CN109554451A - 一种同时进行基因组dna多态性和甲基化检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法，包括DNA片段化，并使用DNA外切酶对所述DNA片段的3’末端进行酶切处理；加入含5‑羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的dNTP混合液，将所述DNA片段的3’末端进行补齐；将修饰后的DNA片段进行重亚硫酸氢盐转化处理并连上高通量测序平台适配的接头，最后通过PCR扩增完成测序文库的构建，通过结合高通量测序平台的双端测序模式，即可同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测，实现了对基因组和表观基因组进行同步检测的目标。

Description

一种同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法。

背景技术

基因组是储存人类遗传信息的载体，大量的科学研究已经证实了诸如单碱基突变，DNA片段重排、插入、缺失以及拷贝数异常等基因组变异与各种人类疾病之间的紧密联系。人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)的完成迅速增加了我们对各种形式的人类遗传变异及它们的进化史与各类疾病表型之间联系的认识，以基因组变异检测为主要内容的精准医疗计划正在让越来越多的患者受益，针对特定基因组异常类型开发的分子靶向药让人类在抗击疾病的道路上战果累累，可以说遗传信息的准确解读为疾病的诊断以及治疗提供了全新的视角。而随着研究技术的进步，人们越来越意识到，与遗传学结构异常同样重要的表观遗传学修饰在人类胚胎发育、衰老以及疾病发生等生理过程发挥着至关重要的作用。这其中最为重要的一种表观遗传学修饰就是DNA甲基化，它在调控基因表达、维持基因组稳定性、调节DNA空间构象、与蛋白相互作用乃至影响染色质高级结构等方面都发挥着关键的作用。可以说，生物性状的决定以及疾病的发生、发展等重要的生物学过程都是遗传学和表观遗传学共同作用的结果。以肿瘤为例，DNA甲基化的异常和基因突变都会造成肿瘤相关基因的异常表达，进而导致肿瘤的发生与转移等。基因突变介导的肿瘤发生主要是因为突变导致很多抑癌基因和致癌基因的异常表达与功能变化；而DNA甲基化异常介导的肿瘤发生则主要是因为基因表达调控的错误，比如肿瘤全基因组水平的甲基化水平降低，抑癌基因启动子区域的异常高甲基化等，都是造成基因调控异常的因素。可见，DNA甲基化和基因组变异并不是独立的基因表达调控机制，二者之间存在着紧密的联系。

大量的研究结果表明，DNA甲基化的异常会改变基因组突变图谱，而基因组突变也会对DNA甲基化模式产生影响。DNA甲基化对基因突变最为直接的影响来自于CpG位点的甲基化，甲基化的胞嘧啶相比未甲基化的胞嘧啶更容易发生水解脱氨基反应，从而变异为胸腺嘧啶(T)，C-T突变得不到有效的修复，从而导致基因组在CpG位点累积大量的突变。例如，肿瘤组织中大量的p53点突变发生在CpG位点，这充分说明了DNA甲基化对基因突变的直接作用。大规模的基因组学和表观基因学组联合分析发现，很多表型相关的SNP位点与DNA甲基化模式之间存在显著的关联，这些位点被称为DNA甲基化数量性状位点(Methylationquantitative trait loci,mQTL)。有研究人员发现，当在干细胞中的一段CpG岛区域中插入一段非CpG序列的时候，这个区域的DNA即可被从头甲基化，虽然机制尚有待进一步研究，但这个结果说明序列组成与DNA甲基化水平之间有非常紧密的联系。此外，印迹基因以及等位基因特异性的甲基化模式同样被证实与基因组变异之间存在显著关联。

21世纪以来，高通量测序技术取得的长足进步为基因组学和表观基因组学的研究提供了可靠的技术保障，大规模的全基因组测序(Whole Genome Sequencing，WGS)正一步步揭开人类各种复杂疾病的神秘面纱，在疾病的诊断、治疗等领域取得了巨大的成效。结合重亚硫酸氢盐处理和高通量测序技术的全基因组重亚硫酸氢盐测序(Whole GenomeBisulfite Sequencing，WGBS)是目前公认的单碱基DNA甲基化检测的“金标准”，DNA甲基化的精确测定正加速我们对生命过程的理解，加快对疾病产生机理的探究，以及为抗癌药物的开发提供新的思路等。细胞是一个有机的整体，基因组和表观基因组在细胞分裂增殖、分化以及病变等生理过程中扮演着同等重要的角色，任何一方发生异常都可能会产生连锁效应，造成另一方的响应。因此，应该时刻将基因组与表观基因组之间的联系作为第一准则，从更加全面角度去探索生命过程的奥秘。然而，目前的研究方法还是只能分别对基因组变异和表观基因组特征进行独立测定，不仅耗时费力，而且在研究基因组于表观基因组相互作用时只能通过间接的比较，无法满足研究二者之间直接联系的需求。

发明内容

本发明提供了一种同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法-GET(Genomeand Epigenome Tracking)，包括以下步骤：

1)将DNA材料进行片段化处理获得DNA片段；

2)使用DNA外切酶对所述DNA片段的3’末端进行酶切处理；

3)使用DNA聚合酶并加入含5-羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的dNTP混合液，将所述DNA片段的3’末端进行补齐；

4)对步骤3)修饰后的DNA片段进行重亚硫酸氢盐转化处理；

5)将步骤4)重亚硫酸氢盐处理后的所述DNA片段两端连上高通量测序平台适配的接头，最后通过PCR扩增完成测序文库的构建，再结合高通量测序平台的双端测序模式，即可同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测。

优选地，本发明所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法中，所述DNA起始材料为基因组DNA或者长度大于1000bp的片段化DNA。

优选地，本发明所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法中，所述片段化处理包括超声破碎或酶切的方法。

优选地，本发明所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法中，所述DNA片段为平均长度约300bp的DNA片段。

优选地，本发明所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法中，所述DNA外切酶对所述DNA片段的3’末端进行酶切处理为具有3’->5’活性外切酶将DNA片段的3’末端切除100-150个碱基。

优选地，本发明所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法中，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶Klenow。

本发明的另一方面为提供了上述方法获得的DNA文库；优选地，通过所述DNA文库利用高通量测序平台的双端测序模式，可同时获得全基因组测序(WGS)和全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS)数据。

优选地，本发明方法获得的DNA文库，可以独立分析基因组变异和甲基化数据；或进一步通过所述独立分析基因组变异和甲基化数据可以寻找相互影响以及共同决定生物性状的直接证据。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供一种全新的测序文库制备方案，通过使用5hmC对DNA片段3’端进行序列重塑，5hmC的掺入能够使DNA片段的3’端在重亚硫酸氢盐处理的过程中不被转化，仍然保持原始的基因组序列结构。结合高通量测序平台的双端测序模式，能够同时进行全基因组测序和全基因组甲基化测序，一端序列提供全基因组测序信息，另一端提供全基因组甲基化信息，从而实现在一次测序中获得两套组学数据，有助于从多维度研究基因组变异以及DNA甲基化异常在各类生理、生化过程中的协同作用。本发明的方法对直接研究DNA甲基化和基因组变异的关系对肿瘤的发生发展具有重要意义；本发明开发出的新型的测序文库构建技术，实现了对基因组和表观基因组进行同步检测的目标。

附图说明

图1为本发明的技术路线示意图；

图2为本发明的一个实施例中的DNA片段化电泳图；

图3为本发明的一个实施例中的高通量测序文库制备琼脂糖凝胶电泳切胶回收图；

图4为本发明的一个实施例中的对文库片段大小进行定量分析结果图；

图5为本发明的一个实施例中的对文库单克隆培养后测序分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法

本发明的技术路线如图1所示，具体方法为：

1)DNA片段化

取3μg 97L肝癌细胞(MHCC-97L细胞，购自上海邦景实业有限公司)基因组DNA，加水将DNA的体积调整至85μL，4℃下使用Biorupter超声打断DNA；功率：80％，工作时间30s、间隙时间30s，6个循环，将DNA片段打断到约300bp(如图2所示，其中可见超声波片段化基因组DNA至主带300bp大小)。

2)3’末端酶切处理

1.在冰上操作准备末端修复体系，按以下顺序添加：

DNA	35μL
		10×NEB Buffer2(购自NEB，货号catB7002)	10μL
Klenow	5μL
		ddH<sub>2</sub>O	补至100μL

2.将上述反应体系在12℃条件下孵育约120min，使DNA片段3’端被酶切除约100-150个碱基。

3)3’末端补平

1.在上述反应体系中加入终浓度为10mM的dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP，其中dCTP为羟甲基修饰，即hmCTP，5-羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸)，37℃孵育30min使片段3’末端补齐。

2.使用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen，cat28104)对末端补平的DNA进行回收，参照操作规范，加入5倍体积buffer PB溶液(Qiagen，cat28104)，轻弹充分混匀，瞬时离心，转至离心柱中，13000rpm离心1min。去除洗脱液体，加入750μL buffer PE溶液(Qiagen，cat28104)，13000rpm离心1min，去除液体，再加入500μL buffer PE溶液(Qiagen，cat28104)，再次洗涤。去除液体，盖上盖子，空转2min，转移到新的收集管上，静置，晾干；先加22μL buffer EB溶液(Qiagen，cat28104)到离心柱中，静置2min，13000rpm离心1min，收集DNA；

4)重亚硫酸氢盐处理

1.亚硫酸氢盐转化溶液配制，配制时，每管重亚硫酸氢盐粉末中需加入900μL灭菌水，300μL M-Dilution Buffer，50μL M-Dissolving Buffer(厂家Zymo research，名称EZ-96DNA Methylation-Gold Kit，货号D5007)，震荡混匀直至干粉完全溶解，取130μL分装到200μLEP管；

2.将20μL步骤3)获得的DNA产物加入130μL亚硫酸氢盐反应体系中，涡旋混匀，瞬时离心；

3.PCR仪设置98℃ 10min；64℃ 2.5h，将反应体系放入其中进行转化反应；

4.取Zymo-SpinIC Column(EZ-96DNA Methylation-Gold Kit，货号D5007)放入收集管中，加入600μL M-Binding Buffer，再将上述150μL反应体系取出加入离心柱中，颠倒数次混合样品，13000rpm离心30s去除滤液；

5.加入200μL M-Wash Buffer(EZ-96DNA Methylation-Gold Kit，货号D5007)，13000rpm离心30s去除滤液；

6.加入200μL M-Desulphonation Buffer(EZ-96DNA Methylation-Gold Kit，货号D5007)，室温下放置15-20min，13000rpm离心30s去除滤液；

7.加入200μL M-Wash Buffer(EZ-96DNA Methylation-Gold Kit，货号D5007)，13000rpm离心30s去除滤液，重复该步骤1次；

8.取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加22μL洗脱缓冲液EB(EZ-96DNA Methylation-Gold Kit，货号D5007)，室温放置2min，13000rpm离心2min，收集DNA溶液。

5)单链接头连接

1.在冰上操作准备反应体系，按以下顺序添加：

DNA	18μL
		10×T4DNA Ligase Buffer(购自NEB公司)	2.5μL
ATP(100mM)	0.5μL
		T4DNA连接酶	1μL
3’Adapter(GATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC)	1.5μL
		5’Adapter(ACACGACGCTCTTCCGATC)	1.5μL

2.吹打混匀，简短离心使试剂沉于管底；

3.水浴锅16℃孵育过夜；

4.使用DNA吸附柱(Qiagen，QIAquick PCR Purification试剂盒，cat28104)纯化法回收连接好接头的DNA片段。

8)PCR扩增

1.在冰上操作准备反应体系，按以下顺序添加：

DNA	5μL
		2×KAPA DNA聚合酶(购自KAPA Biosystems)	12.5μL
PE PCR Primer1.0(购自Illumina)	1μL
		Multiplexing PCR Primer(购自Illumina)	1μL
H<sub>2</sub>O	5.5μL

2.吹打混匀，瞬时离心使试剂沉于管底，放入PCR仪；

3.按照下列条件设置PCR仪器扩增程序并运行：

95℃,60s；

95℃,15s，

65℃,30s，

72℃,45s，

上述三个步骤共循环进行12次；

72℃,3min。

4.琼脂糖凝胶电泳分离目标片段：

1)使用TAE配制2％琼脂糖凝胶：称取0.6g琼脂糖溶于30mL TAE溶液中，加热至完全溶解，倒入插好样品梳的制胶板中，待琼脂糖凝聚后拔出梳子，将胶板置于水平电泳槽中，加入TAE溶液；

2)将超声样品与6×上样缓冲液进行混合，细心地将样品点入上样孔内，电泳(80V，50min)，将凝胶放入混有EB的TAE缓冲液中浸泡10min，用凝胶照相系统观察凝胶；

3)切取400-600bp的片段，割胶后放入离心管中，称量、记录；

4)胶回收：参照QIAquick Gel Extraction Kit(购自Qiagen，Cat 28706)操作规范。

100mg＝100μL体积，加入3倍体积的Buffer QG(购自Qiagen，Cat 28706)，42℃孵育10min,每隔2-3min颠倒混匀，务必保证胶完全溶解，瞬离。加入凝胶样品1倍体积的异丙醇混匀，瞬离。每次取750uL至MinElute离心柱，13000rpm离心1min；加入500μL Buffer QG，离心1min，加入750μL Buffer PE，离心1min；再一次加入500μL Buffer PE洗涤，空转2-3min；将吸附柱转入新的收集管，加入22μL 65℃预热的水洗脱，先静置1-2min，然后13000rpm离心1min。(图3)。

9)文库定量分析

1.浓度测定，将Qubit染料与dsbuffer(购自Thermo，Qubit4)按照1：200的比例混匀形成缓冲液体系；分别将10μL标准品1、2(购自Qubit^TM dsDNA HS Assay Kit货号：Q32854)与190μL缓冲液混匀；取1μL样品与199μL缓冲液混匀；打开Qubit2.0依次放入标准品1、2制作标准曲线；放入样品管测定样品浓度，结果为3.5ng/μL。

2.片段大小分析，使用Agilent 2100bioanalyzer芯片系统，对文库片段大小进行定量分析，结果为文库片段大小546bp(如图4所示)。

10)测序文库单克隆分析

取1μL已经构建好的步骤9)文库，将DNA片段连入T载体单克隆载体，并转入感受态细胞后进行平板菌落筛选，挑选单克隆扩大培养，提取质粒后对插入片段进行测序分析。如图5所示，单克隆测序显示，本方法制备的文库一半保持基因组序列，另一半受重亚硫酸氢盐处理后转化，可用于甲基化测序。因此经过本发明所示流程构建的高通量测序文库，其3’端保持完整的基因组序列结构，能够用于基因组DNA多态性分析，而5’端则通过重亚硫酸氢盐处理判断其原始的甲基化状态(未甲基化的C在测序结果中显示为T，甲基化的C仍然为C)，能够用于甲基化水平检测。因此，测序文库单克隆分析结果充分说明，本发明制备的高通量测序文库，能够同时进行基因组DNA多态性以及甲基化检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法，包括以下步骤：

1)将DNA材料进行片段化处理获得DNA片段；

2)使用DNA外切酶对所述DNA片段的3’末端进行酶切处理；

3)使用DNA聚合酶并加入含5-羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的dNTP混合液，将所述DNA片段的3’末端进行补齐；

4)对步骤3)修饰后的DNA片段进行重亚硫酸氢盐转化处理；

5)将步骤4)重亚硫酸氢盐处理后的所述DNA片段两端连上高通量测序平台适配的接头，最后通过PCR扩增完成测序文库的构建，再结合高通量测序平台的双端测序模式，即可同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测。

2.根据权利要求1所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法，其特征在于，所述DNA起始材料为基因组DNA或者长度大于1000bp的片段化DNA。

3.根据权利要求1所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法，其特征在于，所述片段化处理包括超声破碎或酶切的方法。

4.根据权利要求1所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法，其特征在于，所述DNA片段为平均长度约300bp的DNA片段。

5.根据权利要求1所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法，其特征在于，所述DNA外切酶对所述DNA片段的3’末端进行酶切处理为具有3’->5’活性外切酶将DNA片段的3’末端切除100-150个碱基。

6.根据权利要求1所述的同时进行基因组DNA多态性和甲基化检测的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶Klenow。

7.一种权利要求1～6任意一项所述的方法获得的DNA文库。

8.根据权利要求7所述的DNA文库，其特征在于，所述DNA文库利用高通量测序平台的双端测序模式，可同时获得全基因组测序(WGS)和全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS)数据。

9.根据权利要求7所述的DNA文库，其特征在于，所述DNA文库可以独立分析基因组变异和甲基化数据。

10.根据权利要求7所述的DNA文库，其特征在于，所述独立分析基因组变异和甲基化数据可以寻找相互影响以及共同决定生物性状的直接证据。