CN104372079A - 一种甲基化dna的测序方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲基化DNA的测序方法及其应用。基于目前成熟的高通量测序(Next Generation Sequencing)技术，首次引入羟甲基化修饰的寡核苷酸接头，将DNA甲基化免疫共沉淀测序技术与亚硫酸氢盐处理测序技术相结合，从而将不含有甲基化修饰的DNA片段去除，即只对含有甲基化修饰的DNA片段进行亚硫酸盐处理，最终精确测定这些DNA片段上的甲基化修饰位点；该方法能够使测定全基因组水平的DNA甲基化修饰位点所需的数据量降至常规方法的1/10，从而降低测序成本和信息处理量，更高效地对全基因组DNA甲基化进行高通量测序。

Description

一种甲基化DNA的测序方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种甲基化DNA的测序方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传调控中的重要修饰之一，被称之为哺乳动物DNA中除ATCG四种碱基以外的“第五种碱基”。在哺乳动物胚胎干细胞和大脑中它主要发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶苯环第五位碳原子上，少部分发生在CHG和CHH(H＝A,T,C)上。作为一种共价修饰，DNA甲基化在正常的分化发育和疾病发生中发挥重要作用，同时在更高等真核生物器官的细胞分化中可以稳定遗传，并且在斑马鱼中发现它可以通过精子传给下一代。在细胞分化、疾病和环境影响下，DAN甲基化状态会发生巨大变化。因此，5mC位点的检测以及DNA甲基化水平的评估对发育和疾病发生中DNA甲基化状态的揭示显得尤为重要。

由于2007年高通量测序技术的进步，一些基因组DNA甲基化检测技术也得到发展。在单分子水平定量检测5mC方面，甲基化测序无疑是最强大和全面的一种方法。然而，甲基化测序需要测到至少整个基因组30倍的测序深度，并且对于大样本大基因组的DNA甲基化组的测定，是极其昂贵的。简化的代表性的重亚硫酸盐测序(RRBS)实现单碱基分辨率方案，但是只描绘了覆盖整个基因组的5％并且局限于CpG岛(CGIs)的甲基化图谱。然而，不同样本间的甲基化组分析表明大部分组织和癌症特定的差异甲基化区域发生在CpG岛附近。甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)实现了高达67％的CpG的覆盖度，而RRBS只覆盖了最少的基因组水平的CpGs(12％)。但是，MeDIP-seq不能实现单碱基分辨率，同时也不能检测非CpG的甲基化状。

发明内容

为了克服MeDIP-seq和MethylC-seq的缺陷但又综合两者的优势，我们将亚硫酸盐处理整合到MeDIP-seq的方法中，组成定义为甲基化DNA免疫沉淀亚硫酸盐测序(MB-seq)。

由于在MeDIP方法中连接了甲基化接头的未甲基化的片段会被非特异的拉下，另外未甲基化的Illumina测序接头中的胞嘧啶在亚硫酸盐处理后也会被转化为尿嘧啶，这将导致接头连接的DNA片段不能匹配Illumina测序，因此在MB-seq中这些接头是不适用的。基于羟甲基化的DNA片段不能被5mC抗体富集并且在亚硫酸处理过程中羟甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶有同样的效果，我们创造性地将羟甲基化的接头(接头中所有的胞嘧啶都是羟甲基化的)引入MB-seq中。

具体而言，本发明提供了下述内容：

一种甲基化DNA的测序方法，包括建库步骤和测序步骤：

其中建库步骤是指获得待检测的甲基化DNA文库的步骤，所述建库步骤包括：

1)基因组DNA的片段化及双链DNA片段末端修复；

2)将1)中得到的DNA片段与羟甲基化修饰的寡核苷酸接头连接；

3)富集步骤2)中的甲基化DNA片段；

4)将步骤3)中得到的产物中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基；

5)将4)中的单链DNA通过引物进行扩增以获得双链DNA；

6)去除接头回收纯化DNA。

其中测序步骤是指对前述建库步骤获得的文库进行序列测定，还包括如下步骤：

7)对步骤6)中获得的双链DNA进行测序。

其中建库步骤和测序步骤中，步骤1)包括：

a)将基因组DNA片段化成为DNA片段；

b)将所述DNA片段进行末端修复以获得具有平末端的DNA片段；

c)将2)中得到的DNA片段的3’末端加上A碱基；

本发明中，所述羟甲基化修饰的寡核苷酸接头中所有的碱基胞嘧啶都是羟甲基化的。

本发明中，步骤3)中的富集羟甲基化DNA通过MeDIP技术进行的。

本发明中，步骤4)中通过亚硫酸盐处理试剂盒将DNA中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基。

本发明中，步骤5)中通过高保真DNA聚合酶将单链DNA进行扩增以获得双链DNA。

本发明中，步骤6)中用胶回收试剂盒通过凝胶电泳回收纯化的DNA。

本发明还提供了所述方法构建得到的DNA测序文库。

本发明中还提供了一种试剂盒，其中至少包含用于DNA末端修复的试剂，DNA 3’端加A的试剂，羟甲基化修饰的接头试剂、通过MeDIP技术富集甲基化DNA的试剂，用于将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐试剂，用于扩增的试剂，用于胶回收的试剂。其中，所述扩增的试剂包括引物。

本发明还包括所述试剂盒用于甲基化DNA文库建库或者用于甲基化DNA测序的用途。

本发明MB-seq能够精确地检测到单个5mC位点的甲基化水平并且基因组覆盖度高。相对于甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)准确性提高，无论是在测序深度还是在测序质量评估方面，本技术都表现出明显的优势。同时，本技术在灵敏度与专一性方面都能达到与全基因组亚硫酸盐测序技术相近的效果。相对于全基因组亚硫酸盐测序技术(MethylC-seq)，所需数据量减少，仅需BS的1/10，成本下降。相对于简化的具有代表性的亚硫酸盐测序(RRBS)，对基因组的覆盖度大幅提高。MB-seq的技术对于不同起始量的DNA重复性好。在技术成本上，在功能区甲基化测序数据饱和的情况下可比全基因组亚硫酸氢盐测序的数据量少90％-95％，节约每个样本检测成本80％-90％。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1是各种DNA甲基化测序方法检测灵敏度的比较，包含MB-seq、MeDIP-seq、RRBS及MethylC-seq、；

图2是MB-seq与MeDIP-seq建库流程；

图3是MB-seq技术1微克DNA起始量与500纳克DNA起始量之间的技术重复性相关系数；

图4是MB-seq技术200纳克DNA起始量与50纳克DNA起始量之间的技术重复性相关系数；

图5是不同DNA甲基化测序方法(MB-seq、RRBS、MethylC-seq)不同测序深度下可以覆盖的全基因组CpG的百分数；

图6是不同DNA甲基化测序方法不同测序深度下可以覆盖的重复序列元件中CpG的百分数；

图7是三种亚硫酸盐测序(MB-seq、RRBS、MethylC-seq)检测到的mCpG重叠分析。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

试验用DNA来自通过SV40T/t抗原和人类端粒酶催化后永生化的人类卵巢上皮细胞系(T29)。具体操作过程如下：

1.获取基因组DNA

取T29细胞系，用QIAamp DNA Blood&Tissue Kit(Qiagen公司)提取样品DNA。将提取得到的DNA编号为MB，取其中200纳克DNA样品作为起始材料，参照图2中MB-seq的流程构建文库，本实施例中构建的是Illumina Hiseq 2000Paired End文库。

2.片段化基因组DNA

采用Covaris system(AB公司)将前述步骤1中的DNA样品进行断裂，样品断裂结束后，将断裂后的样品在2％琼脂糖凝胶上进行1×TAE电泳检测，从所述电泳凝胶回收待测DNA片段。为将样品DNA片段控制在100～250bp范围内，Covaris system断裂具体操作为：

1)双击打开Covaris主程序“SonoLAB S-Series V2.54”后点击“Start[Enter]”，待仪器排气30分钟，且水温降为7℃左右后方可使用。打开主程序之前须先确定打碎仪和冷却仪的电源开关是否打开，否则主程序会提示错误并重试。

2)将样品加入待用的130ul的covaris micro Tube中，样品加入量5μg，最后将终体积用TE缓冲液补至130μl，用移液器将样品溶液吹打混匀。点击“Configure”，设置参数见表1：

表1 片段化基因组DNA在Covaris system中的设置参数

选择模式为“Frequency Sweeping”。所有设置完成后点击“Save”或“Save As...”保存好程序，再点击“Return to Main Panel”回到主界面。将断裂管放入Covaris装置中，选择已保存程序，开始打碎。按所设置的程序打碎完成后关闭打碎仪和制冷仪的电源，然后关闭打碎主程序和电脑。

3)将前述2)中断裂后的样品从玻璃管中吸出，放入1.5ml EP管中。取出断裂后的样品用于2％琼脂糖凝胶进行1×TAE电泳检测，并用QIAquick PCR纯化试剂盒进行回收，产物溶于32μl的洗脱缓冲液(Elution buffer，EB)中。

3.末端修复

先从-20℃保存的试剂盒(Illumina Paired End测序文库构建试剂盒)中取出10×多聚核苷酸激酶缓冲液和10mM dNTPs mix，将其置于冰上融解并充分混匀10×多聚核苷酸激酶缓冲液。在1.5mL的离心管中配制100μL末端修复反应体系：取前述步骤2最后获得的30μL的片段化回收产物、45uL超纯水、10μL 10×多聚核苷酸激酶缓冲液(B904)、4μL dNTPsolution set(稀释混合为10mM each)、5μL T4DNA聚合酶、1μL Klenow Fragment(克列诺片段)与5μL T4多聚核苷酸激酶。20℃温浴30分钟后，用QIAquick PCR纯化试剂盒回收纯化经过末端修复的DNA，将产物DNA溶于34μL的EB中。

4.添加A碱基

先从-20℃保存的试剂盒(Illumina Paired End测序文库构建试剂盒)中取出10×bluebuffer和1mM dATP，将其置于冰上融解并使其充分混匀。在1.5mL的离心管中配制50μL的DNA末端加“A”反应的体系：32μL前述步骤3获得的末端修复纯化回收产物、5μL 10×blue buffer、10μL 1mM的dATP(GE公司)与3μL Klenow Fragment(3’-5’外切酶活性)。37℃温浴30分钟后用QIAquick PCR纯化试剂盒回收纯化加A碱基体系中的DNA，将产物溶于32μL的EB中。取1μL于NanoDrop 2000上测OD值并记录样品浓度、OD260/280比值以及OD260/230比值等参数。

5.羟甲基化修饰的寡核苷酸接头的连接

从-20℃保存的试剂盒(Illumina Paired End测序文库构建试剂盒)中取出2×Rapid连接缓冲液和羟甲基化修饰的寡核苷酸接头，将其置于冰上融解并充分混匀2×Rapid连接缓冲液。在1.5mL的离心管中配制100μL的连接反应体系：30μL步骤4得到的加A碱基回收产物、50μL 2x Rapid连接缓冲液、6μL 50uM的羟甲基化修饰的寡核苷酸接头，10μL T4DNA连接酶与4μL超纯水。

其中，羟甲基化修饰的寡核苷酸接头为：

接头1序列记为

SEQ ID NO:15’-pho-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3’，

接头2序列记为

SEQ ID NO:25’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，接头1和接头2所有的碱基胞嘧啶都是羟甲基化的。

将所述连接反应体系20℃温浴15分钟后用ZYMO DNA Clean&ConcentratorPTMP-5(ZYMO公司)回收纯化加有辅助接头1的DNA，产物溶于40μL的TE缓冲液中。

6.甲基化DNA的免疫共沉淀(MeDIP)

(1)取来自步骤5的样品，参考步骤4NanoDrop 2000测定结果，此时DNA为4μg左右，加TE缓冲液补至体积为450μL，充分混匀。在98℃的水浴锅中处理10分钟，然后置于冰上10分钟。

(2)在样品中加入51μL的10×IP缓冲液和10μL Anti-5-Methylcytosine MousemAb(Abcam公司)，充分混匀；将样品竖直放置在rotator(旋转器)上，最慢转速4℃孵育12小时。

(3)取30μL Dynabeads M-280山羊抗小鼠IgG(Invitrogen公司)，用800μL新鲜配制的0.1％PBS-BSA将磁珠洗涤2次，加入30μL 1×IP缓冲液混匀。

(4)将Dynabeads加到DNA-Antibody混合物中，4℃最慢转速震荡混合3小时。

(5)用800μl 1×IP缓冲液将磁珠洗涤3次，第一次洗时在vertex上涡旋2-4秒，涡旋3次；后两次洗涤用移液器反复吹打混合。用磁力架收集后将上清移除。此步操作均在4℃环境下进行。

(6)加入200μL蛋白水解酶K消化缓冲液和3μL 50μg/μl的蛋白水解酶K，50℃烘箱中旋转3小时。

(7)用ZYMO DNA Clean&ConcentratorPTMP-5回收步骤(6)这一反应体系中的DNA，用7倍DNA溶液体积(步骤6)的结合缓冲液(binding buffer)，溶于20μL经60℃水浴过的超纯水中。1μL于NanoDrop 2000上测得OD值并记录样品浓度，并用Q-PCR检测MeDIP效果。

7.亚硫酸氢盐处理进行纯化(Bisulfite treatment)

本实验步骤使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit PTMP(ZYMO公司)进行亚硫酸氢盐处理。

(1)添加130μL的CT翻转试剂到装有20μL步骤6得到的DNA样品的PCR管中。如果DNA样品的体积小于20μL，则用水来弥补差量。通过轻弹试管或移液器操作来混合样品。

(2)将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作：98℃放置10分钟，64℃放置2.5小时后立刻进行下述操作或者在4℃下存储(最多20小时)。

(3)吸取600μL的M结合缓冲液到Zymo-Spin ICPTMP柱中，并将柱子放到试剂盒所提供的收集管中。

(4)装填步骤(2)中的样品到步骤(3)所述的含有M结合缓冲液的Zymo-Spin ICPTMP柱中，盖上盖子将柱颠倒数次来混合样品。

(5)全速(>10000r/min)离心30秒，去除流出液。

(6)吸取200μL的M洗涤缓冲液到柱中，全速离心30秒。

(7)吸取200μL的M-Desulphonation缓冲液到柱中并且在室温(20℃-30℃)下放置15-20分钟。在培养后，全速离心30秒。

(8)吸取200μL的M洗涤缓冲液到柱中，全速离心30秒。再添加200μL的M洗涤缓冲液并且离心30秒。

(9)吸取20μL的M洗脱缓冲液到柱基质中，将柱放置在1.5mL的管中，全速离心来洗脱DNA。

8.亚硫酸氢盐磺酸化处理后DNA的PCR扩增

(1)将步骤7中亚硫酸氢盐处理纯化后的产物从-20℃保存的试剂盒中取出，将其置于冰上化冻并与2×KAPA 2G Robust Mix充分混匀。在0.2mL的PCR管中配制50μL的PCR反应体系：5μL亚硫酸氢盐处理纯化后产物、25μL KAPA 2G Robust Mix、2μL浓度为10pmol/μL的引物PE 1.0(Invitrogen)、2μL浓度为10pmol/μL的引物PE 2.0(Invitrogen)、16μL超纯水。

其中，

PE 1.0记为SEQ ID NO:3：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

PE 2.0记为SEQ ID NO:4：5’-GGTCAGCAGTTGGGTATTGTTTATGTTATTTTGGT。

(2)在热循环仪中运行下列扩增程序：变性温度为94℃保持10秒，迅速降温到52℃保持30秒进行退火，延伸温度为72℃保持30秒，上述步骤进行10个循环后，在72℃保持5分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。扩增完成后将样品在4℃存储。

(3)反应结束后用QIAquick PCR纯化试剂盒回收纯化反应体系中的DNA，产物溶于30μL的EB中。取1μL于NanoDrop 2000上测得OD值并记录样品浓度。

9.去除多余的接头

(1)配制2％的低熔点琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶冷却后待用。

(2)吸取5ul的6×loading buffer(Takara)与纯化后的DNA混匀，再将混好的样品上样到胶孔，旁边点上5ul的100bp ladder marker(Takara)，在110V下电泳40分钟。

(3)选取270-370bp切胶回收，利用QIAquick胶回收试剂盒纯化DNA，并将产物溶于30ul的EB中，取1ul用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒(Invitrogen,USA)，测量浓度。

10.测序

将步骤9中去除辅助接头1后的DNA片段直接用于后续Illumina公司Hiseq 2000系统，进行高通量测序，其采用的实验步骤参见使用Paired End DNA文库制备试剂盒构建常规Paired End DNA测序文库。MB-seq与MeDIP-seq建库流程见图2。

实施例1的结果评价和分析：

1.MeDIP富集效果的检测

对本发明使用的MeDIP方法的富集效果与商业MeDIP试剂盒(Diagenode)的富集效果进行比较(表2)，其中甲基化富集效果(4994)为62.71％，大于Diagenode的甲基化富集效果，非甲基化的富集率(8804)为0.33％，小于Diagenode的非甲基化富集率。

因此，本MeDIP方法的回收率达到商业MeDIP试剂盒(Diagenode)的回收率要求范围，并相对商业MeDIP试剂盒富集量大，因此认为该MeDIP方法可与商用试剂盒相媲美，其试验结果平行可信。

表2 本发明使用的MeDIP方法与Diagenode商业MeDIP试剂盒的富集效果比较

2.与MethylC-seq和RRBS的有效数据比较

在Illumina公司Hiseq 2000系统进行高通量测序，所述的测序是101cycle Paired End测序。具体测序流程与试剂均采用Illumina公司标准流程与试剂盒。测序结果产生15.44Gb数据，能比对(mapping)到参考基因组(homo sapienss)达82.45，稍高于MethylC-seq和RRBS测序比对率近似，具体结果可以参见表3。其中CG平均甲基化水平达81.06％，MethylC-seq约54.48％，RRBS约48.64％。甲基化水平相比说明MeDIP结合甲基化胞嘧啶的特异性较高。

表3 MB文库、MethylC-seq和RRBS文库Hiseq 2000系统测序结果比较

文库	MB	MethylC-seq	RRBS
				DNA起始量	200ng	3μg	500ng
总数据(Gbp)	15.44	152.6	8.88
				过滤后总数据(Gbp)	14.57	137.03	8.09
比对上总数据(Gbp)	12.73	124.19	7.1
				比对率(％)	82.45	81.38	79.95
唯一比对上总数据(Gbp)	11.82	118.42	6.82
				唯一比对率(％)	76.55	77.60	76.80
亚硫酸盐翻转效率(％)	99.45	99.5	99.34
				C的甲基化水平(％)	6.65	4.63	6.96
CG的甲基化水平(％)	81.06	54.48	48.64
				CHG的甲基化水平(％)	0.56	0.52	0.63
CHH的甲基化水平(％)	0.55	0.5	0.67
				检测到甲基化CG数量(Mbp)	20.15	24.43	1.87
所有碱基覆盖度(％)≥1×	73.71	91.25	11.15
				所有C覆盖度(％)≥1×	81.25	97.62	13.91
所有CG覆盖度(％)≥1×	88.11	96.09	26.76

3.MB和MethylC-seq对于DNA甲基化检测的灵敏度显著高于MeDIP-seq

对101cycle Paired End测序数据的比对至基因组的序列进ROC曲线图分析，ROC曲线图是检测测序技术对于DNA甲基化检测灵敏度的重要指标。结果如图1所示，MB的曲线下面积值(AUC值)为97.85％，和MethylC-seq的AUC值(99.64％)非常接近，远高于MeDIP-seq的AUC值(77.96％和73.03％)。以上结果说明该MB方法有很高的特异性，能有效检测DNA样品中的DNA甲基化，并且是在数据成本(见表3)仅为MethylC-seq十分之一的情况下，检测灵敏度却与MethylC-seq相当。

4.对于不同起始量的T29DNA，MB-seq的技术重复性比较

对于DNA甲基化组测序，低起始量的基因组DNA且技术重复性好是至关重要的。本技术通过减少基因组DNA的起始量并以此评估各组之间的相关性系数，通过计算至少10×测序深度覆盖下的所有的CpG位点，可以发现MB-seq技术1微克DNA起始量与500纳克DNA起始量之间的技术重复性相关系数达到0.96，而200纳克DNA起始量与50纳克DNA起始量之间的技术重复性相关系数也达到0.95。具体见图3，图4。

5.MethylC-seq、RRBS和与本技术测序结果共同比对的单个CpG位点的测序深度分析

对T29基因组采用MB-seq方法和MethylC-seq以及简RRBS结果进行比较(图5，图6)，针对在基因组功能区共同比对到的CpG位点做测序深度比较发现，三者测序深度的趋势基本一致，利用本发明的MB-seq方法只需15.44.73G的数据将达到152.6GMethylC-seq测序的水平，它覆盖到了人类基因组所有CpG的89％，而整体数据量降低了90％。另外，虽然RRBS技术的数据量只有8.88G，但是它在基因组功能区共同比对到的CpG位点远远低于前两种方法。同时，由于重复元件的功能在人类和其他物种甲基化组中具有重要作用，能够分析这部分的甲基化水平对破译其功能是关键的一步。如图4所示，MB-seq方法可以覆盖重复元件上所有CpG位点的84％，与MethylC-seq方法相似，而RRBS却只覆盖了15％。

为了评估本技术对DNA甲基化的CpG的查全率，分别比较本技术与RRBS和MethylC-seq三种方法测到的所有甲基化的CpG进行重叠分析。结果如图7所示。

结果表明，在24,762,688个三种亚硫酸盐测序方法检测到的甲基化的CpG中，本技术检测出77.9％的甲基化的CpG，RRBS和MethylC-seq方法分别检测出98.8％和6.9％。同时，从本技术特异性地检测出的甲基化CpG(0.81％)中随机挑选出的120个mCpG进行特定基因座亚硫酸测序，发现它们存在高甲基化水平。而通过对MethylC-seq方法特异性地检测出的mCpG随机挑选进行特定基因座亚硫酸测序，发现其中的82％甲基化水平都低于20％。目前研究通常认为DNA甲基化水平低于20％的，认为其的甲基化修饰作用不显著。说明MB能够检测绝大部分的有意义的DNA甲基化修饰。

因此，通过对MB-seq文库制备技术的illumina测序数据初步分析表明该方法能够从全基因组中特异性的分离出甲基化DNA片段，经亚硫酸氢盐翻转之后，能对illumina读取的序列进行比对、定位，并可以进行单个胞嘧啶的甲基化分析，可用于不同样本的甲基化检测。

相对于MethylC-seq，所需数据量减少，仅需MethylC-seq的1/10，成本下降；相对于RRBS，对基因组的覆盖度大幅提高。综上所述，本技术既能检测到基因组功能区DNA甲基化，又能精准比对单个胞嘧啶甲基化状态。在技术成本上，在功能区甲基化测序数据饱和的情况下可比全基因组亚硫酸氢盐测序的数据量少80％-90％，节约每个样本检测成本70％-80％。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甲基化DNA的测序方法，其特征在于，包括如下步骤： 

1)DNA样品的片段化； 

2)将1)中得到的DNA片段与羟甲基化修饰的寡核苷酸接头连接； 

3)富集步骤2)中的甲基化DNA片段； 

4)将步骤3)中得到的产物中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基； 

5)将4)中的单链DNA通过引物进行扩增以获得双链DNA； 

6)去除接头回收纯化DNA； 

7)对步骤6)中获得的双链DNA进行测序。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包括： 

a)将基因组DNA片段化成为DNA片段； 

b)将所述DNA片段进行末端修复以获得具有平末端的DNA片段； 

c)将b)中得到的DNA片段的3’末端加上A碱基。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟甲基化修饰的寡核苷酸接头中所有的碱基胞嘧啶都是羟甲基化的。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的富集羟甲基化DNA通过MeDIP技术进行。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中通过亚硫酸盐处理试剂盒将DNA中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基。 

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中通过高保真DNA聚合酶将单链DNA进行扩增以获得双链DNA。 

7.根据权利要求1所述方法构建得到的DNA测序文库。 

8.一种试剂盒，其中至少包含所述用于DNA末端修复的试剂、DNA 3’端加A的试剂、羟甲基化修饰的接头试剂、通过MeDIP技术富集甲基化DNA的试剂、用于将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐试剂、用于扩增的试剂、用于胶回收的试剂。 

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述扩增的试剂包括引物。 

10.权利要求8的试剂盒用于建立甲基化DNA文库或者用于甲基化DNA测序的用途。