CN110578004A - 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法 - Google Patents

检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110578004A
CN110578004A CN201911032776.0A CN201911032776A CN110578004A CN 110578004 A CN110578004 A CN 110578004A CN 201911032776 A CN201911032776 A CN 201911032776A CN 110578004 A CN110578004 A CN 110578004A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
biomarker
prostate cancer
prognosis
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911032776.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110578004B (zh
Inventor
范建兵
陈志伟
阮微媚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AnchorDx Medical Co Ltd
Original Assignee
AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AnchorDx Medical Co Ltd filed Critical AnchorDx Medical Co Ltd
Priority to CN201911032776.0A priority Critical patent/CN110578004B/zh
Publication of CN110578004A publication Critical patent/CN110578004A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110578004B publication Critical patent/CN110578004B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测前列腺癌预后的试剂盒以及检测方法，采用飞行时间质谱平台检测，包括分别针对生物标记物KLHL8、FHAD1、ALKBH5、ATP11A、和/或PI15的扩增引物和延伸引物。该检测试剂盒通过首次实现了飞行时间谱平台对于DNA甲基化的多基因位点的平行检测。本发明设计了适用于质谱平台的多基因位点前列腺预后判断的甲基化检测的引物及实验方法，使之优化为多个DNA甲基化位点并行检测的低成本高通量的预后检测方法，填补了现有中国前列腺癌预后检测方法的限制。

Description

检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法。
背景技术
前列腺癌是世界范围内男性发病率第2位、病死率第6位的恶性肿瘤。亚洲国家的前列腺癌发病率一直远低于欧美国家，但随着我国人口老龄化以及生活方式的改变，前列腺癌已经成为常见恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤。
由于我国前列腺癌的筛查体系尚未建立，这使得我国局限性前列腺癌诊断比例占40％左右，1/3左右新诊断患者为局部晚期。提高早诊率和有效治疗率或是降低我国前列腺癌的重要途径。
目前临床上诊断前列腺癌主要依靠直肠指诊、血清PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查，CT对诊断早期前列腺癌的敏感性低于MRI。因前列腺癌骨转移率较高，在决定治疗方案前通常还要进行核素骨扫描检查。确诊前列腺癌需要通过前列腺穿刺活检进行病理检查。
前列腺癌的恶性程度可通过组织学分级进行评估，最常用的是Gleason评分系统，依据前列腺癌组织中主要结构区和次要结构区的评分之和将前列腺癌的恶性程度划分为2-10分，分化最好的是1+1＝2分，最差的是5+5＝10分。
由于血清前列腺特异抗原(PSA)的使用方式和诊断策略是在欧美人群中制定出来的，对于亚洲人群的研究虽然验证了其诊断效能，但在临床应用中也发现了一些差异。我国、日本及韩国的学者均发现亚洲健康人群的PSA正常参考值明显低于欧美人群，因此PSA在中国人群中的诊断效并不理想。基于Gleason评分系统的判别在7分区间区分前列腺癌的恶性程度及预后评估上有很大的局限性。
基于PCR平台的现有产品使用多个RNA表达生物标记物的检测的方法受限于RNA的降解等因素，同时检测通量低，成本高。效用对于中国人群有待验证。
一些研究发现，多个DNA甲基化的生物标记物在欧美人群中与膀胱癌的预后良恶性密切相关。而目前常用检测DNA甲基化的方法包括甲基化芯片技术、全基因组甲基化测序技术、焦磷酸测序法和质谱法。甲基化芯片技术虽然能够同时检测大量的CpG位点，但不能达到单碱基分辨。全基因组甲基化测序法成本高且数据分析量庞大。焦磷酸测序法通量低，无法实现多基因位点并行检测。而现有的质谱法对于甲基化的检测仅能局限在单个基因的多位点检测，检测过程涉及体外转录，步骤繁琐，分析过程复杂，不适用于多个基因的甲基化单位点并行检测。
飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)是国际通用的基因单核苷酸多态性(SNP)的研究平台，其作用原理是：先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器，从而建立质谱图。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法，可实现多个DNA甲基化位点并行检测的低成本高通量的预后检测。
实现上述目的的技术方案如下。
一种检测前列腺癌预后的试剂盒，采用飞行时间质谱平台检测，包括分别针对生物标记物KLHL8、FHAD1、ALKBH5、ATP11A、和/或PI15甲基化检测的扩增引物和延伸引物。
在其中一些实施例中，针对生物标记物KLHL8的扩增引物如SEQID NO.1和SEQIDNO.6，延伸引物如SEQID NO.11；针对生物标记物FHAD1的扩增引物如SEQID NO.2和SEQIDNO.7，延伸引物如SEQID NO.12；针对生物标记物ALKBH5的扩增引物如SEQID NO.3和SEQIDNO.8，延伸引物如SEQID NO.13；针对生物标记物ATP11A的扩增引物如SEQID NO.4和SEQIDNO.9，延伸引物如SEQID NO.14；针对生物标记物PI15的扩增引物如SEQID NO.5和SEQIDNO.10，延伸引物如SEQID NO.15。
