CN112305133B - 一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,属于中药有效成分的分析检测技术领域。所述检测方法通过分别制备供试品溶液、对照品溶液,然后取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪,以乙腈‑0.2%甲酸水溶液为流动相,进行脱洗。本方法操作简便、稳定性高、重复性好、专属性强,并具有供试品制备简单、设备要求较低、实验操作安全、稳定性高、重复性好、专属性强以及操作简便等优势,为后续天葵子中唐松草酚定的定性、定量的研究等提供产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材中有效成分含量的测定方法,尤其涉及一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,属于中药有效成分的分析检测技术领域。
背景技术
天葵子,为毛萇科植物天葵的干燥块根。夏初采挖,洗净,干燥,除去须根,能清热解毒,消肿散结。用于痈肿疔疮,乳痈,凜病,蛇虫咬伤。文献“天葵子化学成分和抗肿瘤活性的初步研究,关频等,2011”文献中提到:天葵子生物碱中的季铵碱可能是抗肿瘤活性成分;文献“天葵子总生物碱对小鼠 S180 实体瘤的抑制作用及对肿瘤炎性微环境干预作用研究,孙健等,2020”中提到:天葵子总生物碱可以抑制肿瘤生长,并且对小鼠胸腺及脾脏的影响较小,并进一步的体外实验表明,天葵子总生物碱可以调控肿瘤微环境中多种肿瘤相关炎性因子的表达;文献“一种含天葵子的预防肿瘤的中药粉剂,CN107308237A”中公开:含有蜂王浆、天葵子、白花蛇舌草、半枝莲、石上柏的中药粉剂具有预防肿瘤的作用。此外,现代药理研究表明天葵子适用于肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肠癌、肾癌、前列腺癌及恶性淋巴肿瘤。
唐松草酚定为季铵型生物碱,由此可见天葵子中唐松草酚定可能具有抗肿瘤的作用,因此,对唐松草酚定的研究同样意义重大。
2015版《中国药典》中天葵子项下均未涉及唐松草酚定,且目前也未有论文、专利等文献公开过关于天葵子中唐松草酚定的含量测定方法。文献“中药天葵子化学成分研究(Ⅱ),蓝华英,2006”中,主要公开:天葵子药材的化学成分分析,以及鉴定出天葵子中含有唐松草酚定的有效成分等。
发明内容
本发明旨在解决现有技术问题,而提出了一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法。在本技术方案中,通过有机溶剂提取有效成分作为供试品溶液,与对照品溶液一并进入高效液相色谱仪中进行测定,可实现天葵子中唐松草酚定的定性和定量检测(检测限可达到0.44μg/mL),为后续天葵子中唐松草酚定的定性、定量的研究,以及为产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法;且本方法提供的方法操作简便、稳定性高、重复性好及专属性强。
为了实现上述技术目的,提出如下的技术方案:
一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,包括如下步骤:
A.对照品溶液的制备:取对照品唐松草酚定,加甲醇溶解,按浓度呈梯度分布配制对照品溶液;
B.供试品溶液的制备:取天葵子粉末5~10g,加入95%乙醇100~150mL溶解,电热套加热回流3~4h,放冷后离心(离心转速为2000~3000rpm);取上清液浓缩至干,残渣加水30~50mL超声分散,用等体积乙酸乙酯萃取2~4次,弃去乙酸乙酯相,水相用等体积正丁醇萃取2~4次,合并正丁醇相,浓缩至干,残渣加甲醇溶解并定容至5~10mL容量瓶中,为供试品溶液;
C.标准曲线的绘制:取所得对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中进行测定,记录对应的色谱图和峰面积;
以对照品溶液的浓度为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,计算得线性回归方程;
D.结果计算:取所得供试品溶液,注入高效液相色谱仪中进行测定,将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中,即得供试品天葵子中唐松草酚定的含量;
高效液相色谱仪内色谱条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm;
色谱柱柱温:20~40℃;
检测器:UV-PDA检测器;
流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸水溶液为流动相B;
流动相流速:0.8~1.2mL/min;
进样量:2~20μL;
检测波长:345nm;
流动相按下表进行梯度洗脱,具体为:
