CN116103402A - 基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其通过检测食管癌基因甲基化检测位点包括ZNF154、RNF126、C2ORF27A、OTOP2、TM4SF19、P16的甲基化情况，从而实现食管癌样本的早期筛查；且该试剂盒与数字PCR相结合，基于可绝对定量、批次间稳定性高、灵敏度高的优势，能够准确分辨样本基因甲基化与食管癌之间的规律；同时采用荧光标记探针进行分型检测，特异性强，适用于不同时期的食管癌患者；从而为食管癌早期筛查、诊断、预后提供方便、快捷、准确的检测手段，具有重要的临床价值。

Description

基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒及其应用。
背景技术
食管癌（ Esophageal cancer, EC）作为一种消化道恶性肿瘤，是全球癌症相关死亡的第六大原因。其中中国的发病风险极高，新发病例局世界首位( Scopus Preview- Schilsky R L A, et al. NEJM. 2020;383:897-00)。通常，食管癌患者初期、中期仅表现出不同程度的吞咽困难，极易错过治疗的最佳时间。等到出现进食障碍，大部分患者的食管肿瘤已经发展进入晚期阶段，严重影响了临床的治疗和预后。因此食管癌的早期筛查非常关键，有效且便捷的检查方法有助于提高食管癌患者的治愈率和生存质量。
目前食管癌的相关检测方法主要包括肿瘤标记物检测、食管癌功能检查、影像学及内镜检查、细胞或组织病理学检查等。其中内镜检查可以很好地达到早期高灵敏度检测的要求，但是广泛的内镜筛查是比较困难的，因为仪器较贵、操作不易且患者接受度低（ Codipilly D C, et al. Gastrointest Endosc. 2018;88:413-426）。而肿瘤标记物源于肿瘤的发生发展过程，可以从离体的血液、唾液、排泄物、表皮细胞等中采集得到，在多种肿瘤中拥有绝对的检测优势，但是目前仍然缺乏食管癌的强特异性标记物。
在生物技术日益成熟的背景下，精准医疗成为了时代号召。为了针对无明显症状人群实现食管癌早筛早诊的目标，核酸分子检测可能成为一项合理的选择。和其他肿瘤一样，多种基因或表观遗传改变引起基因功能的变化，是食管细胞导致病变并引发肿瘤的直接原因。因此，学者们正积极而广泛地探究食管癌病例中基因包含的风险信息（ Zang B, et  al. Aging. 2020;12:3771-3790），以及lncRNA（ Liu H, et al. Pathol Oncol Res.  2020;26:1029-1039）、circRNA（ Shoda K, et al. Biomedicines. 2022;10:1643）等非编码RNA的基因调控情况，然后为临床医师提供食管癌诊断、预后和预测治疗反应的信息。其中，基因甲基化作为表观遗传的主要形式，与癌变有着非常密切的关系。这里的癌症风险包括：启动子区高甲基化可以沉默抑癌基因，广泛的基因组低甲基化促进癌基因的激活、细胞的转化。目前基因甲基化已成为其他肿瘤早筛中十分重要的检测靶标。因此食管癌基因甲基化的深入研究，也将有助于推动食管癌早期诊断难题的解决，但现有国内外未见有相关记载食管癌检测的甲基化基因组合应用，则研发出一种具有实施方便、快捷且高灵敏度和特异性特点的基于甲基化组合应用的食管癌检测方法是本行业人员所迫切需要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，具有高灵敏度和特异性、操作便捷的特点；同时与数字PCR相结合，适用于不同时期的食管癌患者；从而为食管癌早期筛查、诊断、预后提供方便、快捷、准确的检测手段，具有重要的临床价值。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，所述试剂盒所检测的食管癌基因甲基化检测位点包括ZNF154、RNF126、C2ORF27A、OTOP2、TM4SF19、P16，其序列如SEQID NO.1-12所示；且该试剂盒包括特征检测试剂，所述特征检测试剂包括染料定量PCR预混液和如下引物及探针组合：
1）、ZNF154甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.13所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.14所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.25所示的Mut特异探针及如SEQID NO.31所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.32所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.43所示的Wt特异探针；
2）、RNF126甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.15所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.16所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.26所示的Mut特异探针及如SEQID NO.33所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.34所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.44所示的Wt特异探针；
3）、C2ORF27A甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.17所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.18所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.27所示的Mut特异探针及如SEQID NO.35所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.36所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.45所示的Wt特异探针；
4）、OTOP2甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.19所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.20所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.28所示的Mut特异探针及如SEQID NO.37所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.38所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.46所示的Wt特异探针；
5）、TM4SF19甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.21所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.22所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.29所示的Mut特异探针及如SEQID NO.39所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.40所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.47所示的Wt特异探针；
6）、P16甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.23所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.24所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.30所示的Mut特异探针及如SEQ IDNO.41所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.42所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.48所示的Wt特异探针。
进一步地，所述染料定量PCR预混液为来自佰孟医学的染料定量PCR预混液。
进一步地，所述试剂盒的检测样本类型为离体的血液样本。
进一步地，所述特异探针的5'端均包含荧光基团，所述的荧光基团包含FAM、VIC；具体地，Mut特异探针的荧光基团选用FAM，Wt特异探针的荧光基团选用VIC。
进一步地，所述特异探针的3'端均包含猝灭基团，所述猝灭基团为MGB。
进一步地，所述试剂盒的反应体系如下：包括1μL处理后的DNA即硫化模板、2.4μL浓度为10μM的上下游引物、0.75μL浓度为10μM的Mut/Wt探针、15μL的染料定量PCR预混液、及8.45 μL的水混合成均匀的30μL体系。
进一步地，所述试剂盒的PCR反应条件如下（以微滴为单位）：
一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌检测方法，其特征在于：包括如下具体步骤：
（1）、采用磁珠法提取待检测的离体血液样本即血浆中的cfDNA或提取白细胞中的基因组DNA；
（2）、用重亚硫酸盐法转化处理待检测的cfDNA或基因组DNA；
（3）、采用PCR技术检测经步骤（2）转化后的DNA的甲基化状态。
进一步地，所述步骤（1）中，采用白垩纪磁珠法通用型DNA提取试剂盒提取基因组DNA；采用美基磁珠法血浆游离DNA提取试剂盒提取cfDNA。
进一步地，所述步骤（2）的具体操作为：
取2000 ng步骤（1）提取获得的cfDNA或基因组DNA投入到配置好的嘧啶转换反应液中，混匀并离心，接着放入PCR仪中反应并通过DNA吸附）纯化，且PCR程序为98℃/10 min，64℃/40 min，98℃/5 min，64℃/40 min，98℃/5 min，64℃/40 min，4℃/hold。 本发明的有益效果在于：
（1）、本发明试剂盒具有高灵敏度和特异性、操作便捷的特点；
（2）、该试剂盒以DNA甲基化异常作为检测对象，DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，因此DNA甲基化指标的检测可作为食管癌早期筛查、诊断、预后评估的重要指标；
（3）、本发明试剂盒与数字PCR相结合，数字PCR具有更高的检测灵敏度和准确性，能够在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，有效减少假阴性的出现，并获取荧光信号进行统计学分析；且通过数字PCR对起始样本的绝对定量，有助于获得甲基化与食管癌之间的规律，从而实现食管癌的有效筛查。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1为本发明实施例二中的识别甲基化突变的阳性微滴比率图谱（FAM荧光）;
图2为本发明实施例二中的识别未发生甲基化突变的阳性微滴比率图谱（VIC荧光）;
图3为本发明实施例二中ZNF154检测食管癌对应ROC曲线；
图4为本发明实施例二中RNF126检测食管癌对应ROC曲线；
图5为本发明实施例二中C2ORF27A检测食管癌对应ROC曲线；
图6为本发明实施例二中OTOP2检测食管癌对应ROC曲线；
图7为本发明实施例二中TM4SF19检测食管癌对应ROC曲线；
图8为本发明实施例二中P16检测食管癌对应ROC曲线；
图9为本发明实施例二中6个基因共同检测食管癌对应ROC曲线；
图10为本发明实施例三中食管癌早期预测对应ROC曲线；
图11为本发明实施例三中食管癌中期预测对应ROC曲线；
图12为本发明实施例三中食管癌晚期预测对应ROC曲线。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明进行详细描述，以使本领域技术人员能够容易说明书的公开内容实施本发明。本发明所描述的实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明。另外，除非特别说明，本发明中所采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施；且本发明中所采用的样本均为离体样本。
实施例一 筛选甲基化检测位点与对应引物和探针
本发明通过TCGA数据获取与食管癌相关的甲基化数据进行分析，筛选具有显著差异的甲基化位点，通过多重数据过滤分析，最终筛选出ZNF154、RNF126、C2ORF27A、OTOP2、TM4SF19、P16 六个基因甲基化检测位点，这六个检测位点甲基化后的序列如SEQ ID NO.1-6所示，未甲基化的序列则如SEQ ID NO.7-12所示。
根据上述ZNF154、RNF126、C2ORF27A、OTOP2、TM4SF19、P16 的核酸序列，经申请人反复设计和推敲，筛选得到相关对应的特异性引物和探针组合，并将设计好的引物和探针送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成；具体序列如下：
1）、ZNF154甲基化检测的引物及探针组合，其包括Mut特异引物对（如SEQ ID NO：13、14所示）：上游引物5'-AGCGTCGGATGGGTTTAC-3'，下游引物5'-ACTAAACCGAAAACGACG-3'；Mut特异探针（如SEQ ID NO.25所示）5'-TTATGCAGACGTTCGT-3'；Wt特异引物对（如SEQ IDNO：31、32所示）：上游引物5'-AGAGTGGTGAATTAGGGTTTATG-3'，下游引物5'-AAGCAATAACAGAGACTACATT-3'；Wt特异探针（如SEQ ID NO.43所示）5'-ATGTGTCATGATGTTTGTGG-3'；
2）、RNF126甲基化检测的引物及探针组合，其包括Mut特异引物对（如SEQ IDNO.15、16所示）:上游引物5'-GATGAGCCGTTCAGTC-3'，下游引物5'-CTTCACACTACGCCGCA-3'；Mut特异探针（如SEQ ID NO.26所示）5'-TATCGAGATAGTTGTATTCG-3'；Wt特异引物对（如SEQID NO：33、34所示）：上游引物5'-GAGTTGTCTGTATGGAGTATGT-3'，下游引物5'-AAGTTTAATAATCTCAAACTATCCA-3'；Wt特异探针（如SEQ ID NO.44所示）5'-TTTATGTTGTTGTAAGGGTAT-3'；
3）、C2ORF27A甲基化检测的引物及探针组合，其包括Mut特异引物对（如SEQ IDNO.17、18所示）:上游引物5'-ACGATGGTCTGCGTAGG-3'，下游引物5'-TAGGACGTCGACAGACG-3'；Mut特异探针（如SEQ ID NO.27所示）5'-ATTAGCGGTATATATCGTA-3'；Wt特异引物对（如SEQ ID NO：35、36所示）：上游引物5'-GTTGGCTAGTCTTTATGAGGTAT-3'，下游引物5'-AATAACATAAGAACGAAGTC-3'；Wt特异探针（如SEQ ID NO.45所示）5'-TGGTGTGTGTTGGTTATGT-3'；
4）、OTOP2甲基化检测的引物及探针组合，其包括Mut特异引物对（如SEQ IDNO.19、20所示）:上游引物5'-GTTCGTTATTATGCGTCGA-3'，下游引物5'-GCAAAAACAACGCACGATTC-3'；Mut特异探针（如SEQ ID NO.28所示）5'-CGATTGTCTATGCAGTGA-3'；Wt特异引物对（如SEQ ID NO：37、38所示）：上游引物5'-TGTGATTTGATTAGTGAGTGGAGTTT-3'，下游引物5'-TACCATCACACAAACAAGATACAT-3'；Wt特异探针（如SEQ ID NO.46所示）5'-ATGTGTATTGATGTGTGTATTATGT-3'；
5）、TM4SF19甲基化检测的引物及探针组合，其包括Mut特异引物对（如SEQ IDNO.21、22所示）:上游引物5'-TTAGAGTCGAGATTTCTCG-3'，下游引物5'-GCTCTCGTGCACCCG-3'；Mut特异探针（如SEQ ID NO.29所示）5'-AGGTGATTCTTACTGTGTG-3'；Wt特异引物对（如SEQ ID NO：39、40所示）：上游引物5'-ATTAATGAGTTGAAATTGTTTGT-3'，下游引物5'-AAGAGTTCACCGTTGGACA-3'；Wt特异探针（如SEQ ID NO.47所示）5'-AGTAGGAGAGTGAAGGTGTT-3'；
6）、P16甲基化检测的引物及探针组合，其包括Mut特异引物对（如SEQ ID NO.23、24所示）:上游引物5'-TCGTTAGTTATAGTATTTTCAG-3'，下游引物5'-CTATTCTATCTCCGATACTAC-3'；Mut特异探针（如SEQ ID NO.30所示）5'-CGTATACGGGCGTCTTTT-3'；Wt特异引物对（如SEQ ID NO：41、42所示）：上游引物5'-TTGGAGGTAATCGTATTTTTTATTG-3'，下游引物5'-TAACATTATCTGGCACATTGTAACA-3'；Wt特异探针（如SEQ ID NO.48所示）5'-TTAGTGTATTGTGTATTAATG-3'。
其中，Mut特异引物为识别对应基因甲基化突变的引物，Wt特异引物为识别对应基因未发生甲基化突变的引物，Mut特异探针为识别对应基因甲基化突变的探针，Wt特异探针为识别对应基因未发生甲基化突变的探针。
本发明试剂盒包括特征检测试剂，所述特征检测试剂包括染料定量PCR预混液和如上六个基因甲基化检测位点所对应的引物及探针组合；其中染料定量PCR预混液可选自来自佰孟医学的染料定量PCR预混液。
且需要说明的是，本发明探针依据SNP分型设计原理，只有正确结合突变位点的探针才会在DNA聚合酶5'外切酶活性下得以切割，从而释放荧光信号，从而与特异性引物一起增加多位点突变识别的特异性；同时部分引入MGB的作用，增加探针与模板结合的稳定性，来缩短探针的长度提高结合的特异性。本发明在设计Mut特异探针和Wt特异探针时，需遵循下列原则：
a）探针Tm值在65-67 ℃之间，同一甲基化检测位点的Mut特异探针和Wt特异探针之间的Tm值相差1℃以内；
b）探针长度在13-25 bp之间；
c）将突变位点置于探针的1/3处，或者接近探针的3'端但不置于最后两个碱基处；
d）探针的5'端的碱基不能为G；
e）探针的5'端与同方向引物的3’端之间的距离，由近至远控制在1-20 bp的范围以内；
f）探针与目的片段的特异性结合强、效率高。
实施例二 灵敏度和特异性的验证
本实施例取300例食管癌血液样本和300例正常血液样本用以建立甲基化程度评估模型。
1、样本的保存：血液样本由医护人员采集于抗凝保存管中，在常温环境下平稳运送至实验室，自采集之时到处理完成控制在3日之内。
2、DNA的制备：获取相关癌症的血液标本；应用白垩纪磁珠法通用型DNA提取试剂盒提取基因组DNA，取出200μL血液白膜层加入300μL裂解缓冲液（Buffer AL），于58℃放置15 min后加入300μL异丙醇、15μL提取缓冲液（MB Mix）混匀，然后纯化；应用美基磁珠法血浆游离DNA提取试剂盒提取游离DNA（cfDNA），在2 ml血浆中依次加入200μL蛋白酶K、2 ml裂解液、125μL磁珠悬浮液并混匀孵育10 min，经2 ml洗涤液清洗后于56℃干燥8 min，最后利用50μL洗脱液收集；然后通过Qbuit测定浓度，得到该DNA的含量。
3、亚硫酸盐修饰：取2000 ng上述制备的cfDNA或基因组DNA，投入到配置好的嘧啶转换反应液（CT Conversion Mix）中，混匀并短暂离心，接着放入PCR仪中反应，待PCR仪反应结束，通过EpiArt DNA Column纯化转化产物，得处理后的DNA即硫化模板；且其中PCR仪反应程序为98℃/10 min，64℃/40 min，98℃/5 min，64℃/40 min，98℃/5 min，64℃/40min，4℃/hold。
4、数字PCR：首先配制30 μL反应体系：包括1μL上述的硫化模板、2.4μL浓度为10μM的上下游引物、0.75μL浓度为10μM的Mut/Wt探针、15 μL的染料定量PCR预混液（SYBR GreenMix）、8.45μL的水；然后通过微滴生成仪生成反应微滴，启动样本制备仪，进行自检；自检完成后，打开仪器上盖，先将8联排管（试剂盒提供）放入仪器相应位置，将微液滴生成芯片装入配套的生成芯片机械卡具中，压下卡具上盖固定芯片，在水孔中加入30μL待测样本，在油孔中加入180μL微液滴生成油，然后将芯片的水孔和油孔盖上微液滴生成芯片密封垫；将装有微液滴生成芯片的卡具放入仪器相应位置；接着压下把手固定，盖上仪器上盖；操作仪器运行，生成微液滴；微液滴生成完毕后，取出卡具，将含有微液滴的8联排管盖上8联排管盖，待用；一般5分钟内即可完成制备微滴这个步骤。之后将装有制备好的微滴反应液的8联管置于PCR仪中反应，PCR反应条件如下：
需要说明的是，退火温度依据各引物组合的TM值在56-62℃之间选择。
5、微滴读取与信号分析：将上述数字PCR反应完成的8联管放入微滴读取芯片的相应卡槽中，并在规定孔槽中加入适量的微滴检测油；待读取芯片装备完成，放入芯片读取仪中，每个样本需要大约5分钟的时间即可读取结果；最终获得阳性微滴比率图（如图1与图2所示），图1中4个分区依次为背景孔、多位点100%非甲基化孔、多位点100%甲基化孔、样本孔的微滴情况，图2中4个分区依次为背景孔、多位点100%甲基化孔、多位点100%非甲基化孔、样本孔的微滴情况；参照图1与图2可知，分别在多位点100%甲基化和多位点非100%甲基化的DNA质粒对照下，得到样本孔中阳性微滴和阴性微滴的数目。
6、绘制对应ROC曲线：在样本的检测中，分别以FPR=FP/（FP+TN） 为横坐标、TPR=TP/（TP+FN）为纵坐标绘制ROC曲线（其中，TP表示预测和实际都为阴性的样例数；FN表示预测为阳性，而实际为阴性的样例数；FP表示预测为阴性，而实际为阳性的样例数；TN表示预测和实际都为阳性的样例数）；则ZNF154、RNF126、C2ORF27A、OTOP2、TM4SF19、P16、及此6个基因共同检测食管癌对应ROC曲线分别如图4-9所示。
7、结果分析：参照图4至图9，可知用单个基因来检测食管癌，分别得到ZNF154对应ROC曲线的AUC值为0.949，RNF126对应ROC曲线的AUC值为0.907，C2ORF27A对应ROC曲线的AUC值为0.912，OTOP2对应ROC曲线的AUC值为0.906，TM4SF19对应ROC曲线的AUC值为0.911，P16对应ROC曲线的AUC值为0.891；而用6个基因共同检测食管癌，对应ROC曲线的AUC值为0.96。
而按照Ct值小于Cutoff值的标准来判定扩增阳性，这6个基因的Cutoff值分别为38.12、37.77、40.68、38.26、42.92、38.47，然后根据阳性微滴比率计算甲基化水平，并判断甲基化程度。当检测基因的甲基化水平高于50%时视为强甲基化程度，只要检测基因为强甲基化，即判定这个样本为食管癌阳性样本，否则视为食管癌阴性样本。最终6个基因在此标准的共同检测下，食管癌的检测灵敏度提高至91%，检测特异性达到99%；本实施例中样本的检测情况如下表1所示。
表1. 食管癌和正常样本的检测情况
8、
9、通过上述ZNF154、RNF126、C2ORF27A、OTOP2、TM4SF19、P16的同时检测来实时分析血液样本的DNA，充分论证了检测结果的正确性和可靠性。
实施例三 建立预测模型与对样本的分期判定
本实施采用50例早期、50例中期、50例晚期食管癌样本建立甲基化基因数目预测模型，并对80例样本进行分期判定。
为了方便描述与区别，本实施例仅对与实施例二不同之处进行阐述。本实施例中的步骤（1）-（5）同样采用实施例二中样本的保存、DNA的制备、亚硫酸盐修饰、数字PCR、微滴读取与信号分析这五个步骤，此处不再重复描述。
（6）、检测发现，伴随食管癌的发展，更多基因检测结果出现阳性，且采用数量不同的基因检测时，不同时期食管癌样本的检出情况不同（如图2所示）；具体地，采用1个基因检测时，可以识别出66%早期样本；采用2个基因检测时，可以识别100%早期样本和4%中期样本；采用3个基因检测时，可以识别54%中期样本；采用4个基因检测时，可以识别96%中期样本和8%晚期样本；采用5个基因检测时，可以识别100%早期样本和90%晚期样本；采用6个基因检测时，可以识别100%晚期样本。
表2. 不同时期食管癌样本的检出情况
（7）、按照检测的阳性基因数来判断样本的时期，分别以FPR=FPR=FP/（FP+TN）为横坐标、TPR=TP /（TP+FN）为纵坐标绘制ROC曲线。其中：
FN表示预测为目标时期，而实际为其他时期的样例数；
FP表示预测为其他时期，而实际为目标时期的样例数；
TN表示预测和实际都为目标时期的样例数。
从而绘制食管癌早期、中期、晚期预测对应ROC曲线（如图10-12），从图10-12中分别得到食管癌早期预测对应ROC曲线的AUC值为0.983、食管癌中期预测对应ROC曲线的AUC值为0.967、食管癌晚期预测对应ROC曲线的AUC值为0.934。
（8）且通过分析本实施例的50例早期、50例中期、50例晚期样本检测结果发现，不同数量阳性基因与不同时期食管癌样本的联系如下表3所示。
表3. 不同数量阳性基因与不同时期食管癌样本的联系
当仅有2个以下基因甲基化检测阳性时，食管癌早期样本的特异性较高，我们预测该患者处于食管癌早期阶段；当出现3至4个基因甲基化检测阳性时，食管癌中期样本的特异性较高，我们预测该患者处于食管癌中期阶段；当出现5至6个基因甲基化阳性时，食管癌晚期的特异性较高，我们预测该患者处于食管癌晚期阶段。在此标准下，对80例样本进行分期预测判断，同时进行内镜金标准检验作为参照，结果见如下表4。
表4. 食管癌样本的分期判断
由表4可以看出，本发明预测产生的误差较小、一致性较高。
综上，本发明提供一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，具有高灵敏度和特异性的特点，且操作方便快捷；通过形成基因甲基化的组合，实现对食管癌样本的早期筛查；且本发明试剂盒与数字PCR平台相结合，基于可绝对定量、批次间稳定性高、灵敏度高的优势，能够准确分辨样本基因甲基化与食管癌之间的规律；同时采用荧光标记探针进行分型检测，特异性强，适用于不同时期的食管癌患者本；从而为食管癌早期筛查、诊断、预后提供方便、快捷、准确的检测手段，具有重要的临床价值。
且本发明可用于建立甲基化程度评估模型和多基因的预测组合，并应用于临床样本多甲基化位点的同时检测；通过将Ct值小于Cutoff值的样本确定为甲基化阳性，从而基于多位点的甲基化阳性，筛查出具有食管癌风险的早期患者、区分不同时期的食管癌患者、了解其他组织中食管癌的扩散情况。
此外，需要说明的是，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒所检测的食管癌基因甲基化检测位点包括ZNF154、RNF126、C2ORF27A、OTOP2、TM4SF19、P16，其序列如SEQ ID NO.1-12所示；且该试剂盒包括特征检测试剂，所述特征检测试剂包括染料定量PCR预混液和如下引物及探针组合：
1）、ZNF154甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.13所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.14所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.25所示的Mut特异探针及如SEQ IDNO.31所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.32所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.43所示的Wt特异探针；
2）、RNF126甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.15所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.16所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.26所示的Mut特异探针及如SEQ IDNO.33所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.34所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.44所示的Wt特异探针；
3）、C2ORF27A甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.17所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.18所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.27所示的Mut特异探针及如SEQ IDNO.35所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.36所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.45所示的Wt特异探针；
4）、OTOP2甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.19所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.20所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.28所示的Mut特异探针及如SEQ IDNO.37所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.38所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.46所示的Wt特异探针；
5）、TM4SF19甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.21所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.22所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.29所示的Mut特异探针及如SEQ IDNO.39所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.40所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.47所示的Wt特异探针；
6）、P16甲基化检测的引物及探针组合，其包括如SEQ ID NO.23所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.24所示的Mut特异引物、如SEQ ID NO.30所示的Mut特异探针及如SEQ ID NO.41所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.42所示的Wt特异引物、如SEQ ID NO.48所示的Wt特异探针。
2.根据权利要求1所述的基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其特征在于：所述染料定量PCR预混液为来自佰孟医学的染料定量PCR预混液。
3.根据权利要求1所述的基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测样本类型为离体的血液样本。
4.根据权利要求1所述的基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其特征在于：所述特异探针的5'端均包含荧光基团，所述的荧光基团包含FAM、VIC；具体地，Mut特异探针的荧光基团选用FAM，Wt特异探针的荧光基团选用VIC。
5.根据权利要求1所述的基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其特征在于：所述特异探针的3'端均包含猝灭基团，所述猝灭基团为MGB。
6.根据权利要求1所述的基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系如下：包括1μL处理后的DNA即硫化模板、2.4μL浓度为10μM的上下游引物、0.75μL浓度为10μM的Mut/Wt探针、15μL的染料定量PCR预混液、及8.45 μL的水混合成均匀的30μL体系。
7.根据权利要求1所述的基于多基因甲基化水平检测的食管癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应条件如下（以微滴为单位）：
。
8.一种基于多基因甲基化水平检测的食管癌检测方法，其特征在于：包括如下具体步骤：
（1）、采用磁珠法提取待检测的离体血液样本即血浆中的cfDNA或提取白细胞中的基因组DNA；
（2）、用重亚硫酸盐法转化处理待检测的cfDNA或基因组DNA；
（3）、采用PCR技术检测经步骤（2）转化后的DNA的甲基化状态。
9.根据权利要求8所述基于多基因甲基化水平检测的食管癌检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，采用白垩纪磁珠法通用型DNA提取试剂盒提取基因组DNA；采用美基磁珠法血浆游离DNA提取试剂盒提取cfDNA。
10.根据权利要求8所述基于多基因甲基化水平检测的食管癌检测方法，其特征在于：所述步骤（2）的具体操作为：
取2000 ng步骤（1）提取获得的cfDNA或基因组DNA投入到配置好的嘧啶转换反应液中，混匀并离心，接着放入PCR仪中反应并通过DNA吸附柱纯化，且PCR程序为98℃/10 min，64℃/40 min，98℃/5 min，64℃/40 min，98℃/5 min，64℃/40 min，4℃/hold。
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