CN1290349A

CN1290349A - 药用级银杏

Info

Publication number: CN1290349A
Application number: CN98812473A
Authority: CN
Inventors: 塔斯尼姆·A·赫瓦贾; 埃利奥特·P·弗西德曼
Original assignee: PharmaPrint Inc; University of Southern California USC
Current assignee: PharmaPrint Inc; University of Southern California USC
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2001-04-04
Also published as: CA2307194A1; JP2002515402A; AU1363399A; EP1027603A2; WO1999020291A9; WO1999020291A2; WO1999020291A3

Abstract

本发明一般性涉及银杏材料和用于制备该材料(医学有用,并且具有药学可接受的剂型)的方法。更具体地,本发明涉及组合物和在将银杏材料制备成药物的加工过程中的活性指纹的应用,其中限定为药用级组合物,其适合于临床或兽医应用,以治疗和/或改善疾病、病症或症状。

Description

药用级银杏

本申请是1997年10月23日申请的共同待审的美国申请号为08／956600的部分继续申请，其完整公开文本以参考的方式引入本文，后者是1997年4月15日申请的共同待审的美国申请号为08／838198的部分继续申请，08／838198又是1996年4月15日申请的共同待审的美国申请号为08／632273的部分继续申请，08／632273又是1995年4月14日申请的美国申请号为08／421993的部分继续申请，08／421993号申请为了利于1997年2月4日申请的美国申请号为08／774550号申请而放弃。

1．发明领域

本发明总的来水涉及植物药材以及将所述药材转化成医学有用且药学可接受形式的方法。更具体地说，本发明涉及组成指纹和活性指纹在将白果(银杏)加工成适于临床治疗和／或改善疾病、紊乱和／或病情的具备药用级组合物水平的植物药过程中的应用。

2．发明背景

药物生产是在对各生产批次的组成和生物活性的控制下进行的。这种标准化和控制在对患者的可预期性治疗和一致性治疗中提供了可重现的材料。由植物药材制备的植物药给生产者提出了特殊的问题，即期望实现药物需要的有控制、可重现、和标准化。由于植物药含有多种成分，并且由于原料的生长、收获和加工条件所致的组成和含量的巨大差异，导致上述问题成为首要问题。

植物曾是并还将是大量药物化合物的来源。几个世纪以来，各种形式的植物来源材料被用于治疗无数种不同疾病。植物药材的形式通常是来源于一种或多种植物或植物部分的粉末，或者来源于整体植物或选择的植物部分的提取物。这些粉末或提取物大多数是生物活性和非生物活性成分的复杂混合物。

虽然植物粉末和提取物已经广泛地在医学中应用，但仍然存在很多与这类药物应用有关的问题。例如，植物药材的复杂化学性质使其难于以任何形式的控制和预期方式应用。由收获方式不同的植物得到的不同批次的药材其化学组成的潜在差异导致该药材不适于临床应用。

在积极的方面，植物药材中典型存在的生物活性成分的复杂组合提供了协同或增加生物活性范围的可能。然而，由于这些复合药材的未知特征，其药效的潜在改进还不能预测。

上述与植物药固有的化学复杂性有关的问题导致，在从大量具有药用价值的植物材料中分离提取生物活性成分方面需付出巨大的努力。该研究领域随着化学分离和分析技术的改进得以迅速发展。分离纯化后，各种活性成分可以应用于临床，确定具体成分的药效。从植物药材中分离和纯化个体成分是这类药物发展过程的基础。纯化后，通常将可能的活性成分与药物可接受载体混合，然后进行进一步的试验动物研究以及最终的对人的临床实验。证明临床有效性后，这类药物被认为是药用级的，因为它们含有单一的或至多少数几个含量已知、特征明确的成分。

药用级药物的优点在于可以在治疗方案中精确地跟踪各个成分的作用。而且，可以准确控制药物剂量，提供相对可预测的药物作用。所述相对纯的药用级药物的缺点在于由于将药物从天然环境中分离出来，降低了天然形成植物材料提供的复合潜能和协同生物活性。分离产物的研究也可以称为通过分解敏感的生物／植物复合体制备的人工制品。一些行业专家认为由这种协同活性提供的潜在优势，其价值超过了与特征不明确或临床应用不能控制的复合植物材料应用有关的临床风险。

虽然从植物材料中分离和纯化单一成分成为药物研究和发展的普遍方式，研究复合植物提取物，鉴定其药物质量仍然得到关注。一些复合植物药材和提取物存在有效但相对不可预测的药学特性。由于用未曾建立批次稳定性和组成上差异较大的特征不明的药材治疗患者可能引起的固有风险，使这些药材中的大多数不能应用于临床。因此，需要提供标准化上述复合植物材料的方法，以使它们可以更有效地用于临床研究和治疗患者。

2．1银杏

银杏(白果)还被称为银杏树，是其科(银杏科)、目和裸子植物纲(ginkgoatae)仅存的一员。银杏从中国的后冰期已存活了大约2亿年。该单种落叶树生长高度为35-40米。它具有覆盖其与众不同的的树干和枝叶结构的灰色树皮。银杏，仅从其种植可知，是世界范围内常见的耐污染观赏植物。其种名“biloba(白果、二裂片)”来源于其二裂片、扇型的叶片。

银杏树的树叶，如500年前中国植物药所记载，已用于改善脑功能和治疗支气管炎及其它疾病(Foster，1991，银杏，植物药材系列304，美国植物药材协会，Austin，Texas)。在韩国、法国、美国生长有商业规模的银杏叶。对一种标准为含有大约24％类黄酮和6％萜烯内酯(大约50：50的双萜银杏苦内酯和倍半萜烯白果内酯)的浓缩、半纯化的干叶提取物(EGb 761)，进行了大量研究(DeFeudis，1991，银杏提取物(EGb 761)：药理活性和临床应用，Elsevier，巴黎，法国)。其独特的“笼状”六环核结构的银杏苦内酯以及它们的内酯环和叔丁基，从化学和生物学观点，引起了极大的兴趣。

在欧洲销售最好的植物药中，德国Commision E已经批准标准干燥提取物用于大脑机能不全病症，外周动脉阻塞性疾病，和眩晕与耳鸣。这些应用和银杏作为血小板激活因子特异性拮抗剂、抗真菌药、抗氧化剂、和血管舒张药(DeFeudis，1991，Id．)的体外作用相一致。传统上，银杏还被用于作为抗周期的抗生素、止血剂、利尿剂和滋补剂。

3．发明概述

本发明提供了用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法。该方法包括PharmaPrinting^TM的过程。本发明进一步提供了应用本文公开的任何一个方法测定的药用级银杏。本发明具体的实施方案包括，但不限于下面总结实施方案。

本发明提供了用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括以下步骤：将具有生物活性的银杏材料(该银杏材料包括若干成分)的有代表性部分分成若干标记组分，其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分；测定至少一种标记组分的生物活性，以提供有代表性部分的生物活性指纹；将有代表性部分的生物活性指纹与已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以确定银杏材料是否为药用级银杏。

在一个实施方案中，至少一种标记组分含有至少一种活性成分。在另一个实施方案中，该方法包括另外的步骤：测定至少一种标记组分中活性成分的量，以提供有代表性部分的定量组成指纹；将有代表性部分的定量组成指纹与已建立的药用级银杏的定量组成指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。在另一个实施方案中，该方法另外的步骤：测定银杏材料有代表性部分的总体生物活性；将有代表性部分的总体生物活性与总体生物活性标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。在另一个实施方案中，银杏材料为醇提取物。在第5个实施方案中，银杏材料为水或有机提取物。在第6个实施方案中，银杏材料为超临界二氧化碳提取物。在第7个实施方案中，银杏材料为油。在第8个实施方案中，银杏材料为粉末植物药材。在第9个实施方案中，银杏材料为均一材料。在第10个实施方案中，银杏材料为植物药材的混合物。在第11个实施方案中，至少一种活性成分为内酯。在第12个实施方案中，内酯为银杏苦内酯。在第13个实施方案中，银杏苦内酯为银杏苦内酯A。在第14个实施方案中，银杏苦内酯为银杏苦内酯B。在第15个实施方案中，银杏苦内酯为银杏苦内酯C。在第16个实施方案中，内酯为白果内酯。在第17个实施方案中，生物活性为用于治疗或改善心血管疾病的指标。在第18个实施方案中，生物活性为用于治疗或改善心理疾病的指标。

本发明还提供了用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括以下步骤：提供银杏材料，该银杏材料含有具有生物活性的多种成分，其中至少一种成分具有标准生物活性谱；将银杏材料有代表性部分分成若干标记组分，其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分；测定至少一种标记组分中至少一种活性成分的量；基于至少一种活性成分的存在量以及标准生物活性谱计算至少一种标记组分的生物活性，以提供有代表性部分的计算生物活性指纹；将有代表性部分的计算生物活性指纹与已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。在一个实施方案中，该方法包括另外的步骤：测定银杏材料有代表性部分的总体生物活性；将有代表性部分的总体生物活性与总体生物活性标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。在另一个实施方案中，银杏材料为水或有机提取物。在另一个实施方案中，银杏材料为粉末植物药材。在另一个实施方案中，银杏材料为均一材料。在第5个实施方案中，银杏材料为植物药材的混合物。在第6个实施方案中，至少一种活性成分为内酯。在第7个实施方案中，至少一种活性成分为银杏苦内酯。在第8个实施方案中，至少一种活性成分为白果内酯。在第9个实施方案中，生物活性为用于治疗或改善心血管疾病的指标。在第10个实施方案中，生物活性为用于治疗或改善心理疾病的指标。在第11个实施方案中，至少一种标记组分含有一组相关成分。

本发明还提供了用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括：提供具有生物活性的银杏材料，该银杏材料含有多种成分，将银杏材料有代表性部分分成若干标记组分，其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分；测定至少一种标记组分的生物活性，以提供有代表性部分的生物活性指纹；将有代表性部分的生物活性指纹与已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。在一个实施方案中，至少一种活性成分为内酯。

本发明提供了用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括：测定银杏材料有代表性部分的总体生物活性，应用的生物检测选自GABA_A检测，GABA苯并二氮卓中心检测，白细胞三烯C4合成酶检测，5-脂肪氧合酶检测，单胺氧化酶A检测；将有代表性部分的总体生物活性与总体生物活性标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

本发明还提供了用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，包括：将银杏材料有代表性部分分成若干标记组分，该银杏材料含有多种成分，其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分；测定至少一种标记组分中生物活性的量，以提供有代表性部分的定量组成指纹；将有代表性部分的定量组成指纹与已建立的药用级银杏的定量组成指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

本发明还提供了用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括：测定银杏材料有代表性部分的总体生物活性；将有代表性部分的总体生物活性与总体生物活性标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

本发明提供了应用本文公开的任何一种方法测定的药用级银杏。本发明进一步提供了应用本文公开的任何一种方法测定的药用级银杏，其中至少一种标记组分含有一组相关成分。本发明更进一步提供了应用本文公开的任何一种方法测定的药用级银杏，其中至少一种标记组分含有至少两种活性成分。

本发明提供了应用本文公开的任何一种方法测定的药用级银杏，其中所述的多种成分含有至少一种选自下组的成分，包括穗花杉双黄酮、漆树酸、白果内酯、γ-氨基丁酸、银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、桧黄素、异鼠李黄素、4’，5，7-三羟黄酮醇、脯氨酸、和栎精。本发明进一步提供了应用本文公开的任何一种方法测定的药用级银杏，其中至少一种标记组分含有至少一种选自下组的活性成分，包括穗花杉双黄酮、漆树酸、白果内酯、γ-氨基丁酸、银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、桧黄素、异鼠李黄素、4’，5，7-三羟黄酮醇、脯氨酸、和栎精。

本发明还提供了用于制备药用级植物药(例如，银杏)的方法。本方法是PharmaPinting^TM的过程。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：提供含有多种具有给定生物活性成分的银杏植物药材；从该植物药材中取出有代表性的部分；将该部分分成若干标记组分，其中每个标记组分含有至少一种活性成分；测定每个标记组分中给定生物活性的等级，以提供该部分的生物活性指纹；将该部分的生物活性指纹与已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以提供生物活性指纹比值，根据生物活性指纹比值得以确定该植物药材是否为药用级银杏。

本发明还提供了包括以下步骤的方法：提供具有给定生物活性的银杏植物药材，所述的植物药材含有多种成分；将植物药材中有代表性部分分成若干标记组分，其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分；测定每种标记组分中给定生物活性的等级，以提供有代表性部分的生物活性指纹；将有代表性部分的生物活性指纹与已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以确定该植物药材是否为药用级银杏。

在一个实施方案中，一个或更多的标记组分含有一种活性成分。

该方法还可以包括另外的步骤：测定每个标记组分中活性成分的量；以提供该部分的定量组成指纹；将定量组成和生物活性指纹与定量组成和生物活性指纹标准相比较，以确定该植物药材是否为药用级银杏。该方法还可以包括另外的步骤：测定植物药材该部分的总体生物活性；将该部分的总体生物活性与已建立的药用级银杏标准的总体生物活性相比较。

本发明还提供了用于制备药用级银杏的方法，该方法包括以下步骤：提供含有多种具有给定生物活性成分的银杏植物药材，其中每个活性成分具有标准生物活性谱；从该植物药材中取出有代表性的部分；将该部分分成若干标记组分，其中每个标记组分含有至少一种活性成分；测定每个标记组分中每个活性成分的存在量；基于每个活性成分的存在量以及标准生物活性谱计算每个标记组分的生物活性，以提供该部分的计算生物活性指纹；将该部分的计算生物活性指纹与已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以提供生物活性指纹比值，根据生物活性指纹比值确定该植物药材是否为药用级银杏。

本发明的方法可用于从具有给定或所需生物活性的适当植物药材，制备药用级植物药材，例如，银杏。植物药材优选由植物材料提取到的提取物，例如水提物或有机提取物，如醇提物，或超临界二氧化碳提取物，或可以进行进一步加工的有机溶剂提取物。或者，植物药材是植物材料粉末、种子油、香精油、或水蒸汽蒸馏产物。在一个实施方案中，植物药材是单一物理状态的均匀材料，例如油或溶液。植物药材可以是单独地来源于目的植物的纯化材料。

在本发明中，活性成分可以包括但不限于一种或多种下列化学种类：多聚乙酰、生物碱、白果内酯、碳水化合物、类胡罗卜素、肉桂酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、类黄酮、银杏苦内酯、糖甙、异戊二烯类、内酯、脂类、大环抗生素、核酸、青霉素、多肽、酚类、聚乙炔、多聚乙酰、多酚、多糖、蛋白质、前列腺素、甾类和萜类。

在一个实施方案中，本发明提供了制备药用级银杏的方法，其中一种或更多标记组分含有至少两种活性成分。在另一个实施方案中，本发明提供了制备药用级银杏的方法，其中至少一种标记组分含有至少一种选自下组的成分，包括穗花杉双黄酮、漆树酸、白果内酯、γ-氨基丁酸、银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、桧黄素、异鼠李黄素、4’，5，7-三羟黄酮醇、脯氨酸、和栎精。在另一个实施方案中，本发明提供了制备药用级银杏的方法，其中至少一种活性成分选自穗花杉双黄酮、漆树酸、白果内酯、γ-氨基丁酸、银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、桧黄素、异鼠李黄素、4’，5，7-三羟黄酮醇、脯氨酸、和栎精。

银杏的生物活性／临床适应症与人或其它动物的疾病、功能失调或病症有关。因此该方法可用于制备用于治疗和／或改善和／或预防人和／或兽类疾病、功能紊乱或病症的药用级银杏。适应症的例子包括但不限于：中枢和外周血管疾病的治疗，包括脑血管疾病和静脉疾病。银杏给药的主要适应症是增加血流，特别是脑血流。银杏还具有减少视网膜水肿，视网膜中细胞损伤，增加FontaineII期外周动脉闭塞疾病的无疼痛行走距离(间歇的跛行)的适应症。适应症还有源于血管和退化的眩晕和耳鸣。

在这些方法中，所述部分可以分成生物活性成分和非生物活性成分。而且，标记组分可以含有一组相关成分。

本发明还提供了制备药用级植物药材(例如，银杏)的PharmaPrint^_的方法。并且本发明提供了通过本文描述的方法制备的药用级植物药材，例如银杏。

本发明还提供了如上所描述的用于制备药用级银杏的方法，其中活性成分选自类黄酮、银杏苦内酯、配醣、内酯、脂类、和类萜烯。本发明进一步提供了如上所描述的用于制备药用级银杏的方法，其中活性成分为黄酮糖甙的类黄酮。本发明还提供了如上所描述的用于制备药用级银杏的方法，其中活性成分为萜烯内酯的类萜烯。另外，本发明提供了如上所描述的用于制备药用级银杏的方法，其中活性成分为白果内酯。

在一个替换实施方案中，银杏可以与一种或更多选自下述的植物药材组合：V．agnus-castus、芦荟、紫云英、越桔、黑总状升麻(black cohosh)牛蒡、甘菊、栗子、coriolus versicolor、茅草、crampbark、蒲公英根、dong quai、echinacea、土木香、月见草、小米草、false unicorm root、小白菊、大蒜、姜、人参(亚洲或西伯利亚变种)、goldenseal、gota kola、葡萄子提取物、绿茶、guggulipid、山楂、蛇麻子、常春藤、kava、甘草、水飞雉、槲寄生(美洲、亚洲和欧洲变种)、益母草、燕麦、osha、粉色西番莲、南瓜、pygeum、红三叶草、迷迭香、撒尔沙植物、sawpalmetto、黄芩、St．John＇s wort、小荨麻、缬草、wild indigo、wils yam、和yerba mansa。本发明的制备药物的方法包括PharmaPrinting^TM银杏加一种或更多上面所列植物的方法，以及含银杏和一种或多种上面所列植物的药用级药物。在该实施方案的一个方式中，银杏可以与gota kola和／或黄芩组合。以举例说明的方式而不是限制的方式，药用级银杏可以与药用级植物药材组合，例如echinacea、缬草和／或black cohosh。参见1997年10月23日申请的，发明名称为“药用级echinacea”，美国申请号为08／956603(代理人档案号为9117-015)的美国专利申请(其全文作为参考插入本文)；还参见1997年10月23日申请的，发明名称为“药用级缬草”，美国申请号为08／956615(代理人档案号9117-016)的美国专利申请(其全文作为参考插入本文)；还参见1997年10月23日申请的，发明名称为“药用级black cohosh”，美国申请号为08／956611(代理人档案号为9117-018)的美国专利申请(其全文作为参考插入本文)。

3．1定义

术语“药用级”，在本说明书中应用的含义是，植物药中的某些给定生物活性成分和／或非生物活性成分必需在明确规定的绝对和／或相对浓度范围内，和／或这些成分经疾病、失调或病症特异性生物活性检测测定必须表现一定活性水平。所述疾病、失调或病症可以是人或动物患有的。

就象本领域技术人员理解的，术语“药用级”不意味着暗示该植物药只适用于受控制的产品，例如处方列出的药，即“处方药”，或柜台提供的药，即“非处方药”。该术语同样适用于处方列出的药物、非处方药、或者作为饮食添加的成分，即“食品添加剂”。

本文提到的“成分”指分开的化合物(即化学物质)，其天然存在于植物药中，或者加入植物药，从而制备具有规定生物活性范围和／或组成范围的成分的药用级植物药。

本文提到的“活性成分”指一种或多种成分，其在疾病特异性生物检测中得到的各个成分活性总和，它占该植物药材观察到的生物活性的实质性部分。优选活性成分的活性总和占观察到的生物活性的大部分或超过50％。

本文提到的“组分”一般指具有规定参数例如溶解度、分子量范围、极性范围、吸附系数、结合特性、化学反应性、或选择性溶解度的一组成分或一类结构类似的成分。组分更经常为选择性溶剂溶解技术和分离技术(即液-液萃取)的产物，包括pH依赖性分离、色谱分离技术即闪光色谱、制备型高效液相色谱(HPLC)、制备型气相色谱、分配色谱、制备型薄层色谱、亲合色谱、尺寸排阻色谱、液-液色谱例如逆流色谱或向心色谱或离心色谱。

通过参考对本发明的详细描述和具体实施方案的例子以及附图可以更充分地理解本发明。

4．附图简述

图1是按照本发明用于建立标准化学和／或生物活性指纹的程序的示意图，所述标准指纹用于在制备药用级药物过程中，将随后处理的植物药材与之相比较。

图2是按照本发明用于将植物药材加工成为药用级药物的程序的示意图。

图3是分离不同类生物活性组分的程序的示意图。

图4显示了六种商业可购买的银杏产品的化学分析，显示了每个产品中萜烯内酯和黄酮糖甙的相对浓度。

5．发明详述

5．1 PharmaPrinting^TM法

本发明提供了制备可以被分类为药用级植物药的方法。该方法被命名为PharmaPrinting^TM。用本发明方法生产的药用级植物药尤其适合应用于临床研究，更重要是用于治疗患者。该方法确保特定方案中应用的药物质量稳定，始终适于用作人和兽类预防或治疗剂。

本发明提供了密切控制植物提取物和其它植物药材(例如银杏植物药材)的质量、剂量和临床效果的可能。本发明的一方面涉及为各种植物药材建立化学和／或生物活性指纹标准。一旦该标准建立后，其被用于药物生产程序，以确保植物材料符合药用级要求。本发明进一步提供了为多种植物药材建立的具体定量指纹和生物指纹。这些指纹用于确定是否具体植物药材符合特定治疗方案中药物活性要求和药物组成要求的水平。该确定对于保证用植物药材进行的临床研究和患者治疗是基于一致的和可证明的提取组合物参数是重要的。

本发明可用于提供充分表征，批次间组成一致的植物药材，以便可以精确地确定它们的给药剂量，并有效地应用于临床。本文所述的方法提供了临床实验结果可重现的保证。

首先，得到目的植物药材的样品。一些植物药材可以原料的形式或以加工过的提取物的形式通过商业途径获得。通常它们是植物提取物或其它的意欲被用作药物的组合物。加工后的药材可以包括表现给定生物活性的多种活性成分和不直接表现相关生物活性的多种非活性成分。在一个实施方案中，从植物药材中取出一部分，将其用于质量保证程序或标准化程序。优选该部分为均匀植物药材的代表性部分。该程序涉及将植物药材部分分成若干标记组分，其中每种标记组分包括至少一种活性成分或者有时含有一种非活性成分。确定各标记组分中的活性成分或非活性成分的量，以便提供该部分的定量指纹。同时确定各标记组分的生物活性的程度，以提供该部分的生物活性指纹。然后将该部分的化学和／或生物活性指纹与已建立的药用级药物相应指纹相比较。如果该植物的指纹与标准指纹相当，那么该植物被鉴定为药用级植物药。如果不能，那么可以改良该植物药材以便使其与标准指纹相当，或者不使用该植物药材。

5．1．1形成PharmaPrint^_的方法

当一些药材的推定活性成分已知，则其PharmaPrint^_方法的形成始于文献综述。这涉及综述化学文献、生物学文献、已出版的药材的生物检测方法和临床数据。尤其有用的信息资源是由Norman Farnswroth博士为伊利诺斯州大学(Chicago)药学合作研究负责程序管理的NAPRALERT计算机数据库；Leung和Foster，食品、药品和化妆品中应用的常见天然成分大全(Encyclopedia of Common Natural IngredientsUsed in Food，Drug and Cosmetics)，第二次编辑，John Wiley&Sons：New York，NY，1996；草药和植物药(Herbal Drugs andPhytopharmaceuticals)，N．G．Bisset编，CRC出版社：Boca Raton，FL，1994；Duke，生物活性植物药及其活性手册(Handbook of Biologically ActivePhytochemicals and Their Activities)，CRC出版社：Boca Raton，FL，1992；Tyler和Foster＂草药和植物药产品(Herbs and Phytomedicinal Products)＂，非处方药手册(Handbook of Nonprescription Drugs)，Berardi等编，UnitedBook Press，Inc．：Washington，DC，1996。对于一种特定适应症，必须研究文献确定推定的活性成分确实与那种疾病状况有关。另外，如果公开了推定活性成分和适应症的任何生物检测法，生物检测必须与适应症和推定活性成分一致。适当的生物检测应与临床相关端点结合。生物检测应在一段较宽的浓度范围内定量。通常，制作IC₅₀曲线(半数抑制浓度)、EC₅₀(半数有效浓度)、或者适当的K_i或K_d(酶离解常数和其抑制物的离解常数)曲线。然后对植物药材的推定活性成分和色谱组分进行彻底的化学和生物学分析。分析结果，以确定样品中各化学成分的生物活性定量分析。然后，将样品的生物活性作为一个整体与单独成分的生物活性比较。在这一点上，个体化学成分可以与临床相关端点相关。同样的方法可以应用于测定刺激或抑制效果的生物检测。

基于个体成分的活性和已知的总活性，如果混合这些成分，它们应当占生物活性的基本部分。通常，混合活性至少占总活性的25％。

优选个体活性成分的活性总和占观察生物活性的大多数或超过50％。更优选，分离的个体成分代表超过70％的活性。更优选分离的个体成分代表超过80％的生物活性。

另一个考虑是尽可能选择较少的活性成分作为PharmaPrint^_的部分。较少的活性成分对于在原料的接受和加工方面的实际考虑是重要的。本发明建立了有关化学成分和生物活性之间的相关性。一旦满意的相关性建立后，就可以不必对每个样品的生物指纹进行操作。目的植物药材各样品的适当成分和／或标记组分的化学分析足以代表大多数生物活性，然后确定某种给定植物药材样品为药用级。

在一个实施方案中，本发明可以涉及下列程序之一。一个程序(如图1所示)涉及为一种特定的药用级植物药建立组成和生物活性指纹标准。指纹标准建立后，可以如图2所示将植物药材实际加工成药用级药物。

为特定植物药材建立化学和／或生物活性指纹的开始步骤涉及将提取物或粉末分成一组或多组(如图1步骤1所示)。基于这些组作为指纹标记(可以含有或不含有活性成分)的潜力分离并鉴定这些组，所述指纹是为加工的植物药材而建立。经选择和鉴定作为潜在标记的推定成分或推定成分组根据被加工的植物药材和药物用途变化较大。每种植物药材至少应当选择两种推定标记。潜在标记的数目可以超过五个，对于复杂的植物药材提取物或粉末可以多达15-20或者更多。潜在标记的鉴定和选择大部分基于它们的潜在生物活性或对特定药物应用的生物活性的贡献。对于不同的适应症，可以用不同的提取方法对同样的植物药材制备提取物，以便优化特定的生物活性组成。自身无明显生物活性的标记可以被分离，可以被包括作为指纹中应用的标记。当这些标记的存在能够指示提供观察到的植物药整体生物活性的基本部分的其它活性成分的存在时，这些“代理”标记可以作为理想的内标。它们还有助于确定药物的正确植物学名称(即chemotoxonomy)。

将植物药材分成各种推定标记组的最初分离步骤可以通过简单的萃取和分配到复杂的亲和色谱技术等常规分离技术实现，包括凝胶过滤色谱、发光硅胶色谱和反相色谱。一旦鉴定到特定植物药材的推定标记后，则如图1步骤2所述测定各标记的生物活性。用于测定植物药材生物活性的特定生物检测法基于植物药材的预期用途进行选择。优选生物检测将能够反映推定标记的关于用植物药材治疗的疾病或适应症的生物活性。

步骤2中得到的生物检测结果被用于鉴定具有所需生物活性的成分(步骤3)和较少活性或基本上无活性的成分(步骤4)。然后定量分析步骤3和4中鉴定的各组，确定各组中存在的各鉴定组分的量。然后如图1步骤5所述用生物检测和定量组成分析的结果制作植物药材的生物检测指纹和／或化学指纹。确定生物活性和／或化学组成的可接受范围，作为建立植物药材指纹的一部分。此步操作主要基于建立各标记的生物活性和定量的可接受范围，这能够提供加工材料所需的整体药理活性。

另外，可以评价活性和非活性标记的各种组合，以确定由活性和非活性成分组合导致的所需生物活性的潜在增加。

步骤5建立的生物检测和定量指纹可以准确鉴定植物药材，这可以用于建立临床应用所需的剂量疗法和治疗方案。利用任何新药研究中通常应用的常规临床方法建立剂量疗程和治疗方案。用于确定剂量和治疗方案的加工材料必须与步骤5建立的指纹的要求匹配或相符。该方法能够确保剂量和治疗方案有效并可重复，因为用于研究剂量和方案的加工材料都具有同样的本发明的指纹。

通过如图1所示的一般程序确定的生物检测和定量指纹作为制备药用级植物药的部分生产程序。该指纹被作为定性确认或标准化程序的一部分，以确保特定植物药材含有适当的化合物，可以被正确加工，以提供与已经被标准化并按照如图1所示的程序测试的材料发挥相同临床作用的植物药。

制备本发明的药用级植物药的实例程序如图2所示。首先通过萃取、粉末化或其它生产方法加工目的植物药材21，以制备加工的植物材料22。然后分析加工材料22的样品，确定其是否与图1标准化程序中建立的指纹要求相匹配。该定性确认或标准化程序如图2步骤23所示。如果加工材料符合前面建立的特定材料的指纹要求，则其如步骤24所示可以被认为是药用级的。如果该材料接近但不十分符合标准指纹，则按照需要对其改进，以符合指纹标准(步骤25)。使加工材料符合指纹标准的改进可以通过很多方法进行。进一步加工植物药材的方法可以包括对植物药材的进一步萃取、选择性萃取、选择性加工、批次重组(例如，将高剂量和低剂量的批次混合，以制备药用级药材)或者按照需要添加各种化合物。如果植物药材基本上落在生物活性标记和定量标记的指纹范围之外，则抛弃该批次(步骤26)。

在一个实施方案中，用于确定特定植物药材是否属于药用级的定性确认标准化步骤23包括取得均匀样品，优选均一样品，或者待测植物药材的一部分。样品应当包括活性成分，其为药材提供观察生物活性并产生前面确定的标准品的生物活性和／或化学指纹。样品还将包括一种或多种非活性成分。非活性成分是那些不具有直接可测量的生物活性的成分。非活性成分包括下列种类：活性非常低以至于不能占活性的基本部分的成分；其存在表明其它活性成分的存在，可以作为其它成分的代理标记的成分；在相关检测中不表现化学或生物学活性的非活性成分。优选样品仅是待测植物药材的一小部分。因此，取得代表药材全部批次的均匀样品优选均一样品是重要的。

图3显示了一个更详细的方案，表明存在于植物药材水提取物中的不同成分的最初分离步骤。随后采用萃取和沉淀分离水或有机相中的活性成分。图3的方案尤其很好地适用于从植物药材例如槲寄生中分离水溶性活性成分类型。

图3显示了一个分离植物主要化学成分类型的实例性通用方法。主要应当使用新鲜植物(包括叶、根、花、浆果和茎)，虽然也可以使用干药材。如果需要可以使用植物的特殊部分，例如叶、花、茎或根。

在该方法中，可以在液氮温度下冷冻植物的特殊部分或整体植物。这有助于粉碎，并保证活性成分的完整性和效力。

用蒸馏水反复提取磨碎的粉末。如果需要，用热水、乙醇、其它有机溶剂、水醇溶液、稀释乙酸或它们的任意组合进行提取。选择的实际温度优选接近或为水的沸腾温度。优选首先确定提取物的总生物活性。混合的提取物用于进行特定生物检测，例如，如果药物被用作抗菌药，则在有盖培养皿中进行抑制细菌生长的试验。或者，如果药物预期用作抗癌药，则优选进行抑制癌细胞细胞培养的试验。从这些数据计算每毫升提取物中含有的生物活性单位(生物活性单位被定义为在试验系统中该提取物抑制50％的细菌或癌细胞生长的稀释倍数)。可以用于计算刺激效果例如免疫激活等的类似生物活性单位。

为了建立本发明的药物指纹(PharmaPrint^_)，按照图3所示的程序提取植物，将其分为主要成分(例如皂甙、萜类、脂类、生物碱、核酸、蛋白质和碳水化合物)。各成分的分离组分按照需要测试生物活性。这可以指活性(例如槲寄生群的蛋白质和生物碱组分)。进一步用亲和色谱、高效液相色谱、气相色谱或其它色谱将活性成分组分成个体成分。以重量和特定生物活性单位为基础量化提供主要生物活性的成分。这些成分能够为最初的草药提取物提供建立药物要求的指纹。每毫升药用级提取物的生物活性单位为临床研究提供了建立准确剂量的方式。

一旦样品分离成个体标记组分，其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分，对每个组分进行分析，以测定其活性成分的量，并提供样品的定量指纹。每个成分的定量可以通过应用任何已知的定量分析方法获得。示范性的定量方法包括重量分析、光谱分析或应用定量检测器，如使用气相色谱或高效液相色谱和其它分离系统。其它适合的定量方法包括通过酶、放射性、比色、元素分析分光光度法、荧光或磷光和抗体检测(如酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射性免疫测定(RIA))进行分析。

在一个实施方案中，每个组分定量分析的结果用于制备样品的定量指纹。指纹由成分在每个标记组分中的量和该成分的身份组成。然后将该定量指纹和已建立的已知标准指纹相比较(图1)，以确定该材料是否为药用级。如果样品的定量指纹落在药用级指纹要求的定量范围内，该材料可以被鉴定为达到药用级。

作为进一步的质量保证分析，对个体标记组分可以进行生物学检测。用于不同组分检测的生物学检测和用于标准指纹的相同，也依赖于该材料特定的临床应用倾向。

从该材料获得的生物活性和已建立的标准生物活性进行比较，以确定该材料是否为药用级。如果样品的生物活性指纹落在药用级指纹要求的生物活性范围内，该材料可以被鉴定和证明为达到药用级。

5．1．2．可选的形成PharmaPrint^_的方法

当推定的植物药材活性成分未知时，其形成PharmaPrint^_的方法也始于文献综述。这涉及综述该植物药材，或相关植物药材，或由相关活性的植物药材可获得的任何化学文献、生物学文献、已出版的生物检测方法和临床数据。根据疾病状况，选择一系列相关的生物检测法。应用生物检测法分析样品或提取物的总体活性。然后将该显示活性的生物检测法用于推定的活性成分未知的植物药材的组分分析。这种分离是根据通常的方法进行的，例如，通过介电常数、生物亲合性、极性、大小、溶解度或吸附粉末分离。然后分析组分，以确定哪一个组分有活性。假定发现活性，再分馏每个活性组分，以分离单个的推定的活性成分，即，化学成分单一的化合物。根据已知的单体化学化合物和它们定量的生物活性，可以绘出定量效能曲线，并可以测定出每个单体化学化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)。如果推定活性成分是激动剂，可能需要其它的参数(结合、活化、应答)。在通常情况下，生物检测由以下组成：对成分、组分或整个提取物的刺激或抑制作用的进行适当检测，然后对这些影响进行适当定量评价。对于最可能的(或典型的)检测(其中标准(或放射标记的)激动剂或拮抗剂产生可以测定的作用)，可以对该材料的抑制和／或刺激进行评价，并典型地通过IC₅₀、EC₅₀等或其它适当的参数(K_i、K_d、K_m等)进行表示。然后将单个推定活性成分的活性相加，和未分馏的植物药材样品进行比较。如果这些成分是主要活性成分，那么它就具有植物药材(其中活性成分未知)“活性成分”的一个最初指纹。

5．1．3．形成PharmaPrint^_方法的其它改变

如果在检测过程中出现复杂情况，从上述假定活性成分未知的植物药材PharmaPrint^_概括的普通方法具有几种改变。一种改变发生在个体成分的活性总和不占植物药材生物活性的主要部分的情况。在这一点，有几种减少个体成分活性的可能原因，第一，活性成分的分解或降解，或，第二，协同作用。另一种可能的情况，从任何组分都没有发现明显的或大量减少的活性，但是植物药材或提取物在生物检测中显示出活性。和标准相比，非特异性基质作用也可能减少总体提取物的活性。

如果活性成分在分析过程中分解，测定相对简单。仅是组分再结合时，再结合组分的活性和原材料的活性进行比较。如果活性损失较大，那么问题可能在于分解。为了确定哪一个活性成分分解，将植物药材原药的色谱分析和再结合组分进行对比。峰消失或峰面积减小表明该成分可能分解。为了克服许多方法存在的分解，典型地，可以使用温和的提取／分馏方法，如液-液色谱(反相流动色谱)或超临界二氧化碳提取或色谱。

对于个体组分的活性不占植物药材生物活性总和的主要部分的另一个解释，是一个或更多活性成分之间或和非活性成分之间的协同作用。为了确定协同作用的发生，需要对成对的(pair-wise)再结合组分进行分析。如果结合成分比个体组分显示更高的活性，组分中两个或更多的个体成分可以产生协同。例如，一个药材可能含有3个组分，每一个单独具有10％的活性(即，它们未结合的生物活性总和为30％)，但是结合后具有100％的活性。在这种情况下，组分间协同作用。通过重复对组分成对(pair-wise)再结合或观察更大的组分，任何协同活性都会发现。一旦两个组分表现出协同，像上面那样进行再分馏，研究成对的个体组分或成对的分离成分，以发现产生协同的个体成分。也可以研究个体成分或组分三种方式的比较。

为什么当植物药材显示出活性，而组分在生物检测中无活性?这里，解释包括分解、协同、或许多活性成分而没有个体组分显示活性。第一步是分馏每一个最初的组分，看生物检测中是否有活性成分。如果没有，组分应该再结合，分析确定是否有活性的分解发生。如果发生分解，应该按照上面所述进行适当的测定。如果没有分解，应该尝试可选的分馏方法。最终，足够大量或适当大小或选择的组分显示出活性。如果怀疑协同，按照上面描述的协同部分进行实验。

5．2．加工和提取植物药材材料的方法

植物药材(例如银杏)可以加工形成整个植物或植物的选择部位的水或有机提取物。整个植物或部分的植物药材还可以加工形成粉末。许多感兴趣的植物药材商业可以购买到粉末、水提取物、有机提取物或油。在一个实施方案中，优选植物材料提取物，因为它们易于溶解在液体药物载体中。但是，粉末植物材料非常适合许多以固体剂型(例如片剂或胶囊)给药的应用。这些都是本领域技术人员已知的方法。并且，许多植物材料和／或提取物可以商业购买。作为植物药材的加工和提取实例，下文提供了实施例。另外对提供的实施例进行了详细的描述。

对于有代表性的根部，可以切片、冷冻或研磨成粉末。如果是粉末状的，用适当的溶剂振摇，过滤(Tanabe等，1991，Shoyakugaku Zassi，45(4)：316-320)。或者，可以采用以下方法：使根均质化，丙酮提取过滤；可以对植物药材进行蒸汽蒸馏，以获得必要的油，馏出液溶解于丙酮-水或适当的溶液；或者切片的根茎冷冻和／或冷冻干燥，得到的粉末用丙酮-水提取(Tanabe等，1991，Shoyakugaku Zassi，45(4)：321-326)。另一个加工植物药材的方法是用100℃水溶液提取(Yamahara等，1985，J．Ethnopharmacology 13：217-225)。从上述方法提取的最初溶液，可以用适当的溶剂应用液／液提取进一步提取。植物药材可以分别使用极性或非极性溶剂进行两步提取。然后蒸发溶剂，合并组分(Nagabhusan等，1987，Cancer Let．36：221-233)。植物药材还可以加工成可以蒸煮的糊状物或粉末(Zhang等，1994，食品科学杂志(J．Of FoodScience)59(6)：1338-1343)。

提取干燥的植物药材可以使用许多溶剂，例如丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、己烷、异丙醇、甲醇、其它的醇、和超临界二氧化碳(Sipro等，1990，国际食品科学和技术杂志(Int．J．Of FoodScience and Technology)，25：566-575，和其中的参考文献)。

对于其它的植物药材如saw palmetto，医药产品为种子油或浆果。再一个有代表性的制备中，制备采用己烷或超临界二氧化碳提取。许多saw palmetto制剂可以商业购买，例如Permixon^TM或Talso^TM。对于临界二氧化碳提取植物药材的一个实例，参见Indena，欧洲专利No．0 250953 B1。或者，可以将植物药材碾碎，在索氏萃取器中用适当的溶剂(90％)提取(Elghamry等，1969，Experientia 25(8)：828-829)。还可以用乙醇提取植物药材(Weisser等，1996，前列腺(The Prostate)，28：300-306)。

可以用多种方法制备干燥材料，包括冷冻干燥、微波干燥、液氮冷却和研磨成粉末70℃真空干燥10小时；或阴凉处空气干燥，或热空气干燥(List和Schmidt，Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis，Springer-Verlag：纽约，1933，1973-1979；Araya等，1981，比较病理学杂志(Journal of comparative Pathology，135-141)。浸剂、稀释的水溶液提取物、还已知浸剂，可以用60-100℃水制备(Nosel和Schilcher，1990)。还可以使用煎剂。当粒子大小小于0．25mm时，提取更有效率(List和Schmidt，植物药学技术，CRC Press：Boca Raton，FL，1989)。

对于制备植物药材的油提取物，有许多指导原则。植物药材可以在油中45℃下消化(浸渍)10天，同时还推荐70℃下12-24小时(Hobbs，1989，HerbalGram 18／19：24-33；Smith等，实验室中药药学定量确认：Williams，OR，1996)。在St．John’s Wort中，例如，据报道提取中将制品暴露于太阳光下，导致黄酮类含量提高40％(以四羟黄酮计算)(Maisenbacher和Kovar，1992)。另外，据报道对于St．John’s Wort，油制品中的金丝桃素(hypericin)增加20％，其中材料经乙醇进一步提取，和油混合(Georgiev等，1983，Nauchni Tr．-Vissh Inst．Plovid．30：175-183)。

或者，可以制备植物药材的乙醇-水制品(Dyukova，1985，Farmitsiya34：71-72；Georgiev等，1983，Nauchni Tr．-Vissh Inst．Plovid．32：257-263；Wagner和Bladt，1994，Kowalewski等，1981，Herba Pol．27：295-302)。按照 Hagers Handbuch植物药材的酊剂，如St．John’s Wort，可以通过应用药物或冷冻乙醇浸泡植物药材，过滤，在深色瓶中保存(List和Horhammer，1993)。

一些植物药材，如St．John’s Wort，对温度和光都敏感。对于该类植物药材，应该干燥和制冷剂一起包装，或冷藏运输，并闭光和空气保存。在St．John’s Wort中，当在60℃-140℃保存6周以上，粉末提取物、片剂和糖浆制剂中的金丝桃素(hypericin)含量明显减少。干燥提取物在20℃下保存，至少1年保持稳定(Adamski等，1971，Farm．Pol．27：237-241；Benigni等，Hypericum．Plante Medicinali：Chimica，Farmacologia e Terapia，Milano：Inverni & della beffa；1971)。St．John’sWort的其它成分，发现油制剂中的hyperforin和adhyperforin非常不稳定，特别是暴露于光线下，和14日降解的一样多(meisenbacher等，1992，Planta Med．，351-354)。乙醇提取的制剂稳定性(在空气中)提高至6个月。同样地，检测到四个呫吨酮和几种黄酮类化合物(包括四羟黄酮和I3’，Ⅱ 8-biapigenlin)，认为它们可能是外用制剂的活性成分(Bystrov等，1975，四面体通讯(Tetrahedron Letters)32：2791-2794)。

5．2．1．植物材料和粉末植物材料的液体提取物

有代表性地，银杏以干燥提取物的植物药材形式被提供。

通常的液体提取物剂型为“浸剂”。浸剂的制备可以通过浸渍或煎煮加工。浸剂通常是从干燥或新鲜的植物药材中提起水溶性成分有效的方式。

另一个通常的液体植物药材提取物为酊剂。有代表性地，植物药材酊剂为从新鲜或干燥的植物药材的醇或水醇提取物。它通常通过渗透或浸渍加工制备。

植物药材浓的酊剂，和酊剂母液中，100ml酊剂可以代表10g植物药材(干燥重量)。通常的植物药材，100ml酊剂可以代表20g植物药材。在这些制剂中，干燥植物药材和溶剂的比例分别为1∶10和1∶5。这些浓度已经被美国国家药典官方认可，通常制备1∶4和其它浓度的酊剂。

和植物药材粗提取物相比，酊剂的微生物量减少，保存期更长。这主要是由于提取液中含有20％或更大浓度的醇。有时液体提取物由甘油和水作为溶剂进行制备。该甘油溶液通常需要含有至少50％的甘油，以抑制微生物的污染。甘油溶液还可以通过酊剂蒸干乙醇，“后加入”甘油进行制备。

另一种类型的液体提取物为“流体提取液”。流体提取液为植物药材的液体制剂，其药物性质为1ml提取液代表1g干燥植物药材。官方的解释是按照官方的标准(其中使用的溶剂已确定)浸透加工进行制备。

通常通过溶剂蒸发的浓缩液体提取物，可以形成油状、半固体或固体的提取物。

干燥的液体提取物在除去溶剂前，通过液体提取物、油或半固体在适当的载体上吸附进行制备。或者，干燥的粉末状提取物可以按如下制备：从液体提取物中除去溶剂，得到粉末状的固体提取物。

5．3组分的分离

一旦制备出样品提取物和／或可选地商业购买提取物，就需要进行组分分析。如果已经建立指纹，样品或等分试样分成许多相同的具有标准指纹的标记组分。每一个标记组分包括一个或更多的活性或非活性成分。分别根据每一个待测植物药材，建立标记组分。对于一些药材，只需要很少几个标记组分。对于其它更复杂的药材，可能有许多标记组分。例如，槲寄生Viscum album L．蛋白质提取物，优选的蛋白质标记组分为根据组分与糖结合的亲和性分离的组分。但是，根据植物药材中成分的类型，可以建立鉴定和将材料分成标定组分的不同参数。将样品分离成标记组分可根据常规技术中的任何一种来进行，例如液相色谱和抽提方法。应该使用与用于建立标准指纹相同的程序。因为需要测定许多组分的生物活性，因此优选应用非破坏性的分离技术。液柱色谱是一种有用的分离技术，它使用了根据具体所使用的化合物的特定亲和能力的亲和色谱(例如，碳水化合物和靶向酶)。

分馏后，除去溶剂，材料溶解于适当的介质中，用于生物检测。适当的介质的例子包括DEMO、乙醇、不同的洗涤剂、水和适当的缓冲液。溶剂的选择依赖于待测成分的化学性质和与测定系统的相容性。

5．4适当的生物检测方法的建立

示范性的生物检测可以包括任何细胞增殖检测，如L 1210细胞抑制的测定，和特定疾病相关的免疫活性或关键酶的抑制。可用于生物检测的其它转化细胞系的实例包括HDLM-3Hodgkin’s淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤，肝细胞瘤细胞系，携带特定细胞受体或酶的人／动物细胞系的初级或已建立的培养物。

生物检测的结果用于制备药材的生物活性指纹。指纹可以像两个选择标定组分的检测一样简单。相反，指纹可以包括对许多不同组分进行的大量不同的生物检测。可以对不同的标定组分进行相同的检测。也可以对相同的标定组分进行不同的检测。生物检测的结合依赖于特定的植物药材和它可能的临床应用的复杂性。生物检测要和标准药材建立生物活性指纹的方法相同。

5．4．1．酶和基于受体的检测

本发明实际应用中优选酶和基于受体的检测。检测的选择或是根据临床疾病可接受的酶检测，或是从特定临床疾病相关的检测中选择。选择适当、有效的生物检测非常重要。理想地，生物检测应该是稳定的，即经时具有重现性，并在一个较宽的浓度范围内显示出定量的剂量反应。对于活性成分未知的植物药材，选择相关的生物检测。根据可能的活性机理，以人的治疗应用作为指导，选择本领域已知的检测。活性机理应该和临床相关应用相一致。根据酶活性、受体结合活性、细胞培养物活性、抗组织活性和整个动物体内活性，存在大量的临床相关检测。

这部分涉及酶和受体结合检测。有许多关于酶和受体结合检测的书，例如，酶学方法，科学出版社，或Boyers，酶。天然生物活性制品，检测、分离和结构确定，S．M．Colegate和R．J．Molyneux，CRC Press(1993)。也讨论了特定的生物。细胞免疫学方法，R．Rafael Fernadez-Botran和V．Vetvicka，CRC Press(1995)中描述了免疫细胞活化检测和细胞因子受体检测。“筛选微生物代谢物中新药理论和实际的考虑”描述了发现药学相关生物检测的其它方法(Yarbrough)等，(1993)，抗生素杂志(J．Antibiotics)，46(4)：536-544)。还有许多商业合同研究供应商，包括Panlabs，Paracelsian和NovaScreen。

例如，对于用于治疗神经学疾病的植物药材，生物检测的集合可以包括肾上腺素受体、胆碱能受体、多巴胺受体、GABA受体、谷氨酸受体、单胺氧化酶、氧化氮合成酶、阿片受体或5-羟色胺受体。对于心血管疾病，检测的集合可以包括腺苷A₁激动；肾上腺素能α₁、α₂、β₁激动和拮抗；血管紧缩素Ⅰ抑制；血小板凝集；钙通道阻滞；回肠收缩反应；心律失常；心肌收缩；血压；心律；变时性；收缩性；缺氧；低密度；KCN缺氧；门静脉钾去极化；门静脉自发激活；血栓烷血小板凝集。对于代谢疾病，可以使用下列生物检测：胆固醇，血清HDL，全血清；血清HDL／胆固醇比率，HDL／LDL比率；葡萄糖，血清葡萄糖含量；或肾功能，尿钾排泄、尿盐排泄和尿溶剂变化。对于过敏／炎症疾病，可以使用下列生物检测：变态Arthurs反应，被动皮肤过敏反应；缓激肽B₂；气管收缩；组胺H₁拮抗；炎症，角叉菜胶对巨噬细胞移动的影响；白细胞三烯D₄拮抗；神经激肽NK₁拮抗；或血小板激活因子，血小板凝集或重要的炎症介质的生物合成的诱导(例如，白细胞介素IL-1，IL-6，肿瘤坏死因子或花生四烯酸)。对于胃肠道疾病，可以使用下列生物检测：缩胆囊素CCK_A拮抗；外周胆碱能抑制；胃酸，五肽促胃酸激素；胃溃疡，乙醇；回肠电刺激调节；回肠电刺激痉挛或5-羟色胺5-HT₃抑制。对于抗菌、抗真菌、或抗滴虫疾病，可以使用下列：白色念珠菌；大肠杆菌；肺炎克氏杆菌；蛙分支杆菌；普通变形杆菌；绿脓杆菌；耐性金黄色葡萄球菌；胎儿毛滴虫；或须发癣菌。对于其它的疾病，本领域技术人员可以选择相关的生物检测。

基于酶或受体的检测具体实例包括下列：乙酰胆碱酯酶；3-羟基丁醛还原酶；血管紧张素转化酶(ACE)；肾上腺素α、β、大鼠雄激素受体；CNS受体；1或2环加氧酶(Cox1，Cox2)；DNA修复酶；多巴胺受体；雌激素受体内分泌生物检测；纤维蛋白原酶；GABA A或GABAB；β-葡萄糖苷酸酶；脂肪氧化酶，例如5-脂肪氧化酶；单胺氧化酶(MAO-A，MAO-B)；磷脂酶A₂，血小板激活因子(PAF)；钾通道检测；前列环素细胞周期蛋白；前列腺素合成酶；5-羟色胺检测，例如，5-HT活性或其它5-羟色胺受体亚型；5-羟色胺再摄取活性；类固醇／甲状腺总科受体；血栓烷合成活性。可以从大量的资源中获得具体的酶检测，包括Panlabs^TM INC(Bothell，WA)和NovaScreen^TM(Baltimmore，MD)。另外的检测包括：ATP酶抑制，苯并芘羟化酶抑制，HMG-CoA还原酶抑制，磷酸二酯酶抑制，蛋白酶抑制，蛋白质生物合成抑制，酪氨酸羟化酶和激酶抑制，睾酮-5α-还原酶和细胞因子受体检测。

5．4．2．细胞培养物及其它检测

除了酶和受体检测，还有其它生物检测。这些检测优选在细胞培养物中进行，但也可以在整个生物体中进行。细胞培养检测包括培养的肝细胞和肝细胞瘤活性(对胆固醇水平、LDL胆固醇受体水平、HDL／LDL胆固醇比率的影响)；对抗L 1210、HeLa或MCF-7细胞抗癌活性；PC12人成神经细胞瘤细胞调控受体水平；初级细胞培养物促黄体生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)或促乳激素的活性调控；肥大细胞Ca²⁺流入量；对吞噬作用、淋巴细胞活性或TNF释放的细胞培养物检测；血小板凝集活性或对抗HDLM-3 Hodgkin's淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤活性，抗有丝分裂活性，受感染细胞抗病毒活性，抗菌活性(细菌细胞培养物)和抗真菌活性。可以使用的组织或整个动物检测还包括抗炎小鼠耳皮炎，大鼠脚爪膨胀；肌肉收缩检测；被动皮肤过敏反应；血管舒张检测；或全动物碳粒清除试验。这些检测可以从许多来源获得，包括Panlabs^TM Inc．(Bothell，WA)。

5．4．3．抗癌活性

药物的抗癌作用可以通过大量的细胞培养系统进行研究；它们包括小鼠白血球过多、L 1210、P388、L1578Y等。也可以使用人的肿瘤细胞系，像KB和HeLa。在一个有代表性的检测中，肿瘤细胞在适当的细胞培养介质(像含有10％胎牛血清的RPMI-1640)中生长。根据细胞系的细胞周期时间，用不同浓度的测试材料处理对数性生长的细胞14-72小时。在培育期结束时，通过细胞计数器评价处理组和未处理组的细胞生长。通过锥虫兰排除实验和通过线粒体脱氢酶造成的四唑染料减少，测定细胞的生活力。药物抑制培养物中细胞生长的能力可以表明其可能的抗癌作用。这些作用可以通过动物耐受肿瘤(其为人疾病模型)来证实(Khwaja，T．A．等，1986，肿瘤学(Oncology)，43(增补1)：42-50)。

药物抗癌作用的最经济的评价方法，是研究它对含有10％胎牛血清的最小必需介质(MEM)中肿瘤细胞生长的影响。接触药物的细胞(两组)在潮湿的CO₂培养箱中在37℃下培养2-4天(依赖于肿瘤细胞的数量加倍时间)。培养期结束时，统计算细胞数量，计算细胞生长抑制程度，和在同样条件下未处理的对照组细胞生长进行比较。不同的实验室根据个体的需要使用不同类型的细胞系。美国国家癌症研究所(NCI)推荐使用KB细胞(人鼻咽癌)用于抗癌药物的体内评价。细胞生长抑制由药物处理和未处理对照组评价的蛋白质含量(Lowry’s方法)所决定。NCI还推荐使用小鼠白血病P388悬浮培养物用于评价植物提取物和相关天然产物的抗癌潜力。

在微量滴定平板中培养的小鼠白血病L1210细胞，常规用于抗癌活性的体内检测。白血病L1210的细胞数量加倍时间为10-11小时，和药物接触48小时(3-4代的对数生长)，用于评价其抗肿瘤活性。对于生长抑制研究，所有的储备液和稀释液用无菌的0．9％NaCl溶液制备。在微量滴定平板(0．18 ml／孔)中，对于每个抑制剂浓度以2-5×10⁴细胞／ml的浓度接种细胞培养物两份。在每种情况下，加入0．02ml的抑制剂以获得1∶10的稀释液。加盖的微量滴定平板在空气中含有5％CO₂的潮湿的CO₂培养箱中培养48小时。在培养期结束时，将每孔等分量的培养物加入到测量体积的等渗盐水中，用电子细胞计数器计数。通过锥虫兰排除测定细胞的生活力。通过绘制细胞生长抑制百分率(和盐处理的对照组细胞浓度相比)对对数药物浓度的曲线，计算结果，表示为引起50％细胞生长抑制的的浓度(IC₅₀)(从图中可测出)。

也可以评价出药物对肿瘤细胞系的细胞毒效应。然而，这些实验需要较长的时间，而且花费更昂贵。在该研究中，洗涤药物处理的细胞，使其不含药物，然后在软琼质或适当的培养基铺板，通过存活细胞增殖和形成微集落能力评价细胞的生活力。某种药物浓度得到的细胞集落数量和未处理的对照组得到的相比较，以评价细胞杀伤和细胞毒活性。在槲寄生提取物研究中，我们使用EMT-6细胞松散的贴壁培养物(小鼠乳腺癌)。该细胞在含有10％的透析的胎牛血清和抗生素的Eagle’s MEM(F14)中生长。旋转细胞悬浮液，悬浮于添加10％的透析胎牛血清的Spinner’s培养基中的小球(70个细胞／ml)，在塑料培养皿中铺板，培养2小时，使细胞附着。这时细胞和不同浓度的提取物接触2-24小时。然后，除去培养基，用不含药物的培养基代替，在培养皿中培养5-7天。集落用亚甲兰(0．33％，在0．01％KOH中)染色，用自动集落计数器计数。EMT-6细胞的铺板效率为46％。(Khwaja等，1986，肿瘤学(Oncology)，43(增补1)：42-50)。

5．4．4．抗病毒活性

不同药物的抗病毒活性可以通过人细胞系(像HeLa或H9淋巴瘤细胞)的细胞培养物确定。将该细胞用病毒感染，病毒在细胞培养物中增殖。病毒产生细胞溶解作用或致细胞病变效应的能力取作终点。例如，H9细胞的HIV感染导致多核细胞的产生。该致细胞病变效应如果通过某一浓度的药物降低或提高，表示了其作为抗HIV药的潜力。结果可以通过细胞培养物中病毒酶的评价验证，例如，通过研究病毒逆转录酶的表达量。病毒酶的表达降低支持了药物治疗的抗病毒作用(Khwaja T．A．美国专利第5，565，200号；J．Levy等，1984，科学，225∶840)。

5．5．分析化学成分的分析方法

有许多方法用于分离和分析单个的化学成分，包括气相色谱(GC)，质谱(MS)，GC-MS，高效液相色谱(HPLC)，HPLC-MS，薄层色谱(TLC)，高效TLC(HPTLC)凝胶色谱和反相色谱(RPC)。这些色谱方法基可以应用分析级的，也可以应用制备级的。为了确定未知成分的化学结构，有代表性地应用核磁共振(NMR)和质谱组分分析。

色谱类型的确定依赖于最有可能具有生物活性的化学成分。例如，其生物活性是由于脂肪酸，就将该脂肪酸酯化，用GC分析它的酯。对于具有醇基团的有机化合物，将其修饰，制备酯、甲硅烷基或其它极性更小的官能团。该衍生物适合于GC分析(Steinke等，1993，Planta Med．59：155-160；Breu等，1992，Arzneim．-Forsch／Drug Res．42(1)：547-551)。如果活性最可能是由于类黄酮，可以选择HPLC法。反相HPLC(RP-HPLC)已用于许多植物药材(具体为山楂、粉色西番莲、甘菊、银杏)的类黄酮分析(Pietta等，1989，色谱学(Chromatographia)，27(9／10)：509-512)。通过TLC(Vanhaelen和Vanhealen-Fastre，1983，色谱杂志，281：263-271)以及MS分析对大蒜的植物成分进行定量检测。CRC色谱手册关于“液体分析”，K．D．Mukherjee，“甾体的分析和特征鉴定”，H．Lamparczyk，J．Sherma，和“肽和蛋白质的高效液相色谱”，C．TMant和R．S．Hodges，是可获得的现有文献，其描述了柱和溶剂系统。

5．6．组分的分析

在一个可选择的实施方案中，指纹不是根据已知生物活性的个别化学成分，还可以应用限定的组分或化合物的种类建立PharmaPrint^_。一些植物药材的化学成分形成许多密切相关成分的复杂混合物，以至于，从实际的观点考虑，需要根据组分或化合物的种类，而不是根据单个的化合物，建立PharmaPrint^_。该类型的成分的实例为外源凝集素(糖结合蛋白质)或醣蛋白以及水飞蓟中的水飞蓟素。有许多组分分析的实例(凝胶过滤原理和方法，Pharmacia Biotech，Rahms i Lund：瑞典，Ulsumi等，1987，生物化学杂志(J．Biochem．)，101：1199-1208)。

5．7．应用PHARMAPRINTED^TM材料的方法

在植物药材建立指纹后，分析单个样品，以确定其是否落在可接受的标准范围内。一旦样品得到证实，它适合用于有关人和动物的许多疾病。该材料可用于临床实验，以提供稳定质量的材料和用于实验的ose制剂的准确剂量。PharmaPrinted^TM材料还可用于动物的毒理分析，其中质量稳定的材料可用于定量毒理分析。在许多情况下，它可以作为材料分析或生物应用的参考。

PharmaPrinted^TM植物材料可用于植物药相关的任何疾病。参见例如，Leung和Foster，1996，和中药和植物药学，1994。更具体的病状或治疗适应症包括AIDS、适应原(adaptogen)、轻度至中度抑郁、抗关节炎、抗癌、止泻、抗蠕虫、抗炎、通过GI止恶心、抗风湿、解痉、抗溃疡、绞痛、抗菌、抗诱变、抗氧化、抗病毒、动脉硬化、关节炎、哮喘、血压、前列腺良性增生(BPH)、支气管哮喘、支气管炎、镇静、咳嗽、大脑循环紊乱、胆固醇降低、肝硬化、皮肤病抗炎、糖尿病、利尿、剧泻、痛经、消化不良、肺气肿、环境紧张、祛痰、自由基清除剂、GI损伤、痔疮、肝炎、肝保护、高血压、高血脂、血催乳素过多、免疫调节活性、纤维蛋白溶解增加、对抗细菌感染、炎症、失眠、哺乳、肝保护、长寿、月经循环调节、偏头痛、肌肉痛、骨关节炎、疼痛、外周血管疾病、血小板凝集、PMS、促进月经、前列腺疾病、甘油三酯减少、减轻月经痛、呼吸道感染(RTI)、视网膜病、鼻窦炎、风湿、镇静、催眠药、咽喉痛、刺激头发生长、表面伤口愈合、耳鸣、局部湿疹(皮炎)、泌尿道感染(UTI)、静脉曲张、静脉不足或伤口愈合。

其它的适应症包括止血、抗菌、抗寄生虫、退热、强心、祛风、利胆、镇痛、发汗、催吐、通经、润肤、退烧、催奶、肝的、催眠、通便、镇定、祛痰、发红、兴奋、滋补、医治创伤、溃疡stores、溢脓、牙龈炎、胃炎、溃疡、胆结石、间歇性跛行、感冒、流行性感冒、喉炎、头痛、带状疱疹、膀胱炎、肾结石、特异反应性阴道炎、子宫纤维瘤、骨质疏松、痛风。

据报道银杏可有效治疗外周血管疾病，包括脑血管疾病和静脉疾病，阿尔茨海默疾病，和作为抗氧化剂治疗。给药银杏的主要适应症是增加血流，特别是脑血流。在德国已证明银杏提取物可有效治疗脑循环紊乱导致的功能性容量减少和失眠(Yyler，1994，植物药选择，Haworth Press，NY)。银杏还具有减少视网膜水肿，视网膜中细胞损伤，增加FontaineⅡ期外周动脉闭塞疾病的无疼痛行走距离(间歇的跛行)的适应症。适应症还有源于血管和退化的眩晕和耳鸣。

5．8．银杏PHARMAPRINT^_

下面的生物和化学PHARMAPRINT^_值是对植物药材银杏的举例说明。

5．8．1．生物PHARMAPRINT^_

应用本文描述的方法得到的示范性的生物PHARMAPRINT^_值如表1-3所示。参见下文6．4部分对于表1-3中每个数值的每个生物检测的详细讨论和解释。

每个生物检测的值表示为在10^-4M浓度下的抑制百分比范围，除非另有说明。对于提取物和组分的计算基于平均分子量为200的假定。

表1：生物PHARMAPRINT^_

检测	提取物	银杏苦内酯A	银杏苦内酯B	银杏苦内酯C	白果内酯
检测	提取物	银杏苦内酯A	银杏苦内酯B	银杏苦内酯C	白果内酯	[³H]和PAF受体结合的％抑制	-	70±20	85±20	60±20	-
GABA_A的％抑制	50±20	-	-	-	-	[³H]和PAF受体结合的％抑制	-	70±20	85±20	60±20	-
GABA_A的％抑制	50±20	-	-	-	-	缓激肽β₂(10^-5M)	20±10	-	-	-	-
5-脂肪氧合酶的％抑制	60±20	-	30±15	30±15	30±15	缓激肽β₂(10^-5M)	20±10	-	-	-	-
5-脂肪氧合酶的％抑制	60±20	-	30±15	30±15	30±15	环加氧酶-1@300μM的％抑制	30±15	-	-	-	-
激酶蛋白C(非选择性)	20±10	-	-	-	-	环加氧酶-1@300μM的％抑制	30±15	-	-	-	-
激酶蛋白C(非选择性)	20±10	-	-	-	-	白细胞三烯C₄合成酶(@ 1000μM)	75±10	25±10	30±15	30±15	30±15
EGF酪胺酸激活酶	30±15	-	-	-	-	白细胞三烯C₄合成酶(@ 1000μM)	75±10	25±10	30±15	30±15	30±15
EGF酪胺酸激活酶	30±15	-	-	-	-	p59^ryn酪胺酸激活酶	50±20	-	-	-	-
白细胞介素6结合的％抑制	-	-	20±10	-	-	p59^ryn酪胺酸激活酶	50±20	-	-	-	-
白细胞介素6结合的％抑制	-	-	20±10	-	-	白细胞三烯β₄结合的％抑制	-	-	-	20±10	-
谷氨酸AMPA@10^-4M的％抑制	20±10	20±10	-	-	-	白细胞三烯β₄结合的％抑制	-	-	-	20±10	-
谷氨酸AMPA@10^-4M的％抑制	20±10	20±10	-	-	-	毒簟碱M1@10^-4M的％抑制	-	20±10	-	-	-
Na⁺，位点2的％抑制	20±10	30±15	-	-	-	毒簟碱M1@10^-4M的％抑制	-	20±10	-	-	-
Na⁺，位点2的％抑制	20±10	30±15	-	-	-	单胺氧化酶A,MAOA@10^-4M的％抑制	45±20	-	-	-	-
单胺氧化酶B,MAO_B@10^-4M的％抑制	-	35±15	-	-	-	单胺氧化酶A,MAOA@10^-4M的％抑制	45±20	-	-	-	-
单胺氧化酶B,MAO_B@10^-4M的％抑制	-	35±15	-	-	-	5-羟色胺摄取，@10^-4M的％抑制	20±10	-	-	-	-
促肾上腺皮质激素释放因子@10^-4M的％抑制	60±20	-	-	-	20±10	5-羟色胺摄取，@10^-4M的％抑制	20±10	-	-	-	-
促肾上腺皮质激素释放因子@10^-4M的％抑制	60±20	-	-	-	20±10	组胺H₂@10^-4M的％抑制	30±15	-	-	-	-
烟碱神经元位点@10^-4M的％抑制	20±10	-	-	-	-	组胺H₂@10^-4M的％抑制	30±15	-	-	-	-
烟碱神经元位点@10^-4M的％抑制	20±10	-	-	-	-	血管紧张素Ⅱ，2型@10^-4M的％抑制	20±10	-	-	-	-

表2：PAF检测PHARMAPRINT^_

提取物	[³H]和PAF受体结合的％抑制
提取物	[³H]和PAF受体结合的％抑制	GB300
GB301		GB300
GB301		组分	[³H]和PAF受体结合的％抑制
组分17	90±20	组分	[³H]和PAF受体结合的％抑制
组分17	90±20	组分18	96±20
组分19	90±20	组分18	96±20
组分19	90±20	组分20	90±20
组分21	90±20	组分20	90±20
组分21	90±20	组分22	80±20
组分23	110+20	组分22	80±20
组分23	110+20	组分24	104±20
组分25	93±20	组分24	104±20
组分25	93±20	组分26	80±20
组分27	99±20	组分26	80±20
组分27	99±20	组分28	102±20
参照化合物	[³H]和PAF受体结合的％抑制	组分28	102±20
参照化合物	[³H]和PAF受体结合的％抑制	银杏苦内酯A G-4028	70±20
银杏苦内酯B G-6910	85±20	银杏苦内酯A G-4028	70±20
银杏苦内酯B G-6910	85±20	银杏苦内酯C G-8888	58±20
白果内酯G-9999	-	银杏苦内酯C G-8888	58±20

例如，应用表1中的数据，PharmPrint^_可以基于在5-脂肪氧合酶检测中提取物的生物活性和选自下组的一个或更多的检测：GABA_A检测，白细胞三烯C₄合酶检测，单胺氧化酶A检测，烟碱受体检测，5-羟色胺摄取检测，环加氧酶-1检测，和／或组分18，23和／或28在PAF受体中的检测。

在一个供选择的实施方案中，PharmPrint^_的形成基于生物活性等于或大于生物活性范围的最小值，如表1和2中所示。作为该实施方案的说明性实例，基于在5-脂肪氧合酶检测中(60±20)总提取物的生物活性的PharmPrint^_值，在10^-4M浓度至少40％抑制。

在一个优选的实施方案中，生物PharmPrint^_可以基于生物检测中的生物活性，如表3所示。表3：生物药物指纹银杏的药物指纹范围

生物检测标记物	范围(IC₅₀ μg/mL)
	范围(IC₅₀ μg/mL)			宽的范围(平均值±3 STD)	中间范围(平均值±2 STD)	优选范围(平均值±1 STD)
	GABA_BDZ	1.0-100	10.0-40.0	宽的范围(平均值±3 STD)	中间范围(平均值±2 STD)	优选范围(平均值±1 STD)	19.0-30.0
GABA_A	GABA_BDZ	1.0-100	10.0-40.0	1.0-500	5.0-250	52.0-130	19.0-30.0
GABA_A	5-脂肪氧合酶	.0005-50.0	0.01-10.0	1.0-500	5.0-250	52.0-130	0.05-5.0
白细胞三烯C₄合成酶	5-脂肪氧合酶	.0005-50.0	0.01-10.0	50.0-2000	100-1000	200-450	0.05-5.0

5．8．2．化学PHARMAPRINT^_

应用本文描述的方法，银杏的化学PHARMAPRINT^_可以限定为下面表4和5所列。在一个实施方案中，银杏的化学PHARMAPRINT^_如表4所列。在一个优选的实施方案中，银杏的化学PHARMAPRINT^_如表5所列。参见下文6．5部分中选择化学化合物的详细讨论和解释。表4：化学PHARMAPRINT^_

化学化合物	活性PHARMAPRINT^_(％提取物W／W)
化学化合物	银杏苦内酯A	2．0-6．0
银杏苦内酯B	1．0-3．0
银杏苦内酯C	1．0-2．0
白果内酯	1．2-12

表5：化学药物指纹银杏的药物指纹范围

化学标记物	范围％(W/W)
	范围％(W/W)			宽的范围	中间范围	优选范围
	谷氨酸	0.001-0.13％	0.005-0.09％	宽的范围	中间范围	优选范围	0.01-0.05％
谷氨酰胺	谷氨酸	0.001-0.13％	0.005-0.09％	0.001-0.15％	0.005-0.11％	0.01-0.07％	0.01-0.05％
谷氨酰胺	Y-氨基丁酸	0.001-0.19％	0.005-0.1 5％	0.001-0.15％	0.005-0.11％	0.01-0.07％	0.05-0.11％
脯氨酸	Y-氨基丁酸	0.001-0.19％	0.005-0.1 5％	0.001-0.34％	0.005-0.26％	0.05-0.17％	0.05-0.11％
脯氨酸	漆树酸	＜500ppm	＜50.0ppm	0.001-0.34％	0.005-0.26％	0.05-0.17％	＜5.0 ppm
银杏皂甙	漆树酸	＜500ppm	＜50.0ppm	18.0-36.0％	21.0-33.0％	24.0-30.0％	＜5.0 ppm
银杏皂甙	银杏苦内酯	1.0-18.0％	3.5-14.5％	18.0-36.0％	21.0-33.0％	24.0-30.0％	6.0-12.0％
白果内酯	银杏苦内酯	1.0-18.0％	3.5-14.5％	0.5-7.75％	1.14-6.43％	2.46-5.11％	6.0-12.0％
白果内酯	银杏苦内酯A	0.40-6.0％	1.10-5.3％	0.5-7.75％	1.14-6.43％	2.46-5.11％	1.80-4.6％
银杏苦内酯B	银杏苦内酯A	0.40-6.0％	1.10-5.3％	0.05-6.80％	0.15-6.10％	0.85-5.40％	1.80-4.6％
银杏苦内酯B	穗花杉双黄酮	0.0005-0.020％	.002-0.017％	0.05-6.80％	0.15-6.10％	0.85-5.40％	0.005-0.015％

其中ppm表示报道量的单位是百万分之几，而不是％(W／W)。

5．8．3．换算率

应用植物药材(例如银杏)的干燥粉末提取物得到的PharmPrint^_值，可以换算成与植物药材原材料干重有关的值，应用的比例在下表6中进行说明。因此，将基于干燥粉末提取物的PharmPrint^_值换算成与干燥植物材料有关的值，在表6中，通过适当的因子划分。

表6：换算率

换算率
换算率		植物药材	比率(粉末至提取物)
Saw Palmetto	10∶1	植物药材	比率(粉末至提取物)
Saw Palmetto	10∶1	St.John′s wort	5∶1
缬草根	5∶1	St.John′s wort	5∶1
缬草根	5∶1	Echinacea	5∶1
银杏	50∶1	Echinacea	5∶1
银杏	50∶1	人参	5∶1
V.agnus-castus	10∶1	人参	5∶1
V.agnus-castus	10∶1	Black Cohosh	1∶1
越桔	100∶1	Black Cohosh	1∶1
越桔	100∶1	水飞蓟	40∶10

下面的实施例只是为了举例说明，绝不是为了限制本发明的范围。

6．实施例：银杏PHARMAPRINTING^_

下面的实施例举例说明银杏生物PharmPrint^_和化学PharmPrint^_的形成。

6．1．商业供应商／产品名

银杏制品是可获得的最常见的植物药材产品。Egb 761为IPSEN研究实验室(法国，巴黎)的市售提取物，商品名为Tebonin^TM，Tanakan^TM，和Rokan^TM，在欧洲已广泛用于临床实验。IPSEN的另一个银杏提取物，LI 1370，商品名为Kaveri。银杏干燥提取物可以从Indena s．a．(意大利，米兰)获得，其标准为含有24％总银杏黄酮糖甙，6％银杏苦内酯和白果内酯。提取物还可以从以下公司获得：Natural Factors NutritionalProducts，Ltd．(Bumaby，british Columbia，Canada)，Murdock MadausSchwabe(Springville，Utah)，和Zuelling Botanicals，Inc．(德国)的部门Botanicals International购买，Herbal Choice-Botalia，ThompsonNutritional，Hudson，NaturaLife，Botalia Gold，Nature’s Resource，HerbPharm，PhytoPharmica，Nature’s Way，Tebonin^TM(Schwabe，Germany)，Rokan^TM(Intersan，Germany)，和PhytoPharmica。

6．2．临床应用

银杏以液体或固体剂型口服给药，据报道它对外周血管疾病的治疗有效，包括脑血管疾病和静脉疾病。副作用包括偶见肠道不适，头痛，和过敏性皮肤反应。已知银杏和其它药物没有相互作用。银杏禁用于已知对银杏制剂高度过敏的患者。另外，应确定想要进行治疗的病症是否表明根本的疾病过程需要可选择的治疗。最近已有对银杏临床应用的综述(Cleijen和Knipchild，1992，Lancet，340：1136-1139)。

6．2．1．主要适应症

银杏给药的主要适应症是增加血流，特别是脑血流。在德国已证明银杏提取物可有效治疗脑循环紊乱导致的功能性容量减少和失眠(Tyler，1994，植物药选择，Haworth Press，NY)。对于记忆力缺失，注意力不能集中，感情抑郁，和头痛，推荐每日2或3个剂量，每个剂量120-240mg天然干燥提取物(German Commission E Monograph，银杏叶提取物，1994年7月)。

6．2．1．第二适应症

银杏还具有减少视网膜水肿，视网膜中细胞损伤，增加FontaineⅡ期外周动脉闭塞疾病的无疼痛行走距离(间歇的跛行)的适应症。适应症还有源于血管和退化的眩晕和耳鸣。对于间歇的跛行，眩晕和耳鸣，推荐每日2或3个剂量，每个剂量120-240mg天然干燥提取物。银杏成分和使用已在专利文献中进行报道(美国专利No．5，246，216，Bombardelli等，报道了作为抗感染药使用，特别是对卡氏肺囊虫，美国专利No．5，202，313，Bombardelli等，报道了白果内酯衍生物)。

6．3．组分分析

银杏成分的组分分析按照标准色谱技术进行。可参考大量的已公开的方法(例如，Kreuter等，1993，Planta Med．，59：A633；Piettta等，1992，J．Pharm & Biomed．Anal．，10：1077-1079；Huh和Staba，1992，色谱杂志(J．Chromatog．)600：364-369；Pietta等，1990，色谱学(Chromatographia)29：251-253；Lobstein-Guth等，1983，色谱杂志(J．Chromatog．)267：431-438；Kameyama和Urakami，1979，J．Am．OilChem．Soc．5：549-551)。

在对文献进行综合检索后选定银杏的化学标记物。检索结果表明多种生物活性成分可以用作标记物，包括萜烯内酯和黄酮糖甙。

6．3．1．组分

作为例子，但不仅限于此，应用HPLC对银杏组分进行检测。

将20克银杏提取物粉末用40ml去离子水溶解。加入几滴MeOH，以获得澄清溶液。装填入LiChroprep RP-18(40-60μm)的柱中(2．5×92cm，柱体积450ml)。预先装填柱子，用去离子水平衡。按顺序分批用水，水／甲醇混合液，最后用乙酸乙酯过柱。如表7所示的总共收集到28个组分。然后将组分蒸发，得到残渣的重量。每个组分的收集残渣重量在表7中列出。组分体积都是225mL，除了组分20和24位450mL，组分21和28为900mL，组分27为675mL。

表7：制备HPLC柱收集组分

洗脱剂	组分编号	残渣重量(mg)
洗脱剂	组分编号	残渣重量(mg)	100％H₂O	组分1	4.8
	组分2	2787.2	100％H₂O	组分1	4.8
	组分2	2787.2	2.5％MeOH	组分3	271.3
	组分4	58.4	2.5％MeOH	组分3	271.3
	组分4	58.4	5.0％MeOH	组分5	62.6
	组分6	77.7	5.0％MeOH	组分5	62.6
	组分6	77.7		组分7	59.4
	组分8	70.5		组分7	59.4
	组分8	70.5	10％MeOH	组分9	73.6
	组分10	148.8	10％MeOH	组分9	73.6
	组分10	148.8		组分11	101.7
	组分12	101.7		组分11	101.7
	组分12	101.7	25％MeOH	组分13	125.9
	组分14	595.4	25％MeOH	组分13	125.9
	组分14	595.4		组分15	1045.3
	组分16	670.7		组分15	1045.3
	组分16	670.7	50％MeOH	组分17	429.9
	组分18	5093.5	50％MeOH	组分17	429.9
	组分18	5093.5		组分19	2453.5
	组分20	1720.9		组分19	2453.5
	组分20	1720.9	75％MeOH	组分21	1252.8
	组分22	1518.5	75％MeOH	组分21	1252.8
	组分22	1518.5		组分23	312.8
100％MeOH	组分24	153.4		组分23	312.8
100％MeOH	组分24	153.4		组分25	152.1
	组分26	84.6		组分25	152.1
	组分26	84.6		组分27	107
100％EtOAC	组分28	241		组分27	107

对柱组分通过HPLC分析银杏萜烯内酯和黄酮糖甙。在样品组分2、3、10、13-24、和28中检测到萜烯内酯。HPLC条件包括在30℃下使用PhenomenexIB-SIL C-18柱(250×4．6mm)；RI检测器；MeOH∶H₂O∶DMSO(29∶69∶2)的恒溶剂。通过将组分2-28在甲醇盐酸中回流分析检测到黄酮糖甙。HPLC条件包括使用PhenomenexIB-SIL C-18柱(250×4．6mm)；设定在370nm的UV／VIS检测器；MeOH：0．5％磷酸(58∶42)的恒溶剂。

6．4．生物活性检测

银杏的组织水平作用包括膜稳定；氧和葡萄糖利用提高；血小板激活因子(PAF)抑制；脂类过氧化物酶；Na⁺K⁺ATP酶的激活；微循环和组织灌注提高；内皮衍生的松弛因子释放的刺激(Cott，精神药理学公报杂志(J．Psychopharmacology Bulletin)31：745-751，1995)。大量报告还表明人和动物的认知功能提高，说明银杏独有的急性给药改变EEG。

银杏提取物和银杏组分的生物活性可以应用多种检测进行分析，下面描述了其中的几种。

每个生物检测的值表示为在10^-4M浓度下的抑制百分比范围，除非另有说明。抑制百分比大于或等于20％，认为具有明显生物活性。对于提取物和组分的计算基于平均分子量为200的假定。

6．4．1．对血小板作用

近年来更加确定血小板在动脉粥样硬化形成中起到的作用。内皮损伤导致内皮下胶原暴露于循环的血细胞下，这样导致巨噬细胞和血小板在损伤部位发生堆积。在该过程中，血小板分泌多种化学物质，包括血管活性物质和血小板衍生的生长因子(PDGF)。该细胞增殖和平滑肌细胞迁移的结果导致了动脉粥样硬化损伤的增长。

一些研究人员已证明银杏提取物及其成分可抑制血小板凝集，他们的检测可能是有启发性的(Know和Lee，1995，Yakhak hoeji，39：337-345)。

血小板激活因子(PAF)的活性在哮喘、休克、局部缺血、过敏性反应、移植排斥、肾病、CNS疾病和许多炎症的病理学中非常重要。证明银杏苦内酯是天然的PAF拮抗剂，是银杏提取物的重要成分。

6．4．1．1．血小板凝集检测

简而言之，从新西兰种的白化病大鼠(重2．5-3．0kg，雄性或雌性)得到的静脉血，和十分之一体积的柠檬酸三钠(0．13M)混合，然后在室温、220X g下离心10分钟。得到的上清液为富含血小板的血浆(PRP)。通过200μM花生四烯酸钠在37℃下保温，进行非可逆聚集。通过光学凝集器(optical aggregometer)测定凝集。测试材料在30μM的浓度下和PRP保温5分钟。测定对血小板凝集的作用，报道为百分比抑制。文献参考的标准如下所列。检测基于Bertele等(1983，科学(Science)220：517-519)。

化合物 IC₅₀(μM)

阿司匹林(乙酰水杨酸) 12

BM13，505(Daltroban) 3．2

BW-755C 1．2

CGS12970 120

*吲哚美辛 0．28

NDGA 35

苯异妥英 2．6

保泰松 28

*表示使用的标准参照药物；BW-755C=3-氨基-1-[3-(三氟甲基)苯基]-2-二氢吡唑；CGS 12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸；NDGA=去甲二氢愈创木酸。

除了使用200μM花生四烯酸钠诱导血小板凝集，还使用5nM血小板激活因子acether(PAF-acether)(Nunez D．等，1986，欧洲药理学杂志(Eur．J．Pharmacol)123：197-205)。文献参考的标准如下所列。

化合物 IC₅₀(μM)

Nectandrin A(BN-52021) 3．3

CGS-12970 26

CV-3988 10

40

Kadsurenone(L-651108) 1．7

L-652731 0．83

L-659989 0．33

RP-48740 17

SRI-63441 1．7

WEB-2086 0．11

CGS-12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸；CV-3988=3-(4-羟基-7-甲氧基-10-氧-3，5，9-trixa-11-氮杂-4-磷杂二十九烷-1-基)-噻唑啉；L-652731=2R，5R-二(3，4，5-三甲氧基苯)。

还可以使用文献中描述的其它检测。Kieswetter等(1991，Int’l J．Clin．Pharm．，Ther．，& Toxicol．29：151-155)描述了评价血小板凝集的其它技术。血管扩张抑制作用的临床指示是静脉不足的另一种检测。它是通过研究冠状动脉片断对乙酰胆碱的收缩反应得出的(Bettini等，1991，Fitoterapia 62(1)：15-28)。

6．4．1．2．血小板凝集因子检测

该检测测定了银杏提取物和组分对[³H]-血小板激活因子(PAF)和PAF受体结合的作用。从雄性或雌性新西兰种的白化病大鼠(重2．5-3．0kg，)得到的血小板，在改性Tris-HCl pH 7．5缓冲液中应用标准技术制备。50μg的膜试样和0．4nM的[³H]-PAF在25℃下保温60分钟。在1μM PAF存在下，评价非特异性结合。在玻璃过滤器上收集标记的膜，洗涤三次，以除去未结合标记。用液体闪烁计数器计数过滤器，以测定[³H]-PAF特异性结合的量。化合物最初筛选浓度在10μM。文献化合物如下所列；商业可购买的银杏苦内酯A、B和C和白果内酯作为提取物和组分化合物的对照(见下)。

化合物 IC₅₀(nM) Ki(nM) nH

PAF 9 5．8 1．0

WEB-2086^* 110 71 0．8

*WEB-2086=3-(4-[2氯苯]-9-甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]-三唑-[3，3-a][1，4]-二氮杂-2-基)1-(4-吗啉基)-1-丙酮

银杏苦内酯是PAF-acether结合的竞争性抑制剂(Braquet，P．，前列腺素、血栓烷和白细胞三烯研究进展，16：179-198，1986)。

化合物 IC₅₀

银杏苦内酯A 9．4×10^-7M

银杏苦内酯B 2．5×10^-7M

银杏苦内酯C 1．7×10^-7M

6．4．2．GABA_A结合的生物检测

银杏结合物和组分的GABA_A结合活性检测可以应用本领域技术标准进行(Enna等，1977，大脑研究(Brain Research)，124：185-190；Falch等，1986，神经化学杂志(J．Neurochem．)47(3)：898-903)。该检测的参照文献化合物包括安定和蝇蕈醇(Sigma化学公司)。

通过实施例，但不限于此，进行GABA_A拮抗位点结合检测，简要描述如下。

使用从牛小脑膜来源的受体，最终浓度为5．0nM的[³H]-GABA(70-90 Ci／mmol)放射性配体，和GABA，反应在50mM的TRIS-HCl(pH 7．4)中、0-4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤，中止反应。测定过滤器上捕集的放射性，和对照值比较，以确定测试化合物和 GABA_A受体任何互相作用。

参照化合物 Ki(nM)

蝇蕈醇 4．4

异去甲槟榔次碱 9．5

GABA 23．1

TRIP 25．1

检测特性

K_D(结合亲和性)： 370nM

B_max(受体数量)：0．7pmol／mg蛋白质

还可以进行中心GABA_A苯并二氮卓受体检测，例如，如下所示。为了测定[³H]氟硝安定(New England Nuclear，产品目录no．NET 567)和中心GABA_A苯并二氮卓受体(GABA_A，BDZ，中心)的结合，从大鼠大脑皮层制备了部分纯化受体制品。最终放射性配体浓度为0．4 nM。使用每检测点100μg的部分纯化受体。使用3μM冷的安定(Sigma，产品目录no．D0899)测定非特异性结合。该物质、受体和配体在50mM的TRIS-HCl(pH 7．7)、1μM胃酶抑素、1μg／ml亮肽素和10μ／ml胰岛素抑制剂中、4℃下进行60分钟。通过应用Packard GF／B装置迅速过滤，中止反应。应用Packard Topcount装置通过液体闪烁计数测定特异性活性的量(Speth，R．C．等，1979，生命科学(Life Sci．)，24：351)。

化合物受体参数

氟硝安定 Kd=2．1nM

安定 IC₅₀=13 nM

6．4．3缓激肽生物检测

为了研究该物质对缓激肽与其受体(BK2)结合的抑制，从豚鼠回肠膜制备了部分纯化受体制品。检测中使用的放射性配体为最终浓度0．2nM的[³H]缓激肽。用1μM缓激肽TFA盐的内含物测定非特异性结合。检测反应在具有1mM 1，10-菲咯啉、0．1mM杆菌肽和0．1％BSA的25mM TES(pH 6．8)缓冲液中进行。反应在25℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速过滤样品，中止反应。通过液体闪烁计数测定特异性活性的量(Manning，D．J．，J．Pharmacol．Exp．Therap．43：504-512，1986)。

6．4．4免疫活性生物检测

6．4．4．1脂肪氧合酶生物检测

研究该物质潜在抗炎特性的检测可以包括酶5-脂肪氧合酶(5-LO)检测。5-LO催化花生四烯酸和5-羟基二十碳四烯酸(5-HETE)的氧化代谢，起始反应导致炎症原白细胞三烯形成。粗品酶可以从大鼠嗜碱性白血病细胞(RB-1)制备。该物质和粗品酶制品在25℃下保温5分钟。然后通过加入[¹⁴C]-花生四烯酸开始反应。8分钟后，通过加入柠檬酸中止反应。通过放射免疫检测法(RIA)测定放射标记的5-HETE量(Shimuzu，T．等，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．，81：689-693)。

还可以进行下列检测，以测定该物质对5-LO的抑制活性。5-LO酶从分化型HL60细胞部分纯化制得。测试物质和酶在室温下预保温5分钟，然后通过加入0．4μM花生四烯酸开始反应。在室温下保温8分钟后，通过加入柠檬酸中止反应。按照生产厂家说明书应用放射免疫检测法测定产生的5-HETE量(Coffey等，1992，生物化学杂志，267，570)。

化合物	EC₅₀
化合物	NDGA(去甲二氢愈创木酸)	0．02μM

6．4．4．2二聚类黄酮生物检测

二聚类黄酮(Biflavone)抑制体内某些炎症过程(R．Della loggia等，Planta Med 59S：588，1993)。对提取物进行体内测试，以测定抗炎活性。富含二聚类黄酮的组分显示剂量依赖性作用(见下表)。除了该反应，作者还报道了当剂量为200μg／耳部时，耳部炎症细胞减少62％。

组分的抗炎活性

物质剂量μg 动物数浮肿(mg)m±ES 浮肿抑制

对照 … 48 7．5±0．2 …

二聚类黄酮组分 50 13 6．4±0．4^* 15％

100 13 4．7±0．3^* 37％

200 48 2．0±0．2^* 73％

吲哚美辛 70 14 3．0±0．3^* 60％

*分析方差为p＜0．05

局部应用10mg／ml巴豆油，以诱导小鼠耳部炎症。测试化合物的给药或作为局部应用直接用于耳部，或通过强饲法口服给药。测试化合物给药30分钟后，耳部给药巴豆油(8％，在20μl丙酮中)。明显反应的标准为巴豆油给药后2小时耳部肿胀减少≥50％。文献测试化合物如下所列。

化合物 ED₅₀(mg／耳)

对乙酰氨基酚＞30

阿司匹林＞10

BM-13177 ＞10

地塞米松 3

氢化可的松 10

布洛芬 10

吲哚美辛 10

LY-171883 ＞10

NDGA ＞10

Phenidone 3

6．4．4．3环加氧酶-1生物检测

花生四烯酸通过酶环加氧酶-1或-2代谢为前列腺素。前列腺素的激素作用包括降低血压；刺激平滑肌收缩；炎症的调节；血液凝固和免疫反应。

环加氧酶-1(从公羊精囊制备)，每检测管125单位，和1mM GSH，1mM对苯二酚，1．25mM血红蛋白和测试化合物在25℃下预保温1分钟。然后通过加入花生四烯酸(100mM)开始反应。在37℃下保温20分钟后，通过加入三氯醋酸(TCA)中止反应。之后离心分离，加入硫代巴比土酸(thiobarbiturate)，通过在530 nm处吸收值，测定环加氧酶活性(Evans等，1987，Biochem．Pharamac． 36：2035-2037；Boopathy和balasubramanian，1988，生物化学杂志239：371-377)。

下列参照化合物用于抑制环加氧酶-1：

化合物 ED₅₀(μM)

阿司匹林 240

吲哚美辛 1．7

在初始浓度3×10^-4下筛选化合物和组分。如果在3×10^-4下观察到大于50％抑制，绘出全剂量反应曲线。

6．4．4．4白细胞三烯C₄合成酶生物检测

另一个炎症过程中涉及的酶是白细胞三烯C₄合成酶(LTC₄)，从大鼠嗜碱性白血病细胞(RB-1)制备部分纯化的酶制品。LTC₄的甲基酯和粗品酶制品在白蛋白和丝氨酸硼酸盐存在下、15℃保温25分钟。通过加入冰-冷甲醇中止反应。应用RIA读数方法，LTC₄的形成被认为是酶活性的指标(Bach等，生物化学药理学(Biochem．Pharmacol)，34：2695-2704，1985)。

6．4．4．5白细胞介素-6生物检测

该物质对白细胞介素-6(IL-6)与其受体结合的抑制活性，应用从U266人骨髓瘤细胞制备的部分纯化制品，进行测定。必要的检测涉及使用最终浓度为80pM的[¹²⁵I]IL-6。反应在22℃下进行24小时。在40nM IL-6存在下，测定非特异性结合(Lida，J．等，J．Exp．Med．，166：967-981，1987)。

6．4．4．5白细胞三烯B₄生物检测

相反，该物质对白细胞三烯B₄受体的抑制特性，应用从豚鼠脾膜制备的部分纯化的受体进行测定。放射性配体使用最终浓度为0．5nM的[³H]-白细胞三烯B₄。加入500nM白细胞三烯B₄，测定非特异性结合。检测反应在含有NaCl、MgCl₂、EDTA和杆菌素的磷酸盐缓冲液(pH 7．4)中、0℃下进行2小时。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应。通过液体闪烁计数测定结合放射性活性(Cardiner，P．J．等，欧洲药理学杂志(Eur．J．Pharmac．)182：291-299，1990)。

6．4．5．蛋白激酶C生物检测

在应用从小鼠大脑膜制备的酶的结合检测中，检测了蛋白激酶C。放射性配体使用最终浓度为4nM的[³H]-佛波酯二丁酸盐(PDBu)。为了测定非特异性结合，反应中使用1μM PDBu。检测反应在含有1％BSA和0．5nM CaCl₂的50nM Tris-HCl(pH 7．4)中进行。反应在37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速过滤样品，中止反应。通过液体闪烁计数测定特异性活性的量(Dunphy，W．G．等，癌症研究(Cancer Res．)40：3635-3641，1980)。

6．4．6．酪氨酸激酶生物检测

两种检测集中于该物质对两种酪氨酸激酶的抑制特性。第一种检测的酪氨酸激酶为外皮生长因子酪氨酸激酶(EGF TK)。基本上该检测涉及将编码人EGF受体(EGF TK)的细胞内酪氨酸激酶区cDNA，在Sf9昆虫细胞的杆状病毒表达系统中表达。通过使用固定合成多肽作为酶作用物，激酶检测测定了69 kD激酶区的活性。随后反应10分钟，通过和单克隆抗-磷酸酪氨酸抗体保温，测定磷酸化酪氨酸残渣。通过和维生素H-相关的抗小鼠IgG，随后和链酶抗生物素(streptavadin)相关的β-牛乳糖酶保温，定量结合抗-磷酸酪氨酸抗体。测定了荧光素-二-β-半乳糖苷转化为荧光素引起的荧光。通过加入苯乙基-β-硫代半乳糖苷(β-半乳糖苷酶的可逆性竞争抑制剂)，中止和荧光素-二-β-半乳糖苷的反应(Geissler等，1990，生物化学杂志(J．Biol．Chem．)，265：22255-22261)。

第一种检测的激酶为从牛胸腺部分纯化的p59^fyn酪氨酸激酶(FYNTK)。使用固定合成多肽作为酶作用物的荧光终点ELISA，用作酶作用物。该物质和／或载体与酶预保温15分钟。随后在100μM ATP存在下激酶反应10分钟，检测磷酸化酪氨酸残渣，作为用于EGF TK的描述(Appleby等，1992，细胞(Cell)70：751-763)。

6．4．7．谷氨酸受体生物检测

对于谷氨酸受体活性，进行了三种检测。在第一种检测中，研究了谷氨酸受体位点的拮抗(NMDA)。银杏提取物和组分对谷氨酸NMDA拮抗位点的结合检测，可以应用本领域标准技术进行(例如，Lehmann等，1988，J．Pharmac．Exp．Ther．246：65-75；Murphy等，1987，J．Pharmac．Exp．Ther．240：778-784)。这里，受体为从大鼠前脑制备的部分纯化材料。放射性配体为最终配体浓度2nM的[³H]-CGP 39653。应用1mMNMDA测定了非特异性结合。检测反应在50mM Tris-醋酸(pH 7．4)、0-4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应(Lehmann，J．等，J．Pharmac．Exp．Ther．，246：65-75，1988)。

在谷氨酸受体的第二种检测中，应用最终浓度5nM的[³H]-AMPA进行反应。应用100μM AMPA测定了非特异性结合。检测反应在10mMK₂HPO₄／100mM KSCN(pH 7．5)、0-4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应(Nurphy等，1987，神经化学研究(Neurochem．Res．)12：775-781)。

在谷氨酸受体的第三种检测中，应用从大鼠皮层膜制备的部分纯化受体，使用最终浓度为10nM的放射性配体[³H]-氨基乙酸。在1mM氨基乙酸存在下测定非特异性结合。检测反应在50mM HEPES(pH7．1)、4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应(Snell等，欧洲药理学杂志(Eur．J．Pharmacol．)53：370-375，1987)。

6．4．8．蝇蕈碱M₁结合生物检测

银杏提取物、组分和化合物对蝇蕈碱M₁结合检测，应用本领域标准技术进行(例如，Watson等，1983，生命科学(Life Sciences)32：3001-3011；Luthin和Wolfe，1984，Molec．Pharmac．26：164-169)。

通过实施例，但不是限制，按照下面简要描述进行蝇蕈碱M₁结合检测。

应用从牛纹状体膜制备的部分纯化受体，最终浓度为1．0nM的放射性配体[³H]-硝化甘油(70-87 Ci／mmol)和阿托品，在25mM HEPES(pH 7．4)、25℃下反应60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤，中止反应。测定过滤器上捕集到的放射性活性，和对照值相比较，以确定测试化合物和蝇蕈碱结合位点的任何相互作用。

参照化合物 Ki(nM)

阿托品 0．4

哌仑西平 4．5

替伦折平 64．5

检测特性

K_D(结合亲和性)：2．2 nM

B_max(受体数量)： 1．4pmol／mg蛋白质

6．4．9．钠通道生物检测

为了测定该物质对钠通道，位点2(钠通道)的活性，从大鼠前脑制备粗品受体制品，使用的放射性配体[³H]-蟾毒素最终浓度为2nM。在100nM乌头碱存在的条件下测定非特异性结合。检测反应在含有130mM胆碱氯化物的50mM HEPES(pH 7．4)中、37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤，中止反应，通过闪烁计数测定特异性活性(Creveling，C．R．分子药理学(Mol．Pharmacology)23：350-358，1983)。

6．4．10．单胺氧化酶生物检测

应用小鼠肝线粒体膜作为部分纯化的酶源，测定了MAO_A酶活性(MAO_A)的抑制。酶作用物为[¹⁴C]-5-羟色胺，应用1μM的Ro 41-1049，对非特异性活性进行了测定。反应包括酶作用物向[¹⁴C]-5-羟基吲哚乙醛+NH₄ ⁺的转化。简要地，酶和该物质、亚型特异性阻滞剂司来吉兰(300nM)在37℃、100mM KPO₄(pH 7．2)下预保温60分钟。加入酶作用物，再保温10分钟。通过加入0．5ml的2M柠檬酸中止反应。放射性产物用甲苯／乙酸乙酯氟提取，应用闪烁分光光度测定法和对照样品进行比较(Otsuka，S．和Kobayashi，Y．，1964，生物化学药理学(Biochem．Pharmacol．)13：995-1006)。

为了检测该物质对MAO_B抑制的生物活性，还使用大鼠肝线粒体膜作为部分纯化的酶源，测定了MAO_B酶活性(MAO_B)。酶作用物为[¹⁴C]-苯乙胺。在1μM的Ro 166491存在的条件下，对非特异性酶活性进行了测定。简要地，酶和亚型选择性阻滞剂氯吉灵(300nM)在37℃、100mM KPO₄(pH 7．2)下预保温60分钟。然后加入酶作用物，再保温7分钟。通过加入0．5ml的2 M柠檬酸中止反应。然后像检测MAO_A酶一样检测放射活性(Otsuka，S．和Kobayashi，Y．，1964，生物化学药理学(Biochem．Pharmacol．)13：995-1006)。

6．4．11．5-羟色胺受体结合生物检测

还评价了5-羟色胺受体结合的抑制。粗品受体制品从大鼠皮层膜制备。使用的放射性配体[³H]-麦角酰二乙胺最终浓度为5nM。检测反应在含有4mM CaCl₂、0．1mM巴吉林和0．1％抗坏血酸的50mM Tris-盐酸(pH 7．4)中、37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤，中止反应，通过液体闪烁计数测定特异性活性(Peroutka，S．J．和Snyder，S．H．分子药理学(Mol．Pharmacology)16：687-699，1979)。

6．4．12．促肾上腺皮质激素释放因子结合生物检测

银杏提取物和组分与促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)结合检测，可以应用本领域标准技术进行(De Souza，1987，神经科学(Neuroscience)7：88-100；De Souza，1985，神经科学(Neuroscience)5：3189-3203)。

通过实施例，但不是限制，按照下面简要描述进行CRF结合检测。

使用来源于大鼠皮层膜的受体，最终配体浓度为0．1nM的放射性配体[¹²⁵I]-Tyr-OCRF(2200 Ci／mmol)，和Tyr⁰-OCRF(促肾上腺皮质激素释放因子，Tyr⁰-绵羊)，在含有10mM MgCl₂、2mM EGTA和0．3％BSA和0．12 TIU／ml抑肽酶的50mM HEPES中、25℃下进行反应120分钟。通过检测管在Sorvall离心机中4℃下离心15分钟，中止反应。重复洗涤后，收集得到的小球，置于管中，应用γ光谱测定法评价组织小球中捕集到的放射性活性。

参照化合物 Ki(nM)

OCRF 2．3

Tyr⁰-OCRF 4．1

α-螺旋状OCRF(_9-41) 41．1

检测特性

K_D(结合亲和性)： 4．5 nM

B_max(受体数量)： 243 pmol／mg蛋白质

6．4．13．组胺H₂受体生物检测

为了测定该物质对组胺H₂(H2)受体的抑制活性，从豚鼠纹状体膜制备粗品受体制品。使用的放射性配体[³H]-tiotdine最终浓度为4nM，在10nM西米替丁存在的条件下测定非特异性结合。检测反应在50mM NaKPO₄缓冲液(pH 7．4)中25℃下进行20分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应(Martinez-Mur，1990，大脑研究(Brain Res．)，526：322-327)。

6．4．14．烟碱受体生物检测

应用从大鼠皮层膜部分纯化的受体，对神经元烟碱受体进行检测。使用的放射性配体为最终浓度为5nM的[³H]N-甲基氨基甲酰胆碱碘化物。在1μM烟碱硫酸盐存在下测定非特异性结合。检测反应在含有120mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、1mM MgCl₂、和3μM阿托品硫酸盐的50mM Tris-盐酸(pH 7．4)中、4℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应(Boska和Quirion，1987，欧洲药理学杂志(Eur．J．Pharmacology)139：323-333)。

6．4．15．阿片受体生物检测

为了测定该物质对阿片受体的抑制活性，受体从大鼠前脑部分纯化。使用的配体为1nM的[³H]-纳洛酮，但在1μM纳洛酮存在下测定非特异性结合。检测在50mM Tris-盐酸(pH 7．4)、25℃下进行90分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应(Pert，C．和Snyde，S．H．，1974，分子药理学(Mol．Pharmacology)19：868-879)。

6．4．1 6．多巴胺摄取生物检测

为了测定该物质对多巴胺受体(dp)的抑制活性，进行了下列检测。应用[³H]-螺环哌啶苯作为配体(最终浓度为0．3nM)，从牛纹状体膜制备部分纯化的受体。为了测定非特异性结合，用1μM的冷螺环哌啶苯进行测定。反应在含有120mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂和1mM MgCl₂的50mM Tris-盐酸(pH 7．7)、37℃下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应(Leysen等，1978，生物化学药理学(Biochem．Pharmacol．)27：307-316)。

6．4．17．血管紧缩素Ⅱ生物检测

表明该物质活性的其它生物检测有血管紧张素Ⅱ，2型，中心(AT₂)。从牛小脑膜制备部分纯化的受体。作为放射性配体的[¹²⁵I]-tyr⁴-血管紧张素Ⅱ的最终浓度为0．1nM。在50nM人血管紧张素Ⅱ存在的条件下，对非特异性结合进行了测定。检测反应在含有NaCl、EDTA和BSA的磷酸盐缓冲液(pH 7．4)中进行，在37℃下反应60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤反应混合物，中止反应，通过γ计数测定特异性活性(Bennett和Synder，1976，生物化学杂志(J．Bio．Chem．)251：7423-7430)。

6．4．18．过氧化物歧化酶的抑制的生物检测

在体内已观察到银杏提取物对抗几种自由基的抗氧化特性。应用不含萜烃的类黄酮组分或不含类黄酮的萜烃组分，对该作用的机理进行研究。

在最近N．Haramaki等的文章中(1996，抗氧化剂健康疾病(Antioxidant Health Disease)3：487-510)，讨论了EGb 761(24％的类黄酮和6％的类萜烯)抗氧化特性。该提取物抑制黄嘌呤氧化酶活性，以剂量依赖型，并具有最大抑制(70％-80％)。因为黄嘌呤氧化酶是重要的过氧化物源，对该酶的抑制可以归结于EGb 761的抗氧化特性。

为了检测化合物的活性，从Sigma化学公司购买酶过氧化物歧化酶和黄嘌呤氧化酶。反应在含有0．3mM黄嘌呤、0．6mM EDTA、1％牛血清白蛋白、150μM氮兰四唑、0．06U黄嘌呤氧化酶、400mM Na₂CO₃(pH 10．2)和定量的SOD或测试化合物的混合物中进行。通过加入黄嘌呤氧化酶开始酶反应，在25℃下进行20分钟。通过550nm处吸收的读数，测定甲_的生成。然后计算该反应的SOD或测试化合物的百分比抑制。测试化合物的最初筛选在10μM的浓度下(Sun，Y等，临床化学(Clin．Chem．)34：497-500，1988)。SOD的IC₅₀为2．1nM。提取物及其组分的参照化合物为银杏苦内酯A、B和C和白果内酯(Sigma化学公司)。

6．4．19．抗癌检测

有许多标准的生物检测可以评价银杏的抗癌活性。这些检测可以涉及使用整个动物或癌细胞系。Itokawa等(1987，化学药学公报(Chem．Pharm．Bull．)35：3016-3020)描述了银杏细胞培养物中分离的漆树酸、白果酚和腰果酚的抗肿瘤作用。

优选的生物检测将涉及标准增殖检测，应用癌细胞系(例如，MCF-7[乳腺癌]、HeLa[宫颈癌]、SCC-25[鳞状细胞癌]、NCI-H446[肺癌]、HL-60[急性早幼粒细胞白血病]、Hep G2[肝细胞瘤]、COLO 320 DM[结肠癌系])和该物质或溶剂对照培养最多10天。在实验结束时，测定细胞数或菌落形成。该化合物的细胞数和对照进行比较，以测定该物质的IC₅₀。

6．4．20．生物活性检测结果

通过实验，检测了银杏的几种生物活性。结果如下表8所示。

表8：生物检测数据

检测	提取物		参照化合物
检测	提取物		参照化合物					GB300	GB301	银杏苦内酯A	银杏苦内酯B	银杏苦内酯C	白果内酯
[³H]和PAF受体结合的％抑制	-	-	69	85	57.5	-		GB300	GB301	银杏苦内酯A	银杏苦内酯B	银杏苦内酯C	白果内酯
[³H]和PAF受体结合的％抑制	-	-	69	85	57.5	-	GABA_A的％抑制	?/30	73/73	-	-	-	-
缓激肽β₂(10^-5M)	22	-	-	-	-	-	GABA_A的％抑制	?/30	73/73	-	-	-	-
缓激肽β₂(10^-5M)	22	-	-	-	-	-	5-脂肪氧合酶@3μM的％抑制	51	70	-	28	28	28
环加氧酶-1@300μM的％抑制	28	-	-	-	-	-	5-脂肪氧合酶@3μM的％抑制	51	70	-	28	28	28
环加氧酶-1@300μM的％抑制	28	-	-	-	-	-	激酶蛋白C(非选择性)	22	-	-	-	-	-
白细胞三烯C₄合成酶(@1000μM)	71.5	79	26	29	31	28	激酶蛋白C(非选择性)	22	-	-	-	-	-
白细胞三烯C₄合成酶(@1000μM)	71.5	79	26	29	31	28	EGF酪胺酸激活酶	-	28	-	-	-	-
p59^ryn酪胺酸激活酶	-	48	-	-	-	-	EGF酪胺酸激活酶	-	28	-	-	-	-
p59^ryn酪胺酸激活酶	-	48	-	-	-	-	白细胞介素6结合的％抑制	-	-	-	20	-	-
白细胞三烯β₄结合的％抑制	-	-	-	-	21	-	白细胞介素6结合的％抑制	-	-	-	20	-	-
白细胞三烯β₄结合的％抑制	-	-	-	-	21	-	谷氨酸AMPA@10^-4M的％抑制	-	+	23	-	-	-
毒蕈碱M₁@10^-4M的％抑制	-	-	21	-	-	-	谷氨酸AMPA@10^-4M的％抑制	-	+	23	-	-	-
毒蕈碱M₁@10^-4M的％抑制	-	-	21	-	-	-	Na⁺，位点2的％抑制	+	TBD	32	-	-	-
单胺氧化酶A,MAO_A@10^-4M的％抑制	45	-	-	-	-	-	Na⁺，位点2的％抑制	+	TBD	32	-	-	-
单胺氧化酶A,MAO_A@10^-4M的％抑制	45	-	-	-	-	-	单胺氧化酶B,MAO_B@10^-4M的％抑制	-	-	35	-	-	-
5-羟色胺摄取，@10^-4M的％抑制	22	-	-	-	-	-	单胺氧化酶B,MAO_B@10^-4M的％抑制	-	-	35	-	-	-
5-羟色胺摄取，@10^-4M的％抑制	22	-	-	-	-	-	促肾上腺皮质激素释放因子@10^-4M的％抑制	51	70	-	-	-	21
组胺H₂@10^-4M的％抑制	28	-	-	-	-	-	促肾上腺皮质激素释放因子@10^-4M的％抑制	51	70	-	-	-	21
组胺H₂@10^-4M的％抑制	28	-	-	-	-	-	烟碱神经元位点@10^-4M的％抑制	22	-	-	-	-	-
阿片受体，非特异性@10^-4M的％抑制	-	28	-	-	-	-	烟碱神经元位点@10^-4M的％抑制	22	-	-	-	-	-
阿片受体，非特异性@10^-4M的％抑制	-	28	-	-	-	-	多巴胺摄取@10^-4M的％抑制	-	33	-	-	-	-
血管紧张素Ⅱ，2型，中心@10^-4M的％抑制	+	-	-	-	-	-	多巴胺摄取@10^-4M的％抑制	-	33	-	-	-	-
血管紧张素Ⅱ，2型，中心@10^-4M的％抑制	+	-	-	-	-	-	谷氨酸NMDA拮抗位点@10^-4M的％抑制	-	24	-	-	-	-
谷氨酸，氨基乙酸@10^-4M的％抑制	-	27	TBD	TBD	TBD	TBD	谷氨酸NMDA拮抗位点@10^-4M的％抑制	-	24	-	-	-	-

+表示数量不能准确测定的正结果。

6．4．20．1．PAF检测

例如，但不是限制，PAF活性是在暴露于银杏提取物和组分后进行的。对两种提取物、27种组分和4种参照标准物进行了生物检测，以测定PAF和其受体的拮抗的程度(表9)。提取物(GB300和GB301)为商业购买的干燥银杏提取物。组分2-28如上6．3．1．部分所描述的那样获得。纯的银杏苦内酯和白果内酯可从商业或美国主要药学院校获得。实施例PAF实验的结果如下表9所示。

表13：实施例PAF生物检测结果

提取物	[³H]和PAF受体结合的％抑制
提取物	[³H]和PAF受体结合的％抑制	GB300	-
GB301	-	GB300	-
GB301	-	组分	[³H]和PAF受体结合的％抑制
组分2	-	组分	[³H]和PAF受体结合的％抑制
组分2	-	组分3	-
组分4	-	组分3	-
组分4	-	组分5	-
组分6	-	组分5	-
组分6	-	组分7	-
组分8	-	组分7	-
组分8	-	组分9	-
组分10	-	组分9	-
组分10	-	组分11	-
组分12	-	组分11	-
组分12	-	组分13	-
组分14	-	组分13	-
组分14	-	组分15	-
组分16	-	组分15	-
组分16	-	组分17	92
组分18	95.5	组分17	92
组分18	95.5	组分19	91.5
组分20	89.9	组分19	91.5
组分20	89.9	组分21	91.8
组分22	79	组分21	91.8
组分22	79	组分23	110
组分24	104.3	组分23	110
组分24	104.3	组分25	93.3
组分26	80.4	组分25	93.3
组分26	80.4	组分27	99.1
组分28	101.6	组分27	99.1
组分28	101.6	参照化合物	[³H]和PAF受体结合的％抑制
银杏苦内酯AG-4028	69	参照化合物	[³H]和PAF受体结合的％抑制
银杏苦内酯AG-4028	69	银杏苦内酯BG-6910	85
银杏苦内酯CG-8888	57.5	银杏苦内酯BG-6910	85
银杏苦内酯CG-8888	57.5	白果内酯G-9999	-

表明没有生物活性的提取物由于许多不同情况可能得到具有生物活性的组分。第一，分馏当除去非活性成分后，生物活性的浓度增加。第二，组分可以除去干扰物质，其可以是通过和配体络合阻滞活性位点活性结合，或直接和活性位点竞争性附着。第三，化学组成可能在分馏中改变。例如，在大蒜中，蒜氨酸可以转化为蒜素。另外，提取物或油的溶解度可能妨碍获得足够高浓度的提取物。

6．4．20．2．其它检测

进一步通过实施例，不是限制，对指示生物检测的活性进行测定，如下表10所示。

表10：

样品	GABA,BDZ中心结合检测(IC₅₀mg/ml)	样品	GABA_A结合检测(IC₅₀mg/ml)	5-脂肪氧合酶(EC₅₀mg/ml)	白细胞三烯C₄合成酶(EC₅₀mM)	MAO_A(IC₅₀mg/ml)
样品	GABA,BDZ中心结合检测(IC₅₀mg/ml)	样品	GABA_A结合检测(IC₅₀mg/ml)	5-脂肪氧合酶(EC₅₀mg/ml)	白细胞三烯C₄合成酶(EC₅₀mM)	MAO_A(IC₅₀mg/ml)	GB300	0.019	GB300	0.077	0.003mM	0.3	45％@0.1mM
GB301	0.031	GB301	0.052	0.000235	0.365	NA@0.1mM	GB300	0.019	GB300	0.077	0.003mM	0.3	45％@0.1mM
GB301	0.031	GB301	0.052	0.000235	0.365	NA@0.1mM	样品	GABA,BDZ中心(％抑制@0.1mM)	样品	GABAA(％抑制@0.1mM)	5-脂肪氧合酶(％抑制@0.1mM)	白细胞三烯C₄合成酶(EC₅₀mM)	MAO_A(IC₅₀mg/ml)
半制备HPLC组分＃1	NA	1％甲醇	32±23	37±18	NA	NT	样品	GABA,BDZ中心(％抑制@0.1mM)	样品	GABAA(％抑制@0.1mM)	5-脂肪氧合酶(％抑制@0.1mM)	白细胞三烯C₄合成酶(EC₅₀mM)	MAO_A(IC₅₀mg/ml)
半制备HPLC组分＃1	NA	1％甲醇	32±23	37±18	NA	NT	半制备HPLC组分＃2	NA	2.5％甲醇	39±21	NA	NA	NT
半制备HPLC组分＃3	NA	5％甲醇	29.5±26	NA	NA	NT	半制备HPLC组分＃2	NA	2.5％甲醇	39±21	NA	NA	NT
半制备HPLC组分＃3	NA	5％甲醇	29.5±26	NA	NA	NT	半制备HPLC组分＃4	NA	10％甲醇	NA	61.5±27.6	NA	NT
半制备HPLC组分＃5	93	30％甲醇	38±12.7	26.5±16.3	43.5±7.8％@1mM	NT	半制备HPLC组分＃4	NA	10％甲醇	NA	61.5±27.6	NA	NT
半制备HPLC组分＃5	93	30％甲醇	38±12.7	26.5±16.3	43.5±7.8％@1mM	NT	半制备HPLC组分＃6	22	60％甲醇	NA	79.5±9.2	EC₅₀=0.671±0.95	NT
半制备HPLC组分＃7	NA	80％甲醇	NA	95±2.8	EC₅₀=0.536±0.153	NT	半制备HPLC组分＃6	22	60％甲醇	NA	79.5±9.2	EC₅₀=0.671±0.95	NT

半制备HPLC组分躬	57	90％甲醇	46.7±20.6	90.5±12	EC₅₀=0.252±0.049	NT
半制备HPLC组分躬	57	90％甲醇	46.7±20.6	90.5±12	EC₅₀=0.252±0.049	NT	90％甲醇	91	100％甲醇	41	79	EC₅₀=0.258	NT
100％丙酮	NT	100％丙酮	62	77	EC₅₀=0.268	NT	90％甲醇	91	100％甲醇	41	79	EC₅₀=0.258	NT
100％丙酮	NT	100％丙酮	62	77	EC₅₀=0.268	NT	参照	GABA,BDZ中心(IC₅₀mM)	参照	GABA_A(IC₅₀mM)	5-脂肪氧合酶(EC₅₀mM)	白细胞三烯C₄合成酶(EC₅₀mM)	MAO_A(IC₅₀mM)
穗花杉双黄酮	0.0000079	穗花杉双黄酮	84％@0.1mM	0.00066	0.04	NA	参照	GABA,BDZ中心(IC₅₀mM)	参照	GABA_A(IC₅₀mM)	5-脂肪氧合酶(EC₅₀mM)	白细胞三烯C₄合成酶(EC₅₀mM)	MAO_A(IC₅₀mM)
穗花杉双黄酮	0.0000079	穗花杉双黄酮	84％@0.1mM	0.00066	0.04	NA	白果内酯	46％@0.1mM	白果内酯	NA	28％@0.03mM	NA	NA
GABA	NA	GABA	0.000080	NT	NT	NA	白果内酯	46％@0.1mM	白果内酯	NA	28％@0.03mM	NA	NA
GABA	NA	GABA	0.000080	NT	NT	NA	银杏苦内酯A	NA	银杏苦内酯A	NA	NA	NA	NA
银杏苦内酯B	39％@0.1mM	银杏苦内酯B	NA	28％@0.03mM	29％@1mM	NA	银杏苦内酯A	NA	银杏苦内酯A	NA	NA	NA	NA
银杏苦内酯B	39％@0.1mM	银杏苦内酯B	NA	28％@0.03mM	29％@1mM	NA	银杏苦内酯C	NA	银杏苦内酯C	NA	NT	NT	NA
桧黄素	0.008	桧黄素	NT	0.000833	40％@0.1mM	NT	银杏苦内酯C	NA	银杏苦内酯C	NA	NT	NT	NA
桧黄素	0.008	桧黄素	NT	0.000833	40％@0.1mM	NT	异鼠李黄素	0.101	异鼠李黄素	NT	0.00004	NA	NT
4’,5,7-三羟黄酮醇	0.101	4’,5,7-三羟黄酮醇	NT	0.000061	34％@0.1mM	0.0017	异鼠李黄素	0.101	异鼠李黄素	NT	0.00004	NA	NT
4’,5,7-三羟黄酮醇	0.101	4’,5,7-三羟黄酮醇	NT	0.000061	34％@0.1mM	0.0017	脯氨酸	26％@0.1mM	脯氨酸	0.054±0.015	NT	NT	NA
栎精	0.076	栎精	0.024	0.00008	0.104	0.016	脯氨酸	26％@0.1mM	脯氨酸	0.054±0.015	NT	NT	NA
栎精	0.076	栎精	0.024	0.00008	0.104	0.016	假定分子量为200。NT表示未测试。			NA表示无活性(即在报道测试浓度下抑制小于20％)

6．5．化学检测应用GC-MS和HPLC对银杏进行化学检测。主要成分为黄酮醇和黄酮(主要为栎精和4’，5，7-三羟黄酮醇)、糖甙、白果内酯(倍半萜烯)、异银杏黄素、银杏苦内酯A、B、C、M & J(双萜内酯衍生物)、6-羟基犬尿喹啉酸、莽草酸、原儿茶酸、香草酸、对羟基苯甲酸、前花色素(proanthrocyanidins)、阿福豆苷、生物类黄酮、sciopitysin、银杏黄素、白果黄素和银杏酚酸。

为了评价银杏中几种生物活性化合物的浓度，按上面描述检测了六种商业获得的产品。测试的结果如下表11和图＃4所示。表11：银杏产品比较

	类萜烯内酯	黄酮糖甙	总共
	类萜烯内酯	黄酮糖甙	总共	产品A	0.503mg/g	2.147mg/g	2.65mg/g
产品B	1.975mg/g	3.913mg/g	5.888mg/g	产品A	0.503mg/g	2.147mg/g	2.65mg/g
产品B	1.975mg/g	3.913mg/g	5.888mg/g	产品C	0.318mg/g	0.33mg/g	0.648mg/g
产品D	1.66mg/g	3.668mg/g	5.328mg/g	产品C	0.318mg/g	0.33mg/g	0.648mg/g
产品D	1.66mg/g	3.668mg/g	5.328mg/g	产品E	2.646mg/g	1.541mg/g	4.187mg/g
产品F	2.286mg/g	3.117mg/g	5.403mg/g	产品E	2.646mg/g	1.541mg/g	4.187mg/g

通过实例，应用商业获得的银杏提取物和上面描述的方法，测定了银杏几种生物活性成分的浓度。这些成分的水平如下表12所示。

银杏苦内酯A(％W／W)	银杏苦内酯B(％W／W)	银杏苦内酯C(％W／W)	白果内酯(％W／W)
银杏苦内酯A(％W／W)	4．34	1．89	1．57	9

本文中描述和要求的本发明不只限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案只是想作为本发明几个方面的举例说明。任何等同的实施方案应在本发明的范围内。实际上，除了本文展示和描述的修改之外，本领域技术人员还可以从上文描述明显地得出许多修改。这些修改也应落在后面的权利要求范围内。在本申请中，在括号中引用了许多出版物和专利。它们的内容在这里引用作为本申请的参考。

Claims

1．一种用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括以下步骤：

将含有多种成分的具有生物活性的银杏材料的有代表性部分分成多个标记组分，其中至少一种标记组分中含有至少一种活性成分；

测定至少一种标记组分的生物活性，以提供有代表性部分的生物活性指纹；和

将有代表性部分的生物活性指纹和已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

2．权利要求1的方法，其中至少一种标记组分含有至少一种活性成分。

3．权利要求1的方法，还包括以下步骤：

测定至少一种标记组分中活性成分的量，以提供有代表性部分的定量组成指纹；和

将有代表性部分的定量组成指纹和已建立的药用级银杏的定量组成指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

4．权利要求1的方法，还包括以下步骤：

测定银杏材料中有代表性部分的总体生物活性；和

将有代表性部分的总体生物活性和总体生物活性标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

5．权利要求1的方法，其中银杏材料为醇提取物。

6．权利要求1的方法，其中银杏材料为水或有机提取物。

7．权利要求1的方法，其中银杏材料为超临界二氧化碳提取物。

8．权利要求1的方法，其中银杏材料为油。

9．权利要求1的方法，其中银杏材料为粉末状植物药材。

10．权利要求1的方法，其中银杏材料为均一的材料。

11．权利要求1的方法，其中银杏材料为植物药材的混合物。

12．权利要求1的方法，其中至少一种活性成分为内酯。

13．权利要求12的方法，其中内酯为银杏苦内酯。

14．权利要求13的方法，其中银杏苦内酯为银杏苦内酯A。

15．权利要求13的方法，其中银杏苦内酯为银杏苦内酯B。

16．权利要求13的方法，其中银杏苦内酯为银杏苦内酯C。

17．权利要求12的方法，其中内酯为白果内酯。

18．权利要求1的方法，其中生物活性是用于治疗或改善心血管疾病的使用指标。

19．权利要求1的方法，其中生物活性是用于治疗或改善精神疾病的使用指标。

20．一种用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括以下步骤：

提供含有多种具有生物活性的成分的银杏材料，其中至少一种成分具有标准化的生物活性谱；

将银杏材料中有代表性的部分分成多个标记组分，其中至少一种标记组分中含有至少一种活性成分；

测定至少一种标记组分中至少一种活性成分的量；

根据存在的至少一种活性成分的量和标准化的生物活性谱，计算至少一种标记组分的生物活性，以提供有代表性部分的计算生物活性指纹；和

将有代表性部分的计算生物活性指纹和已建立的药用级银杏的生物活性指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

21．权利要求20的方法，其中该方法还包括其它步骤：

测定银杏材料中有代表性部分的总体生物活性；和

22．权利要求20的方法，其中银杏材料为水或有机提取物。

23．权利要求20的方法，其中银杏材料为粉末状植物药材。

24．权利要求20的方法，其中银杏材料为均一的材料。

25．权利要求20的方法，其中银杏材料为植物药材的混合物。

26．权利要求20的方法，其中至少一种活性成分为内酯。

27．权利要求20的方法，其中至少一种活性成分为银杏苦内酯。

28．权利要求20的方法，其中至少一种活性成分为白果内酯。

29．权利要求20的方法，其中生物活性是用于治疗或改善心血管疾病的使用指标。

30．权利要求20的方法，其中生物活性是用于治疗或改善精神疾病的使用指标。

31．权利要求1、4、20或21的方法，其中至少一种标记组分含有一组相关成分。

32．一种用于用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括：

提供具有生物活性的银杏材料，其中银杏材料含有多种成分；

将银杏材料中有代表性部分分成多个标记组分，其中至少一种标记组分中含有至少一种活性成分；

33．权利要求32的方法，其中至少一种活性成分为内酯。

34．一种用于用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括：

应用选自GABA_A检测，GABA苯并二氮卓中心检测，白细胞三烯C4合成酶检测，5-脂肪氧合酶检测和单胺氧化酶A检测的生物检测测定银杏材料有代表性部分的总体生物活性；和

35．一种用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括：

将含有多种成分的银杏材料中有代表性部分分成多个标记组分，其中至少一种标记组分中含有至少一种活性成分；

将有代表性部分的定量组成指纹和和已建立的药用级银杏的定量组成指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

36．一种用于用于测定银杏材料是否为药用级银杏的方法，该方法包括：

测定银杏材料有代表性部分的总体生物活性；和

将有代表性部分的总体生物活性和总体生物活性指纹标准相比较，以确定该银杏材料是否为药用级银杏。

37．一种按照权利要求1、20、32、34、35或36的方法确定的药用级银杏。

38．一种按照权利要求1的方法确定的药用级银杏，其中至少一种标记组分含有一组相关成分。

39．按照权利要求1的方法确定的药用级银杏，其中至少一种标记组分含有至少两种活性成分。

40．权利要求1、2、3或4的方法，其中所说的多种成分含有至少一种选自下组的成分：包括穗花杉双黄酮、漆树酸、白果内酯、γ-氨基丁酸、银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、桧黄素、异鼠李黄素、4’，5，7-三羟黄酮醇、脯氨酸、和栎精。

41．权利要求1、2、3或4的方法，其中至少一种标记组分含有至少一种选自下组的活性成分：包括穗花杉双黄酮、漆树酸、白果内酯、γ-氨基丁酸、银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、桧黄素、异鼠李黄素、4’，5，7-三羟黄酮醇、脯氨酸、和栎精。