JP5402927B2

JP5402927B2 - 抑肝散のバイオアッセイ方法

Info

Publication number: JP5402927B2
Application number: JP2010517646A
Authority: JP
Inventors: 康五十嵐; 善治川上; 潔寺脇
Original assignee: Tsumura and Co
Current assignee: Tsumura and Co
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2028-06-27
Also published as: CN102066930B; US8420336B2; US20110111426A1; CN102066930A; WO2009157083A1; JPWO2009157083A1

Description

本発明は、抑肝散のアッセイ方法に関し、更に詳細には、グルタミン酸受容体に対する作用を用い、漢方製剤である抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を定量的に評価しうるアッセイ方法に関する。

漢方薬は、生薬をブレンドした医薬品であり、その活性成分が全て特定されているわけではない。また、単一の活性成分のみで効果を発揮するとは限らず、複合的に作用する場合もあるため、その品質を保証するには、漢方薬全体として評価をすることができる測定方法が必要であるとされている（特許文献１、特許文献２）。

この測定方法中には、個別の成分を測定し、それらを総合的に評価する方法と、生物材料を用いて生理活性を評価するバイオアッセイがある。そしてバイオアッセイには、生体内（in vivo）試験と、試験管内（in vitro）試験があるが、生体内試験の系は、試験施設、試験動物、処理能力等の点で種々の制約があり、漢方薬の品質評価に用いるには困難が伴っていた。

一方、試験管内試験の系では、特殊な施設を必要とせず、安定した試験結果が短期間に得られるため、この系でバイオアッセイ法を確立することが求められており、実際ミオスタチンについては、バイオアッセイ法が報告されている（特許文献３）。しかし、それ自身が複数の有効成分を含む生薬を組み合わせた漢方薬については、常に適切なバイオアッセイ系が見出されているというものではなく、それらの確立が待たれている。

例えば、漢方製剤である抑肝散は、一般的には下の組成の生薬混合物あるいはその抽出物であり、さらに必要に応じて、賦形剤等の医薬用担体や、その他の製剤上使用しうる成分を含有したものであるが、このものについても適切なバイオアッセイ系は見出されておらず、より高い品質保証を行うためには、その開発が求められている。

特表２０００−５１２６２１特表２００１−５２１８７６特表２００５−５２０４８６

従って、抑肝散について、より高い品質保証を可能とする試験管内試験によるバイオアッセイ系を見出すことが本発明の課題である。

本発明者らは、抑肝散の作用に関し鋭意検討を行っていたところ、このものはグルタミン酸受容体と結合活性を有し、しかもその結合活性は抑肝散の用量に依存することを知った。また、抑肝散の構成生薬であるサイコ、センキュウ、トウキ、カンゾウ等もグルタミン酸受容体と結合活性を有し、グルタミン酸受容体毎に、結合活性を引き起こす生薬が異なることを知った。そして、これらの知見を応用すれば、抑肝散や、サイコ、センキュウ、トウキ、カンゾウあるいはこれらを含有する被検試料のバイオアッセイ方法が構築できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、グルタミン酸受容体を発現している細胞または細胞膜に対して、標識リガンドと抑肝散とを競合的に作用させて抑肝散の結合活性を測定し、この値から抑肝散の薬理活性値を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法である。

また本発明は、グルタミン酸受容体を発現している細胞または細胞膜に対して、標識リガンドと少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料とを競合的に作用させて被検試料の受容体結合活性を測定し、この値から被検試料の薬理活性値を評価することを特徴とする少なくともサイコ、センキュウ、トウキ、またはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法である。

本発明のバイオアッセイ方法によれば、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、試験管内試験により、簡便かつ安定に抑肝散又は抑肝散等の構成生薬であるサイコ、センキュウ、トウキ、又はカンゾウを含有する被検試料の生理活性値（薬理活性価）を求めることが可能である。

本発明の抑肝散のバイオアッセイ方法は、グルタミン酸受容体を発現している細胞または細胞膜を用い、この受容体と抑肝散の結合活性を測定することにより、抑肝散の薬理活性値を評価するというものである。

具体的には、グルタミン酸受容体を発現している細胞または細胞膜に対して、標識リガンドと抑肝散とを競合的に作用させ、結合標識リガンド量から抑肝散の結合活性を測定する方法が利用できる。

より具体的には、細胞または細胞膜に発現しているグルタミン酸受容体で、標識リガンドと抑肝散を競合的に反応させ、標識リガンドのみの特異的結合量と競合後の標識リガンド結合量の差から抑肝散の結合活性値を測定するものである。

本発明において用いるグルタミン酸受容体は、薬理学的基準に基づいて分類できるものである。すなわちグルタミン酸は、イオンチャネル型受容体と代謝型受容体の２つの主要な受容体を介してその作用を媒介することが知られている。そして、イオンチャネル型受容体は、受容体の薬理学的および機能的性質に基づき更に分類されている。

上記イオンチャネル型受容体の主要なものは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（以下、「ＮＭＤＡ」）受容体、カイニン酸受容体およびα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（以下、「ＡＭＰＡ」）受容体である。更に、ＮＭＤＡ受容体は、グルタミン酸結合部位、グリシン結合部位、フェンサイクリジン結合部位、およびポリアミン結合部位を有するものに分類される。

一方、代謝型受容体は、８つの異なるメンバーが既知であり、これらは３つのグループに分けられる。すなわち、ｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ５はグループＩに、ｍＧｌｕＲ２及びｍＧｌｕＲ３はグループIIに、そしてｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７及びｍＧｌｕＲ８はグループIIIに属する。

また、本願発明におけるグルタミン酸受容体に対する非選択的結合とは、イオンチャネル型および代謝型の双方に対し結合性を有する結合のことである。

本発明方法において使用されるグルタミン酸受容体を発現している細胞膜としては、例えば、ウィスター系ラット等の実験動物の脳組織からマシューＡ, シルスらの論文（ＭａｔｔｈｅｗＡ．Ｓｉｌｌｓ，ｅｔａｌ．，１９９１，［^３Ｈ］ＣＧＰ３９６５３：ａｎｅｗＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒａｔｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｒｅｄｉｏｌｉｇａｎｄｗｉｔｈｌｏｗｎａｎｏｍｏｌａｒａｆｆｉｎｉｔｙｉｎｒａｔｂｒａｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９２，１９−２４）等に記載の方法により採取した脳膜分画を挙げることができる。グルタミン酸受容体の種類により、脳膜分画を得るために使用される脳組織の部位は異なり、例えば、グルタミン酸受容体に対する非選択的結合試験ではウィスター系ラットの脳から、ＡＭＰＡ受容体およびＮＭＤＡ受容体に対する結合試験ではウィスター系ラットの大脳皮質から、カイニン酸受容体に対する結合試験では、ウィスター系ラットの脳（小脳を除いたもの）からそれぞれ採取することができる。

更に、本発明方法において使用されるグルタミン酸受容体を発現している細胞としては、遺伝子操作により、グルタミン酸受容体遺伝子を導入した細胞を挙げることができる。例えば、グルタミン酸受容体遺伝子として、ｍＧｌｕＲ５を発現している細胞は、アラモリＩ．らの手段（ＡｒａｍｏｒｉＩ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆａｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃｇｌｕｔａｍａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｍＧｌｕＲ１，ｉｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓ，８，７５７−７６５）により、ヒト組換グルタミン酸受容体発現遺伝子を導入した細胞として作製することができ、具体的には、ｍＧｌｕＲ５を発現したＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞等が挙げられる。また、ｍＧｌｕＲ５を発現している細胞膜を得るには、上記のｍＧｌｕＲ５を発現している細胞を、ホモジネート等の手段により破壊し、高速遠心分離等の手段により細胞膜分画を分離したものが挙げられる。また、市販品として入手可能な、ｍＧｌｕＲ５発現細胞膜分画を利用することもできる。

また、グルタミン酸受容体に対する標識リガンドとして、ラジオアイソトープ、蛍光、酵素等で標識したものが挙げられ、その例としては、［^３Ｈ］Ｌ−グルタミン酸、［^３Ｈ］ＡＭＰＡ、［^３Ｈ］カイニン酸（Ｋａｉｎｉｃａｃｉｄ）、［^３Ｈ］ＣＧＰ−３９６５３、［^３Ｈ］ＭＤＬ−１０５５１９、［^３Ｈ]ＴＣＰ、［^３Ｈ］イフェンプロジル（Ｉｆｅｎｐｒｏｄｉｌ）、［^３Ｈ]キスカル酸（Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃａｃｉｄ）が挙げられ、各グルタミン酸受容体に対応して使い分けられる。

本願発明のバイオアッセイ方法の実施態様の一つは、例えば、ウィスター系ラットから、所定のグルタミン酸受容体が発現されている脳組織を採取し、これから上記方法等により脳膜分画を得、放射リガンド等の標識リガンドと抑肝散との競合反応から結合活性を求める方法が挙げられる。この場合の反応系は、４〜３７℃程度とすることが好ましく、抑肝散の結合活性の測定は、脳膜分画に標識リガンドと抑肝散を加えてから、２０〜１２０分程度の後とすればよい。また、抑肝散の結合活性は、標識リガンドのみの特異的結合量と競合反応後のリガンド結合量の差から測定することができる。

また、本願発明の他の実施態様は、遺伝子操作によりグルタミン酸受容体遺伝子を導入した細胞またはこの細胞の細胞膜を利用し、放射リガンド等の標識リガンドと抑肝散との競合反応から結合活性を求める方法が挙げられる。具体的には、ｍＧｌｕＲ５を発現しているＣＨＯ細胞膜等を用い、［^３Ｈ]キスカル酸と抑肝散との競合反応から結合活性を求める方法が例示される。この場合の反応系は、２５〜３７℃程度とすることが好ましく、抑肝散の結合活性の測定は、細胞膜等に標識リガンドと抑肝散を加えた後、３０〜１２０分程度の後に行えばよい。また、抑肝散の結合活性は、標識リガンドのみの特異的結合量と競合反応後のリガンド結合量の差から測定することができる。

本願発明のバイオアッセイ方法においては、一般的に既知濃度の抑肝散を含む試料を同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被検試料中の抑肝散の薬理活性（結合活性）価を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、既知濃度の抑肝散を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。

以上のようにして、被検試料中の抑肝散の薬理活性価を評価することができるが、この作用機序は、次のように考えられている。すなわち、抑肝散はグルタミン酸受容体に結合するが、本発明においては、当該成分と標識した各リガンドを競合反応させることにより、前記成分量に応じてグルタミン酸受容体に結合する標識リガンドが減少する。この減少した標識リガンド量を測定することにより、抑肝散の結合活性評価が可能となるというものである。

以上説明した本発明のバイオアッセイ法によれば、抑肝散として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性価を評価し、基準製剤と被検製剤を比較することにより、製剤の品質同等性を評価することができる。

さらに、以上説明したバイオアッセイ法において、抑肝散以外の、サイコ、センキュウ、トウキ、カンゾウ又はそれらを含有する被検試料（以下、「生薬試料」という）についても、抑肝散と同様に品質の同等性を評価することが出来る。

ここで、抑肝散以外のサイコを含有する被検試料としては、柴胡加竜骨牡蠣湯、柴胡桂枝乾姜湯、加味帰脾湯、抑肝散加陳皮半夏等の漢方処方やサイコを含有する植物エキス製剤等があげられる。また、抑肝散以外のセンキョウを含有する被検試料としては、七物降下湯、十全大補湯、酸棗仁湯等の漢方処方やセンキョウを含有する植物エキス製剤等が挙げられる。更に、抑肝散以外のトウキを含有する被検試料としては、当帰芍薬散、加味逍遙散、人参養栄湯等の漢方処方やトウキを含有する植物エキス製剤等が挙げられ、更にまた、抑肝散以外のカンゾウを含有する被検試料としては、芍薬甘草湯、温経湯、四逆散等の漢方処方やカンゾウを含有する植物エキス製剤等が挙げられる。

上記のサイコ等を含有する被検試料のバイオアッセイは、基本的には抑肝散について説明したのと同様に実施できるが、グルタミン酸受容体毎に各生薬試料の反応性が異なるので、予め所定の濃度の生薬試料を用いて試験し、検量線を作成しておくことが好ましい。

以上説明した本発明のバイオアッセイ法により、複数の製剤ロットについて薬理活性価の評価を行い、その平均等から導き出される上下限の範囲を規格化し、被検試料の薬理活性価がその範囲に該当するかどうかにより品質同等性を評価することもできる。

次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。

参考例１
被験薬物溶液の調製：
２０ｍｇの被験薬物（ＴＪ−５４または構成生薬エキス）を秤量し、蒸留水を加え、２０ｍｇ/１２５μＬ（構成生薬エキスでは２０ｍｇ/１００μＬ）に調製し、さらにＤＭＳＯで２倍希釈したものを原液とした。この溶液を用いて各濃度に希釈した。

実施例１
種々の濃度の抑肝散（ＴＪ−５４；株式会社ツムラ製）のグルタミン酸受容体に対する結合活性（％）を下記（１）から（６）の方法で求めた。この結果を図１に示す。

（１）グルタミン酸受容体に対する被験薬物の非選択的結合試験：
ウィスター系ラットから採取した脳組織に２０ｍＬ／ｇの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加え、ホモジネート後、遠心分離（３９，０００ｘｇ、１５分、４℃）を３回繰り返すことにより膜分画を得た。１ｍＬのチューブに、２００μＬの得られた膜分画溶液（５−２０ｍｇ／ｍＬ）、２０μＬの［^３Ｈ］Ｌ−グルタミン酸（最終濃度：３．７５ｎＭ）および各濃度の被験薬物溶液２μＬを加えて、３７℃で３０分間インキュベーションした。対照群として、ＤＭＳＯ溶液（最終濃度０．５％）を加え、同様にインキュベーションした。

インキュベーション終了後、セルハーベスター（ＢｒａｎｄｅｌＭＬＲ−４８、Ｓｋａｔｒｏｎｍｉｃｒｏ−９６、パーキンエルマー）でガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ１８２１−９１５ＧＦ／Ｂ、ワットマン）に濾過し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で３−６回洗浄後、ガラス繊維フィルターの［^３Ｈ］Ｌ−グルタミン酸の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＷａｌｌａｃＣｏｕｎｔｅｒ、パーキンエルマー）で測定した。非特異的結合は、５０μＭの非標識Ｌ−グルタミン酸存在下の［^３Ｈ］Ｌ−グルタミン酸の放射活性を測定した。総結合は、被験薬物非存在下での［^３Ｈ］Ｌ−グルタミン酸の放射活性を測定した。なお、被験薬物の結合活性は、以下の結合阻害率（％）から算出した。

結合阻害率（％）＝［１−（ｃ−ａ）／（ｂ−ａ）］×１００
ａ；非特異結合の平均ｃｐｍ
ｂ；総結合の平均ｃｐｍ
ｃ；被験薬物存在下でのｃｐｍ

なお、本実験での各条件は次の通りである。
細胞膜画分の起源：ウィスター系ラットの脳
対照：０．５％ＤＭＳＯ
反応緩衝液：ＣａＣｌ_２２．５ｍＭを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）
反応時間および温度：３０分、３７℃
リガンド：３．７５ｎＭの［^３Ｈ］Ｌ−グルタミン酸（パーキンエルマー）
非特異的リガンド：５０μＭのＬ−グルタミン酸（シグマ）
Ｋｄ：０．２９３μＭ
Ｂｍａｘ：３６ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン
特異的結合：９０％

（２）ＡＭＰＡ受容体に対する被験薬物の結合試験：
ウィスター系ラットから採取した大脳皮質の組織に２０ｍＬ／ｇの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２００ｍＭＫＳＣＮを含む）緩衝液を加え、ホモジネート後、遠心分離（４８，０００ｘｇ、１５分、４℃）を３回繰り返すことにより膜分画を得た。１ｍＬのチューブに、５００μＬの得られた膜分画溶液（５−２０ｍｇ／ｍＬ）、２０μＬの［^３Ｈ］ＡＭＰＡ（最終濃度：５ｎＭ）および各濃度の被験薬物溶液５．２５μＬを加えて、４℃で９０分間インキュベーションした。対照群として、ＤＭＳＯ溶液（最終濃度０．５％）を加え、同様にインキュベーションした。

インキュベーション終了後、セルハーベスター（ＢｒａｎｄｅｌＭＬＲ−４８、Ｓｋａｔｒｏｎｍｉｃｒｏ−９６、パーキンエルマー）でガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ１８２１−９１５ＧＦ／Ｂ、ワットマン）に濾過し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で３−６回洗浄後、ガラス繊維フィルターの［^３Ｈ］ＡＭＰＡの放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＷａｌｌａｃＣｏｕｎｔｅｒ、パーキンエルマー）で測定した。非特異的結合は、１０００μＭの非標識Ｌ−グルタミン酸存在下の［^３Ｈ］ＡＭＰＡの放射活性を測定した。総結合は、被験薬物非存在下での［^３Ｈ］ＡＭＰＡの放射活性を測定した。また、被験薬物の結合活性は、前記式の結合阻害率により評価した。

なお、本実験での各条件は次の通りである。
細胞膜画分の起源：ウィスター系ラットの大脳皮質
反応液：ＫＳＣＮ２００ｍＭを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）
対照：０．５％ＤＭＳＯ
反応時間および温度：９０分、４℃
リガンド：５ｎＭの［^３Ｈ］ＡＭＰＡ（パーキンエルマー）
非特異的リガンド：１０００μＭのＬ−グルタミン酸（シグマ）
Ｋｄ：０．０１８μＭ（Ｋｄ１）、０．９９μＭ（Ｋｄ２）
Ｂｍａｘ：０．６２ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン（Ｂｍａｘ１）、
１７ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン（Ｂｍａｘ２）
特異的結合：９０％

（３）カイニン酸（Ｋａｉｎａｔｅ）受容体に対する被験薬物の結合試験：
ウィスター系ラットから採取した小脳を除いた脳の組織に２０ｍＬ／ｇの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加え、ホモジネート後、遠心分離（４８，０００ｘｇ、１５分、４℃）を３回繰り返すことにより膜分画を得た。１ｍＬのチューブに、５００μＬの膜分画溶液（５−２０ｍｇ／ｍＬ）、２０μＬの［^３Ｈ］カイニン酸（最終濃度：５ｎＭ）および各濃度の被験薬物溶液５．２５μＬを加えて、４℃で６０分間インキュベーションした。対照群として、ＤＭＳＯ溶液（最終濃度０．５％）を加え、同様にインキュベーションした。

インキュベーション終了後、セルハーベスター（ＢｒａｎｄｅｌＭＬＲ−４８、Ｓｋａｔｒｏｎｍｉｃｒｏ−９６、パーキンエルマー）でガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ１８２１−９１５ＧＦ／Ｂ、ワットマン）に濾過し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で３−６回洗浄後、ガラス繊維フィルターの［^３Ｈ］カイニン酸の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＷａｌｌａｃＣｏｕｎｔｅｒ、パーキンエルマー）で測定した。非特異的結合は、１０００μＭの非標識Ｌ−グルタミン酸存在下の［^３Ｈ］カイニン酸の放射活性を測定した。総結合は、被験薬物非存在下での［^３Ｈ］カイニン酸の放射活性を測定した。また、被験薬物の結合活性は、前記式の結合阻害率により評価した。

なお、本実験での各条件は次の通りである。
細胞膜画分の起源：ウィスター系ラットの脳組織（小脳を除く）
反応緩衝液：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）
対照：０．５％ＤＭＳＯ
反応時間および温度：６０分、４℃
リガンド：５ｎＭの［^３Ｈ］カイニン酸（パーキンエルマー）
非特異的リガンド：１０００μＭのＬ−グルタミン酸（シグマ）
Ｋｄ：０．０１２μＭ
Ｂｍａｘ：０．３５ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン
特異的結合：８０％

（４）ＮＭＤＡ受容体のグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）結合部位に対する被験薬物の結合試験：
ウィスター系ラットから採取した大脳皮質の組織に２０ｍＬ／ｇの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加え、ホモジネート後、遠心分離（１，０００ｘｇ、１０分、４℃）した。その上清を集め、遠心分離（２０，０００ｘｇ、２０分、４℃）によりペレットを得た。このペレットを緩衝液で再懸濁し、遠心分離した（８，０００ｘｇ、２０分、４℃）。上清を集め、遠心分離（４８，０００ｘｇ、２０分、４℃）によりペレットを得た。このペレットを緩衝液で再懸濁し、遠心分離（４８，０００ｘｇ、４℃）を３回（２０分・１０分・１０分）行うことにより膜分画を得た。１ｍＬのチューブに、５００μＬの膜分画溶液（５−２０ｍｇ／ｍＬ）、２０μＬの［^３Ｈ］ＣＧＰ−３９６５３（最終濃度：２ｎＭ）および各濃度の被験薬物溶液５．２５μＬを加えて、４℃で２０分間インキュベーションした。対照群として、ＤＭＳＯ溶液（最終濃度０．５％）を加え、同様にインキュベーションした。

インキュベーション終了後、セルハーベスター（ＢｒａｎｄｅｌＭＬＲ−４８、Ｓｋａｔｒｏｎｍｉｃｒｏ−９６、パーキンエルマー）でガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ１８２１−９１５ＧＦ／Ｂ、ワットマン）に濾過し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で３−６回洗浄後、ガラス繊維フィルターの［^３Ｈ］ＣＧＰ−３９６５３の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＷａｌｌａｃＣｏｕｎｔｅｒ、パーキンエルマー）で測定した。非特異的結合は、１０００μＭの非標識Ｌ−グルタミン酸存在下の［^３Ｈ］ＣＧＰ−３９６５３の放射活性を測定した。総結合は、被験薬物非存在下での［^３Ｈ］ＣＧＰ−３９６５３の放射活性を測定した。また、被験薬物の結合活性は、前記式の結合阻害率により評価した。

なお、本実験での各条件は次の通りである。
細胞膜画分の起源：ウィスター系ラットの大脳皮質
反応緩衝液：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）
対照：０．５％ＤＭＳＯ
反応時間および温度：２０分、４℃
リガンド：２ｎＭの［^３Ｈ］ＣＧＰ−３９６５３（パーキンエルマー）
非特異的リガンド：１０００μＭのＬ−グルタミン酸（シグマ）
Ｋｄ：０．０１９μＭ
Ｂｍａｘ：２.３ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン
特異的結合：７０％

（５）ＮＭＤＡ受容体のグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）結合部位に対する被験薬物の結合試験：
ウィスター系ラットから採取した大脳皮質の組織に２０ｍＬ／ｇの５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、ホモジネート後、遠心分離（１，０００ｘｇ、１０分、４℃）した。その上清を集め、遠心分離（２０，０００ｘｇ、２０分、４℃）によりペレットを得た。このペレットを緩衝液で再懸濁し、遠心分離した（８，０００ｘｇ、２０分、４℃）。上清を集め、遠心分離（４８，０００ｘｇ、２０分、４℃）によりペレットを得た。このペレットを緩衝液で再懸濁し、遠心分離（４８，０００ｘｇ、４℃）を３回（２０分・１０分・１０分）行うことにより膜分画を得た。１ｍＬのチューブに、５００μＬの膜分画溶液（５−２０ｍｇ／ｍＬ）、２０μＬの［^３Ｈ］ＭＤＬ−１０５５１９（最終濃度：０．３３ｎＭ）および各濃度の被験薬物溶液５．２５μＬを加えて、４℃で３０分間インキュベーションした。対照群として、ＤＭＳＯ溶液（最終濃度０．５％）を加え、同様にインキュベーションした。

インキュベーション終了後、セルハーベスター（ＢｒａｎｄｅｌＭＬＲ−４８、Ｓｋａｔｒｏｎｍｉｃｒｏ−９６、パーキンエルマー）でガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ１８２１−９１５ＧＦ／Ｂ、ワットマン）に濾過し、５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で３−６回洗浄後、ガラス繊維フィルターの［^３Ｈ］ＭＤＬ−１０５５１９の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＷａｌｌａｃＣｏｕｎｔｅｒ、パーキンエルマー）で測定した。非特異的結合は、１０μＭの非標識ＭＤＬ−１０５５１９存在下の［^３Ｈ］ＭＤＬ−１０５５１９の放射活性を測定した。総結合は、被験薬物非存在下での［^３Ｈ］ＭＤＬ−１０５５１９の放射活性を測定した。また、被験薬物の結合活性は、前記式の結合阻害率により評価した。

なお、本実験での各条件は次の通りである。
細胞膜画分の起源：ウィスター系ラットの大脳皮質
反応緩衝液：５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.７）
対照：０．５％ＤＭＳＯ
反応時間および温度：３０分、４℃
リガンド：０．３３ｎＭの［^３Ｈ］ＭＤＬ−１０５５１９（パーキンエルマー）
非特異的リガンド：１０μＭＭＤＬ−１０５５１９（シグマ）
Ｋｄ：６ｎＭ
Ｂｍａｘ：３．７ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン
特異的結合：８５％

（６）代謝型グルタミン酸受容体、ｍＧｌｕＲ５に対する被験薬物の結合試験：
１ｍＬのチューブに、３０μｇプロテイン／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞膜溶液、２０μＬの［^３Ｈ］キスカル酸（Ｑｕｉｓｑｕｌｉｃａｃｉｄ）（最終濃度：０．０３μＭ）および各濃度の被験薬物溶液１．１μＬを加えて、２５℃で２時間インキュベーションした。対照群として、ＤＭＳＯ溶液（最終濃度０．５％）を加え、同様にインキュベーションした。

インキュベーション終了後、セルハーベスター（Ｍｉｃｒｏ９６ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ，パーキンエルマー）でガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ１８２１−９１５ＧＦ／Ｂ、ワットマン）に濾過し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液で６回洗浄後、ガラス繊維フィルターの［^３Ｈ］キスカル酸の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＷａｌｌａｃＣｏｕｎｔｅｒ）で測定した。非特異的結合は、１０００μＭの非標識Ｌ−グルタミン酸存在下の［^３Ｈ］キスカル酸の放射活性を測定した。総結合は、被験薬物非存在下での［^３Ｈ］キスカル酸の放射活性を測定した。また、被験薬物の結合活性は、前記式の結合阻害率により評価した。

なお、本実験での各条件は次の通りである。
細胞膜の起源：ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ヒト組換ｍＧｌｕＲ５を発現）（パーキンエルマー）
反応緩衝液：ＭｇＣｌ_２２ｍＭ、ＣａＣｌ_２２ｍＭを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）
対照：０．５％ＤＭＳＯ
反応時間および温度：２時間、２５℃
リガンド：０．０３μＭのキスカル酸（パーキンエルマー）
非特異的リガンド：１０００μＭのＬ−グルタミン酸（シグマ）
Ｋｄ：０．０２６μＭ
Ｂｍａｘ：０．６８ｐｍｏｌ／ｍｇプロテイン
特異的結合：８５％

（結果）
図１に示すように、２５から８００μｇ／ｍＬ濃度の抑肝散（ＴＪ−５４；株式会社ツムラ製）のグルタミン酸受容体に対する結合活性（％）は、ＮＭＤＡで最も高い結合活性を示し、次いでカイニン酸、ＡＭＰＡ，ｍＧｌｕＲ５の順であった。また、ＮＭＤＡ受容体においては、グルタミン酸結合部位およびグリシン結合部位への結合活性が見られた。さらに、各グルタミン酸受容体における結合活性は、用量依存性であることが認められた。

実施例２
抑肝散（ＴＪ−５４；株式会社ツムラ製）の各構成生薬の７エキス（５０μｇ/ｍＬ）の結合活性（％）を、実施例１の方法で求めた。この結果を図２に示す。なお。図中には２００μｇ／ｍＬ抑肝散の結合活性（％）も併記した。

図２の結果から、ＡＭＰＡ受容体においては、サイコ、センキュウ、およびトウキで高い活性が認められ、カイニン酸受容体においては、サイコ、センキュウ、トウキ、およびカンゾウで高い活性が認められた。また、ＮＭＤＡ受容体のグルタミン酸結合部位においては、サイコ、センキュウ、トウキおよびカンゾウで高い活性が認められ、ＮＭＤＡ受容体のグリシン結合部位においては、サイコ、センキュウおよびカンゾウで高い活性が認められた。さらに、ｍＧｌｕＲ５においては、サイコおよびセンキュウで高い活性が認められた。

上記実施例１および実施例２の結果から、抑肝散の用量と結合活性の間に高い相関関係があること、また、抑肝散の構成生薬のうち、サイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウと各グルタミン酸受容体に対する結合活性の間に高い相関関係があることがわった。この結果から、実施例１の方法で抑肝散の薬理活性値を測定することができることおよび各グルタミン酸受容体結合活性は、抑肝散中のサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウによるものであることが理解できる。

本発明によれば、試験管内試験により、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、簡単かつ安定に抑肝散の薬理活性価を求めることが可能である。

従って、従来の含有される一定成分を分析する方法に比べ、抑肝散をより高い程度で品質保証することが可能となる。

抑肝散の各グルタミン酸受容体結合活性を示す図である。ここで非選択的結合とは、イオンチャネル型受容体および代謝型受容体の双方に対する非選択的な結合を示す。抑肝散を構成する７生薬の各グルタミン酸受容体結合活性を示す図面である。

Claims

グルタミン酸受容体を発現している細胞または細胞膜に対して、標識リガンドと抑肝散とを競合的に作用させて抑肝散の受容体結合活性を測定し、この値から抑肝散の薬理活性値を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法。
グルタミン酸受容体のイオンチャネル型および代謝型の双方に対し結合性を有する非選択的標識リガンドを用いた請求項１記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
グルタミン酸受容体のイオンチャネル型受容体に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項１記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
イオンチャネル型受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、カイニン酸受容体およびα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項３記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のグルタミン酸結合部位またはグリシン結合部位に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項４記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
グルタミン酸受容体の代謝型受容体に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項１記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
代謝型受容体のｍＧｌｕＲ５に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項６記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
グルタミン酸受容体を発現している細胞または細胞膜に対して、標識リガンドと少なくともサイコ、センキュウ、トウキ、またはカンゾウを含有する被検試料とを競合的に作用させて被検試料の受容体結合活性を測定し、この値から被検試料の薬理活性値を評価することを特徴とする少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法。
グルタミン酸受容体のイオンチャネル型および代謝型の双方に対し結合性を有する非選択的標識リガンドを用いた請求項８記載の少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法。
グルタミン酸受容体のイオンチャネル型受容体に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項８記載の少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法。
イオンチャネル型受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、カイニン酸受容体およびα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項１０記載の少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法。
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のグルタミン酸結合部位またはグリシン結合部位に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項１１記載の少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法。
グルタミン酸受容体の代謝型受容体に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項８記載の少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法。
代謝型受容体のｍＧｌｕＲ５に特異的に結合する標識リガンドを用いた請求項１３記載の少なくともサイコ、センキュウ、トウキまたはカンゾウを含有する被検試料のバイオアッセイ方法。