在其中一些实施例中，针对生物标记物KLHL8的扩增引物如SEQID NO.16和SEQIDNO.21，延伸引物如SEQID NO.26；针对生物标记物FHAD1的扩增引物如SEQID NO.17和SEQIDNO.22，延伸引物如SEQID NO.27；针对生物标记物ALKBH5的扩增引物如SEQID NO.18和SEQID NO.23，延伸引物如SEQID NO.28；针对生物标记物ATP11A的扩增引物如SEQID NO.19和SEQID NO.24，延伸引物如SEQID NO.29；针对生物标记物PI15的扩增引物如SEQID NO.20和SEQID NO.25，延伸引物如SEQID NO.30。
在其中一些实施例中，针对生物标记物KLHL8的扩增引物如SEQID NO.31和SEQIDNO.36，延伸引物如SEQID NO.41；针对生物标记物FHAD1的扩增引物如SEQID NO.32和SEQIDNO.37，延伸引物如SEQID NO.42；针对生物标记物ALKBH5的扩增引物如SEQID NO.33和SEQID NO.38，延伸引物如SEQID NO.43；针对生物标记物ATP11A的扩增引物如SEQID NO.34和SEQID NO.39，延伸引物如SEQID NO.44；针对生物标记物PI15的扩增引物如SEQID NO.35和SEQID NO.40，延伸引物如SEQID NO.45。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括虾碱性磷酸酶。
本发明的另一目的是提供上述检测前列腺癌预后的试剂盒的使用方法。
实现上述目的的技术方案如下。
检测前列腺癌预后的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
提取样本的全基因组DNA；
对所述全基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化；
用上述所述试剂盒中的PCR扩增引物对亚硫酸氢盐转化后的全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
采用虾碱性磷酸酶对所述PCR扩增产物进行处理，去除反应体系中游离的核苷酸；
用上述试剂盒中的延伸引物对PCR扩增产物进行PCR延伸反应，所得产物，再通过芯片点样进行飞行时间质谱平台检测分析，获得每个CpG位点甲基化程度。
在其中一些实施例中，PCR扩增反应程序：PCR反应程序：95℃2分钟；95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，45个循环；72℃5分钟。
在其中一些实施例中，PCR延伸反应程序：94℃30秒；{94℃5秒，(52℃5秒，80℃5秒，5个循环)，45个循环}；72℃3分钟。
针对现有检测方法无法实现多个基因单碱基分辨率并行DNA甲基化的低成本检测的技术问题，本发明提供了一种适合亚洲人的前列腺癌预后预测的试剂盒及前列腺癌预后预测相关的5个甲基化生物标记物的甲基化测试方法。
目前，飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)在基因检测中，主要是用于点突变(SNP)检测。相对于点突变而言，甲基化由于序列的多样性缺乏，设计引物难度增大，另外，由于第一步扩增为多重PCR反应，5个甲基化位点的引物组合会影响到各自的扩增效率。本发明发明人创造性地采用针对前列腺癌预后预测的5个甲基化生物标记物，在现有基于飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)的基因单核苷酸多态性(SNP)的检测原理的基础上，对5个甲基化生物标记物的目标区域作出引物及引物对组合的优化设计，首次实现了飞行时间谱平台对于DNA甲基化的多基因位点的平行检测。针对亚硫酸盐转化后的目标检测序列，在引物序列设计上克服了亚硫酸盐序列缺乏碱基多样性的缺点，并考虑了5个甲基化生物标记物引物对组合之间的相互作用，特别设计了适用于质谱平台的多基因位点前列腺预后判断的甲基化检测的引物及实验方法，使之优化为多个DNA甲基化位点并行检测的低成本高通量的预后检测方法。该方法根据延伸反应中有甲基化和无甲基化的分子量差异定量该位点的甲基化程度。
本发明针对前列腺癌预后结果判断的甲基化生物标记物设计的基于飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的甲基化检测方法填补了现有中国前列腺癌预后检测方法的限制。
附图说明
图1预后判别甲基化模型与现有Gleason评分系统对前列腺癌的预后预测的ROC曲线：甲基化模型对于预后预测的AUC显著大于Gleason评分系统。
图2甲基化模型对于前列腺癌预后良恶性两个组别的区分：甲基化得分在前列腺癌预后良好及预后复发/恶化两个组别间存在显著性差异，所述模型可显著区分预后良恶性。
图3为实施例1所述三个组合的引物对对于PI15甲基化位点的检测对比。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在其中的一个方面，本发明涉及一种检测前列腺癌预后的试剂盒，采用飞行时间质谱平台检测，包括分别针对生物标记物KLHL8、FHAD1、ALKBH5、ATP11A、和/或PI15的扩增引物和延伸引物。其中，5个生物标记物可以并行检测，也根据需要，单独或5个生物标记物之间任意组合检测。本发明基于飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的甲基化检测方法，优选5个生物标记物同时检测，具有低成本高通量，并填补了现有中国前列腺癌预后检测方法的限制。
本发明所述检测前列腺癌预后的试剂盒和方法中，将核酸质谱的SNP检测的基本原理应用于DNA的甲基化检测，进行优化，优化后的检测方法为：首先对福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织样本提取DNA，然后对DNA样本进行亚硫酸氢盐转化，甲基化位点若是已甲基化的状态，则不会有改变，若是未甲基化的状态，则会转化为U碱基。通过设计合适的引物，PCR扩增出含有甲基化位点的一段DNA(甲基化位点前后各70bp左右)，然后用SAP酶去除掉PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物，然后加入一单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨着甲基化位点，采用四种ddNTP替代dNTP。这样，延伸引物在甲基化位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与甲基化位点的等位基因对应。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该位点是否发生甲基化，从而实现检测。
实施例1
本实施例提供了一种用于前列腺癌预后预测的5个甲基化生物标记物的甲基化测试试剂盒，包括虾碱性磷酸酶和3组PCR扩增引物及延伸引物组合中的任意一组，其中，每组PCR扩增引物及延伸引物组合包括5对PCR扩增引物及5条PCR延伸引物，所述3组PCR扩增引物及延伸引物如表1所示。
本发明针对前列腺癌的五个甲基化生物标记物设计了特异性扩增引物和延伸引物，每个甲基化生物标记物设计三对PCR引物，三对延伸引物。进行组合，分别为组合1，组合2，组合3。具体见表1。
引物合成购于Invitrogen公司，其他PCR试剂、SAP试剂、延伸反应试剂均购于AgenaBioscience公司。
所述检测试剂盒包括PCR扩增引物及延伸引物组合3组组合中的其中一组，3组组合对于5个甲基化位点(生物标记物)的检测性能类似，以其中一个生物标记物位点PI15的甲基化程度检测为例，分别使用3个组合的引物对对系列甲基化标准品(Qiagen公司)在该位点的甲基化程度检测(检测方法如实施例2)如图3，组合1、2、3的引物对对于该PI15位点的甲基化检测的线性关系分别为0.998、0.998、0.994，线性关系没有显著差异，拟合线性方程斜率分别为0.86、0.88、0.83，可判断扩增效率类似，没有显著差别。
图3三个组合的引物对对于所选甲基化位点生物标记物PI15的甲基化位点检测对比：组合1、2、3的引物对对于该位点的甲基化检测的拟合线性类似，线性方程的斜率相近，因此扩增效率性能没有显著差异。
实施例2
对8例对福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织样本(其中临床确诊为前列腺癌预后良好组织样本4例，前列腺癌预后复发/转移/致死的组织样本4例)进行检测。具体流程如下：
1、DNA提取方法
组织提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。
2、DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于Zymo公司，按照试剂盒说明书进行。
3、PCR扩增
根据甲基化位点设计5对PCR引物，在1个反应孔(引物系列见附表1)中进行多重PCR，扩增出含目标位点的目标序列，产物大小分别为100bp左右。
1)配置单个引物浓度为0.5μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个甲基化位点的F(正向)和R(反向)引物，共1个反应孔。
2)PCR混合液配置：配制0.5μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个甲基化位点的F(正向)和R(反向)引物。根据表1配制PCR混合液，DNA不要加在其中。本实施例所用的扩增引物和延伸引物为实施例1所述试剂盒的组合3。
表1 PCR混合液配置方案
3)加入DNA样本：加5μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入DNA，DNA上样量100ng，PCR反应总体积10μL。涡旋震荡和离心。
4)PCR反应程序：95℃2分钟；95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，45个循环；72℃5分钟；4℃保存备用。
4、PCR产物消化处理
1)根据表2配制SAP混合液
试剂 终浓度 体积(μL)
Nanopure Water(超纯水) n/a 1.53
SAP Buffer(SAP缓冲液) 0.24x 0.17
SAP酶(1.7U/ul) 0.5U 0.30
总体积[ul] n/a 2
表2 SAP混合液配置表
2)向每一个PCR反应孔中加入2μL SAP混液。完成后，用膜把板封好，涡旋震荡和离心。
3)PCR产物消化处理：37℃40分钟；85℃5分钟
5、目标位点延伸反应
1)根据表3配制iPLEX延伸混液
表3 iPLEX延伸预混液配置表
2)向SAP消化后的产物中加入2μL iPLEX延伸混液并混好，涡旋震荡和离心。
3)PCR反应程序：94℃30秒；{94℃5秒，(52℃5秒，80℃5秒，5个循环)，45个循环}；72℃3分钟；4℃保存备用。
6、上机前处理
1)戴上手套和护眼镜。
2)把洁净树脂(Resin)铺平在384/6mg dimple plate上，风干最少10分钟。
3)在样本板的每一个有样本的孔里加入16ul水。如果有器材和方法，这一步可以使用液体处理器。完成后，用膜把板封好，涡旋震荡和离心。
4)加入6mg洁净树脂(Resin)(11235)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimple plated(波浪板)上，然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。
7、上机检测
1)用点样仪进行Volume Check(体积测试)以找出合适的dispensing speed(点样速度)。不过，点3pt-calibrant(3点标准品)的dispensing speed最少要达到90mm/sec。
2)以板上的真正样本进行volume check，然后用MassARRAYTMNanodispenser RS1000/Fusio(RS1000/Fusio点样仪)或自备点样仪将样本点到SpectroCHIP(芯片)上。
3)MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱
4)将芯片放到MassARRAY Typer Workstation MA4或Compact里打质谱，FlexControl和Spectro Acquire的参数要设定为iPLEX(iPLEX.par)。
备注：使用Typer 4Plate Editor编板时样本档要以纵向导入。而且在编板前将元数据应用在样本上。
5)完成实验后，导出.xml档。
8、数据处理与分析
1)数据处理，通过各甲基化位点的的甲基化峰及非甲基化峰的峰噪值(SNR)计算该位点的甲基化率：
甲基化率＝SNR-M/(SNR-M+SNR-U)；
其中，SNR-M为甲基化峰的峰噪值，SNR-U为非甲基化峰的峰噪值；
根据各甲基化位点的甲基化率计算甲基化模型得分(参考参考文献1Zhao S,Leonardson A,Geybels MS,et al.A five-CpG DNA methylation score to predictmetastatic-lethal outcomes in men treated with radical prostatectomy forlocalized prostate cancer.The Prostate.2018；78:1084–1091)，得分>1的根据该检测方法预测为前列腺癌预后复发/恶化，得分<1或得分＝1的预测为前列腺癌预后良好。
8个样本的检测结果如下表2，最后模型判读结果与Gleason评分系统及其判读或真实临床病理判读对比结果如表3。表3的数据表明，本发明检测方法可准确根据5个甲基化位点的甲基化程度预测前列腺癌的预后情况，8例样本的判读结果(甲基化模型判读)均与临床病例结果一致，而Gleason评分系统对其中3例样本不能做出判断，能做出判断的5例中有1例判读错误。由此证明，本发明检测方法在预测前列腺癌预后良恶性的应用中性能优于现有的Gleason评分系统。
表2样本5个位点甲基化率统计表
表3样本甲基化模型得分、对前列腺癌预后的判断及对比Gleason评分系统及其判读与真实临床病理判读对比表。
采用实施例1所述前列腺癌预后检测试剂盒的组合2和组合1的扩增引物和延伸引物，检测的效果与上述组合3的扩增引物和延伸引物效果一致，具体数据省略。
实施例3
对41例中国人群的福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织样本(其中临床确诊为前列腺癌预后良好组织样本21例，前列腺癌预后复发、转移、致死的组织样本20例)使用实施例1所述检测试剂盒(扩增引物和延伸引物为组合3)和实施例2所述检测方法对每个样本的5个甲基化位点并行检测，所得甲基化程度计算出甲基化模型的得分，对比临床确诊结果画出诊断分类模型的ROC曲线(如图1)，并根据ROC曲线计算相对应的AUC、灵敏度及特异性，同时Gleason评分系统的ROC曲线、AUC、灵敏度及特异性作为对比组。
根据该系列甲基化生物标记物所构建的诊断分类模型，对于中国人群中前列腺癌手术预后良好及预后复发/恶化的预测总体AUC为0.94,灵敏度85％，特异性85.7％，而Gleason评分系统的预测总体AUC为0.78,灵敏度60％，特异性76.2％。基于5个甲基化生物标记物的甲基化测试的前列腺癌预后预测相比Gleason评分系统具有更优越的诊断效能。而这些，目前还没有其他扩增引物和延伸引物能够达到。
对上述前列腺癌手术预后良好及预后复发/恶化两个组别的甲基化得分进行ttest分析，结果表明两组得分之间存在统计学上的显著差异(图2)，证明基于5个甲基化生物标记物的甲基化测试的前列腺癌预后预测可以显著区分中国人群中前列腺癌手术预后良好及预后复发/恶化组别。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
<120> 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg attccaaaac tacccaattc 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg ccttaaacca tttctataac c 31
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg aataatcaac caaactactc 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg aaaacatctt acccttacta a 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg ctaacaactt ttatatatca c 31
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg gaaagaaaaa ttttagataa tt 32
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg gtttgttgaa tgttttagg 29
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg gttttgaaaa aggtaaattt ag 32
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgttggatg ggttgggtgg gattttaagg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg tggttaagag agatttttag 30
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actacccaat tcttaaatcc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttctataac ctctaaacct cc 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caaactactc taaaaacaac tac 23
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacatctta cccttactaa aacaac 26
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caacttttat atatcacaat ttacaac 27
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgttggatg tgtgattaat ttaagatagt atta 34
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg gaatgtttta ggttttacga gt 32
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgttggatg aagttgtttt gagaatag 28
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg gattttttga ttgaatttcg 30
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgttggatg tgattttggt taagagagat tttta 35
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acgttggatg ctatacacca acaccaatat ct 32
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg ctataaaacc ttaaaccat 29
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg atataattca ataatacc 28
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acgttggatg ccaaaatatc tctacctaac 30
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg ctctacaaaa tttaaatact actaac 36
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtttaattga gtaaaga 17
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttttatttt atagatagga aag 23
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaacatctta aatttaaacc 20
<210> 29
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccttacctcc cctc 14
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaaagattgt tttttttgga 20
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg gattatgtat tagtattagt g 31
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg tgggttattt ttgtgatttt tgag 34
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgttggatg gtttagtgtg tttttaattt tgta 34
<210> 34
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg gggtaattta gcgatttttt ga 32
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg gttgttggtt agaggagtag ttaatag 37
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgttggatg aaatttaact aaacaaaaac 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg cctactaaat actccaaacc 30
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg ccaaaacatc ttaaatttaa ac 32
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgttggatg ctctacctaa cgcacgcctt ac 32
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg taccacccaa tcactatttt tttctac 37
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggattgttta atttttgaat t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccatttcaca aataaaaaaa c 21
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gttgttttga gaatagttg 19
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tttgttttta ttggggtaa 19
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccttaaaaaa actacccttt ctaaac 26

Claims (10)

1.一种检测前列腺癌预后的试剂盒，其特征是，采用飞行时间质谱平台检测，包括分别针对生物标记物KLHL8、FHAD1、ALKBH5、ATP11A、和/或PI 15甲基化检测的扩增引物和延伸引物。
2.根据权利要求1所述的检测前列腺癌预后的试剂盒，其特征是，针对生物标记物KLHL8的扩增引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6，延伸引物如SEQ ID NO.11；针对生物标记物FHAD1的扩增引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.7，延伸引物如SEQ ID NO.12；针对生物标记物ALKBH5的扩增引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8，延伸引物如SEQ ID NO.13；针对生物标记物ATP11A的扩增引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9，延伸引物如SEQ ID NO.14；针对生物标记物PI 15的扩增引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.10，延伸引物如SEQ IDNO.15。
3.根据权利要求1所述的检测前列腺癌预后的试剂盒，其特征是，针对生物标记物KLHL8的扩增引物如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.21，延伸引物如SEQ ID NO.26；针对生物标记物FHAD1的扩增引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.22，延伸引物如SEQ ID NO.27；针对生物标记物ALKBH5的扩增引物如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.23，延伸引物如SEQ ID NO.28；针对生物标记物ATP11A的扩增引物如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.24，延伸引物如SEQ IDNO.29；针对生物标记物PI 15的扩增引物如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.25，延伸引物如SEQID NO.30。
4.根据权利要求1所述的检测前列腺癌预后的试剂盒，其特征是，针对生物标记物KLHL8的扩增引物如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.36，延伸引物如SEQ ID NO.41；针对生物标记物FHAD1的扩增引物如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.37，延伸引物如SEQ ID NO.42；针对生物标记物ALKBH5的扩增引物如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.38，延伸引物如SEQ ID NO.43；针对生物标记物ATP11A的扩增引物如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.39，延伸引物如SEQ IDNO.44；针对生物标记物PI 15的扩增引物如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.40，延伸引物如SEQID NO.45。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测前列腺癌预后的试剂盒，其特征是，包括生物标记物KLHL8、FHAD1、ALKBH5、ATP11A、和PI 15的扩增引物和延伸引物。
6.根据权利要求1-4任一项所述的检测前列腺癌预后的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括虾碱性磷酸酶。
7.根据权利要求1-4任一项所述的检测前列腺癌预后的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括SAP试剂、或延伸反应试剂。
8.一种检测前列腺癌预后的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取样本的全基因组DNA；
对所述全基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化；
用权利要求1-7任一项所述试剂盒中的PCR扩增引物对亚硫酸氢盐转化后的全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
采用虾碱性磷酸酶对所述PCR扩增产物进行处理，去除反应体系中游离的核苷酸；
用上述试剂盒中的延伸引物对PCR扩增产物进行PCR延伸反应，所得产物，再通过芯片点样进行飞行时间质谱平台检测分析，获得每个生物标记物的甲基化程度。
9.根据权利要求8所述的检测前列腺癌预后的方法，其特征在于，PCR扩增反应程序：PCR反应程序：95℃2分钟；95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，45个循环；72℃5分钟。
10.根据权利要求8或9所述的检测前列腺癌预后的方法，其特征在于，PCR延伸反应程序：94℃30秒；{94℃5秒，(52℃5秒，80℃5秒，5个循环)，45个循环}；72℃3分钟。
CN201911032776.0A 2019-10-28 2019-10-28 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法 Active CN110578004B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911032776.0A CN110578004B (zh) 2019-10-28 2019-10-28 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911032776.0A CN110578004B (zh) 2019-10-28 2019-10-28 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110578004A true CN110578004A (zh) 2019-12-17
CN110578004B CN110578004B (zh) 2020-12-08

Family

ID=68815389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911032776.0A Active CN110578004B (zh) 2019-10-28 2019-10-28 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110578004B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254191A (zh) * 2020-02-24 2020-06-09 陈征 一种前列腺癌术后gs升级的预测方法
CN112813148A (zh) * 2021-02-02 2021-05-18 博淼生物科技（北京）有限公司 飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016058089A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 The Hospital For Sick Children Dna methylation markers for overgrowth syndromes
CN108474041A (zh) * 2015-12-23 2018-08-31 弗莱德哈钦森癌症研究中心 使用遗传标记的甲基化状态区分转移性-致死性前列腺癌与惰性前列腺癌

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016058089A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 The Hospital For Sick Children Dna methylation markers for overgrowth syndromes
CN108474041A (zh) * 2015-12-23 2018-08-31 弗莱德哈钦森癌症研究中心 使用遗传标记的甲基化状态区分转移性-致死性前列腺癌与惰性前列腺癌

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARINA BIBIKOVA等: "High density DNA methylation array with single CpG site resolution", 《GENOMICS》 *
QUAN-XIANG WEI等: "Germline Allele-Specific Expression of DAPK1 in Chronic Lymphocytic Leukemia", 《PLOS ONE》 *
SHANSHAN ZHAO等: "A five-CpG DNA methylation score to predict metastatic-lethal outcomes in men treated with radical prostatectomy for localized prostate cancer", 《PROSTATE》 *
SHANSHAN ZHAO等: "Epigenome-Wide Tumor DNA Methylation Profiling Identifies Novel Prognostic Biomarkers of Metastatic-Lethal Progression in Men Diagnosed with Clinically Localized Prostate Cancer", 《CLIN CANCER RES》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254191A (zh) * 2020-02-24 2020-06-09 陈征 一种前列腺癌术后gs升级的预测方法
CN111254191B (zh) * 2020-02-24 2023-10-03 陈征 一种前列腺癌术后gs升级的预测方法
CN112813148A (zh) * 2021-02-02 2021-05-18 博淼生物科技（北京）有限公司 飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110578004B (zh) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2885425B1 (en) Expression of protein-coding and noncoding genes as prognostic classifiers in early stage lung cancer
CN110923322B (zh) 膀胱癌相关的dna甲基化生物标志物组合和检测试剂盒
CN110423816B (zh) 乳腺癌预后量化评估系统及应用
CN110578004B (zh) 检测前列腺癌预后的试剂盒以及方法
CN105567822B (zh) 一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒
US10186332B2 (en) Determination device, computer readable medium, and marker for obtaining information on lung cancer
CN110904231A (zh) 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途
CN113025701B (zh) 非酒精性脂肪性肝病易感基因的早筛方法及试剂盒
CN107868827A (zh) septin9目标基因甲基化检测引物及检测人septin9基因甲基化的试剂盒
CN110484621A (zh) 一种肝癌早期预警的方法
CN107630093B (zh) 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途
CN103492570B (zh) 一种强直性脊柱炎相关特异性单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒
WO2019012542A1 (en) DETECTION OF SPECIFIC DNA FROM A FABRIC
CN112280867A (zh) 肝癌早期的预警方法、及预警用检测试剂盒、检测方法
US20220033911A1 (en) Method for determining prognosis of endometrial cancer
US20210404009A1 (en) Method for determining risk of urothelial carcinoma
CN116103402A (zh) 基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒及其应用
CN113025702B (zh) 强直性脊柱炎易感基因的早筛方法及试剂盒
CN108588219A (zh) 一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法
CN114277132A (zh) 免疫相关的lncRNA表达谱预测小细胞肺癌辅助化疗获益及预后的应用
CN109694912B (zh) 甲基化位点的应用、检测甲基化的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
CN111440866A (zh) Dusp3基因甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用
CN110117660A (zh) 可用于肿瘤鉴定的标志物stamp-ep11及其检测试剂
RU2779550C1 (ru) Способ для диагностирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК
CN116064788B (zh) 乳腺癌早期筛查的多重基因甲基化检测荧光定量pcr试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant