CN117538474A - 一种代谢标记结合lc-ms检测dna去甲基化的方法及其应用 - Google Patents

一种代谢标记结合lc-ms检测dna去甲基化的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117538474A
CN117538474A CN202311485717.5A CN202311485717A CN117538474A CN 117538474 A CN117538474 A CN 117538474A CN 202311485717 A CN202311485717 A CN 202311485717A CN 117538474 A CN117538474 A CN 117538474A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluoro
cytosine
dna
cells
genome dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311485717.5A
Other languages
English (en)
Inventor
冯阳
陈胜军
赵永强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Original Assignee
South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences filed Critical South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority to CN202311485717.5A priority Critical patent/CN117538474A/zh
Publication of CN117538474A publication Critical patent/CN117538474A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/89—Inverse chromatography

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种代谢标记结合LC‑MS检测DNA去甲基化的方法及其应用，涉及生物检测技术领域。该方法包括以下步骤：利用氟代‑5‑醛基胞嘧啶(或氟代‑5‑羧基胞嘧啶)对细胞进行代谢标记后，提取得到代谢标记细胞的基因组DNA；对所述基因组DNA进行酶解，使其裂解成核苷；对所述核苷进行液相色谱‑质谱分析，使用反相色谱柱，在正离子模式下检测得到所述氟代‑5‑醛基胞嘧啶(或氟代‑5‑羧基胞嘧啶)及其代谢产物氟代‑胞嘧啶的含量。该方法灵敏度高，准确性强，适用性广，适用于新型DNA去甲基化通路的研究。

Description

一种代谢标记结合LC-MS检测DNA去甲基化的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种代谢标记结合LC-MS检测DNA去甲基化的方法及其应用。
背景技术
5-甲基胞嘧啶(5mC)是高等真核生物中最重要的表观遗传学修饰。5mC修饰对于基因印记、X染色体失活、调控细胞命运和维持基因组的稳定性具有重要的意义。基因组DNA中的5mC是一种动态、可逆的修饰。5mC的形成是在DNA胞嘧啶甲基转移酶(DNMT)催化下，将硫代腺苷甲硫氨酸的甲基转移到DNA胞嘧啶碱基的C5位上生成5-甲基胞嘧啶。而5mC可以经过多条通路进行去甲基化。其中，TET蛋白可以连续氧化5mC形成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，随后TDG糖苷酶识别并切断5fC和5caC的糖苷键形成无碱基位点(AP sites)，进而通过碱基切除修复(BER)恢复成未甲基化的胞嘧啶。上述去甲基化过程被称为TET-TDG-BER，是5mC的特征去甲基化机制。基于TET-TDG-BER的去甲基化通路会产生DNA链的断裂，因此会造成基因突变，危害基因组的稳定性和完整性。而潜在的5fC直接脱醛基和5caC直接脱羧基的DNA去甲基化通路，不涉及TDG糖苷酶切割糖苷键和BER修复过程，从而避免了由于DNA链的断裂造成的基因组的不稳定性和不完整性。因此，急需对这两条新型的DNA去甲基化通路进行证实。
一直以来，对5fC直接脱醛基和5caC直接脱羧基的DNA去甲基化通路的分析，存在着以下的难点：首先，5fC脱醛基和5caC脱羧基的产物均为胞嘧啶(dC)，因此无法与基因组中天然存在的dC进行区分；其次，5fC和5caC等修饰核苷在质谱中的响应较差，并且会受到正常的未修饰核苷的干扰。因此，分析新型DNA去甲基化通路的方法要兼具高灵敏度和该选择性。LC-MS法具备较高的灵敏度和较好的定性能力，已经成为分析核酸修饰的最重要的技术手段。然而，直接使用LC-MS法进行分析，仍然不能直接鉴定出5fC直接脱醛基和5caC直接脱羧基的DNA去甲基化新通路。因此，在新型DNA去甲基化通路的分析中，亟需结合其他技术手段，发展一种新颖的、高灵敏度和高准确性的分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种代谢标记结合LC-MS检测DNA去甲基化的方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该方法灵敏度高，准确性强，适用性广，适用于新型DNA去甲基化通路的研究。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种代谢标记结合LC-MS检测5fC直接脱醛基的DNA去甲基化的方法，包括以下步骤：
利用氟代-5-醛基胞嘧啶对细胞进行代谢标记后，提取得到代谢标记细胞的基因组DNA；
对所述基因组DNA进行酶解，使其裂解成核苷；
对所述核苷进行液相色谱-质谱分析，使用反相色谱柱，在正离子模式下检测得到所述氟代-5-醛基胞嘧啶及其脱醛基产物氟代-胞嘧啶的含量。
进一步地，所述氟代-5-醛基胞嘧啶的代谢标记浓度为300μM。
进一步地，所述酶解采用的酶包括S1核酸酶、磷酸二酯酶、碱性磷酸酶和DNAse I酶。
进一步地，所述液相色谱-质谱分析中，采用的流动相为0.01％甲酸水-甲醇。
本发明还提供一种代谢标记结合LC-MS检测5caC直接脱羧基的DNA去甲基化的方法，包括以下步骤：
利用氟代-5-羧基胞嘧啶对细胞进行代谢标记后，提取得到代谢标记细胞的基因组DNA；
对所述基因组DNA进行酶解，使其裂解成核苷；
对所述核苷进行液相色谱-质谱分析，使用反相色谱柱，在正离子模式下检测得到所述氟代-5-羧基胞嘧啶及其脱羧基产物氟代-胞嘧啶的含量。
进一步地，所述氟代-5-羧基胞嘧啶的代谢标记浓度为300μM。
进一步地，所述酶解采用的酶包括S1核酸酶、磷酸二酯酶、碱性磷酸酶和DNAse I酶。
进一步地，所述液相色谱-质谱分析中，采用的流动相为0.01％甲酸水-甲醇。
本发明还提供上述的检测5fC直接脱醛基的DNA去甲基化的方法和/或检测5caC直接脱羧基的DNA去甲基化的方法在新型DNA去甲基化通路分析中的应用。
进一步地，所述新型DNA去甲基化通路在胚胎干细胞分化过程中的活性变化，进行动态分析的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用氟代-5-醛基胞嘧啶和氟代-5-羧基胞嘧啶作为代谢标记探针，分别将这两种探针加入培养基中，两者会被代谢掺入到细胞基因组DNA中，随后会发生脱醛基和脱羧基反应，从而生成氟代-胞嘧啶。通过利用LC-MS法对氟代-5-醛基胞嘧啶/氟代-5-羧基胞嘧啶及其脱醛基/脱羧基产物氟代-胞嘧啶和再次甲基化产物F-5mC进行分析，从而可以分析DNA中直接脱醛基和直接脱羧基的新型去甲基化通路。(图1)。
本发明提供的新型DNA去甲基化通路的分析方法，使用氟代核酸作为探针分子，其未见明显的细胞毒性，也未见对细胞中的生物学转变过程的影响；且相较于天然核酸分子，其在LC-MS法分析中具备较高的灵敏度，有利于进行检测，因此，该方法可以适用于新型DNA去甲基化通路的研究。
本发明的方法灵敏度高，准确性强，适用性广，可以用于研究胚胎干细胞分化过程中新型DNA去甲基化通路的动态变化，为揭示胚胎干细胞定向分化的表观遗传学基础提供了宝贵的工具，并且在药物模型和再生医学研究领域中具备广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明技术路线的示意图；
图2为F-5fC和F-5caC两种探针分子的合成路线图；其中，a代表叔丁基二甲基氯硅烷，咪唑，吡啶，室温，20h；b代表碘，硝酸铈铵，乙腈，60℃，3h；c代表一氧化碳，双(乙腈)二氯化钯，二异丙基乙胺，甲醇，60℃，12h；d代表吡啶氢氟酸，乙酸乙酯，室温，15h；e代表氢氧化锂，水：乙腈(1:1)，室温，16h；f代表三苯基膦，三丁基氢化锡，三(二亚苄基丙酮)二钯-氯仿加合物，一氧化碳，甲苯，65℃，12h；g代表吡啶氢氟酸，乙酸乙酯，室温，15h；
图3为实施例1合成的F-5fC(A)和F-5caC(B)的核磁谱图；
图4为本发明中分别利用F-5fC和F-5caC进行代谢标记并结合LC-MS分析的示意图；其中，A为利用F-5fC或F-5caC代谢标记的示意图；B为F-5fC、F-5caC、F-dC和F-5mC的化学结构图；C为用LC-MS法检测的核苷的提取离子色谱图；
图5为实施例2中检测小鼠胚胎干细胞(mESC)中新型DNA去甲基化通路的色谱图；其中A为利用300μM F-5fC代谢标记后，mESCs基因组DNA中F-5fC、F-dC和F-5mC的提取离子色谱图；B为利用300μM F-5caC代谢标记后，mESCs基因组DNA中F-5caC、F-dC和F-5mC的提取离子色谱图；
图6为实施例3检测小鼠胚胎干细胞(mESC)分化形成小鼠神经元细胞(mNeuron)过程中，动态5fC脱醛基和5caC脱羧基的结果；其中，A为利用300μM F-5fC代谢标记后，mESC、小鼠拟胚体(mEB)、小鼠神经干细胞(mNSC)和mNeuron的基因组DNA中，F-5fC、F-dC和F-5mC的定量分析结果；B为利用300μM F-5caC代谢标记后，mESC、mEB、mNSC和mNeuron的基因组DNA中，F-5fC、F-dC和F-5mC的定量分析结果；C为mESC分化形成mNeuron过程中，5fC脱醛基能力的分析结果；D为mESC分化形成mNeurons过程中，5caC脱羧基能力的分析结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
如图1所示，本发明首先合成氟代-5-醛基胞嘧啶(F-5fC)和氟代-5-羧基胞嘧啶(F-5caC)两种核酸探针分子，之后分别对细胞进行代谢标记；随后利用LC-MS法，对基因组中5fC直接脱醛基和5caC直接脱羧基的DNA去甲基化新通路进行分析，具体详述如下：
实施例1
本发明合成F-5fC和氟代-5-羧基胞嘧啶两种核酸探针分子的路线(如图2所示)如下：
F-5fC的合成路线：首先，利用叔丁基二甲基氯硅烷对氟代-胞嘧啶(F-dC)上核糖的羟基进行保护；随后在硝酸铈铵的氧化作用下，利用分子碘对其碱基5位进行碘化。之后，通过与三丁基锡氢化物进行羰基化偶联，进而对核糖上的羟基脱保护，从而生成F-5fC；
F-5caC的合成路线：首先，利用叔丁基二甲基氯硅烷对F-dC上核糖的羟基进行保护；随后在硝酸铈铵的氧化作用下，利用分子碘对其碱基5位进行碘化。之后，在甲醇溶剂中，利用钯做为催化剂，将一氧化碳插入到碱基的5位形成甲酸酯的结构。进一步，对核糖上的羟基进行脱保护。最后，利用体积比1:1的水和乙腈做为溶剂，通过氢氧化锂进行皂化反应，生成F-5caC。
合成F-5fC和F-5caC两种核酸探针的步骤具体如下：
(1)将F-dC(593mg,2.42mmol)溶解在10mL吡啶中，加入咪唑(741mg,10.9mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.09g,7.26mmol)，在室温下反应20h。
(2)将步骤(1)得到的反应产物(551mg,1.2mmol)溶解在15mL乙腈中，再加入碘(640mg,2.6mmol)和硝酸铈铵(1.42g,2.6mmol)，在60℃下反应3h。
(3)将步骤(2)得到的反应产物(351mg,0.60mmol)溶解在36mL甲醇中，加入双(乙腈)二氯化钯(8.6mg,0.04mmol)和二异丙基乙胺(220μL,1.32mmol)，并通入一氧化碳(3.5bar)，在60℃下反应3h。
(4)将步骤(3)得到的反应产物(106mg,0.20mmol)溶解在2.8mL乙酸乙酯中，并加入吡啶氢氟酸(52μL,2.00mmol)，在室温下反应15h。
(5)将步骤(4)得到的反应产物(30mg,0.10mmol)溶解在19mL体积比1:1的水和乙腈中，随后加入氢氧化锂(55mg,2.28mmol)，在室温下反应16h，即可生成F-5fC。
(6)将步骤(2)得到的反应产物(216mg,0.37mmol)溶解在5.5mL甲苯中，依次加入三苯基膦(58mg,0.2mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯-氯仿加合物(38mg,0.04mmol)和三丁基氢化锡(120μL,0.44mmol)，并通入一氧化碳(3.5bar)，在65℃下反应12h。
(7)将步骤(6)得到的反应产物(100mg,0.20mmol)溶解在2.8mL乙酸乙酯中，并加入吡啶氢氟酸(52μL,2.00mmol)，在室温下反应15h，即可生成F-5caC。
本步骤合成的F-5fC和F-5caC的核磁谱图分别见图3中A和B。
实施例2
探针标记结合LC-MS分析：
分别利用实施例1合成的F-5fC和F-5caC进行代谢标记并结合LC-MS分析(图4)，图4中A展示了利用F-5fC或F-5caC进行代谢标记的示意图；图4中B为F-5fC、F-5caC、F-dC和F-5mC的化学结构图；图4中C为用LC-MS法检测的核苷的提取离子色谱图。
1.方法
1.1细胞准备
将灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)重悬在小鼠胚胎成纤维细胞完全培养基中，随后接种到10％明胶包被的培养皿中，并置于培养箱中进行培养。6h后，将培养基替换为小鼠胚胎干细胞完全培养基。接下来，将复苏的小鼠胚胎干细胞(mESC)接种到MEF饲养层上，于37℃和5％CO2的条件下进行培养。
1.2代谢标记
在mESC细胞进行传代时，分别向细胞培养基中加入300μM的F-5fC和F-5caC进行代谢标记。继续培养4天，随后收获细胞，并用PBS缓冲液对细胞清洗3次，以除去残留的探针分子。
1.3 DNA提取
将收获的代谢标记后的mESC细胞分别重悬于200μL PBS缓冲液中，随后分别加入25μL蛋白酶K(100μg/μL)进行裂解。接下来，分别向溶液中加入4μL RNAseA(100mg/mL)，在37℃下水浴1h，对细胞中RNA进行酶解消化。进一步，利用试剂盒(Tissue DNA Kit，OmegaCo.)分别提取细胞中的基因组DNA，随后用100μL TE缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)对DNA进行洗脱。采用超微量分光光度计对提取的DNA进行定量。
1.4核酸酶解
分别取10μg DNA，进行真空干燥，然后依次加入21μL水和3μL 10×中性酶解缓冲液(500mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl2，10mM ZnSO4，pH 7.0)，在95℃下水浴加热5min，随后直接置于冰上2min，使DNA双链解开为单链。接下来，依次加入2μL S1核酸酶、2μL磷酸二酯酶、1μL碱性磷酸酶和1μL DNAse I，置于37℃下温育3小时。向酶解的样品中加入470μL水，随后加入500μL氯仿进行抽提三次，每次均在12000rpm下离心5min，以除去残留的酶。
1.5 LC-MS分析
分别将酶解后的样品进行冷冻干燥，随后复溶在20μL水中，直接进行LC-MS分析。
若未特别指明，本实施例中所用的技术手段包括核酸的提取为本领域技术人员所熟知的常规手段。LC-MS法中所用的质谱仪为Waters公司的Xevo TQ-S micro massspectrometer(Milford，美国)，使用电喷雾离子源。液相为Waters公司的Acquity UPLC(Milford，美国)。使用WatersAcquity HSS T3色谱柱进行化合物分离，柱温设置为35℃。流动相A、B相分别为水(含0.01％甲酸)、甲醇。流动相梯度为0-4min 0％-3％B，4-12min 3％B，12-12.5min 3％-80％B，12.5-15min 80％B，15-15.5min 80％-0％B，15.5-18min 0％B。流速设为0.3mL/min，采用在正离子条件下，采用多反应监测模式进行检测。
2.结果
小鼠胚胎干细胞中新型DNA去甲基化通路的LC-MS检测结果见图5，结果显示，在F-5fC代谢标记的细胞基因组DNA中，可以检测到直接脱醛基产物F-dC以及再次甲基化产物F-5mC(图5中A)；在F-5caC代谢标记的细胞基因组DNA中，可以检测到直接脱羧基产物F-dC以及再次甲基化产物F-5mC(图5中B)。上述结果证实在小鼠胚胎干细胞中，存在着5fC直接脱醛基和5caC直接脱羧基的DNA去甲基化新通路。
实施例3小鼠胚胎干细胞分化过程中新型DNA去甲基化通路的动态变化分析
1.方法
1.1细胞准备
将小鼠胚胎干细胞(mESC)用胰酶消化，并在250g下离心5min，随后将细胞沉淀用小鼠胚胎干细胞完全培养基进行重悬，接种到10％明胶包被的培养皿中。接下来，在37℃和5％CO2下培养40min，使小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行贴壁。进一步，随后收集未贴壁的细胞，并接种到未经组织处理的培养皿中，采用悬浮法进行细胞培养。置于37℃和5％CO2的湿润培养箱中培养4天后，即可诱导mESC形成小鼠拟胚体(mEB)。
将上一步中诱导形成的mEB收集到离心管中，在室温中静置15min，使细胞自然沉降至管底。随后吸去上清，将细胞重悬于小鼠神经干细胞诱导分化培养基中，再接种到未经组织处理的培养皿中。在37℃和5％的CO2中培养4天后，即可诱导mEB形成小鼠神经干细胞(mNSC)。
将上一步中诱导形成的mNSC收集到离心管中，在室温静置15min，使细胞自然沉降至管底。随后吸去上清，用小鼠神经干细胞诱导分化培养基重悬细胞。接下来，将细胞接种到15μg/mL多聚赖氨酸(PLL)包被的培养皿中，放入37℃和5％CO2的培养箱中进行培养。2天后，将培养基换为小鼠神经元细胞诱导分化培养基，继续培养4天可诱导mNSC形成小鼠神经元细胞(mNeuron)。
1.2代谢标记
对1.1获得的四种类型细胞(mESC、mEB、mNSC和mNeuron)分别进行代谢标记。将300μM的F-5fC和F-caC探针分子，分别加入到小鼠胚胎干细胞完全培养基，及小鼠拟胚体、小鼠神经干细胞和小鼠神经元细胞的诱导分化培养基中。对于mESC，代谢标记持续4天；而对于mEB、mNSC和mNeuron，诱导分化和代谢标记同时进行4天。随后，分别收获相应类型的细胞，利用PBS缓冲液对细胞清洗3次，以除去残留的探针分子。
1.3DNA提取
分别将收获的细胞重悬于200μLPBS缓冲液中，随后加入25μL蛋白酶K(100μg/μL)进行裂解。接下来，向溶液中加入4μLRNAseA(100mg/mL)，在37℃下水浴1h，对细胞中RNA进行酶解消化。进一步，利用试剂盒(Tissue DNAKit，Omega Co.)提取细胞中的基因组DNA，随后用100μLTE缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)对DNA进行洗脱。采用超微量分光光度计对提取的DNA进行定量。
1.4核酸酶解
分别取10μg各种类型细胞的基因组DNA，进行真空干燥，然后依次加入21μL水和3μL10×中性酶解缓冲液(500mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl2，10mM ZnSO4，pH 7.0)，在95℃下水浴加热5min，随后直接置于冰上2min，使DNA双链解开为单链。接下来，依次加入2μL S1核酸酶、2μL磷酸二酯酶、1μL碱性磷酸酶和1μLDNAse I，置于37℃下温育3小时。向酶解的样品中加入470μL水，随后加入500μL氯仿进行抽提三次，每次均在12000rpm下离心5min，以除去残留的酶。
1.5LC-MS分析
分别将酶解后的样品进行冷冻干燥，随后复溶在20μL水中，进样10μL，用LC-MS分析，检测方法和条件同实施例2。
2.结果
小鼠胚胎干细胞分化形成小鼠神经元细胞过程中，动态5fC脱醛基和5caC脱羧基的检测结果如图6所示，结果显示，在整个分化过程中，均存在着5fC直接脱醛基(图6中A)和5caC直接脱羧基(图6中B)的通路；并且在小鼠胚胎干细胞定向分化形成小鼠神经元细胞的过程中，5fC直接脱醛基的活性逐渐下降(图6中C)，而5caC直接脱羧基的活性逐渐升高(图6中D)。该结果揭示了胚胎干细胞定向分化的表观遗传学机制。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种代谢标记结合LC-MS检测5fC直接脱醛基的DNA去甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用氟代-5-醛基胞嘧啶对细胞进行代谢标记后，提取得到代谢标记细胞的基因组DNA；
对所述基因组DNA进行酶解，使其裂解成核苷；
对所述核苷进行液相色谱-质谱分析，使用反相色谱柱，在正离子模式下检测得到所述氟代-5-醛基胞嘧啶及其脱醛基产物氟代-胞嘧啶的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氟代-5-醛基胞嘧啶的代谢标记浓度为300μM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解采用的酶包括S1核酸酶、磷酸二酯酶、碱性磷酸酶和DNAse I酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱分析中，采用的流动相为0.01％甲酸水-甲醇。
5.一种代谢标记结合LC-MS检测5caC直接脱羧基的DNA去甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用氟代-5-羧基胞嘧啶对细胞进行代谢标记后，提取得到代谢标记细胞的基因组DNA；
对所述基因组DNA进行酶解，使其裂解成核苷；
对所述核苷进行液相色谱-质谱分析，使用反相色谱柱，在正离子模式下检测得到所述氟代-5-羧基胞嘧啶及其脱羧基产物氟代-胞嘧啶的含量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氟代-5-羧基胞嘧啶的代谢标记浓度为300μM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解采用的酶包括S1核酸酶、磷酸二酯酶、碱性磷酸酶和DNAse I酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱分析中，采用的流动相为0.01％甲酸水-甲醇。
9.一种如权利要求1-4任一项所述的方法和/或权利要求5-8任一项所述的方法在新型DNA去甲基化通路分析中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，对所述新型DNA去甲基化通路在胚胎干细胞分化过程中的活性变化，进行动态分析。
CN202311485717.5A 2023-11-09 2023-11-09 一种代谢标记结合lc-ms检测dna去甲基化的方法及其应用 Pending CN117538474A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311485717.5A CN117538474A (zh) 2023-11-09 2023-11-09 一种代谢标记结合lc-ms检测dna去甲基化的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311485717.5A CN117538474A (zh) 2023-11-09 2023-11-09 一种代谢标记结合lc-ms检测dna去甲基化的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117538474A true CN117538474A (zh) 2024-02-09

Family

ID=89789100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311485717.5A Pending CN117538474A (zh) 2023-11-09 2023-11-09 一种代谢标记结合lc-ms检测dna去甲基化的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117538474A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060450A (zh) * 2013-01-09 2013-04-24 武汉大学 一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法
CN106957350A (zh) * 2017-02-28 2017-07-18 北京大学 5‑醛基胞嘧啶的标记方法及其在单碱基分辨率测序中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060450A (zh) * 2013-01-09 2013-04-24 武汉大学 一种利用哌啶水溶液检测dna中5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的方法
CN106957350A (zh) * 2017-02-28 2017-07-18 北京大学 5‑醛基胞嘧啶的标记方法及其在单碱基分辨率测序中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVA KORYTIAKOV等: "Deformylation of 5-Formylcytidine in Different Cell Types", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 16869 *
YANG FENG, 等，: "Direct decarboxylation of ten-eleven translocation-produced 5-carboxylcytosine in mammalian genomes forms a new mechanism for active DNA demethylation", 《CHEM. SCI.》, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 11322 - 11329 *
ZHIQUAN SONG: "Design, Synthesis, and Incorporation of Fluorous 5-Methylcytosines into Oligonucleotides", 《JOC》, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 10263 - 10268, XP055472193, DOI: 10.1021/jo2015399 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103827321B (zh) 用于检测核苷酸修饰的方法
CN106283199B (zh) 检测肿瘤相关的50个热点突变基因的捕获文库和试剂盒
WO2003064700A2 (en) Identification of cell differentiation states based on methylation patterns
KR20160096632A (ko) 핵산의 다중 검출
CN111876471A (zh) 一种rna的原位检测方法
US20230076949A1 (en) Targeted, long-read nucleic acid sequencing for the determination of cytosine modifications
CN111088252B (zh) 一种dna上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法
WO2019062289A1 (zh) 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法
CN108517567A (zh) 用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
CN105505755A (zh) 空间转录组建库测序方法及所用装置
CN109913539A (zh) 一种靶向捕获hla基因序列并测序的方法
EP1407053A2 (en) Dna microarrays comprising active chromatin elements and comprehensive profiling therewith
WO2019080595A1 (zh) 一种原位杂交探针的制备方法
CN107513576A (zh) 一种用于检测遗传性心肌疾病的试剂盒及其应用
CN107314981B (zh) 基于hemin-石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法
CN105734679A (zh) 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法
CN111850101A (zh) 一种单细胞dna表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法
CN117538474A (zh) 一种代谢标记结合lc-ms检测dna去甲基化的方法及其应用
CN116042927B (zh) 一种用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13系统及其试剂盒和方法
CN109988842B (zh) 一种寡核苷酸标记探针原位检测pdl1的试剂组与应用
CN113355456B (zh) 一种maldi tof-ms检测生殖道病原体的核酸指纹图谱库的制备方法
CN113215321B (zh) Maldi-tof ms检测生殖道病原体的检测产品及用途
CN113215322B (zh) Maldi-tof ms检测生殖道病原体的引物组合物及用途
CN109554451A (zh) 一种同时进行基因组dna多态性和甲基化检测的方法
CN114058681A (zh) 一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination