CN102066930B - 抑肝散的生物测定方法 - Google Patents

抑肝散的生物测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102066930B
CN102066930B CN200880130008.2A CN200880130008A CN102066930B CN 102066930 B CN102066930 B CN 102066930B CN 200880130008 A CN200880130008 A CN 200880130008A CN 102066930 B CN102066930 B CN 102066930B
Authority
CN
China
Prior art keywords
liver
loose
receptor
glutamate receptor
bioassay method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200880130008.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102066930A (zh
Inventor
五十岚康
川上善治
寺胁洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsumura and Co
Original Assignee
Tsumura and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsumura and Co filed Critical Tsumura and Co
Publication of CN102066930A publication Critical patent/CN102066930A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102066930B publication Critical patent/CN102066930B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Abstract

为了发现一种能够保证抑肝散的更高品质的、利用试管内试验的生物测定体系，提供了一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，使标记配体和抑肝散竞争性作用于表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜，从而测定抑肝散的结合活性，并由该值评价抑肝散的药理活性值。

Description

抑肝散的生物测定方法
技术领域
本发明涉及抑肝散的测定方法，更详细而言，涉及一种测定方法，该测定方法利用对谷氨酸受体的作用，能定量地评价中药制剂抑肝散的生理活性值(药理活性值)。
背景技术
中药是将生药混合而成的药品，其活性成分并没有完全确定。此外，由于并不限于仅以单一的活性成分发挥效果，有时也共同起作用，因此为了保证其品质，需要能够对中药整体进行评价的测定方法(专利文献1、专利文献2)。
在该测定方法中，有测定个别的成分后对它们进行综合性评价的方法和采用生物材料来评价生理活性的生物测定。而且在生物测定中，有生物体内(体内，in vivo)试验和试管内(体外，in vitro)试验，但生物体内试验的体系在试验设施、试验动物、处理能力等方面存在各种限制，用于中药的品质评价时伴随有困难。
另一方面，在试管内试验的体系中，由于不需要特殊的设施，且短时间内能获得稳定的试验结果，因此寻求利用该体系来建立生物测定法，实际上关于肌肉生长抑制素(Myostatin)的生物测定法已有报道(专利文献3)。但是，对于自身由包含多种有效成分的生药组合而成的中药来说，还没有发现通常适用的生物测定体系，因而期待建立该生物测定体系。
例如，中药制剂抑肝散通常为具有以下组成的生药混合物或其提取物，进而根据需要含有赋形剂等药用载体、其他制剂上可使用的成分，但关于该制剂，也还没有发现合适的生物测定体系，为了保证更佳的品质，期望开发出其生物测定体系。
[表1]
专利文献1：日本特表2000-512621
专利文献2：日本特表2001-521876
专利文献3：日本特表2005-520486
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的课题在于发现能够保证抑肝散的更高品质的、利用试管内试验的生物测定体系。
用于解决问题的方案
本发明人等对抑肝散的作用进行了深入研究，结果认识到，抑肝散具有与谷氨酸受体的结合活性，且该结合活性依赖于抑肝散的用量。此外，认识到抑肝散的构成生药即柴胡、川芎、当归、甘草等也具有与谷氨酸受体的结合活性，且对于每种谷氨酸受体而言，引起结合活性的生药不相同。并且发现，应用该见解，能够建立抑肝散、或柴胡、川芎、当归、甘草或者含有这些生药的待测试样的生物测定方法，从而完成了本发明。
即本发明为一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，使标记配体和抑肝散竞争性作用于表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜，从而测定抑肝散的结合活性，并由该值评价抑肝散的药理活性值。
此外本发明为一种至少含有柴胡、川芎、当归或甘草的待测试样的生物测定方法，其特征在于，使标记配体和至少含有柴胡、川芎、当归或甘草的待测试样竞争性作用于表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜，从而测定待测试样的受体结合活性，并由该值评价待测试样的药理活性值。
发明的效果
根据本发明的生物测定方法，能够不受试验设施、试验动物、处理能力等的限制，通过试管内试验简便且稳定地求出抑肝散或含有作为抑肝散等的构成生药的柴胡、川芎、当归、和甘草的待测试样的生理活性值(药理活性值)。
附图说明
图1是表示抑肝散的各谷氨酸受体的结合活性的图。其中，非选择性结合是指对离子通道型受体和代谢型受体这两者的非选择性结合。
图2是表示构成抑肝散的7种生药的各谷氨酸受体结合活性的图。
具体实施方式
本发明的抑肝散的生物测定方法通过使用表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜来测定该受体和抑肝散的结合活性，从而评价抑肝散的药理活性值。
具体而言，能够利用以下方法：使标记配体和抑肝散竞争性作用于表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜，由结合的标记配体量来测定抑肝散的结合活性。
更具体而言，使标记配体和抑肝散竞争性地与在细胞或细胞膜中表达的谷氨酸受体反应，由仅存在标记配体时的特异性结合量和竞争后的标记配体结合量之差来测定抑肝散的结合活性值。
本发明中使用的谷氨酸受体，可以根据药理学的标准进行分类。即，已知谷氨酸介由离子通道型受体和代谢型受体这两种主要的受体来传递其作用。而且，离子通道型受体可以根据受体的药理学和功能性质进一步分类。
上述离子通道型受体主要是：N-甲基-D-天门冬氨酸(以下称为“NMDA”)受体、红藻氨酸受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸(以下称为“AMPA”)受体。进而，NMDA受体可分为具有谷氨酸结合部位、甘氨酸结合部位、苯环己哌啶结合部位、和多胺结合部位的受体。
另一方面，代谢型受体已知有8个不同的成员，它们被分为三组。即，mGluR1和mGluR5属于组I，mGluR2和mGluR3属于组II，而mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8属于组III。
另外，本申请发明中的对谷氨酸受体的非选择性结合是指，对离子通道型和代谢型这两者均具有结合性的结合。
作为本发明方法中使用的表达谷氨酸受体的细胞膜，例如可列举出根据Matthew A.Sills等的论文(Matthew A.Sills，et al.，1991，[3H]CGP39653：a new N-methyl-D-asparate antagonistredioligand with low nanomolar affinity in rat brain，Eur.J.Pharmacol.，192，19-24)等所记载的方法从Wistar系大鼠等实验动物的脑组织中采集的脑膜部分。根据谷氨酸受体的种类，为得到脑膜部分而使用的脑组织的部位不同，例如，在对谷氨酸受体的非选择性结合试验中可以从Wistar系大鼠的脑采集，在对AMPA受体和NMDA受体的结合试验中可以从Wistar系大鼠的大脑皮质采集，在对红藻氨酸受体的结合试验中可以从Wistar系大鼠的脑(除去小脑后的脑)采集。
此外，作为本发明方法中使用的表达谷氨酸受体的细胞，可以列举出通过基因操作而导入了谷氨酸受体基因的细胞。例如，表达作为谷氨酸受体基因的mGluR5的细胞，可以列举出通过Aramori I.等的方法(Aramori I.et al.，1992，Signaltransduction and pharmacological characteristics of ametabotropic glutamate receptor，mGluR1，in transfected CHOcells，8，757-765)导入了人重组谷氨酸受体表达基因而制作的细胞，具体而言，可列举出表达mGluR5的CHO细胞、HEK-293细胞等。另外，为获得表达mGluR5的细胞膜，可列举出将上述表达mGluR5的细胞通过匀浆等方法破坏、并通过高速离心分离等方法分离细胞膜部分的方法。另外，可以利用作为市售品而可获得的mGluR5表达细胞膜部分。
另外，作为针对谷氨酸受体的标记配体，可列举出用放射性同位素、荧光、酶等标记的配体，作为其例子可列举出[3H]L-谷氨酸、[3H]AMPA、[3H]红藻氨酸(Kainic acid)、[3H]CGP-39653、[3H]MDL-105519、[3H]TCP、[3H]艾芬地尔(Ifenprodil)、[3H]使君子酸(Quisqualic acid)，可根据各谷氨酸受体区分使用。
作为本申请发明的生物测定方法的实施方式的一种，例如可列举出以下方法，该方法是从Wistar系大鼠采集表达了规定的谷氨酸受体的脑组织，然后，通过上述方法等获得脑膜部分，由放射配体等标记配体和抑肝散的竞争性反应求出结合活性。此时的反应体系优选为4～37℃左右，抑肝散的结合活性的测定，只要在向脑膜部分中添加标记配体和抑肝散后20～120分钟左右后进行即可。另外，抑肝散的结合活性能够由仅存在标记配体时的特异性结合量和竞争性反应后的配体结合量之差来测定。
另外，作为本申请发明的其他的实施方式，可列举出以下方法，该方法利用通过基因操作导入了谷氨酸受体基因的细胞或该细胞的细胞膜，由放射配体等标记配体和抑肝散的竞争性反应求出结合活性。具体而言，可举出以下方法，该方法使用表达mGluR5的CHO细胞膜等，由[3H]使君子酸和抑肝散的竞争性反应求出结合活性。此时的反应体系优选为25～37℃左右，抑肝散的结合活性的测定只要在向细胞膜等中添加标记配体和抑肝散后30～120分钟左右后进行即可。另外，抑肝散的结合活性能够由仅存在标记配体时的特异性结合量和竞争性反应后的配体结合量之差来测定。
本申请发明的生物测定方法中，通常优选同时对含有已知浓度的抑肝散的试样进行多个点、优选为3个点以上的测定，由此来定量待测试样中的抑肝散的药理活性(结合活性)值，但如果条件基本没有改变，则也可以使用已经由含有已知浓度的抑肝散的试样制作的标准曲线来测定。
如上述那样，能够评价待测试样中的抑肝散的药理活性值，该作用机制被认为如下。即，抑肝散与谷氨酸受体结合，但本发明中，该成分和标记的各配体发生竞争性反应，从而相应于前述成分量，与谷氨酸受体结合的标记配体减少。通过测定该减少的标记配体量，能够评价抑肝散的结合活性。
根据以上说明的本发明的生物测定法，通过对临床上已确认作为抑肝散的药理效果的标准制剂和待测制剂在同一条件下评价药理活性值，并比较标准制剂和待测制剂，从而能够对制剂的品质同等性进行评价。
进而，在以上说明的生物测定法中，对于除抑肝散以外的、柴胡、川芎、当归、甘草或含有它们的待测试样(以下称为“生药试样”)，也能与抑肝散同样地评价品质同等性。
在此，作为除抑肝散以外的含有柴胡的待测试样，可列举出柴胡加龙骨牡蛎汤、柴胡桂枝干姜汤、加味归脾汤、抑肝散加陈皮半夏等中药配方或含有柴胡的植物提取物制剂等。另外，作为除抑肝散以外的含有川芎的待测试样，可列举出七物降下汤、十全大补汤、酸枣仁汤等中药配方或含有川芎的植物提取物制剂等。另外，作为除抑肝散以外的含有当归的待测试样，可列举出当归芍药散、加味逍遥散、人参养荣汤等中药配方或含有当归的植物提取物制剂等，再另外，作为除抑肝散以外的含有甘草的待测试样，可列举出芍药甘草汤、温经汤、四逆散等中药配方或含有甘草的植物提取物制剂等。
上述含有柴胡等的待测试样的生物测定，基本上能与已对抑肝散所进行的说明同样地实施，由于各种生药试样对每种谷氨酸受体的反应性不同，因此优选预先使用规定浓度的生药试样进行试验、并制作标准曲线。
通过以上说明的本发明的生物测定法，对多个制剂批次进行药理活性值的评价，将由其平均值等导出的上下限的范围进行标准化，通过判断待测试样的药理活性值是否符合该范围，也能够评价品质同等性。
实施例
下面列举出实施例和参考例，对本发明进行更详细的说明，但本发明不受这些实施例等的任何限定。
参考例1
待测药物溶液的调制：
称量20mg的待测药物(TJ-54或构成生药提取物)，加入蒸馏水，调制成20mg/125μL(在构成生药提取物的情况下，为20mg/100μL)，进而用DMSO稀释2倍，以得到的溶液作为原液。用该溶液稀释至各浓度。
实施例1
根据下述(1)到(8)的方法求出各种浓度的抑肝散(TJ-54；株式会社津村制)对谷氨酸受体的结合活性(％)。其结果示于图1。
(1)待测药物对谷氨酸受体的非选择性结合试验：
向从Wistar系大鼠采集的脑组织中加入20mL/g的50mMTris-HCl缓冲液，匀浆后，重复进行3次离心分离(39,000×g、15分钟、4℃)，从而得到膜部分。向1mL的管中加入200μL所得到的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20μL的[3H]L-谷氨酸(最终浓度：3.75nM)和各种浓度的待测药物溶液2μL，在37℃下孵育30分钟。作为对照组，加入DMSO溶液(最终浓度0.5％)，同样地进行孵育。
孵育结束后，用细胞收集器(Brandel MLR-48、Skatronmicro-96、PerkinElmer)过滤到玻璃纤维滤器(Whatman1821-915 GF/B、Whatman)，用50mMTris-HCl缓冲液洗涤3-6次后，用液体闪烁计数器(Wallac Counter、PerkinElmer)测定玻璃纤维滤器的[3H]L-谷氨酸的放射活性。非特异性结合由50μM的非标记L-谷氨酸存在下的[3H]L-谷氨酸的放射活性测得。总结合由待测药物非存在下的[3H]L-谷氨酸的放射活性测得。另外，待测药物的结合活性由以下的结合抑制率(％)算出。
结合抑制率(％)＝[1-(c-a)/(b-a)]×100
a：非特异结合的平均cpm
b：总结合的平均cpm
c：待测药物存在下的cpm
另外，本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源：Wistar系大鼠的脑
对照：0.5％DMSO
反应缓冲液：含有CaCl22.5mM的50mM Tris-HCl(pH7.4)
反应时间及温度：30分钟、37℃
配体：3.75nM的[3H]L-谷氨酸(PerkinElmer)
非特异性配体：50μM的L-谷氨酸(Sigma)
Kd：0.293μM
Bmax：36pmol/mg蛋白质
特异性结合：90％
(2)待测药物对AMPA受体的结合试验：
向从Wistar系大鼠采集的大脑皮质的组织中添加20mL/g的50mM Tris-HCl(含有200mM KSCN)缓冲溶液，匀浆后，重复进行3次离心分离(48,000×g、15分钟、4℃)，从而得到膜部分。向1mL的管中加入500μL所得到的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20μL的[3H]AMPA(最终浓度：5nM)和各种浓度的待测药物溶液5.25μL，在4℃下孵育90分钟。作为对照组，加入DMSO溶液(最终浓度0.5％)，同样地进行孵育。
孵育完成后，用细胞收集器(Brandel MLR-48、Skatronmicro-96、PerkinElmer)过滤到玻璃纤维滤器(Whatman1821-915 GF/B、Whatman)，用50mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤3-6次后，用液体闪烁计数器(Wallac Counter、PerkinElmer)测定玻璃纤维滤器的[3H]AMPA的放射活性。非特异性结合由1000μM的非标记L-谷氨酸存在下的[3H]AMPA的放射活性测得。总结合由待测药物非存在下的[3H]AMPA的放射活性测得。另外，待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外，本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源：Wistar系大鼠的大脑皮质
反应液：含有KSCN200mM的50mM Tris-HCl(pH7.4)
对照：0.5％DMSO
反应时间及温度：90分钟、4℃
配体：5nM的[3H]AMPA(PerkinElmer)
非特异性配体：1000μM的L-谷氨酸(Sigma)
Kd：0.018μM(Kd1)、0.99μM(Kd2)
Bmax：0.62pmol/mg蛋白质(Bmax1)、
17pmol/mg蛋白质(Bmax2)
特异性结合：90％
(3)待测药物对红藻氨酸(Kainate)受体的结合试验：
向从Wistar系大鼠采集的除去小脑的脑组织中加入20mL/g的50mM Tris-HCl缓冲溶液，匀浆后，重复进行3次离心分离(48,000×g、15分钟、4℃)，从而得到膜部分。向1mL的管中添加500μL的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20μL的[3H]红藻氨酸(最终浓度：5nM)和各种浓度的待测药物溶液5.25μL，在4℃下孵育60分钟。作为对照组，加入DMSO溶液(最终浓度0.5％)，同样地进行孵育。
孵育完成后，用细胞收集器(Brandel MLR-48、Skatronmicro-96、PerkinElmer)过滤到玻璃纤维滤器(Whatman1821-915 GF/B、Whatman)，用50mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤3-6次后，用液体闪烁计数器(Wallac Counter、PerkinElmer)测定玻璃纤维滤器的[3H]红藻氨酸的放射活性。非特异性结合由1000μM的非标记L-谷氨酸存在下的[3H]红藻氨酸的放射活性测得。总结合由待测药物非存在下的[3H]红藻氨酸的放射活性测得。另外，待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外，本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源：Wistar系大鼠的脑组织(除去小脑)
反应缓冲液：50mM Tris-HCl(pH7.4)
对照：0.5％DMSO
反应时间及温度：60分钟、4℃
配体：5nM的[3H]红藻氨酸(PerkinElmer)
非特异性配体：1000μM的L-谷氨酸(Sigma)
Kd：0.012μM
Bmax：0.35pmol/mg蛋白质
特异性结合：80％
(4)待测药物对NMDA受体的谷氨酸(Glutamate)结合部位的结合试验：
向从Wistar系大鼠采集的大脑皮质的组织中添加20mL/g的50mM Tris-HCl缓冲溶液，匀浆后，离心分离(1,000×g、10分钟、4℃)。收集其上清液，离心分离(20,000×g、20分钟、4℃)从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲液再悬浮，离心分离(8,000×g、20分钟、4℃)。收集上清液，离心分离(48,000×g、20分钟、4℃)，从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲液再悬浮，进行3次(20分钟、10分钟、10分钟)离心分离(48,000×g、4℃)，从而得到膜部分。向1mL的管中加入500μL的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20μL的[3H]CGP-39653(最终浓度：2nM)和各种浓度的待测药物溶液5.25μL，在4℃下孵育20分钟。作为对照组，加入DMSO溶液(最终浓度0.5％)，同样地进行孵育。
孵育完成后，用细胞收集器(Brandel MLR-48、Skatronmicro-96、PerkinElmer)过滤到玻璃纤维滤器(Whatman1821-915 GF/B、Whatman)，用50mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤3-6次后，用液体闪烁计数器(Wallac Counter、PerkinElmer)测定玻璃纤维滤器的[3H]CGP-39653的放射活性。非特异性结合由1000μM的非标记L-谷氨酸存在下的[3H]CGP-39653的放射活性来测得。总结合由待测药物非存在下的[3H]CGP-39653的放射活性来测得。另外，待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外，本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源：Wistar系大鼠的大脑皮质
反应缓冲液：50mM Tris-HCl(pH7.4)
对照：0.5％DMSO
反应时间及温度：20分钟、4℃
配体：2nM的[3H]CGP-39653(PerkinElmer)
非特异性配体：1000μM的L-谷氨酸(Sigma)
Kd：0.019μM
Bmax：2.3pmol/mg蛋白质
特异性结合：70％
(5)待测药物对NMDA受体的甘氨酸(Glycine)结合部位的结合试验：
向从Wistar系大鼠采集的大脑皮质的组织中，添加20mL/g的50mM HEPE S缓冲溶液，匀浆后，离心分离(1,000×g、10分钟、4℃)。收集其上清液，离心分离(20,000×g、20分钟、4℃)，从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲溶液再悬浮，离心分离(8,000×g、20分钟、4℃)。收集上清液，离心分离(48,000×g、20分钟、4℃)，从而得到颗粒。将该颗粒用缓冲溶液再悬浮，进行3次(20分钟、10分钟、10分钟)离心分离(48,000×g、4℃)，从而得到膜部分。向1mL的管中加入500μL的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20μL的[3H]MDL-105519(最终浓度：0.33nM)和各种浓度的待测药物溶液5.25μL，在4℃下孵育30分钟。作为对照组，加入DMSO溶液(最终浓度0.5％)，同样地进行孵育。
孵育完成后，用细胞收集器(Brandel MLR-48、Skatronmicro-96、PerkinElmer)过滤到玻璃纤维滤器(Whatman1821-915 GF/B、whatman)，用50mM HEPES缓冲液洗涤3-6次后，用液体闪烁计数器(Wallac Counter、PerkinElmer)测定玻璃纤维滤器的[3H]MDL-105519的放射活性。非特异性结合由10μM的非标记MDL-105519存在下的[3H]MDL-105519的放射活性来测得。总结合由待测药物非存在下的[3H]MDL-105519的放射活性来测得。另外，待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外，本实验的各种条件如下。
细胞膜部分的来源：Wistar系大鼠的大脑皮质
反应缓冲液：50mM HEPES(pH7.7)
对照：0.5％DMSO
反应时间及温度：30分钟、4℃
配体：0.33nM的[3H]MDL-105519(PerkinElmer)
非特异性配体：10μM MDL-105519(Sigma)
Kd：6nM
Bmax：3.7pmol/mg蛋白质
特异性结合：85％
(6)待测药物对代谢型谷氨酸受体mGluR5的结合试验：
向1mL的管中加入30μg蛋白质/100μL的CHO-K1细胞膜溶液、20μL的[3H]使君子酸(Quisqulic acid)(最终浓度：0.03μM)和各种浓度的待测药物溶液1.1μL，在25℃下孵育2个小时。作为对照组，加入DMSO溶液(最终浓度0.5％)，同样地进行孵育。
孵育完成后，用细胞收集器(Micro 96 FilterMate，PerkinElmer)过滤到玻璃纤维滤器(Whatman 1821-915 GF/B、Whatman)，用20mM HEPES缓冲溶液洗涤6次后，用液体闪烁计数器(Wallac Counter)测定玻璃纤维滤器的[3H]使君子酸的放射活性。非特异性结合由1000μM的非标记L-谷氨酸存在下的[3H]使君子酸的放射活性来测得。总结合由待测药物非存在下的[3H]使君子酸的放射活性来测得。另外，待测药物的结合活性由前述算式的结合抑制率评价。
另外，本实验的各种条件如下。
细胞膜的来源：CHO-K1细胞(表达人重组mGluR5)(PerkinElmer)
反应缓冲液：含有MgCl2 2mM、CaCl2 2mM的20mM HEPES(pH7.4)
对照：0.5％DMSO
反应时间及温度：2小时、25℃
配体：0.03μM的使君子酸(PerkinElmer)
非特异性配体：1000μM的L-谷氨酸(Sigma)
Kd：0.026μM
Bmax：0.68pmol/mg蛋白质
特异性结合：85％
(结果)
如图1所示，关于25到800μg/mL浓度的抑肝散(TJ-54；株式会社津村制)对谷氨酸受体的结合活性(％)，NMDA显示出最高的结合活性，接着依次是红藻氨酸、AMPA、mGluR5。另外，NMDA受体中，可见与谷氨酸结合部位和甘氨酸结合部位的结合活性。进而，可认为各谷氨酸受体中的结合活性存在用量依赖性。
实施例2
以实施例1的方法求出抑肝散(TJ-54；株式会社津村制)的各构成生药的7种提取物(50μg/mL)的结合活性(％)。该结果示于图2。另外，图中也一并记载了200μg/mL抑肝散的结合活性(％)。
由图2的结果可认为，对于AMPA受体，柴胡、川芎、和当归有较高活性，对于红藻氨酸受体，柴胡、川芎、当归、和甘草有较高活性。另外认为，对于NMDA受体的谷氨酸结合部位，柴胡、川芎、当归和甘草有较高活性，对于NMDA受体的甘氨酸结合部位，柴胡、川芎和甘草有较高活性。此外认为，对于mGluR5，柴胡和川芎有较高活性。
由上述实施例1和实施例2的结果可知，抑肝散的用量与结合活性之间存在较高的相关关系，另外，抑肝散的构成生药中，柴胡、川芎、当归或甘草与对各谷氨酸受体的结合活性之间存在较高的相关关系。由该结果可以了解到，以实施例1的方法能够测定抑肝散的药理活性值，以及各种谷氨酸受体的结合活性是由抑肝散中的柴胡、川芎、当归或甘草产生的。
产业上的可利用性
根据本发明，通过试管内试验，能够不受试验设施、试验动物、处理能力等的限制，简便且稳定地求出抑肝散的药理活性值。
因此，与以往的对所含的一定成分进行分析的方法相比，能够以更高程度保证抑肝散的品质。

Claims (7)

1.一种抑肝散的生物测定方法，其特征在于，使标记配体和抑肝散竞争性作用于表达谷氨酸受体的细胞或细胞膜，从而测定抑肝散的受体结合活性，由该值评价抑肝散的药理活性值。
2.根据权利要求1所述的抑肝散的生物测定方法，其使用对谷氨酸受体中的离子通道型和代谢型这两者均具有结合性的非选择性标记配体。
3.根据权利要求1所述的抑肝散的生物测定方法，其使用与谷氨酸受体中的离子通道型受体特异性结合的标记配体。
4.根据权利要求3所述的抑肝散的生物测定方法，其使用与离子通道型受体中的N-甲基-D-天门冬氨酸受体、红藻氨酸受体以及α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸受体特异性结合的标记配体。
5.根据权利要求4所述的抑肝散的生物测定方法，其使用与N-甲基-D-天门冬氨酸受体的谷氨酸结合部位或甘氨酸结合部位特异性结合的标记配体。
6.根据权利要求1所述的抑肝散的生物测定方法，其使用与谷氨酸受体中的代谢型受体特异性结合的标记配体。
7.根据权利要求6所述的抑肝散的生物测定方法，其使用与代谢型受体中的mGluR5特异性结合的标记配体。
CN200880130008.2A 2008-06-27 2008-06-27 抑肝散的生物测定方法 Active CN102066930B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2008/061703 WO2009157083A1 (ja) 2008-06-27 2008-06-27 抑肝散のバイオアッセイ方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102066930A CN102066930A (zh) 2011-05-18
CN102066930B true CN102066930B (zh) 2014-10-08

Family

ID=41444159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880130008.2A Active CN102066930B (zh) 2008-06-27 2008-06-27 抑肝散的生物测定方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8420336B2 (zh)
JP (1) JP5402927B2 (zh)
CN (1) CN102066930B (zh)
WO (1) WO2009157083A1 (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040157917A1 (en) * 2001-07-05 2004-08-12 Serge Gobaille Identification of modulators of neurotransmitter activity of xanthurenic acid

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6379714B1 (en) 1995-04-14 2002-04-30 Pharmaprint, Inc. Pharmaceutical grade botanical drugs
US5851798A (en) 1997-01-27 1998-12-22 Smithkline Beecham Corporation Nucleic acid encoding human GPR14 receptor
US6159700A (en) * 1997-01-27 2000-12-12 Smithkline Beecham Corporation Method of finding agonist and antagonist to human and rat GPR14
US6133420A (en) 1997-01-27 2000-10-17 Smithkline Beecham Corporation GPR14 polypeptides
WO1999020292A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Pharmaprint, Inc. Pharmaceutical grade ginseng
AU2002328046B2 (en) 2001-07-11 2007-09-20 Orico Limited Bioassay for myostatin
EP1908492A4 (en) * 2005-06-22 2008-12-10 Ajinomoto Kk METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR ACTIVATOR
JP5267461B2 (ja) 2007-07-11 2013-08-21 株式会社ツムラ 抑肝散のバイオアッセイ方法
US20090098228A1 (en) 2007-10-10 2009-04-16 Tsumura & Co. Agent and method for improvement of impairment of learning and memory
JP5434599B2 (ja) 2008-02-15 2014-03-05 株式会社ツムラ 抑肝散のバイオアッセイ方法
WO2009122580A1 (ja) 2008-04-03 2009-10-08 株式会社ツムラ 抑肝散のバイオアッセイ方法
US20110039292A1 (en) 2009-08-11 2011-02-17 Tsumura & Co. Bioassay for yokukansan

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040157917A1 (en) * 2001-07-05 2004-08-12 Serge Gobaille Identification of modulators of neurotransmitter activity of xanthurenic acid

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficacy of Choto-san on vascular dementia and the protective effect of the hooks and stems of Uncaria sinensis on glutamate-induced neuronal death;Takashi Itoh et al;《mechanisms of ageing and development》;19991231;第111卷;155-173 *
Takashi Itoh et al.Efficacy of Choto-san on vascular dementia and the protective effect of the hooks and stems of Uncaria sinensis on glutamate-induced neuronal death.《mechanisms of ageing and development》.1999,第111卷155-173.
五十嵐康.現代に蘇える漢方療法 抑肝散の作用メカニズムの解明.《Geriatr Med》.2008,第46卷(第3期),255-261.
現代に蘇える漢方療法 抑肝散の作用メカニズムの解明;五十嵐康;《Geriatr Med》;20080301;第46卷(第3期);255-261 *

Also Published As

Publication number Publication date
US8420336B2 (en) 2013-04-16
WO2009157083A1 (ja) 2009-12-30
US20110111426A1 (en) 2011-05-12
CN102066930A (zh) 2011-05-18
JPWO2009157083A1 (ja) 2011-12-01
JP5402927B2 (ja) 2014-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Multiple muscarinic acetylcholine receptor subtypes modulate striatal dopamine release, as studied with M1–M5 muscarinic receptor knock-out mice
Li et al. Design and synthesis of minimalist terminal alkyne‐containing diazirine photo‐crosslinkers and their incorporation into kinase inhibitors for cell‐and tissue‐based proteome profiling
Wood et al. SB-243213; a selective 5-HT2C receptor inverse agonist with improved anxiolytic profile: lack of tolerance and withdrawal anxiety
Samaha et al. “Breakthrough” dopamine supersensitivity during ongoing antipsychotic treatment leads to treatment failure over time
Rahman et al. Zinc, manganese, calcium, copper, and cadmium level in scalp hair samples of schizophrenic patients
Mirin et al. Affective illness in substance abusers
Calandreau et al. Extracellular hippocampal acetylcholine level controls amygdala function and promotes adaptive conditioned emotional response
AU2016282996A1 (en) Methods, apparatuses, and systems for analyzing microorganism strains from complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
CN101608240A (zh) 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及其使用方法
Zhou et al. cDNA expression analysis of a human radiosensitive-radioresistant cell line model identifies telomere function as a hallmark of radioresistance
Scatton et al. Pharmacological and molecular targets in the search for novel antipsychotics
Lu et al. Assessing drug-induced long QT and proarrhythmic risk using human stem-cell-derived cardiomyocytes in a Ca2+ imaging assay: evaluation of 28 CiPA compounds at three test sites
Meintker et al. Immature platelets do not reliably predict platelet recovery in patients with intensive chemotherapy or stem cell transplantation
CN102066930B (zh) 抑肝散的生物测定方法
Reppe et al. Abnormal muscle and hematopoietic gene expression may be important for clinical morbidity in primary hyperparathyroidism
Xu et al. Asymmetric expression of Wnt/B-catenin pathway in AIS: primary or secondary to the curve?
Hummerich et al. DASB–in vitro binding characteristics on human recombinant monoamine transporters with regard to its potential as positron emission tomography (PET) tracer
CN101945663B (zh) 抑肝散的生物测定方法
Marcoli et al. Pharmacological diversity between native human 5‐HT1B and 5‐HT1D receptors sited on different neurons and involved in different functions
Dascal et al. Shared determinants of receptor binding for subtype selective, and dual endothelin‐angiotensin antagonists on the AT1 angiotensin II receptor
Kurjak et al. Characterization of prejunctional and postjunctional muscarinic receptors of the ascending reflex contraction in rat ileum
Miyazaki et al. Ninjin'yoeito, a traditional Japanese medicine, increases dopamine content in PC12 cells
Anderson et al. Characterisation of imidazoline I2 binding sites in pig brain
Riddell et al. Longitudinal assessment of skeletal muscle functional mechanics in the DE50-MD dog model of Duchenne muscular dystrophy
Beving et al. The effects of citalopram (Lu 10-171) on the serotonin (5-HT) uptake kinetics in platelets from endogenously depressed patients

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant