RU2779550C1 - Способ для диагностирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК - Google Patents
Способ для диагностирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2779550C1 RU2779550C1 RU2021118062A RU2021118062A RU2779550C1 RU 2779550 C1 RU2779550 C1 RU 2779550C1 RU 2021118062 A RU2021118062 A RU 2021118062A RU 2021118062 A RU2021118062 A RU 2021118062A RU 2779550 C1 RU2779550 C1 RU 2779550C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ovarian cancer
- genes
- methylation
- markers
- coding rna
- Prior art date
Links
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 229920003003 Telomeric non-coding RNA Polymers 0.000 title claims abstract description 12
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 6
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000035533 AUC Effects 0.000 description 3
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 102100017491 ACTN1 Human genes 0.000 description 1
- 101700056226 ACTN1 Proteins 0.000 description 1
- 208000000058 Anaplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 102000007122 Fanconi Anemia Complementation Group G Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010033305 Fanconi Anemia Complementation Group G Protein Proteins 0.000 description 1
- 201000000127 Fanconi anemia complementation group G Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- 102100003724 PLLP Human genes 0.000 description 1
- 101700070861 PLLP Proteins 0.000 description 1
- 102100013040 RUNX3 Human genes 0.000 description 1
- 101700072077 RUNX3 Proteins 0.000 description 1
- 102100012980 TNFRSF10B Human genes 0.000 description 1
- 101710030970 TNFRSF10B Proteins 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant Effects 0.000 description 1
- 108060003434 alpha Proteins 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic Effects 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000771 oncological Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 201000001539 ovarian carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности молекулярной и клинической онкологии. Описан способ для диагностики рака яичников на основе группы генов длинных некодирующих РНК путем выявления метилирования по крайней мере одного маркера из трех, согласно изобретению маркерами являются гены: SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3. Заявляемый способ позволяет выявить рак яичников с высокой клинической чувствительностью и специфичностью. 1 ил., 3 табл., 3 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к области молекулярной и клинической онкологии, и касается системы маркеров для диагностики рака яичников путем оценки статуса метилирования набора генов длинных не кодирующих белок РНК (нкРНК): SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3. Заявленный способ, основанный на анализе метилирования набора из трех генов длинных нкРНК, позволяет со 100%-ой специфичностью и почти со 100%-ой чувствительностью диагностировать рак яичников. Выявление метилирования хотя бы одного из генов данного набора в предположительно пораженной раком ткани яичников позволяет с высокой достоверностью диагностировать рак яичников у данной пациентки.
Рак яичников (РЯ) - наиболее злокачественное онкогинекологическое заболевание у женщин. РЯ протекает практически бессимптомно вплоть до запущенных стадий, осложненных метастазированием и образованием асцита [1]. Для своевременной диагностики РЯ необходимо открытие новых более эффективных молекулярных маркеров. Длинные некодирующие белок РНК (нкРНК) отмечены как важные регуляторы клеточных процессов и потенциальные биологические маркеры онкологических заболеваний, включая РЯ [2]. Эпигенетические маркеры, включая метилирование супрессорных генов и профили метилирования генов микроРНК перспективны в диагностике рака, в частности рака яичников [3].
Нами обнаружено гиперметилирование целого ряда генов длинных нкРНК в опухолях больных РЯ в отличие от парных гистологически нормальных тканей яичников от тех же пациенток и в отличие от тканей яичников «доноров» (людей, умерших от неонкологических заболеваний). Анализ метилирования трех генов SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3, для которых гиперметилирование в опухолях РЯ обнаружено нами ВПЕРВЫЕ, мы предлагаем использовать как способ для диагностирования РЯ.
Ранее в патенте США (U.S. Pat. No. 7,507,536 (2009)) был предложен набор генов (TM4SF11, TNFRSF10B, RUNX3, ACTN1, FANCG) для диагностики и прогноза рака яичников [4]. Выявление метилирования хотя бы в одном маркере этой группы генов рассматривается как выявление предрасположенности к возникновению РЯ. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.
В другом патенте США (U.S. Pat. No. 9,410,956 (2016)) описаны маркеры для идентификации рака яичников и предсказания клинической картины заболевания, основанные на анализе изменений экспрессии группы генов микроРНК [5]. Аберрантная экспрессия 4 микроРНК (miR-214, -199а*, -200а и -100) была выявлена примерно в половине или более случаев РЯ, преимущественно на поздних стадиях и при высокой степени анаплазии. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.
В качестве ближайшего аналога рассмотрим патент РФ (RU 2703399 С1, 16.10.2019), в котором описан способ для диагностики рака яичников, основанный на анализе метилирования группы генов микроРНК (miR-124a-3, -129-2, -193а, -107) [6]. Этот способ позволяет диагностировать рак яичников со 100%-специфичностью и с клинической чувствительностью 87%.
Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал способов диагностирования рака яичников за счет применения новых маркеров на основе генов длинных нкРНК.
Задача решена путем:
- разработки заявляемого способа диагностики рака яичников на основе анализа уровня метилирования набора из трех генов длинных нкРНК (SSTR5-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3), который позволяет выявлять РЯ путем обнаружения метилирования, по крайней мере, у одного гена из этого набора
Диагностику рака яичников осуществляют по методу:
Берут образцы ткани яичников у лиц, обследуемых для выявления онкологического заболевания или с установленным диагнозом. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани яичников проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Анализ уровня метилирования генов длинных нкРНК проводят с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (qMSP) с детекцией в реальном времени, как описано в работе [7]. Для оценки значимости различий применяют непараметрический критерий Манна-Уитни.
Различия считают значимыми при p<0.05. Расчеты проводят в системе для статистического анализа данных IBM SPSS Statistics 22. Статус метилирования каждого гена в каждом образце опухолей РЯ и нормальных тканей яичников пост-мортальных «доноров» оценивают с применением порогового уровня. Для набора генов длинных нкРНК рассчитывают специфичность и чувствительность набора маркеров методом ROC-анализа.
Пример 1. Анализ уровня метилирования трех генов длинных нкРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3, используемых в заявляемом способе для диагностики рака яичников.
Для анализа метилирования каждого гена используют две пары праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Таблица 1). Используют набор реактивов «qPCRmix-HS SYBR» по протоколу фирмы Евроген. Амплификацию проводят в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяют с помощью контрольного локуса АСТВ с использованием олигонуклеотидов специфичных к неконвертированной матрице [7]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяют локус АСТВ с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Scientific, США). Соотношение уровней метилирования и их значимость оценивают с применением непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считают значимыми при р<0.05. Уровень метилирования 3 генов днРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3 определен в 18 образцах нормальных яичников от пост-мортальных лиц без онкопатологии в анамнезе (Таблица 2) и в 44 образцах опухолей рака яичников (Таблица 3).
Пример 2. Оценка статуса метилирования 3 генов длинных нкРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3 в образцах рака яичников с учетом порогового уровня. Для выявления факта гиперметилирования исследуемых генов длинных нкРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3 в опухолях рака яичников (РЯ) был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена на основании данных, полученных для «доноров» (Таблица 2). Пороговый уровень равен N(mean) + 2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в норме («доноры»), SD - стандартное отклонение [8]. Для двух генов (SSTR5-AS1 и MAGI2-AS3) гиперметилирование установлено во всех 44 образцах опухолей РЯ (Таблица 3). Для гена KCNK15-AS1 отмечено снижение уровня ниже порогового в единственном образце (#29) из 44 образцов РЯ (Таблица 3).
Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемого способа для диагностики рака яичников на основе набора маркеров {SSTR5-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3).
Важным свойством заявляемого способа и набора маркеров для диагностики рака яичников является высокая клиническая чувствительность и специфичность. Так как метилирование 3 маркеров этого набора не выявлено ни в одном из 18 исследованных образцов доноров (таблица 3), то есть ложноположительные результаты не обнаружены, можно утверждать о возможности использовать заявляемый способ и набор маркеров для диагностики рака яичников со 100%-специфичностью. При этом отсутствие метилирования в опухолях РЯ среди 44 пациенток выявлено только у одного из маркеров и только в единственном образце (№29) (1/44, 2,3%), а в 88% случаев метилирование выявлено и в этом маркере тоже. В соответствии с этими данными, клиническая чувствительность и специфичность заявляемого способа и набора маркеров для диагностирования рака яичников, рассчитанная методом ROC-анализа, составляют 98% и 100%), соответственно, величина AUC (Area Under the ROC Curve) составила 0,989. Таким образом, заявляемый способ позволяет диагностировать рак яичников с 98%-ой клинической чувствительностью и со 100%-специфичностью, то есть строго специфично - у пациенток истинно больных раком яичников. Анализ характеристик набора маркеров методом ROC-анализа показан на Фигуре (Графике). Согласно параметрам, оценивающим набор маркеров (в частности - критерий > 0), достаточно выявления метилирования хотя бы одного из трех маркеров данного набора для диагностирования злокачественных опухолей яичников у пациентки.
Заявляемый способ для диагностирования рака яичников характеризуются тем, что
- Позволяет диагностировать рак яичников с высокой 98%-ой клинической чувствительностью и 100%-специфичностью при величине AUC, характеризующей надежность отобранного набора маркеров, близкой к единице (0,989). Рассмотренный ближайший аналог (RU 2703399 С1, 16.10.2019) [6] позволяет диагностировать рак яичников с меньшей чувствительностью (87%) и при меньшей величине AUC (0,936).
Цитированные источники научно-технической информации:
1. Braga ЕА, Fridman MV, Kushlinskii NE. Molecular Mechanisms of Ovarian Carcinoma Metastasis: Key Genes and Regulatory MicroRNAs. Biochemistry (Mosc). 2017 May; 82(5):529-541. doi: 10.1134/S0006297917050017. PMID: 28601063.
2. Braga EA, Fridman MV, Moscovtsev AA, Filippova EA, Dmitriev AA, Kushlinskii NE. LncRNAs in Ovarian Cancer Progression, Metastasis, and Main Pathways: ceRNA and Alternative Mechanisms. Int J Mol Sci. 2020 Nov 23; 21(22):8855. doi: 10.3390/ijms21228855. PMID: 33238475.
3. Dong, A., Lu, Y., Lu, B. (2016) Genomic/Epigenomic Alterations in ovarian carcinoma: translational insight into clinical practice, J. Cancer, 7, 1441-1451.
4. U.S. Pat. No. 7,507,536 (2009) Van Criekinge et al. Methylation markers for diagnosis and treatment of ovarian cancer.
5. U.S. Pat. No. 9,410,956 (2016) Cheng; Jin Q. Micro-RNA profiling in ovarian cancer.
6. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Брага Э.А., Бурденный A.M., Пронина И.В., Филиппова Е.А., Казубская Т.П. Способ для диагностики рака яичников на основе группы генов микроРНК. Патент на изобретение RU 2703399 С1, 16.10.2019. Заявка №2018138755 от 02.11.2018.
7. Hattermann K., Mehdorn Н.М., Mentlein R., Schultka S., Held-Feindt J. A methylation-specific and SYBR-green-based quantitative polymerase chain reaction technique for 06-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation analysis. Analytical Biochemistry. 2008. Vol. 377, N 1, 62-71. doi 10.1016/j.ab.2008.03.014.
8. Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, Brakensiek K, Becker T, Klempnauer J, Schlegelberger B, Kreipe H, Flemming P. Distinct methylation patterns of benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation profiling. Clin Cancer Res. 2005 May 15; 11(10):3654-60. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2462
Claims (1)
- Способ для диагностики рака яичников на основе группы генов длинных некодирующих РНК путем выявления метилирования по крайней мере одного маркера из трех, отличающийся тем, что маркерами являются гены: SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2779550C1 true RU2779550C1 (ru) | 2022-09-08 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807396C1 (ru) * | 2022-12-09 | 2023-11-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики I-II стадий серозного рака яичников высокой степени злокачественности по липидному профилю сыворотки крови |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011095623A2 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-11 | Febit Holding Gmbh | miRNA IN THE DIAGNOSIS OF OVARIAN CANCER |
| WO2011127219A1 (en) * | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| RU2642989C1 (ru) * | 2016-12-19 | 2018-01-29 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ") | Способ диагностики онкологических заболеваний |
| RU2703399C1 (ru) * | 2018-11-02 | 2019-10-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Способ для диагностики рака яичников на основе группы генов микроРНК |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011095623A2 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-11 | Febit Holding Gmbh | miRNA IN THE DIAGNOSIS OF OVARIAN CANCER |
| WO2011127219A1 (en) * | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| RU2642989C1 (ru) * | 2016-12-19 | 2018-01-29 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ") | Способ диагностики онкологических заболеваний |
| RU2703399C1 (ru) * | 2018-11-02 | 2019-10-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Способ для диагностики рака яичников на основе группы генов микроРНК |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807396C1 (ru) * | 2022-12-09 | 2023-11-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики I-II стадий серозного рака яичников высокой степени злокачественности по липидному профилю сыворотки крови |
| RU2807480C1 (ru) * | 2022-12-29 | 2023-11-15 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Способ для прогноза метастазирования рака молочной железы на основе набора генов длинных некодирующих РНК |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Toiyama et al. | DNA methylation and microRNA biomarkers for noninvasive detection of gastric and colorectal cancer | |
| EP3245604B1 (en) | Method and system for determining cancer status | |
| DK2898100T3 (en) | NON-INVASIVE DETERMINATION OF A FOSTER METHYLOM OR PLASMA TUMOR | |
| EP3658684B1 (en) | Enhancement of cancer screening using cell-free viral nucleic acids | |
| Fang et al. | Genome-wide analysis of aberrant DNA methylation for identification of potential biomarkers in colorectal cancer patients | |
| CN113785076A (zh) | 预测癌症预后的方法及其组合物 | |
| WO2015073949A1 (en) | Method of subtyping high-grade bladder cancer and uses thereof | |
| EP2982986B1 (en) | Method for manufacturing gastric cancer prognosis prediction model | |
| US10457988B2 (en) | MiRNAs as diagnostic markers | |
| WO2018009705A1 (en) | Liver cancer methylation markers and uses thereof | |
| EP2707506A2 (en) | Method of detecting cancer through generalized loss of stability of epigenetic domains, and compositions thereof | |
| CA2847290A1 (en) | Gene biomarkers for prediction of susceptibility of ovarian neoplasms and/or prognosis or malignancy of ovarian cancers | |
| US20170204471A1 (en) | Methods and nucleotide fragments of predicting occurrence, metastasis of cancers and patients' postoperative survival in vitro | |
| EP2657348B1 (en) | Diagnostic miRNA profiles in multiple sclerosis | |
| KR102096498B1 (ko) | 대장암 진단 또는 재발 예측을 위한 마이크로RNA-4732-5p 및 이의 용도 | |
| WO2018158589A1 (en) | Diagnostic and prognostic methods | |
| WO2016044142A1 (en) | Bladder cancer detection and monitoring | |
| JP2017502699A (ja) | Ｍｉｒｎａ比率を使用する肺がん決定 | |
| RU2779550C1 (ru) | Способ для диагностирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК | |
| CN107119144B (zh) | 多功能转录调控因子ctcf的dna结合位点ctcf_55的应用 | |
| WO2017119510A1 (ja) | 乳がんの診断のための検査方法、遺伝子マーカー、および検査薬 | |
| KR102096499B1 (ko) | 대장암 진단 또는 재발 예측을 위한 마이크로rna-3960 및 이의 용도 | |
| RU2807480C1 (ru) | Способ для прогноза метастазирования рака молочной железы на основе набора генов длинных некодирующих РНК | |
| RU2795976C1 (ru) | Способ для диагностирования рака молочной железы на основе набора генов длинных некодирующих РНК | |
| WO2022188776A1 (zh) | 可用于胃癌her2伴随诊断的基因甲基化标记物或其组合和应用 |