WO2009122580A1 - 抑肝散のバイオアッセイ方法 - Google Patents

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康 五十嵐
善治 川上
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    • G01N33/5058—Neurological cells

Definitions

  • the present invention relates to an assay method for yokukansan, and more particularly, to an assay method capable of quantitatively evaluating the physiological activity value (pharmacological activity value) of yokukansan, which is a Chinese medicine preparation, using cultured nerve cells. .
  • Cigarette is a medicinal product blended with herbal medicines, and not all active ingredients are specified.
  • a single active ingredient does not exert its effect but acts in a complex manner, a measurement method that can be evaluated as a whole Chinese medicine is necessary to guarantee its quality.
  • Patent Document 1 Patent Document 2.
  • This measurement method includes a method for measuring individual components and comprehensively evaluating them, and a bioassay for evaluating physiological activity using biological materials.
  • Bioassays include in vivo tests and in vitro tests, but the in vivo test systems have various limitations in terms of test facilities, test animals, and processing capacity. However, it was difficult to use for the quality evaluation of herbal medicine.
  • Yokukansan a Kampo preparation
  • Yokukansan a Kampo preparation
  • an object of the present invention is to find a bioassay system based on an in vitro test that enables higher quality assurance for yokukansan.
  • the present inventors have been diligently studying from the idea that there is a possibility of directly protecting the cell death caused by glutamic acid as an effect of yokukansan, which is generally used in research on cell death. It was confirmed that cell death was suppressed in a dose-dependent manner when cultured cells were cultured in the presence of glutamic acid to induce cell death and simultaneously add yokukansan. And if this knowledge was applied, it discovered that the bioassay method of the yokukansan with respect to the neuronal cell death could be constructed
  • the present invention adds a sufficient amount of glutamic acid and yokukansan to induce cell death in a medium for culturing cells, and determines the pharmacology of yokukansan from the viability of the cultured cells in the medium. It is a bioassay method for yokukansan characterized by evaluating activity value.
  • bioassay method of the present invention it is possible to easily and stably determine the physiological activity value (pharmacological activity value) of yokukansan by in vitro tests without any restrictions on test facilities, test animals, processing capacity, etc. is there.
  • a sufficient amount of glutamic acid and yokukansan to induce cell death are added to a medium for culturing nervous system cultured cells, and the nervous system in the medium is added. This is to evaluate the pharmacological activity value of Yokukansan from the survival rate of cultured cells.
  • known cells can be used as the allogeneic cultured cells, but it is preferable to use PC12 cells derived from rat adrenal brown cell types.
  • This PC12 cell is generally used in a wide variety of studies on cell death, and its characteristic is that it responds to a neurotrophic factor (NGF).
  • NGF neurotrophic factor
  • the culture without NGF shows the trait of adrenal medulla chromaffin cells, but in the presence of NGF, long nerve fibers are stretched and differentiated into sympathetic ganglion cells. Its use is extremely wide, especially for molecular biological use, and it has recorded enormous usage.
  • PC12 cells cause cell death by glutamic acid, but plant-derived components such as scutterralin, isoflavonoids, ( ⁇ )-epigallocatechin gallate, and the like suppress this cell death. This is known (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • PC12 cells used in the present invention are cultured in a RPMI1640 medium supplemented with 5% fetal bovine serum and 10% non-immobilized serum in a collagen-coated flask by culturing for a certain period, for example, 3 to 7 days. Can be produced.
  • PC12 cells respond to neurotrophic factor (NGF), but PC12 cells cause cell death depending on the concentration of glutamate regardless of the presence or absence of NGF stimulation. Therefore, in practicing the present invention, the presence or absence of NGF stimulation on PC12 cells is not affected.
  • NGF neurotrophic factor
  • the glutamic acid concentration in the culture medium for culturing nervous system cultured cells be a concentration sufficient to induce cell death in these cultured cells.
  • the pH in the medium tends to be acidic, and as a result, cell death due to changes in the culture environment is a concern. Therefore, cell death due to glutamic acid is induced at a lower concentration. It is necessary to select conditions that can be used.
  • the best cell death induction conditions selected as a result of these are to use dialyzed serum as the medium, collagen-coated plate as the plate, and medium without adding phenol red.
  • the implementation of the bioassay method of the present invention is not limited to these conditions.
  • the concentration of glutamic acid in the medium for effectively inducing cell death is preferably 1 ⁇ M to 50 mM, more preferably 1 mM to 20 mM.
  • One aspect of the evaluation method in the bioassay method of the present invention is to measure the cell death of PC12 cells in a medium supplemented with a sufficient amount of glutamic acid and a certain amount of yokukansan to induce cell death. Induction, the number of viable cells is measured by MTT assay, and the pharmacological activity value of Yokukansan is evaluated from these.
  • Such an MTT assay is a method in which 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) is a substrate for intracellular mitochondrial dehydrase, and has high viability. This is based on the fact that the amount of MTT that is reduced as much as possible, and the resulting yellow to red formazan amount corresponds well with the number of viable cells.
  • This method is a method capable of measuring only living cells, and measures the light absorbance of a sample at a wavelength of 570 nm with a reference wavelength of 690 nm. Of course, other known methods may be used as long as the number of viable cells can be measured.
  • this measurement in general, it is preferable to measure a plurality of samples containing yokukansan at a known concentration at the same time, preferably three or more points, and to quantify the pharmacological activity value of yokukansan in the test sample. If the conditions hardly change, measurement may be performed using a calibration curve already prepared with a sample containing a known concentration of yokukansan.
  • the pharmacological activity value of yokukansan can be evaluated in cultured cells of the nervous system. This mechanism of action is directly based on the action of yokukansan. That is, according to the studies by the present inventors, it was found that yokukansan suppresses cell death of cultured cells of the nervous system induced by glutamic acid, and thereby, pharmacological activity of cell death suppression in yokukansan. It became possible to evaluate the price.
  • the reference preparation and test preparation clinically pharmacologically effective as yokukansan are evaluated for pharmacological activity under the same conditions, and the reference preparation and test preparation are compared.
  • the quality equivalence of the preparation can be evaluated.
  • the pharmacological activity value of the test sample falls within the range of the upper and lower limits derived from the average and the like by evaluating the pharmacological activity value with the bioassay method of the present invention for a plurality of preparation lots
  • the quality equivalence can also be evaluated.
  • PC12 cell culture PC12 cells (source: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) were cultured as follows. That is, a 75 cm 2 culture area flask coated with collagen (collagen acidic solution IAC-15: manufactured by Koken Co., Ltd.) was used, and 500 mL of RPMI1640 medium (GIBCO 22400-089) was used as a growth medium. -An antibiotic-containing medium supplemented with a streptomycin solution (GIBCO 15070-063) further contained 5% fetal bovine serum (FBS; ICN 2916754) and 10% non-immobilized horse serum (HS; GIBCO 26050) Medium was added.
  • FBS fetal bovine serum
  • HS non-immobilized horse serum
  • PC12 cells After thawing PC12 cells that had been cryopreserved, they were cultured in this growth medium for one week or more and used for experiments.
  • the passage of PC12 cells was performed by a mechanical peeling method using a Pasteur pipette and a syringe.
  • all cell cultures were performed in a CO 2 incubator under air containing 5% CO 2 at 37 ° C.
  • Example 2 Induction of cell death by glutamate: Using the PC12 cells obtained in Example 1, culture conditions that efficiently cause cell death by glutamic acid were examined. They are as follows.
  • the induction medium is an antibiotic-containing medium in which 5 mL of penicillin-streptomycin solution is added to 500 mL of RPMI 1640 medium (GIBCO 11835-030), in which 5% dialyzed fetal bovine serum (GIBCO 26400-044) and 10% Medium containing dialysis horse serum (Biowest S090D).
  • PC12 cells were seeded in a 96-well plate coated with collagen at 5000 cells / well, cultured for 3 days in the induction medium from the day of seeding, and 1 to 20 mM of glutamic acid was added on day 2 of the seeding to induce cell death. .
  • a measured value (% with respect to control) is based on the group without glutamic acid added.
  • Cell viability (%) [(As-Abs) / (Ac-Abc)] ⁇ 100
  • Ac is the absorbance of the negative control (well with cells, control medium and MTT solution)
  • Abs is the blank absorbance of the sample (well containing test substance-supplemented medium and MTT solution)
  • Abc is the blank absorbance of the negative control (well with control medium and MTT solution)
  • TJ-54 Yokukansan (TJ-54; manufactured by Tsumura Corporation) (hereinafter referred to as “TJ-54”) was added.
  • TJ-54 Yokukansan
  • TJ-54 was shown to suppress cell death in a concentration range of 10 to 1,000 ⁇ g / ml. The result is shown in FIG.
  • TJ-54 suppresses the decrease in MTT activity due to the addition of glutamic acid in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 5 concentration-dependent inhibitory effect of cell death when TJ-54 is added on the basis of cell death induced by 17.5 mM glutamic acid is used for the construction of a bioassay system for yokukansan. It became clear that it was possible (Fig. 6).
  • FIG. 2 is a drawing showing the relationship between the amount of TJ-54 added and the cell viability in a medium with a glutamic acid concentration of 17.5 mM.
  • Control means the cell viability without addition of glutamic acid.
  • FIG. 5 is a calibration curve showing the TJ-54 concentration-dependent inhibitory effect on glutamate-induced cell death based on the cell death induced by 17.5 mM glutamate from the results of FIG.

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Abstract

　抑肝散について、より高い品質保証を可能とする、試験管内試験によるバイオアッセイ系を見出すことを目的とし、培養細胞を培養する培地中に、細胞死を誘発するのに十分な量のグルタミン酸と、抑肝散を添加し、培地中の培養細胞の生存率から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法を提供する。  

Description

抑肝散のバイオアッセイ方法
　本発明は、抑肝散のアッセイ方法に関し、更に詳細には、神経系培養細胞を用い、漢方製剤である抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を定量的に評価しうるアッセイ方法に関する。
　漢方薬は、生薬をブレンドした医薬品であり、その活性成分が全て特定されているわけではない。また、単一の活性成分のみで効果を発揮するわけではなく、複合的に作用するものであるため、その品質を保証するには、漢方薬全体として評価をすることができる測定方法が必要であるとされている（特許文献１、特許文献２）。
　この測定方法中には、個別の成分を測定し、それらを総合的に評価する方法と、生物材料を用いて生理活性を評価するバイオアッセイがある。そしてバイオアッセイには、生体内（in　vivo）試験と、試験管内（in　vitro）試験があるが、生体内試験の系は、試験施設、試験動物、処理能力等の点で種々の制約があり、漢方薬の品質評価に用いるには困難が伴っていた。
　一方、試験管内試験の系では、特殊な施設を必要とせず、安定した試験結果が短期間に得られるため、この系でバイオアッセイ法を確立することが求められており、実際ミオスタチンについては、バイオアッセイ法が報告されている（特許文献３）。しかし、それ自身が複数の有効成分を含む生薬を組み合わせた漢方薬についは、常に適切なバイオアッセイ系が見出されているというものではなく、それらの確立が待たれている。
　例えば、漢方製剤である抑肝散は、一般的には下の組成のものであるが、このものについても適切なバイオアッセイ系は見出されておらず、より高い品質保証を行うためには、その開発が求められている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
特表２０００－５１２６２１ 特表２００１－５２１８７６ 特表２００５－５２０４８６ "PlantaMed."2004　May;70(5):427-31.（Hong　H,　Liu　GQ.　Scutellarin　attenuates　oxidative　glutamate　toxicity　in　PC12　cells.） "J．Ethnopharmacol."2005　Apr　8;98(1-2):89-94.（Yu　D,　Duan　Y,　Bao　Y,　Wei　C,　An　L.　Isoflavonoids　from　Astragalus　mongholicus　protect　PC12　cells　from　toxicity　induced　by　L-glutamate.） "Clin.　Exp.　Pharmacol.　Physiol."　2004　Aug;31(8):530-6.（Lee　JH,　Song　DK,　Jung　CH,　Shin　DH,　Park　J,　Kwon　TK,　Jang　BC,　Mun　KC,　Kim　SP,　Suh　SI,　Bae　JH.　(-)-Epigallocatechin　gallate　attenuates　glutamate-induced　cytotoxicity　via　intracellular　Ca　modulation　in　C12　cells.）
　従って、本発明の課題は、抑肝散について、より高い品質保証を可能とする試験管内試験によるバイオアッセイ系を見出すことである。
　本発明者らは、抑肝散の作用として、グルタミン酸による細胞死を直接保護する作用を有する可能性があるとの着想から、鋭意検討を行っていたところ、一般的に細胞死に関する研究で用いられる神経系培養細胞をグルタミン酸の存在下で培養し、細胞死を誘発させ、同時に抑肝散を添加させると、細胞死が用量依存的に抑制されることを確認した。そして、この知見を応用すれば、神経細胞死に対する抑肝散のバイオアッセイ法が構築できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、細胞を培養する培地中に、細胞死を誘発するのに十分な量のグルタミン酸と、抑肝散とを添加し、培地中での培養細胞の生存率から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法である。
　本発明のバイオアッセイ法によれば、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、試験管内試験により、簡単かつ安定に抑肝散の生理活性値（薬理活性価）を求めることが可能である。
　本発明の抑肝散のバイオアッセイ法は、神経系培養細胞を培養する培地中に、細胞死を誘発するのに十分な量のグルタミン酸と、抑肝散とを添加し、培地中の神経系培養細胞の生存率から抑肝散の薬理活性価を評価するというものである。
　本願発明の抑肝散のバイオアッセイ法において、神経系培養細胞としては、同種細胞として公知の細胞を利用できるが、ラット副腎褐色細胞種由来のＰＣ１２細胞を用いることが好ましい。このＰＣ１２細胞は、一般的に細胞死に関する研究において多岐に使用されており、その特徴は、神経栄養因子（Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）に応答することである。ＮＧＦ非存在の培養では副腎髄質クロム親和細胞の形質を示すが、ＮＧＦ存在下によって長い神経線維を伸ばし交感神経節細胞様に分化する。その利用はきわめて広く、特に分子生物学的利用については膨大な利用度を記録している。また、ＰＣ１２細胞は、グルタミン酸により細胞死を起こすが、スカッテラリン（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｎ）、イソフラボノイド（Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）、(－)－エピガロカテキン　ガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ　ｇａｌｌａｔｅ）等の植物由来成分がこの細胞死を抑制する事が知られている（非特許文献１ないし３）。
　本発明において使用されるＰＣ１２細胞は、コラーゲンをコーティングしたフラスコ中で５％ウシ胎児血清と１０％非動化血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、一定期間、例えば、３日間ないし７日間培養することにより作製することができる。
　また、ＰＣ１２細胞は、神経栄養因子（Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）に応答するが、ＮＧＦ刺激の有無に関わらずＰＣ１２細胞はグルタミン酸の濃度に依存した細胞死を起こす。よって、本願発明を実施する上で、ＰＣ１２細胞に対するＮＧＦ刺激の有無は影響しない。
　本願発明の抑肝散のバイオアッセイ法においては、神経系培養細胞を培養する培地中のグルタミン酸濃度を、これら培養細胞に細胞死の誘発を引き起こすに十分な濃度とする必要がある。しかしながら、グルタミン酸を高濃度で培地に添加した場合には、培地中のｐＨが酸性側へ傾く結果、培養環境変化による細胞死の影響が懸念されるので、より低濃度でグルタミン酸による細胞死を誘発できる条件を選択する必要がある。
　具体的には、血清中にはグルタミン酸が存在し、これらが神経細胞の生存率に影響を及ぼすことを考慮し、血清の影響を検討する必要がある。更に、神経系の細胞を培養する場合、細胞の培養容器への接着を高めるため細胞外基質(コラーゲン、ポリリジン等)をコーティングする事が通例であるが、これらについてもより良いものを検討する必要がある。更に加えて、培地添加物であるフェノールレッドはエストロジェン様活性を有しており、吸光測定あるいは蛍光測定に影響を及ぼす場合があるので、これも検討が必要となる。
　そして、これらの結果選定された最良の細胞死誘発条件としては、培地に透析血清を用い、プレートとしてはコラーゲンでコートしたものを使用し、フェノールレッドを添加しない培地を用いることである。しかしながら、本発明のバイオアッセイ法の実施は、これら条件に限定されるものではない。
　本発明において、効果的に細胞死を誘発するための培地中のグルタミン酸の濃度は、１μＭ～５０ｍＭであることが好ましく、更に好ましくは、１ｍＭ～２０ｍＭである。
　本発明のバイオアッセイ法での評価法の一つの態様は、細胞死を誘発するのに十分な程度の量のグルタミン酸と一定量の抑肝散を添加した培地中で、ＰＣ１２細胞の細胞死を誘発し、ＭＴＴアッセイ法で生存細胞数を測定し、これらから抑肝散の薬理活性価を評価する方法である。
　かかるＭＴＴアッセイ法とは、３－（４,５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２,５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）が細胞内のミトコンドリアの脱水酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるＭＴＴ量が多く、その結果生じる黄色～赤色のホルマザン量が生存細胞数とよく対応することを利用したものである。この方法は、生細胞のみを測定することができる方法であり、６９０ｎｍを参照波長とし５７０ｎｍの波長におけるサンプルの光吸度を測定するものである。もちろん、生存細胞数が測定できる方法であれば他の公知方法を用いても良いことはいうまでもない。
　この測定において、一般的には、既知濃度の抑肝散を含む試料を同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被検試料中の抑肝散の薬理活性価を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、既知濃度の抑肝散を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。
　以上のようにして、神経系培養細胞において抑肝散の薬理活性価を評価することができるが、この作用機序は、直接抑肝散の作用に基づくものである。すなわち、本発明者らの研究により、抑肝散は、グルタミン酸により誘発された神経系培養細胞の細胞死を抑制することが見出され、このことにより、抑肝散における細胞死抑制の薬理活性価を評価することが可能となったのである。
　更に、本発明のバイオアッセイ法で、抑肝散として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を、同一条件で薬理活性価を評価し、基準製剤と被検製剤を比較することにより、製剤の品質同等性を評価することができる。
　更にまた、複数の製剤ロットについて本発明のバイオアッセイ法で薬理活性価の評価を行いその平均等から導き出される上下限の範囲に対し、被検試料の薬理活性価がその範囲に該当するかどうかにより品質同等性を評価することもできる。
　次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
実　施　例　１
　　　ＰＣ１２細胞の培養：
　ＰＣ１２細胞（供給源：大日本住友製薬株式会社）の培養は、次のようにして行った。すなわち、コラーゲン（コラーゲン酸性溶液ＩＡＣ－１５：株式会社　高研製）をコーティングした培養面積７５ｃｍ２のフラスコを用い、この中に、増殖培地として、５００ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ　２２４００－０８９）に５ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン溶液(ＧＩＢＣＯ　１５０７０－０６３)を添加した抗生物質含有培地に、更に５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＩＣＮ　２９１６７５４）と １０％の非動化ウマ血清（ＨＳ；ＧＩＢＣＯ　２６０５０）を含有させた培地を入れた。凍結保存したＰＣ１２細胞を解凍後、この増殖培地にて１週間以上培養し、実験に使用した。ここで、ＰＣ１２細胞の継代は、パスツールピペット、シリンジを用いて機械的剥離法により行った。なお、以下の実施例も含み、すべての細胞培養は３７℃で５％ＣＯ２を含む空気下のＣＯ２インキュベーター内で行った。
実　施　例　２
　　　グルタミン酸による細胞死誘発：
　実施例１で得たＰＣ１２細胞を用い、グルタミン酸による細胞死を効率よく引き起こす培養条件を検討した。それらは、以下の通りである。
（１）血清　
　グルタミン酸細胞死に対する血清の影響を検討した。通常の血清(ＦＢＳおよびＨＳ)と透析血清（排除限界１００００ダルトンの限外ろ過膜で透析した血清）の比較において、グルタミン酸細胞死に対する血清の影響に顕著な差は認めらないが、透析血清で細胞死を誘発しやすい傾向が見られた。結果を図１に示す。
（１）コーティング
　ＰＣ１２細胞の培養容器への接着を効率よくする細胞基質を探索した。そして、コラーゲン、ポリ－Ｌ－リシン（Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ；ＳＩＧＭＡ　Ｐ４７０７、分子量：７０，０００－１５０，０００）およびＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標登録）（窒素含有陽イオンを表面に添加した初代培養用プレート）の３種類の培養プレートについて検討した。顕微鏡下の観察では、ポリ－Ｌ－リシンとＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標登録）のプレートでは凝集した細胞が浮遊しており、細胞の接着が弱かったことにより細胞数が減少していた。ＭＴＴアッセイ法により生存細胞を測定した結果を図２に示す。
（１）培地添加物
　細胞死を検出し易しくする為に、培地中の添加物の検討を行った。フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ　１６４０　(ＧＩＢＣＯ　２２４００－０８９)培地をＰＲ(＋)とし、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有しないＲＰＭＩ　１６４０　(ＧＩＢＣＯ　１１８３５－０３０)培地をＰＲ(－)として比較検討した。その結果、培地にフェノールレッドを含有しない培地は、細胞死が起こり易かった。この結果を図３に示す。
　以上の検討により、グルタミン酸による細胞死誘発には、コラーゲンでコートしたプレートに細胞を播種し、透析血清を添加したフェノールレッドを含有しない培地を誘発培地として用いることを最良の培養条件と判断した。誘発培地は、５００ｍＬのＲＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ　１１８３５－０３０）に５ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン溶液を添加した抗生物質含有培地で、その中に５％の透析ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ　２６４００－０４４）と１０％の透析ウマ血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ　Ｓ０９０Ｄ）を含有する培地である。
実　施　例　３
　　　抑肝散のバイオアッセイ：
　上記（１）～（３）の条件を基に、ＰＣ１２細胞を以下のように培養した。
　ＰＣ１２細胞をコラーゲンでコーティングした９６穴プレートに５０００細胞／ウェルで播種し、播種日から誘発培地で３日間培養し、播種２日目に１ｍＭ～２０ｍＭ濃度のグルタミン酸をそれぞれ添加し細胞死を誘発した。
　上記細胞死の誘発から２４時間後に、上記の９６穴プレート中の培地１００μＬに対し２０μＬの０．５％ＭＴＴ液（Ｄｏｊｉｎｄｏ　３４５－０１８２１）を添加し、５時間培養し、１００μＬの停止液（１０％　ＳＤＳ　ｉｎ　０．０１Ｎ　ＨＣｌ）の添加で反応を停止した。ホルマザンの結晶をピペットにより溶解し、一晩放置後に６９０ｎｍを参照波長として５７０ｎｍの波長における吸光度を分光光計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＭＣＣ／３４０、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ社製）で測定した。その後、得られた吸光度を基に、下記の計算式により細胞生存率を算出した。その結果を図４に示す。なお、測定値（コントロールに対する％）は、グルタミン酸無添加群を対照としたものである。
 
　　　　　　　　　細胞生存率（％）＝[（As-Abs）/（Ac-Abc）]×100
 
式中、Asは、検体の吸光度（細胞、被検物質添加培地およびMTT溶液の入ったウ
　　　ェル）
　　　Acは、陰性対照の吸光度（細胞、対照培地およびMTT溶液の入ったウェル）
　　　Absは、検体のブランク吸光度（被検物質添加培地およびMTT溶液の入ったウ
　　　ェル）
　　　Abcは、陰性対照のブランク吸光度（対照培地およびMTT溶液の入ったウェル）
　次に、図４から効果的に細胞死を引き起こしたグルタミン酸濃度１７．５ｍＭを選択し、抑肝散（ＴＪ－５４；株式会社ツムラ製）（以下、「ＴＪ－５４」という）を添加し、ＰＣ１２細胞のグルタミン酸細胞死に対するＴＪ－５４の抑制効果を、上記と同様細胞生存率から測定した。ＰＣ１２細胞において、ＴＪ－５４が１０～１，０００μｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に細胞死を抑制していることが示された。その結果を、図５に示す。
　この結果により、ＴＪ－５４は、グルタミン酸添加によるＭＴＴ活性の低下を、濃度依存的に抑制することが示された。（図５）。また、１７．５ｍＭグルタミン酸で誘発した細胞死を基準にＴＪ－５４を添加した際の濃度依存的な細胞死の抑制効果を検量線化することで、抑肝散のバイオアッセイ系の構築に利用できることが明らかになった（図６）。
　本発明によれば、試験管内試験により、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、簡単かつ安定に抑肝散の薬理活性価を求めることが可能である。
　従って、従来の含有される一定成分を分析する方法に比べ、抑肝散をより高い程度で品質保証することが可能となる。
通常血清と透析血清を使用した際のグルタミン酸添加量と生存細胞率の関係を示す図面である。図中、Ｎｏｒｍａｌは、通常血清を、Ｄｉａｌｙｚｅｄは、透析血清を意味する。 ３種プレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（商標登録））における、グルタミン酸濃度と生存細胞の関係を示す図面である。 グルタミン酸濃度と細胞生存率の関係を、培地添加物の有無により示した図面である。図中、ＰＲ（＋）は、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地、ＰＲ（－）は、フェノールレッドおよびＨＥＰＥＳを含有しないＲＰＭＩ　１６４０培地を意味する。 グルタミン酸濃度と細胞生存率の関係を示す図面である。 グルタミン酸濃度１７．５ｍＭの培地中での、ＴＪ－５４の添加量と細胞生存率の関係を示す図面である。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは、グルタミン酸無添加での細胞生存率を意味する。 図５の結果から、１７．５ｍＭグルタミン酸で誘発した細胞死を基準に、グルタミン酸誘発細胞死に対するＴＪ－５４の濃度依存的な抑制作用を示した検量線である。

Claims (4)

  1. 　培養細胞を培養する培地中に、細胞死を誘発するのに十分な量のグルタミン酸と、抑肝散とを添加し、培地中の培養細胞の生存率から抑肝散の薬理活性価を評価することを特徴とする抑肝散のバイオアッセイ方法。
  2. 　培養細胞が神経系培養細胞である請求項第１項記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
  3. 　培養細胞がＰＣ１２細胞である請求項第１項記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
  4. 　培養細胞を培養する培地中のグルタミン酸の濃度が１μＭ～５０ｍＭである請求項第１項ないし第３項の何かに記載の抑肝散のバイオアッセイ方法。
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