优选的,在步骤A的对照品溶液中,唐松草酚定浓度为0.0552~0.552mg/mL,对照品溶液的浓度与对应色谱图中唐松草酚定色谱峰的峰面积具有良好的线性关系。
优选的,在步骤A中,所述对照品溶液为五份,浓度分别为:0.0552mg/mL、0.138mg/mL、0.276mg/mL、0.414mg/mL及0.552mg/mL。该五份对照品溶液浓度的设置,提供的方法具有较高的准确性。
优选的,所述方法的检测限可达到0.44μg/mL。
采用本技术方案,带来的有益技术效果为:
1)在本发明中,通过有机溶剂提取有效成分作为供试品溶液,用天葵子药材中唐松草酚定进行定位,将供试品溶液与对照品溶液一并进入高效液相色谱仪中进行测定,可实现天葵子中唐松草酚定的定性和定量检测,为后续天葵子中唐松草酚定的定性、定量的研究,以及为产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法;且本方法操作简便、稳定性高、重复性好及专属性强,RSD值均符合要求,实际检测效果良好;
2)本发明实用性强,在实际检测过程中,其检测限可达0.44μg/mL,可以判断药材质量的优劣,检测过程简单、快捷;
3)本发明弥补了现有技术中关于天葵子中唐松草酚定含量测定的空白,比如:现有技术(论文 “中药天葵子化学成分研究(Ⅱ),蓝华英,2006”)仅对天葵子药材的化学成分分析,以及鉴定天葵子中含有唐松草酚定的有效成分等,而本发明针对天葵子中唐松草酚定的含量测定提供检测方法,为对应的其他研究奠定了基础。
附图说明
图1为本发明中唐松草酚定对照品溶液的标准曲线及回归方程;
图2为本发明采用三批次天葵子药材与浓度为0.0567mg/mL唐松草酚定对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中,所涉及的仪器包括:
高效液相色谱仪:Waters2695-996 HPLC、Agilent 1100软件,
电子天平:XS205DΜ(METTLER TOLEDO),
超纯水机:WP-Z-UV(四川沃特尔水处理设备有限公司),
超声波清洗器:BK-360B(济南巴克超声波科技有限公司),
加热套:MH-1000(北京科伟永兴仪器有限公司),
离心机:TD6M(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);
在以下实施例中,所涉及的试剂包括:
乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、水(超纯水),其余试剂均为分析纯;
在以下实施例中,所涉及的供试品包括:
天葵子药材批号:WN202010182-01、WN202010183-01、WN202010184-01(购自成都荷花池中药市);
在以下实施例中,所涉及的对照品包括:
唐松草酚定(成都普思生物科技股份有限公司,批号:PS012547,含量以100%计)。
实施例1
一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,包括如下步骤:
A.对照品溶液的制备:取对照品唐松草酚定,加甲醇溶解,按浓度呈梯度分布配制对照品溶液;
B.供试品溶液的制备:取天葵子粉末5g,加入95%乙醇100mL溶解,电热套加热回流3h,放冷后离心(离心转速为2000rpm);取上清液浓缩至干,残渣加水30mL超声分散,用等体积乙酸乙酯萃取2次,弃去乙酸乙酯相,水相用等体积正丁醇萃取2次,合并正丁醇相,浓缩至干,残渣加甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中,为供试品溶液;
C.标准曲线的绘制:取所得对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中进行测定,记录对应的色谱图和峰面积;
以对照品溶液的浓度为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,计算得线性回归方程;
D.结果计算:取所得供试品溶液,注入高效液相色谱仪中进行测定,将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中,即得供试品天葵子中唐松草酚定的含量;
高效液相色谱仪内色谱条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm;
色谱柱柱温:20℃;
检测器:UV-PDA检测器;
流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸水溶液为流动相B;
流动相流速:0.8mL/min;
进样量:2μL;
检测波长:345nm;
流动相按下表1进行梯度洗脱,具体为:
表1 梯度洗脱
实施例2
一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,包括如下步骤:
A.对照品溶液的制备:取对照品唐松草酚定,加甲醇溶解,按浓度呈梯度分布配制对照品溶液;
B.供试品溶液的制备:取天葵子粉末10g,加入95%乙醇150mL溶解,电热套加热回流4h,放冷后离心(离心转速为3000rpm);取上清液浓缩至干,残渣加水50mL超声分散,用等体积乙酸乙酯萃取4次,弃去乙酸乙酯相,水相用等体积正丁醇萃取4次,合并正丁醇相,浓缩至干,残渣加甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中,为供试品溶液;
C.标准曲线的绘制:取所得对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中进行测定,记录对应的色谱图和峰面积;
以对照品溶液的浓度为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,计算得线性回归方程;
D.结果计算:取所得供试品溶液,注入高效液相色谱仪中进行测定,将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中,即得供试品天葵子中唐松草酚定的含量;
高效液相色谱仪内色谱条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm;
色谱柱柱温:40℃;
检测器:UV-PDA检测器;
流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸水溶液为流动相B;
流动相流速:1.2mL/min;
进样量:20μL;
检测波长:345nm;
流动相按下表2进行梯度洗脱,具体为:
表2 梯度洗脱
实施例3
一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,包括如下步骤:
A.对照品溶液的制备:取对照品唐松草酚定,加甲醇溶解,分别配制浓度为0.0552mg/mL、0.138mg/mL、0.276mg/mL、0.414mg/mL及0.552mg/mL的五份对照品溶液;
B.供试品溶液的制备:取天葵子粉末5.0g,加入95%乙醇100mL溶解,电热套加热回流3h,放冷后离心(离心转速为2000rpm);取上清液浓缩至干,残渣加水30mL超声分散,用等体积乙酸乙酯萃取2次,弃去乙酸乙酯相,水相用等体积正丁醇萃取3次,合并正丁醇相,浓缩至干,残渣加甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中,以续滤液为供试品溶液;
C.标准曲线的绘制:取所得对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中进行测定,记录对应的色谱图和峰面积;
以对照品溶液的浓度为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线(如图1所示),计算得线性回归方程为y = 18256907.9860 x - 17910.2683(R² = 0.9995),同时表明对照品溶液中唐松草酚定含量在0.0552~0.552mg/mL范围内时,具有良好的线性关系;
D.结果计算:取所得供试品溶液,注入高效液相色谱仪中进行测定,将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中,即得供试品天葵子中唐松草酚定的含量;
高效液相色谱仪内色谱条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm;
色谱柱柱温:35℃;
检测器:UV-PDA检测器;
流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸水溶液为流动相B;
流动相流速:1.0mL/min;
进样量:5μL;
检测波长:345nm;
流动相按下表3进行梯度洗脱,具体为:
表3 梯度洗脱
实施例4
基于实施例3,对天葵子中唐松草酚定含量的测定方法中的检测限、定量限、精密度、重复性、溶液稳定性、耐用性、准确度(加样回收)、样品检测进行考察,以对本发明作进一步的说明。
一、检测限和定量限考察
以信噪比为3时,所对应的对照品唐松草酚定浓度为检测限;信噪比为10时,所对应的对照品唐松草酚定浓度为定量限,浓度分别为0.44μg/mL和1.47μg/mL。
二、精密度考察
取任意一批次的天葵子药材,按实施例3中的处理方式,制备供试品溶液,平行进样六次,结果如下表4。
表4 精密度考察结果
可知:相对标准偏差RSD值为0.42%,试验方法精密度符合要求。
三、重复性考察
取任意一批次的天葵子药材,按实施例3中的处理方式,制备六份供试品溶液,分别进样一次,结果如下表5。
表5 重复性考察结果
可知:相对标准偏差RSD值为3.94%,试验方法重复性符合要求。
四、溶液稳定性考察
取任意一批次的天葵子药材,按实施例3中的处理方式,制备供试品溶液,分别在0h、2h、4h、6h及8h进样检测,结果如下表6。
表6 溶液稳定性考察结果
可知:相对标准偏差RSD值为1.74%,试验方法溶液稳定性符合要求。
五、耐用性考察
取任意一批次的天葵子药材,按实施例3中的处理方式,制备供试品溶液,分别在两台不同高效液相色谱仪、三根不同的色谱柱上进样检测,结果如下表7-8。
表7 耐用性考察结果(同一台高效液相色谱仪、三根色谱柱)
表8 耐用性考察结果(同一色谱柱、两台高效液相色谱仪)
可知:相对标准偏差RSD值均低于4%,该检测方法耐用性符合要求。
六、准确度(加样回收)考察
取唐松草酚定14.24mg,置于100mL容量瓶中,加甲醇适量,使其溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.1424mg/mL对照品溶液;
取已知含量的天葵子药材粉末2.5g,精密称定,平行6份,置于圆底烧瓶中,分别精密加入上述所得唐松草酚定对照品溶液1mL,加入95%乙醇50mL,加热回流3h,放冷,以2000rpm/min离心,上清液浓缩至干,残渣加水30ml超声分散,用等体积乙酸乙酯萃取2次,弃去乙酸乙酯相,水相用等体积正丁醇萃取3次,合并正丁醇相,浓缩至干,残渣用甲醇溶解定容至5mL容量瓶中,用0.22μm有机膜过滤,以续滤液为供试溶液,注入高效液相色谱仪,测定,计算回收率试验结果见表9。
表9 准确度(加样回收)考察结果
可知:回收率为86.87~106.25%,表明本方法具有较好的测定准确度。
七、样品检测
取天葵子药材(粉末)三批,按实施例3中对应步骤制备供试品溶液,取浓度为0.0567mg/mL的唐松草酚定对照品溶液和所得供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,如图2所示,用峰面积外标一点法计算唐松草酚定含量,试验结果如下表10所示。
表10 三批天葵子药材的检测结果
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,其特征在于,包括如下步骤:
A.对照品溶液的制备:取对照品唐松草酚定,加甲醇溶解,按浓度呈梯度分布配制对照品溶液;
B.供试品溶液的制备:取天葵子粉末,加入95%乙醇溶解,加热回流,放冷后离心;取上清液浓缩至干,残渣加水超声分散,用等体积乙酸乙酯萃取,弃去乙酸乙酯相,水相用等体积正丁醇萃取,合并正丁醇相,浓缩至干,残渣加甲醇溶解并定容于容量瓶中,为供试品溶液;
C.标准曲线的绘制:取所得对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中进行测定,记录对应的色谱图和峰面积;
以对照品溶液的浓度为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,计算得线性回归方程;
D.结果计算:取所得供试品溶液,注入高效液相色谱仪中进行测定,将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中,即得供试品天葵子中唐松草酚定的含量;
高效液相色谱仪内色谱条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm;
色谱柱柱温:20~40℃;
检测器:UV-PDA检测器;
流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸水溶液为流动相B;
流动相流速:0.8~1.2mL/min;
进样量:2~20μL;
检测波长:345nm;
流动相按下表进行梯度洗脱,具体为:
2.根据权利要求1所述的测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,其特征在于,在步骤A中,所述对照品溶液中,唐松草酚定浓度为0.0552~0.552mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,其特征在于,在步骤A中,所述对照品溶液为五份,浓度分别为:0.0552mg/mL、0.138mg/mL、0.276mg/mL、0.414mg/mL及0.552mg/mL。
4.根据权利要求1所述的测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,其特征在于,在步骤B中,所述离心速率为2000~3000rpm。
5.根据权利要求1或4所述的测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,其特征在于,在步骤B中,取天葵子粉末5~10g,加入95%乙醇100~150mL溶解,电热套加热回流3~4h,放冷后离心;取上清液浓缩至干,残渣加水30~50mL超声分散,用等体积乙酸乙酯萃取2~4次,弃去乙酸乙酯相,水相用等体积正丁醇萃取2~4次,合并正丁醇相,浓缩至干,残渣加甲醇溶解并定容至5~10mL容量瓶中,为供试品溶液。
6.根据权利要求1所述的测定天葵子中唐松草酚定含量的方法,其特征在于,所述方法的检测限为0.44μg/mL。
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