | 组分3 | 112.5 | 0.8400 |
100%H2O | 组分4 | 112.5 | 5.6942 |
10%MeOH | 组分5 | 225 | 3.8306 |
10%MeOH | 组分6 | 225 | 0.6317 |
10%MeOH | 组分7 | 225 | 0.9414 |
10%MeOH | 组分8 | 225 | 0.1152 |
20%MeOH | 组分9 | 225 | 0.0593 |
20%MeOH | 组分10 | 225 | 0.0702 |
20%MeOH | 组分11 | 225 | 0.0718 |
20%MeOH | 组分12 | 225 | 0.0270 |
40%MeOH | 组分13 | 225 | 0.0237 |
40%MeOH | 组分14 | 225 | 0.0729 |
40%MeOH | 组分15 | 225 | 0.0655 |
40%MeOH | 组分16 | 225 | 0.0278 |
80%MeOH | 组分17 | 225 | 0.0220 |
80%MeOH | 组分18 | 225 | 0.6110 |
100%MeOH | 组分19 | 225 | 0.5464 |
100%MeOH | 组分20 | 225 | 0.5456 |
100%MeOH | 组分21 | 900 | 0.1138 |
100%EtOAC | 组分22 | 450 | 0.0991 |
22个柱组分中的每一个0.5ml等分试样,再进一步进行HPLC分析。HPLC条件如下。使用水μBondpak C-18 ODS柱(250cm×4.6cmID)和PDA检测器(200-400nm),溶剂坡度为在75分钟内18%乙腈提高至40%乙腈,最后5分钟保持100%乙腈。
6.3.生物活性检测
推定的人参生物活性模式有两方面作用。第一,它具有适应性作用,它非特异性地增强身体中对外源压力因子和潜在的有害化学物质的抵抗力(Kim等,1992,Biochem.Biophys.Res.Commun.189:670-676)。第二,它促进身心机能整体改善(Mohri等,1992,Planta Medica58:321-323)。人参表现出的免疫调节活性可以部分解释为它的适应性作用。人参提取物对小鼠腹腔内给药,刺激了细胞调节免疫,提高了对抗绵羊红细胞和天然杀伤细胞的抗体水平(Singh等,1984,PlantaMedica 50:549)。还有人参皂甙Rg1和Rb1改善正常以及认知损害动物的记忆和学习的报道(由Foster综述,1996,美国植物药材委员会,植物药材系列-303)。
6.3.1.GABAA/B受体的拮抗剂
GABA(γ-氨基丁酸)是哺乳动物中枢神经系统(CNS)主要的抑制性递质。当GABA从突触前部释放,它可以和受体结合,或被细胞摄取和代谢。有两类GABA受体,GABAA和GABAB。GABAA受体激活氯通道,同时受体通过和细胞内第二信使(如G蛋白或腺苷酸环化酶)相互作用,调节Ca2+和K+通道(Kimura等,1994,Gen.Pharmacol.25:193-199)。人参皂甙Rb1、Rb2、RC、Re、Rt和Rgl都抑制[3H]-蝇蕈醇结合的高亲和性GABAA位点。相反,总皂甙组分和只有人参皂甙RC抑制[3H]-蝇蕈醇结合的位点。
对化合物进行GABAA的生物检测中,使用从牛小脑细胞膜部分纯化的受体。浓度设定在5nM [3H]-GABA,反应在50mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中、0-4℃下进行60分钟。在反应中,用1μM GABA测定非特异性结合。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应。用闪烁计数测定纤维上捕集的放射性,和对照化合物比较,以测定[3H]-GABA和GABAA受体结合的竞争度(Enna等,1977,大脑研究(Brain Research),124:185-190)。文献化合物和检测特性如下所列。人参提取物和其组分的参照化合物为Rb1、Rb2、Rc、Re、Rf和Rg(Sigma化学公司或Indofine化学公司)。
参照化合物 Ki(nM)
蝇蕈醇 4.4
异去甲槟榔次碱 9.5
GABA 23.1
TRIP 25.1
检测特性
KD(结合亲和性): 370nM
Bmax(受体数量): 0.7pmol/mg蛋白质
和受体结合的抑制,使用从大鼠皮层细胞膜部分纯化的受体。使用5nM浓度的[3H]-GABA配体,加上100μM的异去甲槟榔次碱,一起阻滞和GABAA的结合。反应在含有2.5mM CaCl2的50mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.4)中进行,在25℃下保温60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应。用闪烁计数测定纤维上捕集的放射量,值和对照相比较,测定在[3H]-GABA和受体结合中是否有任何竞争的发生(Scherer等,1988,大脑研究公报(Brain Res.Bulletin),21:439-443)。文献化合物如下所列。提取物和组分标准与上面描述的GABAA检测中使用的相同。
参照化合物 Ki(nM)
GABA 13.0
(+/-)-氯苯氨丁酸 250.0
曲胺(kojic Amine) 1177.0
蝇蕈醇 2543.0
5-氨基戊酸 3540.0
Thiomuscimol >10,000
2-羟基氯苯氨丁酸 >10,000
SR95531 >10,000
检测特性
KD(结合亲和性):38nM
Bmax(受体数量):222 fmol/mg蛋白质
6.3.2.抗血小板活性
近年来更加确定血小板在动脉粥样硬化形成中起到的作用。内皮损伤导致内皮下胶原暴露于循环的血细胞下,这样导致巨噬细胞和血小板在损伤部位发生堆积。在该过程中,血小板分泌许多化学物质,包括血管活性物质和血小板衍生的生长因子(PDGF)。该细胞增殖和平滑肌细胞迁移的结果导致了动脉粥样硬化损伤的增长。
已报道70%的甲醇人参提取物和人参皂甙Ro可以迟延凝血和提高纤维蛋白溶解(Kuo等,1990,Planta Medica 56:164-167)。对人参提取物及其组分对血小板凝集的抑制进行了检测,如下所描述。
6.3.2.1.血小板凝集检测
简要地,从新西兰种的白化病大鼠(重2.5-3.0kg,雄性或雌性)得到的静脉血,和十分之一体积的柠檬酸三钠(0.13M)混合,然后在室温、220X g下离心10分钟。得到的上清液为富含血小板的血浆(PRP)。通过200μM花生四烯酸钠在37℃下保温,进行非可逆聚集。通过光学凝集器(optical aggregometer)测定凝集。测试材料在30μM的浓度下和PRP保温5分钟,以测定血小板凝集的百分比抑制。文献参考的标准如下所列。检测基于Bertele等,1983,科学(Science)220:517-519。
化合物 IC50(μM)
阿司匹林(乙酰水杨酸) 12
BM 13,505(Daltroban) 3.2
BW-755C 1.2
CGS 12970 120
*吲哚美辛 0.28
NDGA 35
苯异妥英 2.6
保泰松 28*表示使用标准参照药物;BW-755C=3-氨基-1-[3-(三氟甲基)苯基]-2-二氢吡唑;CGS12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸;NDGA=去甲二氢愈创木酸。
除了使用200μM花生四烯酸钠诱导血小板凝集,还使用5nM血小板激活因子acether(PAF-acether)(Nunez等,1986,欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol)123:197-205)。文献参考的标准如下所列。
化合物 IC50(μM)
Nectandrin A(BN-52021) 3.3
CGS-12970 26
CV-3988 10
Kadsurenone(L-651108) 1.7
L-652731 0.83
L-659989 0.33
RP-48740 17
SRI-63441 1.7
WEB-2086 0.11CGS-12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸;CV-3988=3-(4-羟基-7-甲氧基-10-氧-3,5,9-trixa-11-氮杂-4-磷杂二十九烷-1-基)-噻唑啉;L-652731=2R,5R-(3,4,5-三甲氧基苯)。
还可以使用文献中描述的其它检测。Kieswetter等(1991,Int’l J.Clin.Pharm.,Ther.,& Toxicol.29:151-155)描述了评价血小板凝集的其它技术。血管扩张抑制作用的临床指示是静脉不足的另一种检测。它是通过研究冠状动脉片断对乙酰胆碱的收缩反应得出的(Bettini等,1991,Fitoterapia 62(1):15-28)。
6.3.2.2.PAF受体(PAF-R)检测
在该检测中,通过测定[3H]-血小板激活因子(PAF)和PAF受体的结合,分析人参提取物和组分。取样品10μM。从雄性或雌性新西兰种的白化病大鼠(重2.5-3.0kg,)得到的血小板,在改性Tris-HCl pH7.5缓冲液中应用标准技术制备。50μg的膜等分试样和0.4nM的[3H]-PAF在25℃下保温60分钟。在1μMPAF存在下,评价非特异性结合。过滤膜,洗涤三次,计数过滤器,以测定[3H]-PAF特异性的结合。参见Hwang等(1983,生物化学(Biochemistry)22:4756-4763)对检测的描述。
同样地,生物检测可以使用1nM量的[3H]-十六烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱,在含有0.25%BSA的50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中反应2小时。通过玻璃过滤器过滤,从结合的中分离未结合的配体。通过液体闪烁计数测定捕集的放射量(修改自Hwang等,1985,生物化学杂志(J.Biological Chemistry)260:15639-15645)。
6.3.3淋巴细胞和PC-12细胞活性
发现人参的脂溶性组分刺激PC-12细胞分化(Mohri等,1992,PlantaMedica 58:321-323),醇提取物刺激免疫系统细胞(Singh等,1984,Planta Medica 50:549)。
为了检测拟神经元细胞系PC-12,细胞在35mm胶原涂层的无菌组织培养平板(在37℃下,用5%血清和5%牛胎儿血清补充的Dulbecco’s改良基本培养基(DMEM))上生长。为了评价神经突的生长,利用计算机图像处理仪(XL-500,奥林巴斯,日本),测定贴附于相差显微镜每天每个细胞的总面积,定量试验PC-12细胞的过程。在5个以上区域中筛选出的细胞作为适当的样品进行检测。(Mohri等,1992,PlantaMedica 58:321-323)。
T和B淋巴细胞检验如下。应用标准程序从小鼠胸腺分离的T-细胞,在初始细胞浓度5×106细胞/ml、37℃下的DEMO中生长。在10-0.001μM的范围内10倍稀释液中评价测试化合物。在37℃下培养15小时后,向培养物中加入2μCi[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷。再培养48小时后收获细胞,通过闪烁计数测定加入的胸腺嘧啶脱氧核苷量(Dayton等,1992,分子药理学(Mol.Pharmacol.)41:671-676)。文献参照化合物如下所列。文献参照提取物和组分化合物与GABAA/B受体拮抗部分的相同。
化合物 EC50
氰丙亚胺 >10μM
抑氨肽酶B >10μM
刀豆素A 1.8μg/ml
白细胞介素2(人) >100ng/ml
白细胞介素2(大鼠) >30U/ml
白细胞介素5 >10ng/ml
左旋咪唑 >10μM
肿瘤坏死因子 >10ng/ml
为了检测人参衍生物对B-细胞生长的调控,应用标准程序从小鼠脾脏分离细胞。细胞在浓度为106细胞/ml的DEMO中生长。化合物用DEMO稀释,测定范围在10-0.001μM的10倍稀释液。在37℃下培养15小时后,加入2μCi[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷。48小时后收获细胞,通过闪烁计数测定加入的胸腺嘧啶脱氧核苷(Dayton等,1992,分子药理学(Mol.Pharmacol.)41:671-676)。文献参照化合物如下所列。对提取物和组分化合物进行检测(与GABA/B受体拮抗部分列出的相同)。
化合物 EC50
氰丙亚胺 >10μM
抑氨肽酶B >10μM
白细胞介素2(人) >100ng/ml
白细胞介素2(大鼠) >30U/ml
白细胞介素5 >10ng/ml
左旋咪唑 >10μM
脂多糖 0.38μg/ml
肿瘤坏死因子 >10 ng/ml
6.3.4.抗抑郁(丁苯喹嗪)检测
注射丁苯喹嗪甲烷磺酸盐(100mg/kg i.p.)30分钟后,给一组体重22±2g的ICR种小鼠口服给药人参、人参提取物、人参提取物组分、或载体空白。60分钟后纪录体温。丁苯喹嗪诱导的低温反应减少50%或更多被认为是作用明显,可以表明具有抗抑郁活性(Gylys等,1963,Annals N.Y Acad.Sci.107:899-913)。
*表示使用标准参照药物。6.3.5.抗压力检测
化合物 | ED50mg/kgp.o. |
阿米替林 | 3 |
苯丙胺 | 1 |
丁氨苯丙酮 | 30 |
可乐定 | >30 |
去甲丙米嗪 | 1 |
氟西汀 | >30 |
*丙米嗪 | 3 |
米安舍林 | 30 |
巴吉林 | 10 |
沙丁胺醇 | >30 |
反苯环丙胺 | 3 |
通过测定PC12细胞激活的检测中,对人参压力释放的临床适应症进行了生物分析。下面过程如Mohri等所描述(1992,Planta Medica 58:321-323)。他们报道了人参亲脂性成分可以激活他们的模型中的神经元细胞。
或者,可以在大鼠或小鼠体内模型中评价人参的抗压力活性。在该动物模型中研究人参成分的实验可以按照Nabata等进行(1973,日本药理学杂志(Japan J.Pharmacol.)23:29-41)。他们报道了应用小鼠和大鼠的大量行为检测结果,包括条件避免实验,运动原协调实验和爬杆实验。
另外,还可以进行用于评价人参派生的抗压力物质的受体结合检测。靶受体包括,但不仅限于此,如上面提到的GABAA和GABAB受体。进行受体结合检测可以使用本领域技术人员公知的任何方法,例如,Kimura等的方法,1994,基因药理学(Gen.Pharmacol.)25(1):193-199。
6.3.6.对于GABAA和PAF受体的生物检测概述表
对两种提取物、18种组分和7中参照标准物进行了生物检测,以测定GABA配体和GABAA受体结合的拮抗,或PAF和其受体的拮抗(表13)。第一种提取物,PG101,是由尖头和纤维(PE 5%N,East EarthHerb,Eugene,OR)制成的中国人参根提取物。提取物的组分由Hauser(Boulder,CO)提供,纯的人参皂甙从Sigma(St.Louis,MO)或IndofineChemical Company(Sommerville,NJ)商业购买。表13:生物检测概述表,报道了指定的提取物、组分和参照化合物在GABAA受体和PAF受体检测中的百分比抑制。
提取物 | GABAA受体(10-4M) | PAF受体(10-4M) |
PG101 | 99 | 2 |
PG102 | 102 | 10 |
组分 | GABAA受体(10-4M) | PAF受体 |
人参组分3 | 97.5 | - |
人参组分4 | 99.2 | - |
人参组分5 | 85.7 | 26(10-4M) |
人参组分6 | 71.4 | - |
人参组分7 | 67 | - |
人参组分8 | 91 | 27(10-8M) |
人参组分9 | 94 | - |
人参组分10 | 79.7 | 28(10-8M) |
人参组分11 | 79 | - |
人参组分12 | 85.2 | 25(10-8M) |
人参组分13 | 87.2 | - |
人参组分14 | 83.4 | - |
人参组分15 | 72.2 | 33(10-8M) |
人参组分16 | 68.5 | 22(10-4M) |
人参组分17 | 94.9 | - |
人参组分18 | 33.3 | - |
参照人参皂甙 | GABAA受体(10-4M) | PAF受体 |
RC G-0902 | - | |
Re G-1027 | - | |
Rb1 G-0777 | - | |
Rf G-0107 | - | |
Rd G-0102 | - | |
Rb2 G-0104 | - | |
Rg1 G-0101 | - |
6.3.7.其它生物检测
如下段所描述,对人参提取物和参照化合物进行了26项另外的生物检测。结果总结于下面的表14-18中。上面表13和下面表14-18中结果表明在测试浓度下未观察到活性(0%抑制或激活)。
应用从牛纹状体膜制备的部分纯化受体,测定了这些物质产生的[3H]-硝化甘油对蝇蕈碱M1受体(M1)的抑制。最终热配体浓度为1nM,在100nM阿托品存在的条件下,对非特异性结合进行了测定。反应在25mM HEPES(pH7.4)、25℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应。用液体闪烁计数测定结合放射活性(Watson等,1983,生命科学(Life Sciences)32:3001-3011)。
为了检测谷氨酸受体,进行了两种检测。在第一种检测中,研究了谷氨酸受体位点的拮抗剂(NMDA)。这里,受体为从大鼠前脑制备的部分纯化材料。放射性配体为最终配体浓度2nM的[3H]-CGP 39653。应用1mM NMDA测定了非特异性结合。检测反应在50 mM Tris-醋酸(pH 7.4)、0-4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应(Lehmann等,1988,J.Pharmac.Exp.Ther.246:65-75)。在谷氨酸受体的第二种检测中,应用最终浓度5nM的[3H]-AMPA进行反应。应用100μM AMPA测定了非特异性结合。检测反应在10 mM K2HPO4/100mM KSCN(pH 7.5)、0-4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应(Nurphy等,1987,神经化学研究(Neurochem.Res.)12:775-781)。
为了测定中枢神经系统缩胆囊素受体(CCKB)的抑制,制备了从小鼠前脑膜制备的部分纯化受体。使用最终浓度为0.02nM的[125I]-缩胆囊素,在1μM硫酸处理的缩胆囊素8存在的条件下,对非特异性结合进行了测定。反应在含有360mM NaCl、15mM KCl、5mM MgCl2、1mM EGTA和0.25mg/ml杆菌肽的20mM HEPES(pH 6.5)中、25℃下进行120分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应(Wennogle等,1983,生命科学(Life Sciences)36:1485-1492)。
应用小鼠肝线粒体膜作为部分纯化的酶源,测定了MAOA酶活性(MAOA)的抑制。酶作用物为[14C]-5-羟色胺,应用1μM的Ro41-1049,对非特异性活性进行了测定。反应包括酶作用物向[14C]-5-羟基吲哚乙醛+NH4 +的转化。简要地,酶和所需的酶作用物、亚型特异性阻滞剂司来吉兰在37℃、100mM KPO4(pH7.2)下预保温60分钟。加入酶作用物,再保温10分钟。通过加入0.5ml的2M柠檬酸中止反应。放射性产物用甲苯/乙酸乙酯氟提取,应用闪烁分光光度测定法和对照样品进行比较(Otsuka,S.和Kobayashi,Y,1964,生物化学药理学(Biochem.Pharmacol.)13:995-1006)。还使用大鼠肝线粒体膜作为部分纯化的酶源,测定了MAOB酶活性(MAOB)的抑制。酶作用物为[14C]-苯乙胺。在1μM的Ro 166491存在的条件下,对非特异性酶活性进行了测定。简要地,酶和亚型选择性阻滞剂氯吉灵(300nM)在37℃、100mM KPO4(pH 7.2)下预保温60分钟。然后加入酶作用物,再保温7分钟。通过加入0.5ml的2M柠檬酸中止反应。然后像检测MAOA酶一样检测放射活性(Otsuka,S.和Kobayashi,Y.,1964,生物化学药理学(Biochem.Pharmacol.)13:995-1006)。
为了测定该物质对多巴胺受体(dp)所需的抑制活性,进行了下列检测。应用[3H]-螺环哌啶苯作为配体(最终浓度为0.3nM),从牛纹状体膜制备部分纯化的受体。为了测定非特异性结合,用1μM的螺环哌啶苯进行测定。反应在含有120mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2和1mM MgCl2的50mM Tris-盐酸(pH7.7)、37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应(Leysen等,1978,生物化学药理学(Biochem.Pharmacol.)27:307-316)。
应用从牛纹状体膜制备部分纯化的受体,测定了该物质对配体和腺苷受体(ADNS)结合的抑制性质。放射性配体使用最终配体浓度为4 nM的[3H]-5’-N-乙基羧基氨基腺苷。在10μM NECA存在的条件下,对非特异性酶活性进行了测定。反应在50mM Tris-盐酸(pH7.7)、25℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应(Bruns,R.等,1986,药理学(Pharmacology)29:331-346)。
为了测定该物质对阿片受体(阿片)的抑制活性,从大鼠前脑制备部分纯化的受体。使用的配体为1nM的[3H]-纳洛酮。反应在50mMTris-盐酸(pH 7.4)、25℃下进行90分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应(Pert,C.和Snyde,S.H.,1974,分子药理学(Mol.Pharmacology)19:868-879)。
为了测定促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)受体的抑制,使用从大鼠皮层膜制备的部分纯化的受体。使用的放射性配体为最终配体浓度0.1nM的[125I]-Tyr-CRF。在1μM Tyr-CRF存在的条件下,对非特异性结合进行了测定。反应在含有10mM MgCl2、2mM EGTA、0.12TIU/ml抑肽酶和0.3%BSA的50mM HEPES中、25℃下进行120分钟。通过在4℃下离心15分钟,中止反应。重复洗涤后,溶解得到的小球,应用γ计数器测定放射性活性(De Souza,E.B.,1987,神经科学(Neuroscience)7:88-100)。
为了测定肾上腺素α2受体(肾上腺素α2)的传递作用,从大鼠整个大脑制备了部分纯化的受体。使用的放射性配体为最终配体浓度1nM的[6,7-3H]-醋酸曲安缩松。在10μM醋酸曲安缩松存在的条件下,对非特异性结合进行了测定。检测反应在含有10mM钼酸钠和10mMα-单硫甘油的50mM K2HPO4(pH7.4)中、0℃下进行16小时。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应。通过液体闪烁计数测定结合放射性活性(Da Han等,1994,Neurochem.Int.24:339-348)。
应用从人血小板制备的部分纯化的受体,测定了该物质对血栓烷A2(血栓烷A2)受体的抑制活性。使用最终浓度为2nM的放射性配体[3H]-SQ 29,548。加入10μM蒎烷-血栓烷,测定非特异性结合。检测反应在含有138mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、5.5 mM右旋糖和2mM EDTA的25mM Tris-盐酸(pH7.4)、25℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应。通过液体闪烁计数测定结合放射性活性(Hedberg,A.等,1988,J.Pharmacol.Exp.Ther.245:786-792)。
应用从豚鼠脾膜制备的部分纯化的受体,测定了该物质对白细胞三烯B4受体的抑制特性。放射性配体使用最终浓度为0.5nM的[3H]-白细胞三烯B4。加入500nM白细胞三烯B4,测定非特异性结合。检测反应在含有NaCl、MgCl2、EDTA和杆菌素的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中、0℃下进行2小时。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应。通过液体闪烁计数测定结合放射性活性(Cardiner,P.J.等,1990,欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmac.)182:291-299)。
通过从猪胰腺部分纯化的酶磷脂酶A2的抑制分析,进一步研究了该物质的抗炎活性。简要地,酶和该物质在含有[14C]-3-卵磷脂的100mM氨基乙酸-NaOH缓冲液(pH9)中预保温10分钟。通过加入2.5mM Ca++开始反应,保温5分钟。通过加入200mM EDTA中止反应。用酸性己烷提取产物,通过闪烁计数测定存在的放射性活性量(Katsumata,M.等,Anal.Biochem.154:676-681,1986)。
为了测定该物质如何影响白细胞介素(IL-8)与其受体的结合,从人中性白细胞制备了受体的部分纯化制品。反应在改性的Tris-盐酸(pH7.5)缓冲液中进行。简要地,30μg粗品受体制品和15pM[125I]IL-8在0℃下保温120分钟。通过含有250nM IL-8的反应,测定非特异性活性。通过玻璃过滤器过滤膜,洗涤三次,测定捕获的放射性活性量(Grob,P.M.等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265:8311-8316,1990)。
另一种研究该物质潜在抗炎特性的检测涉及酶5-脂肪氧合酶(5-脂肪氧合酶)的研究。从大鼠嗜碱性白血病细胞(RB-1)制备粗品酶。该物质和粗品酶制品在25℃下保温5分钟。然后通过加入[14C]-花生四烯酸开始反应。8分钟后,通过加入柠檬酸中止反应。通过放射免疫检测法(RIA)测定放射标记的5-HETE量(Shimuzu,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.美国,81:689-693,1984)。通过应用粗品酶制品的相同组织源,对相关酶,白细胞三烯C4(LT C4)合成酶进行了检测。LT C4的甲酯和粗品酶制品在白蛋白和丝氨酸硼酸盐存在的条件下,在15℃下保温15分钟。通过加入冰甲醇中止反应。LT C4的形成作为应用RIA示值方法酶活性的指标(Bach等,生物化学药理学(Biochem.Pharmacol.)34:2695-2704,1985)。
发现该物质在两种通道中的抑制活性。第一,检测了Ca2+激活,电压不敏感钾通道受体(K通道)。粗品受体制品从大鼠前脑制备,使用的[125I]-蜂毒明肽最终浓度为0.05nM。在100nM蜂毒明肽存在的条件下测定非特异性结合。检测反应在含有0.1%BSA和5mM KCl的50mMTris-盐酸(pH7.4)、0-4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应。通过γ计数测定结合放射性活性(Seager,M.等,神经科学(Neuroscience)7:565-570,1987)。
发现的第二通道活性为钠通道,位点2(钠通道)。粗品受体制品从大鼠前脑制备,使用的放射性配体[3H]-蟾毒素最终浓度为2nM。在100nM乌头碱存在的条件下测定非特异性结合。反应在含有130mM胆碱氯化物的50mM HEPES(pH7.4)中、37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应,通过闪烁计数测定特异性活性(Creveling,C.R.分子药理学(Mol.Pharmacology)23:350-358,1983)。
表明该物质活性的其它生物检测有血管紧张素Ⅱ,2型,中心(AT2)。从牛小脑膜制备部分纯化的受体。作为放射性配体的[125I]-tyr4-血管紧张素Ⅱ的最终浓度为0.1nM。在50nM人血管紧张素Ⅱ存在的条件下,对非特异性结合进行了测定。检测反应在含有NaCl、EDTA和BSA的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中进行,在37℃下反应60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物,中止反应,通过γ计数测定特异性活性(Bennett,J.P.和Synder,S.H.生物化学杂志(J.Bio.Chem.)251:7423-7430,1976)。
另一组对该物质表现出活性的受体为组胺H1(H1)和组胺H2(H2)。H1受体的粗品受体制品从牛小脑膜制备。使用的放射性配体[3H]-新安替根最终浓度为2nM。在10μM吡咯烷甲苯基丙烯存在的条件下测定非特异性结合。反应在50mM Na-KPO4(pH7.5)中、25℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应,通过液体闪烁计数测定特异性活性(Chang等,神经化学杂志(J.Neurochemistry)32:1653-1663,1979)。
H2受体的粗品受体制品从豚鼠纹状体膜制备。使用的放射性配体[3H]-tiotdine最终浓度为4nM。在10nM西米替丁存在的条件下测定非特异性结合。检测反应在与H1受体相同的缓冲液中进行。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应,通过液体闪烁计数测定特异性活性(Gajtkowski等,自然304:65-67,1983)。为了测定该物质对抗β-肾上腺素非选择性受体检测(肾上腺素β,NS)的活性,从大鼠皮层膜制备粗品受体制品。使用的放射性配体为最终浓度为2nM的[3H]-DHA。反应在10μM烯丙心安存在的条件下进行测定非特异性结合。检测反应在50 mM Tris-盐酸(pH7.4)中、37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应,通过液体闪烁计数测定特异性活性(Riva,M.和Creese,I.分子药理学(Mol.Pharmacol.)36:211-218,1989)。
最后一个表明一些物质抑制的受体检测为5-羟色胺受体。粗品受体制品从大鼠皮层膜制备。使用的放射性配体[3H]-麦角酰二乙胺最终浓度为5nM。检测反应在含有4mM CaCl2、0.1mM巴吉林和0.1%抗坏血酸的50mM Tris-盐酸(pH 7.4)中、37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤,中止反应,通过液体闪烁计数测定特异性活性(Peroutka,S.J.和Snyder,S.H.分子药理学(Mol.Pharmacology)16:687-699,1979)。表14:生物检测概述表报道了指示的提取物和参照化合物在血栓烷A2受体检测(TXA2)、白细胞三烯B4受体检测(LTB4)、磷脂酶A2受体检测(PLA2)、白细胞介素-8受体检测(IL8R)、和谷氨酸受体AMPA位点检测(AMPA)中的百分比抑制。括号中为获得报道百分比抑制的测试浓度。
表15:生物检测概述表报道了指示的提取物和参照化合物在指示的生物检测中的百分比抑制。括号中为获得报道百分比抑制的测试浓度。
表16:生物检测概述表报道了指示的提取物和参照化合物在单胺氧化酶A(MAOA)和其它指示的生物检测中的百分比抑制。括号中为获得报道百分比抑制的测试浓度。
表17:生物检测概述表报道了指示的提取物和参照化合物在单胺氧化酶B(MAOB)和其它指示的生物检测中的百分比抑制。括号中为获得报道百分比抑制的测试浓度
表18:生物检测概述表报道了指示的提取物和参照化合物在指示的生物检测中的百分比抑制。括号中为获得报道百分比抑制的测试浓度。
提取物 | TXA2 | LTB4 | PLA2 | IL8R | AMPA(10-4M) |
PG101 | - | - | - | - | 90 |
PG102 | - | - | - | - | 87 |
参照化合物 | - | - | - | - | - |
人参皂甙Rc G-0902 | - | - | 55(300μm) | - | - |
人参皂甙Re G-1027 | 20(10μm) | - | - | - | - |
人参皂甙Rb1 G-0777 | - | - | 60(300μm) | - | - |
人参皂甙Rf | - | - | - | - | - |
人参皂甙Rd G-0102 | - | - | 64(300μm) | 22(10μm) | - |
人参皂甙Rb2 G-0104 | - | 23(10μm) | 55(300μm) | - | - |
人参皂甙Rg1 | - | - | - | - | 21 |
提取物 | 谷氨酸NMDA,甘氨酸(10-4M) | 5-脂肪氧合酶 | 白细胞三烯C4合成酶 | 非选择性腺苷受体(1μm) | Ca2+作用,Voltinsens.KChnl(10-4M) |
PG101 | 47 | 39(10μm) | - | 44 | |
PG102 | 58 | - | 20(1mM) | 26 | |
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | 20 | 24(1mM) | 53 | 98 | |
人参皂甙Re G-1027 | - | 20(1mM) | - | 86 | |
人参皂甙Rb1 G-0777 | 23 | - | - | ||
人参皂甙Rf | - | - | - | ||
人参皂甙Rd G-0102 | 25 | 63(1mM) | - | ||
人参皂甙Rb2 G-0104 | 28 | - | 39(100μm) | - | |
人参皂甙Rg1 | 30 | - | - | - |
提取物 | 钠位点2(10-4M) | 多巴胺摄取(10-4M) | 血管紧张素Ⅱ,2型,中心(10-4M) | 促肾上腺皮质激素释放因子(10-4M) | MAOA(10-4M) |
PG101 | - | 23 | - | - | |
PG102 | - | - | 20 | 27 | |
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | 24 | 27 | 25 | 21 | 21 |
人参皂甙Re G-1027 | - | - | - | - | 28 |
人参皂甙Rb1 G-0777 | - | 29 | - | 23 | - |
人参皂甙Rf | - | - | - | 34 | - |
人参皂甙Rd G-0102 | 22 | 41 | 48 | - | 32 |
人参皂甙Rb2 G-0104 | 23 | 23 | 28 | 32 | - |
人参皂甙Rg1 | 25 | - | - | 25 | 20(10-5M) |
提取物 | MAOB(10-4M) | 组胺H1(10-4M) | 组胺H2(10-4M) | 非选择性肾上腺素能α-1(10-4M) | 簟毒碱M1(10-4M) |
PG101 | - | - | - | 41 | |
PG102 | - | - | - | - | |
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | - | - | - | - | - |
人参皂甙Re G-1027 | - | 20 | - | - | - |
人参皂甙Rb1 G-0777 | - | - | 28 | - | - |
人参皂甙Rf | - | - | 21 | 26(10-6M) | 22 |
人参皂甙Rd G-0102 | - | - | 29 | 21 | - |
人参皂甙Rb2 G-0104 | - | 26 | 23 | 36 | |
人参皂甙Rg1 | - | - | 20 | - |
提取物 | 非选择性阿片受体(10-4M) | 非选择性肾上腺素能β(10-4M) | CCKB(10-4M) | 谷氨酸NMDA拮抗剂位点(10-4M) | 5-羟色胺摄取(10-4M) |
PG101 | - | - | - | 73 | 23 |
PG102 | - | 146(10-6M) | - | 88 | |
参照化合物 | |||||
人参皂甙Rc G-0902 | - | - | - | - | - |
人参皂甙Re G-1027 | - | - | - | - | - |
人参皂甙Rb1 G-0777 | - | - | - | - | - |
人参皂甙Rf | - | - | - | - | - |
人参皂甙Rd G-0102 | 54 | 46 | 22 | - | - |
人参皂甙Rb2 G-0104 | - | - | - | - | - |
人参皂甙Rg1 | - | - | - | - | - |
6.4.化学检测
通过HPLC或TLC对人参进行化学检测。色谱峰可以通过质谱进一步分析。人参含有大量的成分,包括但不仅限于:甾醇(β-谷甾醇和β-葡糖苷)、7-9%的人参多糖、人参辛苷A-U、果胶、游离糖、biomins、polyacetylines和多肽。Sappinins被日本研究人员称为人参皂甙,被俄罗斯研究人员称为panaxosides。在亚洲人参中至少发现18种sappines。它们都是三萜系化合物。已报道有6种panaxosides。还报道人参油中含有倍半萜烯,有至少56种被称为gynsaponins的皂角苷(Leung和Foster,1996)。
一个人参皂甙化学分析的实施例提供如下。6种人参提取物胶囊样品标记如下:标记A,提取物软胶囊批号611251;标记B,提取物软胶囊批号GG 10527;根粉末胶囊批号HC 10999;标记D,提取物(4%)软胶囊批号50959 AA;标记E,提取物(4∶1)软胶囊批号7B04201;和标记F,提取物软胶囊批号5N03338。
胶囊中人参皂甙的HPLC检测按如下进行。测定胶囊的平均重量。内容物溶解于提取物溶剂中,按照Hauser Part号4129.000(Boulder,CO)进行HPLC分析,只是在凝胶胶囊样品制备中省略固相提取物净化步骤。根据对于6个人参皂甙标准物(Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd,从Indofine化学公司(Sommerville,NJ)获得)中每一个的柱反应进行定量。结果如图4所示。
图4中报道的浓度根据每个样品的平均囊片内容物重量,代表两个独立测定的平均值。和上面提到的包括固相提取物净化步骤获得的结果(未显示)相比,结果没有相差10%。绘制图4的数据在表19中列出。表19:指示的人参皂甙和总人参皂甙的浓度。
标记 | A | B | C | D | E | F |
Rg1 | 1.9 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 1.7 | 0.6 |
Re | 1.6 | 1.4 | 0.3 | 0.9 | 4.6 | 1.2 |
Rb1 | 2.9 | 0.9 | 0.5 | 1.5 | 1.2 | 0.8 |
Rc | 1.3 | 0.4 | 0.3 | 1.1 | 1.4 | 0.6 |
Rb2 | 1.2 | 0.7 | 0.3 | 1.0 | 1.4 | 0.7 |
Rd | 0.9 | 1.5 | 0.2 | 0.7 | 2.4 | 0.9 |
总人参皂甙 | 9.8 | 5.4 | 2.3 | 5.8 | 12.7 | 4.8 |
本文中描述和要求的本发明不只限于本文公开的具体实施方案的范围,因为这些实施方案只是想作为本发明几个方面的举例说明。任何等同的实施方案应在本发明的范围内。实际上,除了本文展示和描述的修改之外,本领域技术人员还可以从上文描述明显地得出许多修改。这些修改也应落在后面的权利要求范围内。在本申请中,在括号中引用了许多出版物和专利。它们的内容在这里引用作为本申请的参考。
Claims (33)
1.一种用于制备药用级人参的方法,该方法包括以下步骤:
将含有多种成分的人参材料的有代表性部分分成多个标记组分,其中至少一种标记组分中含有至少一种活性成分;
测定每个标记组分的生物活性程度,以提供有代表性部分的生物活性指纹;和
将有代表性部分的生物活性指纹和已建立的药用级人参的生物活性指纹标准相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
2.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中一个或更多的标记组分含有至少一种活性成分。
3.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中该方法还包括以下步骤:
测定至少一种标记组分中活性成分的量,以提供有代表性部分的定量组成指纹;和
将有代表性部分的定量组成指纹和已建立的给定药用级人参的定量组成指纹标准相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
4.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中该方法还包括其它步骤:
测定人参材料中有代表性部分的总体生物活性;和
将有代表性部分的总体生物活性和生物活性指纹标准中的总体生物活性相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
5.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中人参材料为超临界二氧化碳提取物,醇提取物,水提取物,有机提取物,油状或粉末状植物药材。
6.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中人参材料为均一的材料。
7.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中人参材料为植物药材的混合物。
8.按照权利要求7的用于制备药用级人参的方法,其中植物药材混合物含有重量比至少10%的人参根。
9.按照权利要求1、2、3或4的用于制备药用级人参的方法,其中至少一种活性成分选自人参皂甙,碳水化合物,脂肪酸,脂肪酸酯,酚和萜类化合物。
10.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中生物活性指纹是用于治疗或改善下列病症或疾病:压力疾病,炎症,心血管疾病,胃肠道疾病,代谢疾病和肾上腺疾病的指标。
11.一种用于制备药用级人参的方法,该方法包括以下步骤:
提供一种含有多种成分的人参材料,其中这些成分具有给定的生物活性,并且每一个成分具有标准化的生物活性谱;
将人参材料中有代表性的部分分成许多标记组分,其中至少一种标记组分中含有至少一种活性成分;
测定在每一个标记组分中存在的每一个活性成分的量;
根据存在的每一个活性成分的量和标准化的成分生物活性谱,计算每一个标记组分的生物活性,以提供有代表性部分的计算生物活性指纹;和
将有代表性部分的计算生物活性指纹和已建立的药用级人参的生物活性指纹标准相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
12.按照权利要求11的用于制备药用级人参的方法,其中该方法还包括其它步骤:
测定人参材料中有代表性部分的总体生物活性;和
将有代表性部分的总体生物活性和标准的总体生物活性相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
13.按照权利要求11的用于制备药用级人参的方法,其中人参材料为提取物。
14.按照权利要求13的用于制备药用级人参的方法,其中提取物为水或有机提取物。
15.按照权利要求11的用于制备药用级人参的方法,其中人参材料为粉末状植物药材。
16.按照权利要求11的用于制备药用级人参的方法,其中人参材料为均一的材料。
17.按照权利要求11的用于制备药用级人参的方法,其中人参材料为植物药材的混合物。
18.按照权利要求17的用于制备药用级人参的方法,其中植物药材混合物含有重量比至少10%的人参根。
19.按照权利要求11或12的用于制备药用级人参的方法,其中活性成分选自人参皂甙,碳水化合物,脂肪酸,脂肪酸酯,酚和萜类化合物。
20.按照权利要求11的用于制备药用级人参的方法,其中生物活性指纹是用于治疗或改善下列病症或疾病:压力疾病,炎症,心血管疾病,胃肠道疾病,代谢疾病和肾上腺疾病的指标。
21.一种用于制备药用级人参的方法,该方法包括以下步骤:
提供一种含有一种给定生物活性的人参材料,其中所述的人参材料含有多种成分;
将人参材料中有代表性的部分分成多个标记组分,其中至少一种标记组分中含有至少一种活性成分;
测定每一个标记组分的给定生物活性的程度,以提供有代表性部分的生物活性指纹;
将有代表性部分的生物活性指纹和已建立的药用级人参的生物活性指纹标准相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
22.按照权利要求21的用于制备药用级人参的方法,其中活性成分选自人参皂甙,碳水化合物,脂肪酸,脂肪酸酯,酚和萜类化合物。
23.一种用于制备药用级人参的方法,其中包括:
应用选自血小板激活因子受体检测,GABAA受体检测,谷氨酸受体检测,和磷脂酶A2检测的生物检测测定有代表性部分的总体生物活性;和
将有代表性部分的总体生物活性和标准的相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
24.按照权利要求1、11、21或23的用于制备药用级人参的方法,其中一个或更多的标记组分含有一组相关成分。
25.一种用于制备药用级人参的方法,该方法包括以下步骤:
测定人参材料的多个标记组分中至少一种标记组分的活性成分的量,以提供有代表性部分的定量组成指纹;和
将有代表性部分的定量组成指纹和和已建立的药用级人参的定量组成指纹标准相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
26.一种用于制备药用级人参的方法,其中该方法包括以下步骤:
测定人参材料有代表性部分的总体生物活性;和
将有代表性部分的总体生物活性和总体生物活性指纹标准相比较,以确定该人参材料是否为药用级人参。
27.按照权利要求9的用于制备药用级人参的方法,其中人参皂甙选自人参皂甙Rc、人参皂甙Re、人参皂甙Rb1、人参皂甙Rf、人参皂甙Rd、人参皂甙Rb2、和人参皂甙Rg1。
28.按照权利要求19的用于制备药用级人参的方法,其中人参皂甙选自人参皂甙Rc、人参皂甙Re、人参皂甙Rb1、人参皂甙Rf、人参皂甙Rd、人参皂甙Rb2、和人参皂甙Rg1。
29.按照权利要求22的用于制备药用级人参的方法,其中人参皂甙选自人参皂甙Rc、人参皂甙Re、人参皂甙Rb1、人参皂甙Rf、人参皂甙Rd、人参皂甙Rb2、和人参皂甙Rg1。
30.一种按照权利要求1、11、21、23、25或26的方法制备的药用级人参。
31.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中一种或多种标记组分含有至少两种活性成分。
32.按照权利要求1的用于制备药用级人参的方法,其中至少一种标记组分含有至少一种选自下组的成分:人参皂甙Rb1,人参皂甙Rg1、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸。
33.按照权利要求1、11或21的用于制备药用级人参的方法,其中至少一种活性成分选自人参皂甙Rb1,人参皂甙Rg1、和γ-氨基丁酸。
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